Cistanche Tubulosa Ekstraktlarının Streptozotosin-Nikotinamid İle İndüklenen Diyabetik Sıçanlarda Erkek Üreme Fonksiyonu Üzerine Etkisi-Ⅰ

1. Giriş

Diabetes Mellitus (DM), diyabetin arttığı bir durumdur.glikoz seviyeleriPankreasın yeterli miktarda insülin üretememesi veya vücudun bunu etkili bir şekilde kullanamaması nedeniyle kanda. Dünya Sağlık Örgütü'ne göre diyabetli kişilerin sayısı 1980'de 108 milyondan 2014'te 422 milyona yükseldi. Dört ana kategori vardır: pre-diyabet (diyabetten önceki bir aşama), tip 1 (pankreasın insülin üretemediği), tip 2 (vücudun insülini kullanamadığı) ve gebelik diyabeti (hamilelik sırasında ortaya çıkan). Oksidatif stres, reaktif oksijen türlerinin (ROS) ve antioksidanların [2] üretimi arasındaki dengesizlik nedeniyle ortaya çıkar ve sonuçta diyabetik duruma yol açar. Diyabetin komplikasyonları arasında böbrek yetmezliği, sinir hasarı, körlük, felç, kalp krizi, fetal ölüm ve kısırlık yer alır. [1] Çalışmalar erkek diyabetik hastalarda sperm çekirdeğinin, deoksiribonükleik asidin (DNA) ve mitokondrinin önemli ölçüde hasar gördüğünü göstermektedir (3). Spermin taşınması sırasındaki oksidatif stres, erkek üreme sisteminin sürecini değiştirecektir [4,5].

CİNSEL FONKSİYONU GELİŞTİREN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Spermatogenez süreci hipotalamus-hipofiz-gonadal (HPG) ekseni tarafından kontrol edilir. Hipotalamus tarafından üretilen gonadotropin salgılatıcı hormon (GnRH), luteinize edici hormon (LH) ve folikül uyarıcı hormonun (FSH) üretimini uyarır. Leydig hücreleri seminifer tübülün yakınında bulunur vetestosteron üretmekLH'nin kontrolü altındadır. FSH, erkeklik hormonunun geçişine yardımcı olan antijen bağlayıcı proteinin (ABP) üretimini tetikler. Dolayısıyla kısırlık ve diğer sorunlar çoğunlukla HPG ekseninde meydana gelen rahatsızlıklardan dolayı ortaya çıkar. Streptozotosin-nikotinamid kombinasyonunun uygulanması deney sıçanlarında diyabeti tetikledi. Streptozotosin, pankreastaki insülin üreten hücreler için toksik olan kimyasal bir bileşiktir ve nikotinamid, hücreleri tam hasardan koruyan, suda çözünebilen bir vitamindir.

Cistanche tubulosa, "Rou Cong-Rong" olarak da bilinen bir çöl bitkisidir [7]. Esas olarak Calotropis procera ağacının kökünde yetişen ve Gansu, Qinghai, Sincan, Moğolistan, İran ve Hindistan'ın kurak topraklarında yaygın olarak dağıtılan, klorofil olmayan parazit bir bitkidir. Cistanche tubulosa'nın ortak adı "Çöl Sümbülü"dür. Geleneksel Çin tıbbında yaygın olarak kabul görmektedir ve "Çöl Ginseng'i" adı verilmiştir. Tıbbi alanda hastalıklı lökore, aşırı metroraji, kronik böbrek hastalıkları, kabızlık, iktidarsızlık ve kısırlığın tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Kimyasal bileşenleriCistanche tubulosa uçucu olmayan feniletanoid glikozitlerden oluşur(PHG'ler), iridoidler, lignanlar, uçucu yağlar, alditoller, oligosakkaritler ve polisakkaritler [8]. Araştırmalar gösteriyor kiekinekozitBu bitkiden elde edilen ROS seviyelerini düzenleyerek hasarlı fibroblastı korur [9]. Bu bileşik, nöroproteksiyon ve osteoporozun önlenmesi ile birlikte antioksidan, vazorelaksasyon ve anti-inflamatuar aktiviteler üretir [10,11].

Bu çalışma, etkisini araştırmayı amaçlamıştır.Cistanche tubulosa özüStreptozotosin-nikotinamid kaynaklı diyabetik sıçanın üreme fonksiyon bozukluğu üzerinde ECH içeren.

