EDS1-etkileşime giren J Protein 1, Arabidopsis'te Bitkinin Doğuştan Bağışıklığının Temel Bir Negatif Düzenleyicisidir

Soyut

Bitkiler, patojenlere karşı bağışıklık tepkilerini optimize etmek için kesin mekanizmalar geliştirmiştir. GELİŞTİRİLMİŞ HASTALIK DUYARLILIĞI 1 (EDS1), bazal direnci ve efektör tarafından tetiklenen bağışıklığı düzenleyerek bitkinin doğal bağışıklığında hayati bir rol oynar. Direnç takviyesi için EDS1'in nükleositoplazmik trafiği gereklidir, ancak moleküler mekanizma hala belirsizdir. Burada, patojen enfeksiyonuna yanıt olarak DnaJ proteini benzeri bir şaperon görevi gören EDS1-INTERACTING J PROTEIN1'in (EIJ1), EDS1 ile etkileşime girerek bitki bağışıklığının önemli bir negatif düzenleyicisi olarak işlev gördüğünü gösteriyoruz. EIJ1'in fonksiyon kaybı mutasyonu bitki büyümesini etkilemedi ancak patojen direncini önemli ölçüde arttırdı. Patojen enfeksiyonu üzerine EIJ1, kloroplasttan sitoplazmaya yeniden yerleşti ve burada EDS1 ile etkileşime girdi, böylece patojen tarafından tetiklenen EDS1'in çekirdeğe taşınması kısıtlandı ve erken enfeksiyon aşamasında dirençten ödün verildi. Hastalığın gelişimi sırasında, EIJ1 yavaş yavaş bozuldu ve transkripsiyonel direncin güçlendirilmesi için EDS1'in nükleer birikimine izin verildi. Avirulent suşu Pst DC3000 (AvrRps4), efektör tarafından tetiklenen bağışıklık yanıtındaki bozulmayı hızla indükleyerek EIJ1'in baskılayıcı etkisini ortadan kaldırdı. Dolayısıyla bulgularımız, EIJ1'in doğuştan gelen bitki bağışıklığının önemli bir EDS1-bağımlı negatif düzenleyicisi olduğunu gösterir ve bağışıklık tepkisi sırasında EDS1'in nükleer ve sitoplazmik dağılımının nasıl düzenlendiğine dair mekanik bir anlayış sağlar.

cistanche faydaları-bağışıklık sistemini güçlendirir

giriiş

Bitkiler, bağışıklık tepkilerini modüle etmek için karmaşık bir ağ geliştirmiştir. Bitkiler kendilerini patojenlere karşı savunmak için iki ana düzenleyici strateji kullanır: modelle tetiklenen bağışıklık (PTI) ve efektörle tetiklenen bağışıklık (ETI). PTI, patojen veya mikropla ilişkili moleküler modelleri tanıyan model tanıma reseptörleri (PRR'ler) tarafından yönetilir (Zipfel, 2008). Enfeksiyonu kolaylaştırmak için öldürücü patojenler, patojen efektörlerini salgılayarak PTI'yi baskılar ve besin alımını ve sonuçta üremeyi kolaylaştırmak için konakçı hücreleri manipüle ederler (Tsuda ve Katagiri, 2010). Bitkinin bu öldürücü patojenlere karşı gösterdiği düşük seviyeli direnç, bazal direnç olarak adlandırılır (Jones ve Dangl, 2006; Klessig ve diğerleri, 2018). Öte yandan ETI'ye, patojenler tarafından salgılanan efektörlerin varlığını doğrudan veya dolaylı olarak tanıyabilen bitki tarafından kodlanan hastalık direnci (R) proteinleri aracılık eder (Tsuda ve Katagiri, 2010). Çoğu R proteini, bir nükleotid bağlanma bölgesi ve lösin açısından zengin bir tekrar alanı (NB-LRR) içerir. Bir N-terminal Toll/İnterlökin-1 reseptörü (TIR) ​​protein-protein etkileşim alanı içeren NB-LRR proteinleri, TIR-NB-LRR (TNL) proteinleri olarak bilinir ve en büyük NB- grubunu oluştururlar. LRR proteinleri (Caplan ve diğerleri, 2008). Bazal dirençle karşılaştırıldığında ETI, patojenlere karşı daha güçlü ve daha hızlı bir savunma tepkisi oluşturur ve buna sıklıkla aşırı duyarlı tepkinin karakteristik bir özelliği olan lokal hücre ölümü eşlik eder (HR; Dodds ve Rathjen, 2010). Bitki bağışıklığının merkezi düzenleyicisi olan GELİŞMİŞ HASTALIK DUYARLILIĞI 1 (EDS1), biyotrofik ve hemibiotrofik patojenlerin istilasını kısıtlayarak bazal direncin kontrol edilmesine yardımcı olur (Wiermer ve diğerleri, 2005). EDS1 ayrıca, esas olarak R proteinlerinin TNL sınıfının aracılık ettiği ETI'de de önemli bir rol oynar (Heidrich ve diğerleri, 2012). EDS1, hücre içi reaktif oksijen türleri (ROS) üretimini, salisilik asit (SA) birikimini ve diğer süreçleri düzenlemek ve böylece patojen direncini güçlendirmek için sitoplazmada ve/veya çekirdekte çekirdek düzenleyicileri PHYTOALEXIN DEFICIENT 4 ve YAŞLANMA İLE İLGİLİ GENE 101 ile yakın işbirliği içinde çalışır (Ruste) 'rucci ve diğerleri, 2001; Rietz ve diğerleri, 2011; Wagner ve diğerleri, 2013). Buna göre Arabidopsis eds1 mutantı, Pseudomonas syringae pv'ye karşı oldukça duyarlıdır. domates (Pst) suşu DC3000 ve ISOCHORISMATE SYNTHASE1 (ICS1; bir SA biyosentetik geni) ekspresyonunun ve SA biyosentezinin inhibe edildiği, tehlikeye atılmış bir TNL aracılı ETI gösterir (Parker ve diğerleri, 1996; Feys ve diğerleri, 2001; Bartsch ve diğerleri). diğerleri, 2006). Ek olarak EDS1, sitoplazma ile çekirdek arasında nükleer taşıma reseptörlerinin aracılık ettiği protein trafiğini sergiler (Garcı'a ve diğerleri, 2010). EDS1'in nükleer fonksiyonları bazal direnç ve ROS üretimini içerse de, programlanmış hücre ölümü ve direnç takviyesi, EDS1'in nükleer ve sitoplazmik lokalizasyonunun koordinasyonunu gerektirir (Heidrich ve diğerleri, 2011). Etkili bazal direnç ve TNL ile tetiklenen bağışıklık için sitozoldeki EDS1 miktarı ile çekirdekteki miktar arasındaki denge önemlidir (Garcı'a ve diğerleri, 2010). Bununla birlikte, EDS1'in bitkide doğuştan gelen bağışıklık tepkileri sırasında nükleositoplazmik dağılım modelini nasıl koruduğu belirsizliğini koruyor. DnaJ proteinleri (veya J proteinleri), sistein (Cys) açısından zengin alan süper ailesine ait olan ve yeni oluşan proteinlerin katlanması ve birleştirilmesine, proteinlerin daha sonra yeniden katlanma ile membranlar boyunca taşınmasına ve proteinlerin membranlar boyunca taşınmasına katılan şaperon proteinleridir (Pulido ve Leister, 2018) ve katlanmamış veya kusurlu proteinlerin imhası (Bukau ve diğerleri, 2006). Bu süreçler, çoğu hücresel proteinin farklı gelişim aşamalarında normal fonksiyonu için gereklidir (Pulido ve Leister, 2018). Çeşitli organizmalarda yapılan araştırmalar, DnaJ proteinlerinin biyotik ve abiyotik stres yanıtlarında, özellikle de bağışıklık yanıtlarında da farklı roller oynadığını göstermektedir. Nicotiana benthamiana'da DnaJ proteini Nb-MIP1, viral patojenlere yanıtta bir kokaperon olarak işlev görür (Du ve diğerleri, 2013). Soya fasulyesi (Glycine max L.) Çekirdeğe lokalize bir DnaJ proteini olan Gm-ısı şok proteini 40 (HSP40.1), soya fasulyesi mozaik virüsüne karşı direncin pozitif bir düzenleyicisidir (Liu ve Whitham, 2013). Domateslerde (Solanum lycopersicum), kloroplast lokalize DnaJ proteini Le-CDJ2'nin bakteriyel patojen Pseudomonas solanacearum'a karşı direnci arttırdığı rapor edilmiştir (Wang ve diğerleri, 2014). Ek olarak, bir tütün (Nicotiana tabacum) DnaJ proteini olan Tsi{68}} etkileşimli protein1'in (Tsip1) strese yanıt olarak Tsi{71}}aracılı transkripsiyonel aktivasyonu düzenlediği rapor edilmiştir (Ham ve diğerleri, 2006). Bu sonuçlar, DnaJ proteinlerinin bitki bağışıklığında önemli bir rol oynadığını açıkça göstermektedir; ancak altta yatan mekanizmaların daha fazla araştırılması gerekmektedir. Bu çalışmada, HSP{76}}benzeri bir DnaJ proteini olan Arabidopsis thaliana EDS1 INTERACTING J PROTEIN 1'i (EIJ1) izole ettik ve EIJ1'in planta'da EDS1 ile etkileşime girdiğini gösterdik. İşlev kaybı olan eij1 mutant bitkileri, yabani tip bitkilerle karşılaştırıldığında normal büyüme, daha güçlü patojen direnci ve patojenler tarafından enfeksiyon üzerine dirençle ilişkili genlerin daha yüksek ekspresyonu gösterdi. Ancak EIJ1'in fonksiyon kaybı mutasyonu, Pst DC3000 ile mücadele sonrasında eds1 mutantının duyarlı fenotipini kurtarmadı. Ayrıca, normal olarak kloroplastta lokalize olan EIJ1 proteini, patojen inokülasyonu üzerine kloroplasttan sitoplazmaya salındı ​​ve burada EDS1 ile etkileşime girdi, böylece patojen tarafından tetiklenen çekirdeğe taşınması önlendi ve sonuç olarak direnç tepkisini erkenden tehlikeye attı. enfeksiyon aşaması. Bu bulgular, EDS1'in nükleositoplazmik dağılım modelinin altında yatan düzenleyici mekanizmanın önemli ayrıntılarını aydınlatıyor ve mahsullerde hastalığa dirençli üreme için potansiyel olarak etkili bir hedef sağlıyor.