2. Malzemeler ve Yöntemler

2.1. Malzemeler

ECH ve CTE, Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd'den (Yilan, Tayvan) satın alındı. Gelişmiş glikasyon son ürünleri (AGE'ler), Biovision'dan (San Francisco, CA, ABD) satın alındı. LC-540 ve TM3 hücre dizileri Gıda Endüstrisi Araştırma ve Geliştirme Enstitüsü'nden (Hsinchu, Tayvan) satın alındı. Beş haftalık Sprague-Dawley (SD) erkek sıçanları, Ulusal Laboratuvar Hayvanları Merkezi'nden (Taipei, Tayvan) satın alındı. Feed Lab Diet®, PMI Nutrition International, Inc.'den (Taipei, Tayvan) satın alınmıştır. 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH), Sigma'dan (St. Louis, MO, ABD) elde edildi. Metanol ve 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) de Sigma'dan satın alınmıştır. Dulbecco'nun değiştirilmiş Eagle ortamı/F12 ve trypsin-EDTA, GIBCO'dan (New York, NY, ABD) elde edildi. 3-(4, 5-dimetiltiyazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolyum bromür (MTT), dikloro-dihidro-floresein diasetat (DCFH-DA), dimetil sülfoksit (DMSO) ve nitromavi tetrazolyum (NBT) Sigma'dan satın alındı. Glikoz enzimatik kitleri Kyokutoseiyaku, Tokyo, Japonya'dan temin edildi. İnsülin ELISA kitleri Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A'dan (Uppsala, İsveç) satın alınmıştır. T-PER Doku Proteini Ekstraksiyon Reaktifi Thermo Scientific'ten (Chicago, IL, ABD) satın alınmıştır. Anti-insan/Fare/Sıçan nükleer faktör-kappa B NF-κB poliklonal antikorları, Santa Cruz Bioteknoloji, Santa Cruz, CA, ABD'den satın alınmıştır. Gelişmiş glikasyon son ürünleri (RAGE) poliklonal antikorları için Anti-Fare/Sıçan reseptörü, anti-İnsan/Fare/Sıçan StAR poliklonal antikorları ve anti-İnsan/Fare/Sıçan Sitokrom P450 17A1 monoklonal antikorları Gene'den satın alınmıştır. Tex (Irvine, CA, ABD). Anti-İnsan/Fare/Sıçan CYP11A1 poliklonal antikorları, Cell Signaling Technology'den (Beverly, PA, ABD) elde edildi. Easy-Blue reaktifi Invitrogen, Thermo Fisher Scientific'ten (Carlsbad, CA, ABD) satın alındı. Agaroz ve 100 bp'lik DNA işaretçisi Promega, Corporation'dan (Madison, WI, ABD) elde edildi. RNeasy Lipid Tissue Mini Kit, QIAGEN, Hilden, Almanya'dan satın alındı.

CİNSEL FONKSİYONU GELİŞTİREN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.2. Yöntemler

2.2.1. İn Vitro Analiz

LC{{0}} ve TM3 Hücre Kültürü: LC-540 hücre çizgileri, sodyum bikarbonat (1,5 g/L) ile desteklenmiş Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) ortamında 37 ◦C'de kültürlendi, L-glutamin (2 mM), esansiyel olmayan amino asitler (0.1 mM), sodyum piruvat (1.0 mM) ve fetal sığır serumu (FBS) (%10) %5 CO2 inkübatörü (CO2 inkübatörü, Napco 5410, Tayvan). TM3 hücre çizgisi, glikoz (4,5 g/L), sodyum piruvat (0,5 mM), L-glutamin (2,5 mM), sodyum bikarbonat (1,2 g/L), {{ 28}}(2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit (HEPES, 15 mM) ve fetal dana serumu (FCS, %10) veya at serumu (%5) 37 ◦C'de %5'lik bir oranda CO2 inkübatörü.

Hücre Canlılığının BelirlenmesiEkinekozit (ECH): 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolyum bromür (MTT) reaktifi, hücre canlılığı tahlili için kullanıldı. Hücre konsantrasyonu bir 96-kuyu plakasında 2 x 105 hücre/mL'ye ayarlandı. Daha sonra 20 µL ECH (%2 ortam içinde seyreltilmiş) ilave edildi ve %5 CO2 inkübatöründe 24 saat 37 ◦C'de inkübe edildi. Daha sonra 100 µL MTT reaktifi eklendi ve 4 saat boyunca 37 ◦C’de karanlık ortamda inkübe edildi. Absorbans 570 nm'de ölçüldü (ELISA okuyucu, Dynatech MR5000, Kloten, İsviçre).

Göreceli hücre canlılığı (%)=[(570 nm'de bir örnek - 570 nm'de Boş)]/[(570'de Akontrol - 570'de Boş)] × 100.

Nitroblue Tetrazolium (NBT) İndirgeme Testi ve 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) Testi: Hücre sayısı 1× 1{{10}}6 hücre/'ye ayarlandı mL. Daha sonra 50 mg/mL ECH, resveratrol (RES) ve ileri glikasyon son ürünleri (AGE'ler) (kontrol) eklendi ve 37 ◦C'de 18 saat boyunca birlikte kültürlendi. Daha sonra 0,3 mL NBT solüsyonu (0,1 mg/mL NBT, %5 FBS ve 10 mL DMEM içerisinde çözülmüş %3 dimetil sülfoksit (DMSO)) ilave edildi ve 37 ◦C'de %5 CO2 içerisinde 1 saat inkübe edildi. Santrifüjden sonra (800 x g'de 3 dakika boyunca) süpernatan çıkarıldı ve 200 uL DMSO ilave edildi ve bir ultrasonik osilatörde (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Tayvan) 5 dakika boyunca çalkalandı. Absorbans 630 nm'de ölçüldü. DPPH radikal analizi için standart olarak Trolox (%95 alkol içinde) alındı. Daha sonra 75 µL 0,5 mM DPPH çözeltisi, 25 µL numune ile karıştırıldı ve oda sıcaklığında, karanlık bir yerde 30 dakika reaksiyona girmesi sağlandı. Karışım çalkalandı ve absorbans 517 nm'de ölçüldü.

Reaktif Oksijen Türleri (ROS) İçerik Analizi: Hücre sayısı, %2 FBS içeren bir 12-kuyu plakasında 2 x 105 hücre/mL'ye ayarlandı. Daha sonra plakaya 50 µL/mL ECH, RES ve AGE eklenerek 37 ◦C'de 24 saat inkübe edildi. 24 saat sonra 20,70 -diklorofloresin-diasetat (DCFH-DA) ilave edildi ve 30 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edildi. Santrifüjden sonra (400 x g, 5 dakika), süpernatan çıkarıldı ve hücreler iki kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkandı. Daha sonra hücreler 1 mL PBS içerisinde süspanse edildi ve bir akış sitometresi (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, ABD) kullanılarak ROS seviyeleri belirlendi.

Protein Tanımlaması ve Kantitatif Analizi: Proteinler, bir protein ekstraksiyon reaktifi (T-PER) kullanılarak ekstre edildi. Hücre yoğunluğu bir 12-kuyu plakasında 2 x 105 hücre/mL'ye ve 50 uL/mL ECH, RES ve ileri glikasyon son ürünü (RAGE) antagonisti için bir reseptöre ayarlandı ve AGE'ler eklenip inkübe edildi 37 ◦C'de %5 CO2 inkübatöründe 24 saat süreyle. Daha sonra 400 µL T-PER eklendi, hücreler kazındı ve 125000x g'de 20 dakika (4 ◦C) santrifüj edildi. Süpernatan toplandı ve daha ileri analiz için −80 ◦C'de (−80 ◦C dondurucu, Nuaire, Plymouth, MN, ABD) saklandı. Protein miktarının belirlenmesi için bir bisinkoninik asit (BCA) kiti kullanıldı. Daha sonra, 10 µL standart hücre çözeltisi ve 200 µL BCA reaktifi 8-kuyu plakalarına eklendi ve 30 dakika boyunca %5 CO2 inkübatöründe 37 °C'de inkübe edildi. Absorbans 562 nm'de ölçüldü. Protein tanımlama analizi, sodyum dodesil sülfat (SDS)-poliakrilamid jel (SDS-PAGE) elektroforezi ile gerçekleştirildi. Bir protein yükleme tamponuna protein lizatı eklenerek numuneler hazırlandı ve spesifik proteinleri tespit etmek için western blot analizi yapıldı.