cistanche faydaları-bağışıklık sistemini güçlendirir

Sonuçlar

EIJ1, in vitro ve in vivo olarak EDS1 ile etkileşime girer

Bitki savunma yanıtlarının önemli bir bileşeni olan EDS1, bitkinin doğuştan gelen bağışıklık sinyal ağının önemli bir düğümünde bulunur. EDS1'in potansiyel etkileşimli protein ortaklarını belirlemek için iki hibritli bir maya taraması gerçekleştirdik. EDS1, DnaJ süper ailesine ait (Ek Şekil 1A); bilinmeyen bir fonksiyona (Şekil 1, A ve B) sahip bir Arabidopsis HSP40- benzeri şaperon proteini (AT2G24860) ile güçlü etkileşim gösterdi; bu protein bundan sonra EIJ1 olarak anılacaktır. Dizi analizi, EIJ1'in dört Cys açısından zengin Zn parmak motifi (CXXCXGXG; Ek Şekil 1A) dahil olmak üzere 144 amino asit kalıntısı içerdiğini gösterdi. Diğer kapalı tohumlu türlerin EIJ1 homologlarına sahip olmasına rağmen, en yakın homologların Brassicaceae ile sınırlı olduğu görülmektedir (Ek Şekil 1B ve Dosya S1). Özellikle EIJ1, patojen direncinde rol oynayan N. tabacum Tsip1 proteini ile dizi benzerliği gösterdi (Ek Şekil 1B; Ham ve diğerleri, 2006). EDS1 ve EIJ1 arasındaki etkileşimden sorumlu fonksiyonel alanları tanımlamak için, maya iki hibrit analizlerinde bu proteinlerin iki kesik versiyonu kullanıldı (Şekil 1A; Ek Şekil 1A). EIJ1'in N terminali, tam uzunluktaki EDS1'in yanı sıra EDS1 N terminali ile güçlü etkileşim gösterdi, ancak EDS1 C terminali ile zayıf bir etkileşim gösterdi (Şekil 1B). Bu, lipaz benzeri bir alan içeren EDS1'in N terminalinin ve EIJ1'in N terminalinin etkileşimleri için gerekli ve yeterli olduğunu göstermektedir. EIJ1'in C terminali, DNA'ya veya diğer proteinlere bağlanmasını kolaylaştırabilecek korunmuş Cys bakımından zengin bir Zn parmak alanı içermesine rağmen, EDS1 ile etkileşime katkıda bulunmaz. Aşağı çekme analizleri, in vitro olarak EDS1 ve EIJ1 arasındaki etkileşimi daha da doğruladı (Şekil 1C), 35Spro: EIJ1- 6HA 35Spro: EDS1-3FLAG transgenik bitkileri kullanılarak ortak immünopresipitasyon (Co-IP) analizleri plantadaki etkileşimlerini doğruladı (Şekil 1D). Birlikte ele alındığında bu sonuçlar, EDS1'in hem in vitro hem de in vivo olarak EIJ1 ile etkileşime girdiğini göstermektedir. EIJ1'in karakterizasyonu EIJ1'in hücre altı lokalizasyonunu belirlemek için, 35Spro: EIJ1-mCherry yapısını oluşturmak üzere EIJ1 açık okuma çerçevesini, karnabahar mozaik virüsü 35S promoterinin kontrolü altında mCherry raportör geniyle birleştirdik. Bu yapı, tarımsal filtreleme yoluyla geçici olarak N. benthamiana yapraklarına dönüştürüldü. Floresan mikroskobu, EIJ1-mCherry'nin hem kloroplastta hem de çekirdeğe lokalize olduğunu gösterdi (Şekil 2A). Bu lokalizasyon modeli, transgenik 35Spro: EIJ1-6HA bitkilerinin immünoblot analizi ile doğrulandı (Ek Şekil 2). EIJ1'in ekspresyon modelini araştırmak için, EIJ1'in genomik dizisi, EIJ1pro: EIJ1-GUS transgenik Arabidopsis çizgilerini oluşturmak üzere ß-glukuronidaz (GUS) raportör geni ile birleştirildi. Rozet yaprakları ve köklerinde güçlü GUS aktivitesi tespit edildi; ancak GUS aktivitesi silikalarda zayıftı ve saplarda ve çiçeklerde tespit edilemiyordu (Şekil 2B). Bu sonuçlar, çeşitli dokularda kantitatif ters transkripsiyon-PCR (RT-PCR) ile incelenen EIJ1'in ekspresyon sonuçlarıyla tutarlıydı (Şekil 2C). EDS1'in bitki bağışıklığının merkezi bir düzenleyicisi olduğu göz önüne alındığında (Saikat ve diğerleri, 2011), EDS1'in varsayılan bir kofaktörü olan EIJ1'in aynı zamanda patojen enfeksiyonuna tepkide bulunup bulunmadığını araştırdık. EIJ1'in transkript seviyesi, hemibiotrofik bakteri Pst DC3000 veya SA ile muamele edilerek indüklendi (Şekil 2D). GUS boyaması, Pst DC{80}}aşılanmış yapraklarda (Şekil 2E–G) EIJ1'in indüklendiğini ve trikomların çevresinde belirgin şekilde yoğunlaştığını ortaya çıkardı; bu da EIJ1'in savunma tepkisinde olası bir biyolojik ilişkisini ima ediyor (Xin ve He, 2013). Daha sonra, Pst DC3000 veya SA ile tedavi edilen 35Spro: EIJ1-HA bitkilerindeki EIJ1 seviyesini inceledik. İlginç bir şekilde, Pst DC3000 veya SA tedavisi üzerine EIJ1, hızlı bir indüksiyonun ardından kademeli olarak bozuldu (Şekil 2, H ve I). Bu sonuç, EIJ1'in transkripsiyon sonrası düzenlemesini gösteren, patojen enfeksiyonu sırasında 35Spro: EIJ1-HA bitkilerinde gözlemlenen EIJ1-HA'nın stabil ekspresyon modeliyle tutarlı değildi (Ek Şekil 3). Birlikte, bu sonuçlar EIJ1'in bitki bağışıklık tepkisinde rol oynadığını göstermektedir.

erkekler için cistanche faydaları-bağışıklık sistemini güçlendirir

EIJ1'in işlev kaybı mutasyonu, SA yolu yoluyla Pst DC3000'e direnci artırır

EIJ1'in bitki bağışıklığındaki rolünü araştırmak için, EIJ1'in üçüncü ekzonunda bir T-DNA yerleşimi içeren bir Arabidopsis mutantı (SALK_142975) tanımladık (Şekil 3, A ve B). Kantitatif RT-PCR analizi, EIJ1'in bu eij1 T-DNA yerleştirme mutantında zayıf şekilde eksprese edildiğini gösterdi; bu nedenle bu EIJ1 aleline eij{{10}} adını verdik (Şekil 3C). Daha sonra, 3-haftalık eij1-1 mutant bitkilerin ve Arabidopsis (A. thaliana) ekotipli Columbia (Col-0; vahşi tip) bitkilerin hastalık direnci fenotipini aşağıdakilerle aşılama yoluyla değerlendirdik: Pst DC3000. Aşılamadan 5 gün sonra (dpi) enfekte olmuş yaprakların değerlendirilmesi, eij{19}} yapraklarında Col-0 yapraklarına göre daha az nekrotik lezyon olduğunu ortaya çıkardı (Şekil 3D). Tutarlı bir şekilde, 5 dpi'de eij1-1 yaprakları Col-0 yapraklarından önemli ölçüde daha düşük bir bakteri titresi gösterdi, ancak bakteri titresi 5 dpi'de Col-0 ve eij1-1 yaprakları arasında hiçbir fark göstermedi. 0 dpi (Şekil 3E). Daha sonra, 6xHA etiket dizisiyle birleştirilmiş bir EIJ1 genomik parçasını eij1-1 arka planına dönüştürerek eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA tamamlama çizgileri oluşturduk. Tamamlama çizgileri, eij1-1'nin patojen direnç fenotipini tamamen kurtardı (Şekil 3E), eij1-1'nin işlev kaybı olan bir mutant olduğunu destekledi. EIJ1'in apoplastik bağışıklık üzerindeki etkisini belirlemek için bu tamamlama hatlarının hastalık direnci fenotipi, Pst DC3000'in basınç infiltrasyonu ile de değerlendirildi ve benzer sonuçlar elde edildi (Ek Şekil 4A). EIJ1'in fonksiyonunu doğrulamak için daha sonra EIJ1'in promotör bölgesinde bir T-DNA yerleşimi içeren başka bir Arabidopsis mutantı eij1-2 (WiscDsLox343G09) tanımladık (Ek Şekil 5, A ve B). EIJ1 transkriptleri, eij1-2 mutantında zar zor tespit edilebiliyordu, bu da eij1-2'nin EIJ1'in boş bir aleli olduğunu gösteriyor. Eij1-1'ye benzer şekilde, bakteriyel büyüme analizleri, eij1-2'nin Col-0'den önemli ölçüde daha düşük bir bakteri titresinde mevcut olduğunu ortaya çıkardı (Ek Şekil 5, D ve E). Özetle bu sonuçlar, EIJ1'in bitki bağışıklık tepkisinde önemli bir baskılayıcı rol oynadığını göstermektedir.

Şekil 1 EIJ1, in vitro ve planta'da EDS1 ile etkileşime girer. (A) EIJ1, EDS1'de bulunan alanları ve bunların kesilmiş versiyonlarını gösteren şematik diyagram. (B) Maya iki hibrit analizleri EIJ1, EDS1 ve bunların kesik versiyonları arasındaki etkileşimleri gösterir. Dönüştürülmüş maya hücreleri, SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade ve SD/-Trp/-Leu ortamı üzerinde büyütüldü. Boş, yalnızca vektör denetimleri; AD, aktivasyon alanı; BD, DNA bağlama alanı. (C) His-EIJ1 ve GST-EDS1 füzyon proteinleri arasındaki in vitro doğrudan etkileşimi gösteren aşağı çekme deneyi. His-EIJ1 proteinleri, hareketsizleştirilmiş GST veya GST-EDS1 proteini ile inkübe edildi. İmmün çökeltilmiş fraksiyonlar sırasıyla anti-His ve anti-GST antikorları tarafından tespit edildi. (D) Arabidopsis'in yapraklarında EIJ1 ve EDS1'in etkileşimini gösteren Co-IP. 3-Haftalık 35Spro: EIJ1-6HA (genotip kontrolü olarak) ve 35Spro: EIJ1-6HA 35Spro: EDS1-3FLAG yapraklarından ekstrakte edilen toplam proteinler, ya bir anti-FLAG antikoru ya da bir bağışıklık öncesi serum (IgG). Birlikte immünopresipitasyona tabi tutulan proteinler, sırasıyla anti-FLAG ve anti-HA antikorları kullanılarak tespit edildi. (B-D)'de sunulan temsili sonuçlar bağımsız olarak üç kez tekrarlandı.

Bir tür reaktif oksijen türü olan hidrojen peroksitin (H2O2) üretimi, patojenlerin başarılı bir şekilde tanınmasının ve ardından İK ile ilişkili programlanmış hücre ölümü de dahil olmak üzere bitki savunma tepkilerinin aktivasyonunun bir işaretidir (Lam ve diğerleri, 2001; Torres ve diğerleri, 2001). diğerleri, 2006; Nanda ve diğerleri, 2010). Bu nedenle, 3-haftalık patojenle aşılanmış Col-0, eij1-1 ve eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA'da H2O2 düzeyini izledik 3,3-diaminobenzidin (DAB) boyama yöntemini kullanarak bitkiler. Sonuçlar, H2O2'nin enfekte bitkilerde yüksek düzeylerde biriktiğini ancak aşılanmamış (sahte) bitkilerde tespit edilmediğini gösterdi (Şekil 3F). Eij1-1 yapraklarında Col- 0 yapraklarına ve Pst DC3000 ile aşılanmış tamamlama çizgilerine göre daha yüksek düzeyde H2O2 tespit edildi (Şekil 3F). Ayrıca, tripan mavisi boyama, hücre ölümünün (microHR, Alvarez ve diğerleri, 1998) Pst DC3000 ile aşılamadan 24- saat sonra (HPI) eij1-1 yapraklarında meydana geldiğini, ancak hiçbir microHR, Col-0 ve eij1-1 EIJpro1:EIJ1-6HA bitkilerinde gözlendi (Şekil 3G). Avirulent Pst DC3000 (AvrRps4) ile aşılama, daha yüksek H2O2 birikimi ve daha fazla mikroHR ile sonuçlandı, ancak bu üç genotip arasında görünür bir fark gözlenmedi (Şekil 3, F ve G). Bu sonuçlar, EIJ1'in patojenlere karşı bazal dirençte önemli bir rol oynadığını ima etti.

Şekil 2 EIJ1 mRNA ve proteinin ekspresyon modeli. (A) EIJ1'in kloroplast ve çekirdek lokalizasyonu. Bir EIJ1-mCherry füzyon proteini, N. benthamiana yapraklarında geçici olarak eksprese edildi ve eş odaklı mikroskopi ile analiz edildi. DAPI floresansı çekirdeği gösterir. Klorofil floresansı yeşil renkle gösterilir. Çubuk=10 lm. (B) Köklerde, gövdelerde, rozet yapraklarında, çiçeklerde, silikalarda ve 10-günlük fidelerde (soldan sağa) EIJ1 ifadesini gösteren GUS boyaması. Çubuk=1 mm. (C) qRT-PCR ile tespit edildiği gibi, kökler, gövdeler, rozet yaprakları, çiçekler ve silikalar dahil olmak üzere Col bitkilerinin çeşitli dokularında EIJ1'in ekspresyon modeli. Göreceli ifade, incelenen genin transkripsiyon seviyesinin ACTIN2'ninkine göre normalleştirilmesiyle hesaplandı (aşağıdakiyle aynı). Veriler, üç biyolojik kopyanın ortalama ± SD'sidir. Küçük harfler önemli farklılıkları belirtir (tek yönlü ANOVA, P 5 0.01; Ek Veri Kümesi 1). (D) Pst DC3000 (OD600=0.1) ile daldırma aşılanmış veya 0,05 mM SA püskürtülmüş 3-haftalık Col bitkileri kullanılarak EIJ1'in ekspresyon analizi. Veriler, üç biyolojik kopyanın ortalama ± SD'sidir (Ek Veri Seti 1). (E – G) GUS boyaması, EIJ1 ekspresyonunun patojenler tarafından indüklendiğini gösterir. Üç haftalık pEIJ1:EIJ1-GUS bitkileri sahte aşılandı (10 mM MgCl2; E) veya Pst DC3000 (OD600=0.1; F) ile daldırma aşısı yapıldı. Çubuk=1 mm. Büyütülmüş resim, EIJ{38}}GUS'un (G)'deki trikom bölgesinde yoğunlaştığını gösterir. Bar=100 lm. 4 hpi'deki yapraklar toplandı ve bir GUS boyama solüsyonuyla inkübe edildi. (H) ve (I) Pst DC3000 veya SA tedavisinin ardından EIJ1'in ekspresyon modeli. Toplam proteinler, Pst DC3000 (OD600=0.1; H) ile aşılanmış veya 0,05 mM SA (I) ile püskürtülmüş 3-haftalık 35Spro: EIJ1-6HA bitkilerinden ekstrakte edildi, ve bir anti-HA antikoru kullanılarak tespit edildi. Alt paneller yükleme kontrolü olarak Coomassie Brilliant Blue (CBB) ile boyamayı göstermektedir. (H) ve (I)'de sunulan immünoblot analizleri bağımsız olarak üç kez tekrarlandı.

Şekil 3 Arabidopsis EIJ1 mutasyona uğramış alel eij1-1'nin tanımlanması. (A) eij1-1 (SALK_142975) içindeki T-DNA yerleştirme bölgesini gösteren şematik diyagram. Ekzonlar kutularla, intronlar ise kutuların arasındaki çizgilerle temsil edilir. Kara kutular EIJ1 kodlama bölgelerini temsil eder ve beyaz kutular çevrilmemiş bölgeyi temsil eder. Üçgen, T-DNA'nın yerleştirme bölgesini gösterir. (B) Genomik DNA'nın PCR amplifikasyonu, eij1-1'nin homozigot bir yerleştirme mutantı olduğunu doğrular. Kullanılan primerler (P1, P2) (A)'da gösterilmiştir. LB, T-DNA sol kenar primerini belirtir ve M, DNA moleküler belirteçlerini belirtir. (C) EIJ1 ifadesinin qRT-PCR analizi. Toplam RNA, 3-haftalık eij1 ve Col yapraklarından ekstre edildi. EIJ1'in eij1-1'deki göreceli ifadesi 1'e ayarlandı. Veriler, üç biyolojik kopyanın ortalama ± SD'sidir (Ek Veri Seti 1). (D) Col, eij1-1'nin hastalık direnci fenotipi ve iki temsili EIJ1 tamamlama transgenik çizgisi eij1 EIJ1pro: EIJ1-6HA. Üç haftalık bitkilere Pst DC3000 (OD600=0.05) ile daldırma aşısı uygulandı. Gösterilen yapraklar 5 dpi'de fotoğraflandı. Çubuklar=5 mm. (E) 0 ve 5 dpi'de (D)'de açıklanan bitkilerde Pst DC3000'in bakteriyel büyümesi. cfu/g, gram taze ağırlık başına koloni oluşturma birimi. Veriler, üç biyolojik kopyanın ortalama ± SD'sidir. Küçük harfler önemli farklılıkları gösterir (tek yönlü ANOVA, P 5 0.01, Ek Veri Kümesi 1). (F) Col yapraklarındaki H2O2 seviyelerinin incelenmesi,