2.2.2. Canlı Analizi

Hayvan Modeli Tasarımı: Altmış {{0}} haftalık erkek Sprague–Dawley (SD) sıçanları, Ulusal Laboratuvar Hayvanları Merkezi'nden (Taipei, Tayvan) satın alındı. Her sıçan, kontrollü sıcaklık (23 ± 1 ◦C) ve nem (%40-60) altında, 12 saat aydınlık/12 saat karanlık döngüsüyle dezenfektanlı paslanmaz çelik kafeslerde ayrı ayrı barındırıldı. Yiyecek ve su istenildiği kadar sağlandı. Her sıçan ilk haftada evcilleştirildi ve ana diyet olarak laboratuvar kemirgen diyeti 5001 verildi. Tüm prosedürler, Tayvan Ulusal Tayvan Okyanus Üniversitesi'nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (IACUC Onay No. 101026) standartlarına uygun olarak yapılmıştır. Evcilleştirmenin ardından sıçanlar iki gruba ayrıldı: laboratuvar diyeti 5001 ile beslenen kontrol grubu (Con) ve tüm deney boyunca yüksek yağlı diyetle (HFD, %40) beslenen diyabetik grup. Diyabetik gruptaki sıçanlara 4 hafta boyunca HFD ile beslenildikten sonra, diyabeti (DM) tetiklemek amacıyla streptozotosin (65 mg/kg) (STZ) enjekte edildi. STZ enjekte edildikten sonraki 15 dakika içinde nikotinamid (230 mg/Kg Vücut Ağırlığı) enjekte edildi. Enjeksiyondan bir hafta sonra, diyabetik Mellitus'un (DM) başarılı indüksiyonunu belirlemek için oral glukoz tolerans testi (OGTT) yapıldı. Bundan sonra hayvanlar altı gruba ayrıldı: kontrol (laboratuvar diyeti 5001 ile beslendi); DM grubu (DM + 45% HFD); DMR grubu (DM + rosiglitazon: 0,571 mg/kg BW) %+ 45 HFD; DME1 grubu (DM + CTE: 80 mg/kg VA) %+ 45 HFD; DME2 grubu (DM + CTE: 160 mg/kg VA) %+ 45 HFD; ve DME4 grubu (DM + CTE: 320 mg/kg BW) %+ 45 HFD. Pozitif kontrol olarak Rosiglitazon (RSG) alındı. Tayvan Gıda ve İlaç İdaresi (TFDA) sağlıklı gıda fonksiyonel değerlendirme kılavuzlarının tavsiyesine göre üç doz CTE (80, 160 ve 320 mg/kg) kullanıldı. Tedaviler deneyin sonuna kadar uygulandı. Tüm deney sıçanları 6 hafta sonra sakrifiye edildi. Sıçanlardan alınan kanlar 4 ◦C'de 3000 rpm'de 15 dakika santrifüj edildi. Süpernatan aşağıdaki analiz için incelendi:

Toplam Glikoz, Trigliserit ve Kolesterol Tayini: Glikoz tayini, glikoz enzimatik kitleri ile gerçekleştirildi. Daha sonra reaktiflere 20 µL kan plazma örneği eklenerek 37 ◦C’de 5 dakika bekletildi. Toplam trigliseritler ve toplam kolesterol konsantrasyonu, trigliserit ve kolesterol enzimatik kitleri kullanılarak belirlendi. Daha sonra reaktiflere 10 µL kan plazması eklendi ve deney, üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirildi. Absorbans 510 nm'de ölçüldü.

Plazma toplam glikoz/trigliserit/kolesterol (mg/dL)=(Aörnek − ABlank)/(Astandart − ABlank) × 200.

Asample: Kan numunelerinin absorbansı, ABlank: Numune içermeyen kitlerin absorbans değeri, Astandard: Standart reaktifin absorbans değeri, 200: 200 mg/dL konsantrasyonundaki standart reaktifler.

İnsülin, Leptin ve Homeostatik Model Değerlendirmesi – İnsülin Direnci (HOMA-IR) Tayini:İnsülin seviyesi insülin ELISA kitleri ile belirlendi. Burada, 25µL kan plazması eklendi.reaktifler ve absorbans 450 nm'de ölçüldü. Toplam leptin içeriği birleptin enzimi immünometrik test kiti.Daha sonra 100µL plazma analiz edildi ve absorbansELISA okuyucusu kullanılarak 450 nm'de ölçüldü. Tüm deney buna göre gerçekleştirildiüreticinin talimatları. HOMA-IR değeri homeostaz modelinden belirlendideğerlendirme denklemi=Açlık plazma insülin konsantrasyonu (mg/mL)× açlık plazma glikozukonsantrasyonlar (mmol/L)/22,5.