EIJ1, EDS1 aktivitesini baskılayarak bitki bağışıklığına aracılık eder

EDS1 ve EIJ1 arasındaki genetik ilişkiyi anlamak için, eij1-1 mutantını eds1-22 ile geçerek eij1-1 eds1-22 çift mutant çizgileri oluşturduk; Tehlikeli patojen direnci sergileyen EDS1-90'nin (AT3G48090; Col-0 arka planı) işlevli mutant aleli (Yang ve Hua, 2004). Normal büyüme koşulları altında eij1-1, eds1-22 ve eij1-1 eds1-22 mutant bitkileri arasında morfolojik bir farklılık gözlenmedi (Şekil 4, A ve B). Pst DC3000 ile aşılamanın ardından, eij1-1 mutant bitkileri 5 dpi'de Col-0 bitkilerinden daha güçlü direnç sergiledi (Şekil 4, A ve B). Bununla birlikte, eij1-1 eds1-22 çift mutantı, eds1-22 tek mutantıyla karşılaştırılabilir düzeyde dikkate değer nekrotik lezyonlar ve yüksek bakteri titresi sundu; bu, eij1-1 alelinin bunu başaramadığını gösterir. eds'in hastalığa duyarlı fenotipini kurtarmak1-22 (Şekil 4, A ve B). Pst DC3000'in basınç infiltrasyonunun ardından hastalık direnci de değerlendirildi ve benzer sonuçlar elde edildi (Ek Şekil 4B). Ayrıca EDS1 boş aleli olan eds1-2;'yi kullandık. Sütun arka planı; Bartsch ve diğerleri, 2006), genetik analiz için eij1-1 eds1-2 çift mutant bitkileri oluşturmak için. Eij1-1 eds1-22'ye benzer şekilde, eij1-1 eds1-2 çift mutant bitkileri de dikkat çekici nekrotik lezyonlar ve eij1-1'den daha yüksek bakteri titresi gösterdi; eds1-2 tek mutantıyla karşılaştırılabilir (Ek Şekil 6). Bu genetik kanıt, EDS1'in EIJ1'e epistatik olduğunu göstermektedir. Yukarıdaki gözlemlerle tutarlı olarak, H2O2, Col{{ ile karşılaştırıldığında eij1-1 yapraklarında yüksek düzeylerde birikirken, eds1- 22 ve eij1-1 eds1-22 yapraklarında düşük düzeylerde birikmiştir. 53}}, Pst DC3000 aşılaması üzerine ayrılır (Şekil 4C). Ayrıca, eij1-1'deki microHR, Pst DC3000 veya avirulent Pst DC3000 (AvrRps4; Şekil 4D) ile 24 hpi'de EDS1'in fonksiyon kaybıyla açıkça bastırıldı. Bu sonuçla tutarlı olarak, eij1-1 eds1-22 ve eds1-22 bitkilerindeki ICS1 ve PR1'in ifade seviyeleri karşılaştırılabilir ancak eij1-1 ve Col{'dakilerden önemli ölçüde daha düşüktü {71}} bitki (Şekil 4E). Bu sonuçlar, EIJ{73}}aracılı doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin EDS1'e bağlı olduğunu desteklemektedir. Bitki bağışıklık tepkisinde EIJ1-EDS1 etkileşiminin rolünü araştırmak için, Pst DC3000 ile 24 hpi'de eij1-1, eds1-22 ve Col-0 yapraklarının RNA sekans analizini gerçekleştirdik. ; aşılanmamış Col{83}} yaprakları sahte bir tedavi olarak kullanıldı. Col_Pst DC3000'e karşı Col_mock, eij1-1_Pst DC3000'e karşı Col_'de toplam 2762, 923 ve 622 diferansiyel olarak eksprese edilmiş gen (DEG) tanımlandı Pst DC3000 ve eds1-22_Pst DC3000 ile Col_Pst DC3000 karşılaştırmaları. Bu genler bundan sonra sırasıyla patojene duyarlı, EIJ{99}düzenlenmiş ve EDS{100}}düzenlenmiş genler olarak anılacaktır (Ek Şekil 7A ve Veri Kümesi 2). Bu genler arasında 471'i EIJ1 tarafından düzenlenmiştir; 396'sı EDS1 tarafından düzenlenmiştir (Şekil 4F; Ek Veri Seti 2); ve 124'ü EIJ1 ve EDS1 tarafından birlikte düzenlendi (Şekil 4F). Küme analizi, birlikte düzenlenen genlerin (124) %93,5'inin (116) EDS1 tarafından yukarı regüle edildiğini ve EIJ1 tarafından aşağı regüle edildiğini gösterdi (Şekil 4F; Ek Şekil 7B ve Veri Seti 2), EIJ1'in baskıcı rolünü destekler. EDS1 işlevi. Gen ontolojisi (GO) analizi ayrıca EIJ1 ve EDS1 tarafından antagonistik olarak düzenlenen genlerin çoğunun esas olarak stres tepkilerinde ve doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinde rol oynadığını ortaya çıkardı (Şekil 4G; Ek Tablo S1). Bu analizler, EIJ1 ve EDS1'in patojen enfeksiyonu sırasında dirençle ilişkili genleri zıt bir şekilde düzenlediğini göstermektedir. EDS{135}}düzenlenen genlerin önemli bir kısmı (272/396), muhtemelen EDS1'in alt kat değişimi (52) veya EIJ{140}}bağımsız işlevi nedeniyle EIJ1 tarafından düzenlenmedi.

cistanche tubulosa-bağışıklık sistemini iyileştirir

Cistanche Enhance Immunity ürünlerini görüntülemek için buraya tıklayın

【Daha fazlasını isteyin】 E-posta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

EIJ1, sitoplazmada EDS1 ile etkileşime girer ve EDS1'in nükleer ticaretini engeller

EIJ1, yaprak hücrelerinin kloroplastında ve çekirdeğinde lokalizedir (Şekil 2A), oysa EDS1 proteini, her iki yerde de meydana gelen bir nükleositoplazmik dağılım modeli sergiler (Garcı'a ve diğerleri, 2010). EIJ1'in plantadaki EDS1 ile nerede ve nasıl etkileşime girdiğini araştırmak için Arabidopsis protoplastlarını kullanarak geçici ekspresyon analizleri yaptık. İlginç bir şekilde, EIJ1, yeşil floresan proteinin (GFP; kontrol) varlığında kloroplast ve çekirdekteki orijinal hücre içi lokalizasyon modelini korusa da, kloroplastla lokalize EIJ1-mCherry, EDS{ ile birlikte eksprese edildiğinde sitoplazmada yayıldı. {9}}Protoplastlarda GFP (Şekil 5A, Ek Dosya 2'deki kopyalara bakın). Bu fenomen, EIJ1-mCherry'nin EDS1-GFP veya GFP kontrolü ile geçici olarak birlikte eksprese edildiği N. benthamiana epidermal hücrelerinde doğrulandı (Ek Şekil 8, Ek Dosya 2'deki kopyalara bakın) . Bu gözlemler, EDS1 aşırı ekspresyonunun, EIJ1'in hücre altı yeniden lokalizasyonuna yol açabileceğini göstermektedir. Daha sonra, EDS1 ve EIJ1'in etkileşime girdiği hücre içi konumu belirlemek için rekombinant Glutatyon S-Transferaz (GST)-EDS1 füzyon proteini (yem) ve toplam protein ekstraktı, çekirdekleri tükenmiş fraksiyonlar ve çekirdekleri kullanarak bir aşağı çekme tahlili gerçekleştirdik. 35Spro'nun zenginleştirilmiş fraksiyonları: EIJ1-HA transgenik çizgileri (av proteinleri). Sonuçlarımız, toplam protein ekstraktı ve 35Spro: EIJ1-HA yapraklarının çekirdekleri tükenmiş fraksiyonları kullanıldığında EDS1'in EIJ1-HA ile immüno-çökeltildiğini, ancak çekirdeklerle zenginleştirilmiş fraksiyonlar kullanıldığında bunun gerçekleşmediğini gösterdi (Şekil 5B), EIJ1 ve EDS1 arasındaki etkileşimin sitoplazmada meydana geldiğini düşündürmektedir.

Şekil 4 EIJ1 ve EDS1, bitkilerin patojenlere karşı direncini zıt şekilde düzenler. (A) Col, eij1-1, eds1-22 ve eij1-1 eds1-22'nin hastalığa direnç fenotipi. Üç haftalık bitkilere Pst DC3000 (OD600=0.05) ile daldırma aşısı uygulandı. Gösterilen yapraklar 5 dpi'de fotoğraflandı. Çubuk=5 mm. (B) 0 ve 5 dpi'de (A)'da açıklanan bitkilerde Pst DC3000'in bakteriyel büyümesi. Veriler, üç biyolojik kopyanın ortalama ± SD'sidir. Küçük harfler önemli farklılıkları gösterir (tek yönlü ANOVA, P 5 0.01, Ek Veri Kümesi 1). (C) Col, eij1-1, eds1-22 ve eij1-1 eds1-22 bitkilerindeki H2O2 seviyelerinin incelenmesi. Üç haftalık bitkilere Pst DC3000 veya Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1) ile daldırma aşısı uygulandı ve ardından 24 hpi'de DAB ile boyandı. Bar=500 lm. (D) Col, eij1-1, eds1-22 ve eij1-1 eds1-22 bitkilerinin hücre ölümü analizi. Üç haftalık bitkilere Pst DC3000 veya Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1) ile dip aşı uygulandı ve ardından 24 hpi'de tripan mavisi ile boyandı. Bar=500 lm.

EIJ1'in bitki bağışıklık tepkisini EDS1-bağımlı bir şekilde negatif olarak düzenlediği göz önüne alındığında (Şekil 4), daha sonra patojenlerin EIJ1 ile EDS1 arasındaki etkileşim üzerindeki etkisini inceledik. Şaşırtıcı bir şekilde, Pst DC3000 enfeksiyonu, hem kloroplast hem de çekirdek yerine sitoplazmadaki EDS1-EIJ1 etkileşimini arttırdı (Şekil 5C, Ek Dosya 2'deki kopyalara bakın). Bu bulgu, EDS1'in nükleositoplazmik dağılım modeli ve EDS1 nükleer lokalizasyonunun transkripsiyonel seviyede patojen direncinin güçlendirilmesindeki rolü (Garcı'a ve diğerleri, 2010) ile birlikte bizi EIJ1'in rolünü araştırmaya zorladı. Patojen enfeksiyonu sırasında EDS1'in hücre içi trafiği. Eij1-1, EIJ1 aşırı ifadesi ve Col{19}} bitkilerinden izole edilen Arabidopsis protoplastlarında EDS1-3FLAG'ı geçici olarak ifade ettiğimizde, EIJ1, EDS1'in çekirdeğe geçişini belirgin şekilde bastırdı (Ek Şekil 9) . Ayrıca immünoblot analizi, eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG ve eij1-1 eds1-22 EDS1pro: EDS{{30} arasında toplam EDS1 proteini bolluğu açısından çok az fark olduğunu ortaya çıkardı. }FLAG transgenik bitkiler (Şekil 5D, Ek Dosya 2'deki kopyalara bakın). Ancak eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG transgenik bitkileri ile karşılaştırıldığında, Pst DC3000- aşılanmış eij1-1 eds1-22 EDS1pro: EDS13FLAG bitkileri belirgin bir artış gösterdi çekirdeklerle zenginleştirilmiş EDS1 proteini seviyesinde ve sitoplazmayla lokalize EDS1 seviyesinde bir azalma (Şekil 5D, Ek Dosya 2'deki kopyalara bakınız), EIJ1'in EDS1'in sitoplazmadan çekirdeğe kaçakçılığında baskıcı rolünü doğrulamaktadır. Daha sonra, EIJ1-EDS1 etkileşiminin aracılık ettiği bu yeniden dağıtım sürecinin bitkilerdeki dirençle ilişkili genlerin transkripsiyonel düzenlemesini etkileyip etkilemediğini test ettik. 35Spro: EIJ1-mCherry ve 35Spro: EDS1-3FLAG efektör yapıları tek tek veya raportör yapılarla birlikte N. benthamiana yaprak epidermal hücrelerine dönüştürüldü (Şekil 5E). Pst DC3000 ile 24 hpi'de EDS1, PR1 ve ICS1 ekspresyonunu etkinleştirirken (Şekil 5F), EIJ1 ise EDS{65}}indüklenen gen ekspresyonunu belirgin şekilde inhibe etti (Şekil 5F). Tam uzunluktaki EIJ1'in aksine, eij1-1'de etkilenmeyen EIJ1 proteininin N-terminal ucu, EDS1-'nin indüklediği PR1 ifadesini inhibe edemedi (Ek Şekil 10, A ve B) ), EIJ1'in sağlam protein yapısının baskılayıcı işlevi için gerekli olduğunu gösterir. Bu sonuçlar birlikte, EIJ1'in, EDS1'in nükleositoplazmik trafiğini düzenleyerek EDS{77}}aracılı direnç yanıtında temel bir baskılayıcı olarak işlev gördüğünü desteklemektedir. EIJ1 proteini, hızlı bir başlangıç ​​indüksiyonundan sonra Pst DC{80}}aşılanmış veya SA ile işlenmiş bitkilerde kademeli olarak bozunduğundan (Şekil 2, H ve I), EDS1'in de EIJ1'in bozunmasını bir etki yoluyla tetikleyip tetiklemediğini araştırdık. protein-protein etkileşimi. eds{86}}Spro: EIJ1-HA transgenik bitkileri kullanılarak yapılan hücresiz bozunma deneyleri ve in vivo protein saptama deneyleri, EDS1'in ne yokluğunun ne de varlığının EIJ1 bozunmasını etkilemediğini gösterdi (Ek Şekil 11). EDS1, EIJ1'in patojen tarafından tetiklenen bozulmasına dahil değildir.