Plazma Lipid Peroksidasyonu: Burada, {{0}},5 mL kan plazması, 1 mL reaktifle (%15, ağ/hac trikloroasetik asit, 0,25 N hidroklorik asit (HCl) ile karıştırıldı) ) ve 0.375%, w/v tiyobarbitürik asit, 0,25 N HC1 içinde) ve 100 °C'de 15 dakika boyunca bir su banyosuna (Su Banyosu, BUCHI 461, Zürih, İsviçre) yerleştirildi. Soğutulduktan sonra 1 mL n-butanol ilave edildi, kuvvetlice çalkalandı ve 1500xg'de 10 dakika santrifüj edildi. Süpernatan toplandı ve absorbans 532 nm'de ölçüldü [12].

Malondialdehit (MDA) konsantrasyonu (nM/mL)=[(532 nm'de bir örnek - 532 nm'de Ablank)/ (532 nm'de bir standart - 532 nm'de Ablank)] × 5.

standart 532 nm - Ablank at 532 nm)] × 5. Plazma Testosteron ve Luteinizan Hormon (LH) Düzeylerinin Belirlenmesi: Kan plazmasındaki testosteron düzeyini ölçmek için testosteron ELISA kiti kullanıldı. LH konsantrasyonunu belirlemek için RIA kiti kullanıldı. Daha sonra 50 µL plazma eklendi ve hesaplamalar LH-RP-3 (standart) hormonunun konsantrasyonuna dayandırıldı. Diğer adımlar üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirildi.

Tümör Nekroz Faktörü (TNF)- ve İnterlökin-6 (IL-6) Konsantrasyonunun Belirlenmesi: Yakalanan antikor, kaplama tamponunda 250 kez seyreltildi, bir 96-'ye eklendi. kuyu plakası (100 µL/kuyu) ve gece boyunca 4 ◦C'de tutuldu. Süpernatan aspire edildi ve beş kez yıkama tamponu (1 kez PBS, %0.05 Tween 20) ile yıkandı. 200 µg tahlil seyrelticisi ile inkübasyondan (1 saat) sonra, hücreler 5 kez yıkama tamponu ile yıkandı ve her kuyucuğa 100 µL TNF-standart solüsyonu veya test numuneleri ilave edildi ve 2 saat süreyle inkübe edildi. Yıkamanın ardından 100 µL IL-6-tespit edilen antikorlar eklendi ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edildi. Süpernatan aspire edildi ve 5 kez yıkandı. Daha sonra üzerine 480 µL avidin-yaban turpu peroksidazı (HRP) enzimi eklendi ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edildi. Süpernatan aspire edildi ve beş kez yıkama tamponu ile yıkandı. Daha sonra 100 µL substrat solüsyonu eklendi ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edildi. Daha sonra her kuyucuğa 50 µL stop solüsyonu (1M fosforik asit) eklendi ve absorbans 450 nm'de ölçüldü.

CİNSEL FONKSİYONUN ONARILMASI İÇİN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Sperm ve Testis Parametrelerinin Analizi

Sperm Örneği Toplama: Sperm örneği toplama işlemi daha önce [13]'te bildirilen yönteme göre gerçekleştirildi. Süpernatandan sperm toplandı ve daha ileri analizler için kullanıldı.

Sperm Sayısı, Sperm Hareketliliği ve Anormal Sperm: Sperm sayısı hemasitometre ve tripan mavisi solüsyonu kullanılarak hesaplandı. Daha sonra 100 µL sperm sıvısı tripan mavisi solüsyonu ile karıştırılarak hemasitometre ve mikroskop kullanılarak sperm sayısı, hareketliliği ve anormal sperm hesaplandı (14).

Nitro mavi Tetrazolyum NBT İndirgemesi ve Sperm ve Testisin Lipid Peroksidasyonu: Lipid peroksidasyonu ve NBT indirgemesi, aynı plazma analizi prosedürüne göre analiz edildi.

Süperoksit Dismutaz (SOD) ve Katalaz Aktivitesinin Belirlenmesi: Süperoksit dismutaz (SOD) aktivitesi RANSEL kiti kullanılarak analiz edildi. Burada, {{0}.05 mL testis homojenatları, 1,7 mL reaksiyon çözeltisine (0,05 mM ksantin, 0,025 mM 2-({) eklendi. {9}}iyodofenil)- 3-(4-nitrofenol)-5-feniltetrazolyum klorür (INT)). Karıştırdıktan sonra 0,25 mL ksantin oksidaz (80 U/L) ilave edildi ve oda sıcaklığında 30 saniye reaksiyona sokuldu. Absorbans 505 nm'de ölçüldü. Testis homojenatının protein konsantrasyonu Bio-Rad DC protein tahlil kiti ile belirlendi ve spesifik aktivitesi (U/mg protein) hesaplandı. Katalaz (CAT) aktivitesi daha önce bildirilen bir yönteme göre belirlendi [15].

H&E (Hematoksilen ve Eozin) Boyama

Testisler 24 saat boyunca %10 formalinde ıslatıldı ve 4 ◦C'de saklandı. Dokular mikro boyuttaydı ve lam üzerine yapıştırılmıştı. Sabitlemeden sonra (%95 metanol + 5% asetik asit), slaytlar 3 dakika boyunca hematoksilene daldırıldı, 5 dakika boyunca akan su ile yıkandı ve ardından %50, %70 ve %90 alkol ile ıslatıldı. bir dakika. Daha sonra slaytlar 10 saniye boyunca eozin ile boyandı ve solgunlaşana kadar bir dakika boyunca %100 alkolde bekletildi. Son olarak slayt bir dakika boyunca ksilene batırıldı. Daha sonra slayt havayla kurutuldu ve kapatıldı. Lekeli tüp, morfolojiyi gözlemlemek için ters fazlı bir kontrast mikroskobuna (Ters Faz Farkı Mikroskobu, Olympus CK-2, Tokyo, Japonya) yerleştirildi.

Hipotalamusun Analizi

Fare KISS1, G-protein bağlı reseptör (GPR) 54, sitokin sinyalleme 3'ün baskılayıcısı (SOCS-3) ve sirtuin 1(SIRT1) gen dizileri, NCBI (Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi) gen veri tabanından tanımlandı. ve Primer 5.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, ABD.) kullanılarak özel bir primer tasarlandı. Deneyde kullanılan primerler Tablo 1'de listelenmiştir.

Hipotalamustan Ribonükleik asitin (RNA) ekstraksiyonu. Beynin hipotalamusundan RNA ekstraksiyonu RNeasy Lipid Tissue Mini Kit kullanılarak gerçekleştirildi. Elde edilen mRNA'lar, ters transkripsiyon (RT) ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yoluyla kantitatif olarak ölçüldü. RT analizinden elde edilen tamamlayıcı DNA daha sonra kullanılmak üzere -20 ◦C'de saklandı. Ekstrakte edilen DNA, Taq polimeraz kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) analizine tabi tutuldu. Daha sonra PCR ürününden 5~10 µL alınmış ve %1,5 agar kolloidi üzerinde elektroforez ile analiz edilmiştir. Görüntü bir UVP BioDoc-It görüntüleme sisteminde çekildi. Ters kopyalanmış tamamlayıcı deoksiribonükleik asit (cDNA) alındı ​​ve IQ SYBR Green Supermix Kiti kullanılarak PCR yapıldı. Daha sonra iQTM 5 Optik Sistem Yazılımı ile analizleri yapılmıştır. Proteinler, bir protein ekstraksiyon reaktifi (T-PER) kullanılarak ekstre edildi. Daha sonra 400 µL T-PER'e 20 mg testis homojenatı eklendi ve 4 ◦C'de (125,000xg) santrifüj edildi (High-Speed ​​Centrifuge, Hettich CR-12, Tuttlen, Almanya). ) 20 dakika boyunca. Aşağıdaki yöntem, in vitro analizde "proteinin tanımlanması ve miktarının belirlenmesi analizi"ne benzerdi.

2.3. İstatistiksel Analiz

Deney sonuçları ortalama ± standart sapma (Ortalama ± SD) olarak ifade edildi ve veriler, Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0 yazılımı, IBM, Armonk, New York, NY, ABD kullanılarak analiz edildi. Gruplar arasındaki farklar tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile analiz edildi. Farklı grupların çoklu karşılaştırmaları, anlamlı düzey olarak p < 0.05 değerinde Duncan testiyle analiz edildi.