Cistanche tubulosa'nın faydaları-Bağışıklık sistemini güçlendirmek

Patojen enfeksiyonu EIJ1'in hücre içi lokalizasyonunu değiştirir

Patojen aşılaması üzerine sitoplazmada EIJ1 ve EDS1 arasındaki artan etkileşim (Şekil 5, B ve C), bitki hücrelerinde EIJ1'in patojen tarafından tetiklenen olası bir yeniden lokalizasyonunu ima etti. Bu olasılığı test etmek için, Pst DC3000 ile aşılanmış N. benthamiana yapraklarında EIJ1'in hücre altı lokalizasyonunu inceledik. Enfekte olmamış koşullar altında, EIJ1-mCherry kloroplast ve çekirdeğe lokalize edildi. Ancak 24 dpi'de floresans sinyalleri kloroplastlarda büyük ölçüde azaldı ve sitoplazmada arttı (Şekil 6A). Patojenlerin yapraklarda EIJ1'in kloroplasttan sitoplazmaya ayrışmasını tetikleyip tetiklemediğini daha da belirlemek için, 35Spro: EIJ1-6HA transgenik bitkileri kullanılarak EIJ1 proteininin immünoblot analizi yapıldı. Toplam proteinler, kloroplast proteinleri ve sitoplazmik proteinler, Pst DC3000 ile 0 ve 4 hpi'de 35Spro: EIJ1-6HA transgenik bitkilerinden izole edildi. EIJ1'in bolluğu sitoplazmik fraksiyonda belirgin şekilde arttı, ancak 24 dpi'de kloroplast fraksiyonunda azaldı (Şekil 6B, Ek Dosya 2'deki kopyalara bakın), bu da kloroplast ve sitoplazmadaki EIJ1 protein seviyeleri arasında negatif bir korelasyon olduğunu gösterir.

Şekil 5 EIJ1, EDS1'in nükleer kaçakçılığına aracılık etmek için sitoplazmada EDS1 ile etkileşime girer. (A) Arabidopsis protoplastlarında EDS1 ve EIJ1'in lokalizasyonunu gösteren geçici ekspresyon analizi. Çubuk=10 lm. (B) EIJ1 ve EDS1 arasındaki etkileşimin aşağı çekme analizi. 3-haftalık eij1-1 35Spro: EIJ1-6HA transgenik bitkilerinden ekstrakte edilen toplam proteinler, çekirdeği tükenmiş fraksiyonlar ve çekirdeği zenginleştirilmiş fraksiyonlar, hareketsizleştirilmiş GST-EDS1 veya GST proteinleri ile inkübe edildi , sırasıyla. IP'ler, anti-HA veya anti-GST antikorları kullanılarak tespit edildi. PEPC ve histon H3 sırasıyla sitoplazmik ve nükleer belirteçler olarak kullanıldı. Yıldız işaretleri GST-EDS1 proteinlerinin bantlarını gösterir. (C) Pst DC3000 enfeksiyonu, sitoplazmada EDS1 ve EIJ1'in protein etkileşimini arttırır. Toplam proteinler, çekirdeği tükenmiş fraksiyonlar, çekirdeği zenginleştirilmiş fraksiyonlar ve kloroplast proteinleri, aşağıdakilerle daldırma yöntemiyle aşılanmış 3-haftalık EIJ1pro: EIJ1-6HA 35Spro: EDS1-3FLAG bitkilerinden ekstre edildi. Pst DC3000 (OD600=0.1) veya 4 hpi'de sahte aşılanmış ve bir anti-FLAG antikoru veya bir bağışıklık öncesi serum (IgG) kullanılarak immüno-çökeltilmiştir. Birlikte immüno-çökeltilmiş proteinler, anti-HA ve anti-FLAG antikorları kullanılarak tespit edildi. N'si tükenmiş, çekirdeği tükenmiş fraksiyonlar; N ile zenginleştirilmiş, çekirdeklerle zenginleştirilmiş fraksiyonlar. PEPC ve histon H3 sırasıyla sitoplazmik ve nükleer belirteçler olarak kullanıldı. (D) İmmünoblot analizi, EIJ1'in, EDS1'in sitoplazmik ve nükleer dağılımına aracılık ettiğini göstermektedir. Toplam proteinler, çekirdeği tükenmiş fraksiyonlar ve çekirdeği zenginleştirilmiş fraksiyonlar, 3-haftalık baskılardan1-22 EDS1pro: EDS1- 3FLAG ve eij1-1 baskılardan{{59 çıkarıldı }} EDS1pro: EDS1-3FLAG transgenik bitkileri, Pst DC3000 (OD600=0.1) ile daldırma yoluyla aşılanmış veya 4 hpi'de sahte aşılanmış ve bir anti-FLAG antikoru kullanılarak tespit edilmiştir. Sahte aşılama işlemi 1'e ayarlıyken eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG'den proteinlerin bağıl yoğunluğu. M, sahte; P, Pst DC3000. PEPC ve histon H3 sırasıyla sitoplazmik ve nükleer belirteçler olarak kullanıldı. (A), (C) ve (D)'de sunulan sonuçlar bağımsız olarak üç kez tekrarlandı (Ek Dosya 2). (E) ve (F) EIJ1 ve EDS1 tarafından düzenlenen PR1 ve ICS1 promoter aktivitesinin geçici analizi. Geçici ekspresyon analizlerinde kullanılan çeşitli yapılar (E)'de gösterilmektedir. PR1pro: GUS veya ICS1pro: GUS, efektörler veya boş vektör (Kontrol) ile 24 saat boyunca Pst DC3000 (OD600=0.1) ile kısırlaştırılan N. benthamiana yapraklarına birlikte dönüştürüldü. Çeşitli efektörler tarafından düzenlenen PR1 ve ICS1'in ekspresyon seviyesini gösteren göreceli GUS aktivitesi (GUS/Lusiferaz), (F)'de gösterilmektedir. Veriler, üç biyolojik kopyanın ortalama ± SD'sidir (Ek Veri Seti 1). Küçük harfler önemli farklılıkları gösterir (tek yönlü ANOVA, P 5 0.01).

Patojenin tetiklediği EIJ1'in kloroplasttan ayrışması, EIJ1'in sitoplazmada potansiyel bir fonksiyonu olduğunu gösterir. Bu olasılığı test etmek için, kloroplast hedefleme dizisini (CTS; Lee ve diğerleri, 2008) EIJ1-mCherry raportör geninin N-terminal ucuna bağlayarak EIJ1 proteinini kloroplastlar üzerinde hareketsiz hale getirdik. Daha sonra CTS-EIJ1-mCherry füzyonu, yerel promoterin kontrolü altında N. benthamiana yapraklarında ifade edildi. Floresans yalnızca kloroplastlarda tespit edildi ancak Pst DC3000-aşılanmış N. benthamiana yapraklarının sitozolünde ve çekirdeğinde tespit edilmedi (Ek Şekil 12A). Bu gözlem, CTTagged EIJ1'in kloroplastta tutulduğunu ve patojen enfeksiyonu nedeniyle sitoplazmaya zorlanmadığını doğruladı. Daha sonra, bitki bağışıklık tepkisinde CTS-EIJ1'in biyolojik fonksiyonunu değerlendirmek için EIJ1pro: CTS-EIJ1-6HA transgenik Arabidopsis soylarını oluşturduk. Beklendiği gibi, eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA'nın aksine, eij1-1 EIJ1pro: CTS-EIJ1-6HA hatları, diğer hatlarla karşılaştırıldığında patojenlere karşı direnç açısından önemli bir fark göstermedi. eij1-1, kloroplastta hareketsiz hale getirilen EIJ1'in eij1-1'nin hastalık direnci fenotipini kurtaramadığını gösterir (Şekil 6C). Bu gözlemle tutarlı olarak, PR1'in ifadesi, eij1-1 EIJ1pro: CTSEIJ1-6HA transgenik bitkilerinde, eij1-1'ye benzer şekilde yüksek bir seviyede tutuldu (Ek Şekil 12B). Ek olarak CTS-EIJ1, EDS1 transkripsiyon aktivitesini EIJ1'e göre daha az baskılama yeteneği sergiledi (Şekil 6, D ve E). Bu sonuçlar, patojen enfeksiyonuna karşı erken konak tepkisinin, EIJ1'in hücre içi yeniden lokalizasyonunu tetiklediği, bunun da EDS1'in çekirdeğe geçişini baskılayarak bağışıklık tepkisini modüle ettiği sonucuna varmamıza yol açtı.

EIJ1 virülans efektörünün tetiklediği yanıtı düzenler

Tip III salgılama sistemi tarafından salgılanan P. syringae'nin AvrRps4 efektör proteini, EDS1'e bağlı olan ETI'yi başlatmak için TIR-NB-LRR reseptörü RPS4 tarafından tanınır (Gassmann ve diğerleri, 1999; Wirthmueller ve diğerleri, 2007; Heidrich ve diğerleri, 2012). EIJ1'in ETI'ye dahil olup olmadığını değerlendirmek için eij1-1 yapraklarını avirülent Pst DC3000 (AvrRps4) veya virülan Pst DC3000 ile aşıladık. eij1-1 yaprakları öldürücü Pst DC3000'e karşı Col-0 yapraklarından daha fazla direnç gösterdi (Şekil 7A). Bununla birlikte, Col-0 ve eij1-1 yaprakları arasında avirulent Pst DC3000'e (AvrRps4) karşı direnç açısından önemli bir fark gözlenmedi, ancak her iki genotip de avirulent Pst DC3000'e (AvrRps4) Pst DC3000'e göre daha fazla direnç gösterdi (AvrRps4) Şekil 3, F ve G; Şekil 7, A), EIJ1'in RPS{27}} kaynaklı ETI için gerekli olmayabileceğini göstermektedir. Ayrıca bitkilerin, kusurlu bir tip III salgılama sistemini barındıran ve PTI'yi baskılamak için konakçı hücrelere efektörler enjekte edemeyen Pst DC3000 hrcC'ye karşı direncini de belirledik (Gassmann ve diğerleri, 1999; Gloggnitzer ve diğerleri, 2014). Hem eij1-1 mutantı hem de Col-0 yaprakları, Pst DC3000 hrcC'ye karşı benzer direnç gösterdi (Ek Şekil 13), bu da EIJ1'in PTI'ye dahil olmadığını gösteriyor.

EDS1'in nükleer birikiminin, savunma gen ekspresyonu ve direncinin TIR-NB-LRR ile indüklenen yeniden programlanması için vazgeçilmez olduğu göz önüne alındığında (Garcı'a ve diğerleri, 2010), EIJ1'in hücre içi dağılımı düzenleyip düzenlemediğini inceledik. ETI'ye yanıt olarak EDS1'in. 3-haftalık eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG ve eij1-1 eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG bitkilerinin yaprakları aşılandı Pst DC3000 veya Pst DC3000 (AvrRps4) ile ve çekirdekleri tükenmiş ve çekirdekleri zenginleştirilmiş fraksiyonlar 0 ve 4 hp'de ekstre edildi. Önceki çalışmayla tutarlı olarak (Garcı´a ve diğerleri, 2010), Pst DC3000 (AvrRps4) ile aşılanan eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG bitkilerinde EDS1'in nükleer lokalizasyonunda bir artış gözlemlendi, ancak Pst DC3000 ile aşılanmış olanlarda bu durum söz konusu değildir. Bununla birlikte, EIJ1'in fonksiyon kaybı, EDS1'in ETI kaynaklı nükleer birikimini etkilemedi (Şekil 7B; Ek Dosya 2'deki kopyalara bakınız). Bu, avirulent Pst DC3000'in (AvrRps4), EIJ1'i atlayarak çekirdeğe EDS1 kaçakçılığını tetiklediğini veya EIJ1'in işlevini bilinmeyen bir şekilde ortadan kaldırdığını göstermektedir. Bu olasılıkları test etmek için avirulent Pst DC3000'in (AvrRps4) EIJ1 düzeyi üzerindeki etkisini inceledik. EIJ1 aşırı ekspresyon çizgileri (Şekil 2H) kullanılarak elde edilen sonuçlara benzer şekilde, Pst DC3000 ile aşılanan eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA bitkileri, enfeksiyonun erken bir aşamasında EIJ1 birikiminde artış gösterdi, ancak EIJ1 kademeli olarak azaldı 8 hpi'den sonra bozuldu (Şekil 7C; Ek Dosya 2'deki kopyalara bakın). EIJ1'in birikmesi, Pst DC{58}}ile tetiklenen EDS1'in erken enfeksiyon aşamasında çekirdeğe akışını önlemek için yeterlidir (Şekil 5, D ve 7, B). Bu sonuçla tutarlı olarak, EIJ1'in fonksiyon kaybı, enfekte bitkilerde EDS1'in nükleer translokasyonunu hızlandırdı (Ek Şekil 14). Buna karşılık, Pst DC3000 (AvrRps4), EIJ1 protein bozulmasını hızla indükleyerek EIJ1 fonksiyonunu ortadan kaldırdı, ancak EIJ1 gen transkripsiyonunu baskılayarak değil (Şekil 7C; Ek Şekil 15), böylece enfeksiyonun erken aşamasında EDS1'in daha fazla nükleer translokasyonunu teşvik etti (Şekil 7B). ). Pst DC3000 ile aşılanan eij1-1 bitkilerinin, avirulent Pst DC3000 (AvrRps4) ile aşılanan Col-0 ve eij1-1 bitkileriyle karşılaştırılabilir direnç sergilediği gözlemi, bu hipotezi desteklemektedir. Bu, en azından bir dereceye kadar, neden virülan suşun değil de avirülent suşun, ETI yanıtını tetiklemek için güçlendirilmiş direnci monte edebildiğini açıklayabilir. Bu nedenle, bu gözlemler EIJ1'in konakçı hücrelerde virülans efektörünün tetiklediği yanıtta rol oynadığını göstermektedir.

Şekil 6 EIJ1'in sitoplazmaya yeniden lokalizasyonu EDS1-bağımlı direnç için gereklidir. (A) Pst DC3000 enfeksiyonu, EIJ1'in hücre altı lokalizasyonunu değiştirir. EIJ1-mCherry, Pst DC3000 (OD600=0.1) ile kısırlaştırılan veya 24 saat boyunca sahte aşılanan N. benthamiana yapraklarında geçici olarak ifade edildi. Çubuk=10 lm. (B) Pst DC3000 enfeksiyonu, EIJ1'in kloroplasttan ayrılmasını tetikler. Toplam proteinler, sitoplazmik proteinler ve kloroplastik proteinler, Pst DC3000 (OD600=0.1) ile daldırma aşılanmış veya sahte aşılanmış 3-haftalık EIJ1pro: EIJ1-6HA bitkilerinden ekstre edilmiştir. 4 hpi'de ve anti-HA antikoru tarafından tespit edildi. PEPC, histon H3 ve RbcL sırasıyla sitoplazmik, nükleer ve kloroplastik belirteçler olarak kullanıldı. Sahte tedavi ile proteinlerin göreceli yoğunluğu 1'e ayarlanmıştır. (A) ve (B)'de sunulan sonuçlar bağımsız olarak üç kez tekrarlanmıştır (Ek Dosya 2). (C) Kloroplastlarda hareketsizleştirilmiş EIJ1, eij1-1 direncini eski haline getiremiyor. Üç haftalık bitkilere Pst DC3000 (OD600=0.05) ile daldırma aşısı yapıldı. 0 ve 5 dpi'de Pst DC3000'in bakteriyel titresi belirlendi. CTS, kloroplast lokalizasyon sinyalleri. Veriler, üç biyolojik kopyanın ortalama ± SD'sidir (Ek Veri Seti 1). (D) ve (E) EIJ1, CTS-EIJ1 ve EDS1 tarafından düzenlenen PR promoter aktivitesinin geçici analizi. Geçici ekspresyon analizlerinde kullanılan çeşitli yapılar (D)'de gösterilmektedir. PR1pro: GUS, efektörler veya boş vektör (Kontrol) ile birlikte, 24 saat boyunca Pst DC3000 (OD600=0.1) ile kısırlaştırılan N. benthamiana yapraklarına dönüştürüldü. Çeşitli efektörler tarafından düzenlenen PR1'in ekspresyon seviyesini gösteren nispi GUS aktivitesi (GUS/Lusiferaz), (E)'de gösterilmektedir. Hata çubukları, üçlü bağımsız numunelerin standart sapmasını temsil eder. Veriler, üç biyolojik kopyanın ortalama ± SD'sidir. Küçük harfler önemli farklılıkları gösterir (tek yönlü ANOVA, P 5 0.01, Ek Veri Kümesi 1).

Şekil 7 EIJ1 ve EDS1 bitkinin bazal direncini modüle eder. (A) Col ve eij1-1 mutantının bakteriyel büyümesi. Üç haftalık bitkilere Pst DC3000 veya Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.05) ile daldırma aşısı yapıldı. 0 ve 5 dpi'de Pst DC3000'in bakteriyel titresi belirlendi. Veriler, üç biyolojik kopyanın ortalama ± SD'sidir. Küçük harfler önemli farklılıkları gösterir (tek yönlü ANOVA, P 5 0.01, Ek Veri Kümesi 1). (B) EIJ1, çekirdeklerde Pst DC3000 (AvrRps4) ile tetiklenen EDS1 birikimini pek etkilemez. Çekirdekleri tükenmiş fraksiyonlar ve çekirdekleri zenginleştirilmiş fraksiyonlar, 3-haftalık eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG ve eij1-1 eds1-22 EDS1pro'dan çıkarıldı: EDS1-3FLAG transgenik bitkileri, Pst DC3000 (OD600=0.1), Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1) ile daldırılarak aşılanmış veya 4 hpi'de aşılanmış sahte aşılanmış ve kullanılarak tespit edilmiştir. bir anti-FLAG antikoru. PEPC ve histon H3 sırasıyla sitoplazmik ve nükleer belirteçler olarak kullanıldı. Sahte tedavi uygulanan bitkilerden elde edilen proteinlerin nispi yoğunluğu, 1. M, sahte; P, Pst DC3000; R, Pst DC3000 (AvrRps4). (C) Pst DC3000 (AvrRps4) enfeksiyonu, EIJ1 proteininin bozulmasını teşvik eder. Toplam proteinler, Pst DC3000 veya Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1) ile daldırma aşılanmış 3-haftalık eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA bitkilerinden ekstre edildi. ve bir anti-HA antikoru kullanılarak tespit edildi. Alt panel, yükleme kontrolü olarak Coomassie Brilliant Blue (CBB) ile boyamayı gösterir. (B) ve (C)'de sunulan temsili sonuçlar bağımsız olarak iki kez daha tekrarlandı ve yükleme kontrolü olarak bir anti-ACTIN antikoru ile araştırıldı (Ek Dosya 2). (D) EDS{67}}bağımlı bitki bazal direncini düzenleyen EIJ1'in varsayımsal modeli. Bitkiler patojenler tarafından istila edildiğinde, EIJ1 kloroplasttan hızla sitoplazmaya salınır ve burada EDS1 ile etkileşime girer. EIJ1-EDS1 etkileşimi, EDS1'in sitoplazmadan çekirdeğe taşınmasını önler ve böylece EDS1'in nükleer direncini kısıtlayarak EDS{74}}aracılı bağışıklık tepkilerinin modülasyonuna olanak tanır. Oklu ve kör çizgiler sırasıyla aktivasyonu ve baskıyı gösterir.

Tartışma

Hayatta kalmayı en üst düzeye çıkarmak için bitkiler, büyümeyi optimize etmek ve istilacı patojenlere karşı savunma yapmak için kesin bir mekanizma geliştirmiştir, ancak bu mekanizmaların birçok ayrıntısı belirsizliğini korumaktadır. EDS1, biyotrofik ve hemibiotrofik patojenlere karşı direnci düzenlediği için bitkinin doğuştan gelen bağışıklık sinyalleme ağında önemli bir konuma sahiptir (Wiermer ve diğerleri, 2005). Bu çalışmada, bir şaperon DnaJ proteinini kodlayan bir gen olan EIJ1'i tanımladık ve EIJ1'in erken patojen enfeksiyonuna duyarlı olduğunu ve EDS1 ile doğrudan etkileşime girerek bitkinin doğal bağışıklığında rol oynadığını gösterdik. Bu bulgulara dayanarak EIJ1 için düzenleyici bir model öneriyoruz (Şekil 7D). Bitkiler patojenler tarafından istila edildiğinde EIJ1, kloroplasttan sitoplazmaya hızla salınır ve burada EDS1 ile etkileşime girer. Bu EIJ1–EDS1 etkileşimi, EDS1'in sitoplazmadan çekirdeğe taşınmasını önler ve bu, EDS1'in nükleer direncini kısıtlayarak, SA biyosentezinin indüksiyonu ve direnç ifadesi gibi EDS1-aracılı bağışıklık tepkilerinin modülasyonuna izin verir -ilişkili genler. Bitkiler istilacı patojenlerden sürekli uyaranlara maruz kaldığında, EIJ1 yavaş yavaş bozulur ve direnç takviyesi için EDS1'in nükleer birikiminin artmasına yol açar. Bu bulgular, patojen istilasına karşı erken konak tepkisi sırasında EIJ1'in önemli bir baskıcı rolünü göstermektedir ve EDS1'in hücre altı lokalizasyonunun direnç sağlamak üzere nasıl düzenlendiğine dair anlayışımızdaki boşluğu doldurmaktadır.

Dizi analizi, EIJ1'in bir DnaJ proteini olduğunu ortaya çıkardı. Arabidopsis genomu yedi farklı klasik DnaJ proteini tipini kodlar (Pulido ve Leister, 2018). Önceki çalışmalar, DnaJ proteinlerinin bitki bağışıklığında önemli ve farklı roller oynadığını göstermektedir. Örneğin soya fasulyesi (Glycine max) GmHSP40, hücre ölümünü ve hastalık direncini olumlu yönde düzenler (Liu ve Whitham, 2013). Buna karşılık, pirinç (Oryza sativa L.) Os-DjA6 proteini, her yerde bulunmanın aracılık ettiği proteazom bozunma yolu yoluyla bitkide doğuştan gelen bağışıklığı olumsuz yönde düzenler (Zhong ve diğerleri, 2018). Bir J alanı içeren P. syringae'ye özgü Hopl1 virülans efektörü, bitkinin stres-tepki mekanizmasıyla etkileşime girdiği kloroplastı hedef alır (Jelenska ve diğerleri, 2007). Bu çalışmalar, DnaJ proteinlerinin bitki savunma tepkisinde farklı roller oynadığını göstermektedir. EIJ1'e homolog olan bir N. tabacum DnaJ proteini olan Tsip1, strese yanıt olarak genlerin Tsi1- aracılı transkripsiyonel aktivasyonunu düzenler (Ham ve diğerleri, 2006). Tsi1, N. tabacum'da hem biyotik hem de abiyotik stres yanıtlarında önemli bir düzenleyici olarak işlev gören APETALA2 (AP2) tipi bir transkripsiyon faktörünü kodlar (Park ve diğerleri, 2001). SA, Tsip1'in kloroplasttan sitoplazmaya yeniden lokalizasyonunu tetikler; bu, Tsip1 ve Tsi1 arasındaki etkileşimi ve ardından stresle ilişkili genlerin transkripsiyonel aktivasyonu için Tsip1-Tsi1 kompleksinin çekirdeğe girişini kolaylaştırır (Ham ve diğerleri, 2006). . Bu çalışmada Tsip1'den farklı olarak EIJ1 normal koşullar altında kloroplast ve çekirdeğe lokalize edildi. Patojen enfeksiyonunun, EIJ1'in kloroplasttan sitoplazmaya yeniden lokalizasyonunu tetiklediğini ve sitoplazmada EIJ1 ile EDS1 arasındaki etkileşimin, EDS{32}}aracılı nükleer direnci inhibe ettiğini gösterdik. Bu bulguyla tutarlı olarak, işlev kaybı olan eij1mutant, patojenlere karşı vahşi tipten (Col-0) daha güçlü bir direnç sergiledi. Bu, EIJ1'in bitkide doğuştan gelen bağışıklıkta olumsuz bir rol oynadığını doğrulamaktadır. Önceki çalışmalara göre, EDS1'in koordineli nükleer ve sitoplazmik aktiviteleri, bitkilerin patojenlere karşı doğuştan gelen bağışıklık tepkisini tamamlaması için gereklidir (Garcı'a ve diğerleri, 2010; Heidrich ve diğerleri, 2011). EDS1'in nükleer lokalizasyonu, SA ile ilişkili ve diğer bitki savunma tepkilerini indüklemek amacıyla TNL'nin neden olduğu direncin transkripsiyonel yeniden programlanması için gereklidir (Wirthmueller ve diğerleri, 2007). Patojenlere karşı tam direnç sağlamak için enfeksiyon süreci boyunca sitoplazmik EDS1 havuzu da korunur (Garcı'a ve diğerleri, 2010). Bu gözlemler, bitkilerin patojen enfeksiyonuna maruz kaldıklarında uygun savunma tepkileri için sitoplazma ve çekirdek arasındaki EDS1 tahsisini tam olarak nasıl düzenlediğine ilişkin önemli bir endişeye yol açmaktadır. Burada, EDS1'in farklı hücre altı bölmelere kesin tahsisinin kısmen protein-protein etkileşimi yoluyla EIJ1 tarafından düzenlendiğini gösteriyoruz. EIJ1'in fonksiyon kaybı mutasyonu, EDS1'in çekirdeğe taşınmasını belirgin şekilde destekledi (Şekil 5, D ve 7, B), bu da hastalık direncinin artmasına yol açtı.

EIJ1, patojen enfeksiyonunun erken bir aşamasında hızlı bir şekilde uyarıldığından ve daha sonra hastalık gelişimi sırasında bozulduğundan, EIJ1'in, bitkilerin optimal savunmalarını geliştirmelerine olanak tanıyan önemli bir negatif bağışıklık düzenleyicisi olduğunu düşünüyoruz. EDS1 aktivitesinin EIJ1-aracılı baskılanması, patojenik bakterilerin ara sıra yaptığı saldırılar gibi kısa süreli uyarılara karşı gereksiz bağışıklık tepkilerinin ortaya çıkmasını önleyebilir. Alternatif olarak patojenik bakteriler, muhtemelen virülan efektörler salgılayarak EIJ1'in kloroplasttan ayrılmasını tetikleyerek konakçının bağışıklığını manipüle edebilir. EIJ1'in kloroplastta bilinmeyen bir işlev gerçekleştirme olasılığını göz ardı edemedik. Bildiğimiz gibi, biyotrofik patojenlere karşı dirençte rol oynayan bir bitki hormonu ve sinyal molekülü olan SA, öncelikle kloroplastta biyosentezlenir ve daha sonra çoklu ilaç ve toksin taşıyıcısı olan EDS5 tarafından sitoplazmaya aktarılır (Serrano ve diğerleri, 2013). EIJ1, patojen aşılaması üzerine SA biyosentetik geni ICS1'in ekspresyonunu aşağı regüle ettiğinden muhtemelen SA birikiminin negatif bir düzenleyicisidir (Şekil 4E). EDS1 ile etkileşimi yoluyla EIJ1-aracılı transkripsiyonel baskılamaya ek olarak, EIJ1'in SA biyosentezinde veya SA'nın kloroplasttan tanımlanamayan bir şekilde taşınmasında da doğrudan bir rol oynaması mümkündür. Gelecekte yapılacak bir çalışmada EIJ1 ve SA biyosentez sürecinin bağlantılı olduğunun bulunması şaşırtıcı olmayacaktır. İlginç bir şekilde EIJ1 de çekirdeğe lokalize oldu. Her ne kadar EIJ1 çekirdekte EDS1 ile etkileşime girmemiş olsa da, muhtemelen temel kofaktörlerin veya modifikasyonların eksikliğinden dolayı, çekirdeğe lokalize EIJ1'in fonksiyonu daha fazla araştırmaya değerdir.

cistanche tubulosa-bağışıklık sistemini iyileştirir

Patojenik bakteriler, PRR'ler gibi patojen direnç proteinlerini hedefleyerek konağın PTI'sini alt üst etmek için hücre içi efektörler üretirken, bitki sitoplazmik NOD benzeri reseptörler, ETI'yi başlatmak için bu efektörleri algılar (Dou ve Zhou, 2012; Khan ve diğerleri, 2016). Önceki çalışmalar ve sonuçlarımız, avirulent Pst DC3000'in (AvrRps4), sitoplazmik EDS1'in çekirdeğe geçişini desteklediğini gösterdi (Garcı'a ve diğerleri, 2010). Ayrıca, sonuçlarımız Pst DC3000 (AvrRps4) ile tetiklenen EDS1 nükleer birikiminde ve ardından Col-0 ve eij1-1 mutant bitkileri arasındaki patojen direncinde önemli bir fark olmadığını gösterdi (Şekil 7, A ve B) . Ek olarak eij1-1 mutantının sergilediği direnç, tip III salgılama sistemi arızalı Pst DC3000 hrcC suşu ile aşılanan Col-0 bitkilerinin sergilediği dirençle karşılaştırılabilir düzeydeydi (Ek Şekil 12). Ayrıca, EIJ1 birikimi, avirülent Pst DC3000 (AvrRps4) ile aşılanmış bitkilerde, virülan Pst DC3000 (Şekil 7C) ile aşılanmış bitkilere göre belirgin şekilde daha düşüktü; bu, EIJ1'in, konakçı hücrelerde virülans efektörünün tetiklediği bağışıklık tepkisinin önemli bir düzenleyicisi olduğunu gösterir. Çünkü Pst DC3000-aşılanmış eij1-1 bitkileri, Pst DC3000 (AvrRps4) ile aşılanmış Col-0 bitkilerinin direnç fenotipini taklit etmiştir (Şekil 3, F, G, 4, C, D ve 7, A), EIJ1, ETI'nin virülan suşlar tarafından indüklenmesini önlemek için bir bariyer görevi görebilir. Sonuç olarak, bir şaperon DnaJ proteini olan EIJ1'i belirledik ve bunun bitki patojenlerine karşı erken bir bağışıklık tepkisinde rol oynadığını gösterdik. EIJ1 ve EDS1 arasındaki etkileşim, muhtemelen ya gereksiz bitki bağışıklık tepkileri tarafından kısa süreli uyarımı önlemek, bir manipülasyon mekanizması yoluyla patojenik istilayı kolaylaştırmak için ya da her ikisini birden yapmak için EDS1'in nükleer kaçakçılığını baskılar. Altta yatan mekanizmadan bağımsız olarak EIJ1 aleli, hastalığa dirençli yetiştirmede bitkinin doğuştan gelen bağışıklığının modifikasyonu için etkili bir potansiyel hedef olarak kullanılabilir. EIJ1 bitkilerin normal büyümesini etkilemediğinden, genom düzenleme yoluyla EIJ1 fonksiyonunun zayıflatılması, büyüme üzerinde çok az etkiyle mahsullerin hastalık direnci seviyesini belirgin şekilde yükseltebilir.

Referanslar

Alvarez, ME, Pennell, RI, Meijer, PJ, Ishikawa, A, Dixon, RA, Lamb, C (1998) Reaktif oksijen ara maddeleri, bitki bağışıklığının kurulmasında sistemik bir sinyal ağına aracılık eder. Hücre 92: 773–784

An, C, Mou, Z (2011) Salisilik asit ve bitki bağışıklığında işlevi. J Integr Bitki Biol 53: 412–428

Armbruster, U, Carrillo, LR, Venema, K, Pavlovic, L, Schmidtmann, E, Kornfeld, A, Jahns, P, Berry, JA, Kramer, DM, Jonikas, MC (2014) İyon antiport, dalgalanan ışıkta fotosentetik iklimlendirmeyi hızlandırır ortamlar. Nat Komün 5: 5439

Bartsch, M, Gobbato, E, Bednarek, P, Debey, S, Schultze, JL, Bautor, J, Parker, JE (2006) Arabidopsis bağışıklığında ve hücre ölümünde salisilik asitten bağımsız GELİŞMİŞ HASTALIK DUYARLILIĞI1 sinyali, monooksijenaz FMO1 tarafından düzenlenir ve Nudix hidrolaz NUDT7. Bitki Hücresi 18: 1038–1051

Ben Rejeb, K, Lefebvre-De Vos, D, Le Disquet, I, Leprince, AS, Bordenave, M, Maldiney, R, Jdey, A, Abdelly, C, Savoure´, A (2015) NADPH oksidazlar tarafından üretilen hidrojen peroksit Arabidopsis thaliana'da tuz veya mannitol stresi sırasında prolin birikimini arttırır. Yeni Phytol 208: 1138–1148

Bukau, B, Weissman, J, Horwich, A (2006) Moleküler şaperonlar ve protein kalite kontrolü. Hücre 125: 443–451

Caplan, J, Padmanabhan, M, Dinesh-Kumar, SP (2008) Bitki NB-LRR bağışıklık reseptörleri: tanımadan transkripsiyonel yeniden programlamaya. Hücre Konağı Mikrop 3: 126–135 10.1016/j.chom.2008.02.010

Dodds, PN, Rathjen, JP (2010) Bitki bağışıklığı: bitki-patojen etkileşimlerinin bütünleşik bir görünümüne doğru. Nat Rev Genet 11: 539–548

Dou, D, Zhou, JM (2012) Konakçı bağışıklığını bozan fitopatojen efektörleri: farklı düşmanlar, benzer savaş alanı. Hücre Konağı Mikrop 12: 484–495

Du, Y, Zhao, J, Chen, T, Liu, Q, Zhang, H, Wang, Y, Hong, Y, Xiao, F, Zhang, L, Shen, Q (2013) Tip I J-alanı NbMIP1 proteinleri Hem Tütün mozaik virüsü enfeksiyonu hem de bitkinin doğuştan gelen bağışıklığı için gereklidir. PLoS Pathog 9: e1003659

Fan, H, Hu, Y, Tudor, M, Ma, H (1997) AG'nin K alanları ile DNA bağlayıcı proteinlerin MADS alanı ailesinin üyeleri olan AGL'ler arasındaki spesifik etkileşimler. Bitki J 12: 999–1010

Feys, BJ, Moisan, LJ, Newman, MA, Parker, JE (2001) Arabidopsis hastalığı direnci sinyal proteinleri EDS1 ve PAD4 arasındaki doğrudan etkileşim. EMBO J 20: 5400–5411

Garcı'a, AV, Blanvillain-Baufume', S, Huibers, RP, Wiermer, M, Li, G, Gobbato, E, Rietz, S, Parker, JE (2010) EDS1'in dengeli nükleer ve sitoplazmik aktiviteleri, Bitkinin doğuştan gelen bağışıklık tepkisini tamamlayın. PLoS Pathog 6: e1000970

Gassmann, W, Hinsch, ME, Staskawicz, BJ (1999) Arabidopsis RPS4 bakteriyel direnç geni, hastalığa dirençli genlerin TIR-NBS-LRR ailesinin bir üyesidir. Bitki J 20: 265–277

Gloggnitzer, J, Akimcheva, S, Srinivasan, A, Kusenda, B, Riehs, N, Stampfl, H, Bautor, J, Dekrout, B, Jonak, C, Jime'nez-Go'mez, JM (2014) Saçma- aracılı mRNA bozunması, bitkinin antibakteriyel savunmasını düzenlemek için bağışıklık reseptörü seviyelerini modüle eder. Hücre Konağı Mikrobu 16: 376–390

Ham, BK, Park, JM, Lee, SB, Kim, MJ, Lee, IJ, Kim, KJ, Kwon, CS, Paek, KH (2006) DnaJ tipi bir Zn parmak proteini olan Tobacco Tsip1, işe alınır ve potansiyelini artırır Tsi1-aracılı transkripsiyonel aktivasyon. Bitki Hücresi 18: 2005–2020

Heidrich, K, Blanvillain-Baufume', S, Parker, JE (2012) NB-LRR reseptör sinyallemesinde moleküler ve uzaysal kısıtlamalar. Curr Opin Bitki Biol 15: 385–391

Heidrich, K, Wirthmueller, L, Tasset, C, Pouzet, C, Deslandes, L, Parker, JE (2011) Arabidopsis EDS1, patojen efektör tanımayı hücre bölmesine özgü bağışıklık tepkilerine bağlar. Bilim 334: 1401–1404

Hu, Y, Zhou, L, Huang, M, He, X, Yang, Y, Liu, X, Li, Y, Hou, X (2018) Gibberellinler, Arabidopsis'in geç embriyogenezinde önemli bir rol oynar. Nat Bitkiler 4: 289–298

Huang, M, Hu, Y, Liu, X, Li, Y, Hou, X. (2015) Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1, FİTOKROM ETKİLEŞİM FAKTÖRÜ4 ile etkileşime girerek embriyonik sonrası gelişime aracılık eder. Bitki Hücresi 27: 3099–3111

Jelenska, J, Yao, N, Vinatzer, BA, Wright, CM, Brodsky, JL, Greenberg, JT (2007) Pseudomonas syringae'nin AJ alanı virülans efektörü, konakçı kloroplastları yeniden şekillendirir ve savunmayı bastırır. Curr Biol 17: 499–508

Jones, J, Dangl, J (2006) Bitki bağışıklık sistemi. Doğa 444: 323–329

Khan, M, Subramaniam, R, Desveaux, D (2016) Muhafızlar, tuzaklar, yemler ve tuzaklar: tip III efektör sensörleri ile bitkilerde patojen algısı. Curr Opin Microbiol 29: 49–55

Kinkema, M, Fan, W, Dong, X (2000) PR gen ifadesinin aktivasyonu için NPR1'in nükleer lokalizasyonu gereklidir. Bitki Hücresi 12: 2339–2350

Koch, E, Slusarenko, A (1990) Arabidopsis tüylü küf mantarının neden olduğu enfeksiyona karşı hassastır. Bitki Hücresi 2: 437–445

Lam, E, Kato, N, Lawton, M (2001) Programlanmış hücre ölümü, mitokondri ve bitkinin aşırı duyarlı tepkisi. Doğa 411: 848–853

Lee, DW, Kim, JK, Lee, S, Choi, S, Kim, S, Hwang, I (2008) Arabidopsis nükleer kodlu plastid transit peptidleri, farklı kloroplast hedefleme sekans motiflerine sahip çok sayıda sekans alt grubu içerir. Bitki Hücresi 20: 1603–1622