3. Sonuçlar

3.1. İn Vitro Analiz

3.1.1. ECH, CTE ve RES'in Antioksidan Aktivitelerinin Karşılaştırılması

Uzun vadeli saatYüksek oksidatif stres ve kronik inflamasyon diyabetik hastalığın ana nedenleridir.komplikasyonlar [16] CTE'ler çeşitli içerirekinekosid gibi feniletanoid glikozitler(ECH) ve akteozitantioksidan aktivite potansiyeline sahip [17] DPPH radikal temizlemeECH'nin antioksidan aktivitesini değerlendirmek için tahlil yapıldı. Trolox ve resveratrol(3,5,4'-trihidroksistilben, RES) sırasıyla standart ve pozitif kontrol olarak alındı. Gösterildiği gibiŞekilde1, ECH daha iyi radikal temizleme aktivitesi gösterdi ve aktivite önemli ölçüde daha yüksektipozitif kontrolden (RES) daha fazladır.

3.1.2. LC-540 ve TM3 Leydig Hücrelerinde ECH'nin Hücre Canlılığı

Farklı ECH konsantrasyonlarının hücre canlılığını değerlendirmek için MTT tahlili yapıldı. LC-540 Leydig hücreleri ve TM3 Leydig hücreleri, ECH ile tedavi edildikten sonra %80'den fazla canlılık gösterdi (Şekil 2). Diğer konsantrasyonlarla karşılaştırıldığında, ECH'nin 100-uM konsantrasyonu (%2 FBS içinde 100 uM seyreltileri) TM3 Leydig hücrelerinde daha iyi hücre canlılığı gösterdi. Sonuç, artan ECH konsantrasyonunun hücrelere herhangi bir önemli toksisiteye katkıda bulunmadığını gösterdi.

3.1.3. LC-540 ve TM3 Leydig Hücrelerinde NBT Tahlili ile AGE'nin İndüklediği Süperoksit Üretimi Üzerinde ECH'nin Etkisi

AGE'ler glikozun oksidasyonu ve O2-, hidroksil radikalleri ve karbonil grupları gibi serbest radikallerin oluşumu nedeniyle vücutta oksidatif hasara neden olur [18]. 50 ug/mL AGE'lerle uyarıldıktan sonra LC-540 (Şekil 3a) ve TM3 (Şekil 3b) hücreleri, ECH ve RES (her biri 5 μM ve 10 μM) ile işleme tabi tutuldu. Sonuçlar, süperoksit anyon üretiminin kontrol grubunda (uyarılmış AGE'ler) arttığını, ancak süperoksit anyon üretiminin kontrol grubundan (uyarılmış AGE'ler) sonra azaldığını, ancak süperoksit anyon üretiminin süperoksit üretiminden sonra azaldığını ve korunduğunu gösterdi. hücreleri oksidatif hasardan korur. LC-540 hücreleri durumunda, 10 uM ECH normal grupla hemen hemen benzer aktivite gösterdi. Her iki hücredeki süperoksit üretimi, hem ECH hem de RES konsantrasyonundaki artışla azaldı.

CİNSEL FONKSİYONU GELİŞTİREN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.1.4. AGE ile Uyarılan LC-540 Leydig Hücrelerinde ECH'nin H2O2 Üretimi Üzerindeki Etkisi

Oksidatif türlerin varlığını tespit etmek için DCFH-DA tahlili yapıldı. Floresan boya DCFH-DA, hücrelere girdikten sonra hücre içi H2O2 tarafından oksitlenir ve diklorofloresein (DCF) oluşturur. Şekil 4'te gösterildiği gibi, AGE ile uyarılan grupta (kontrol) hücre içi H2O2 üretiminde önemli bir artış olurken, 10 uM ECH ve RES eklenmesi, hücrelerdeki H2O2 üretimini önemli ölçüde azalttı. 10 uM ECH'nin uygulanması, H2O2 üretiminin yalnızca yaklaşık %47,1'i ile sonuçlandı; bu, kontrol grubuna göre önemli ölçüde daha düşüktü.

3.1.5. AGE ile Uyarılan LC-540 Leydig Hücrelerinde ECH'nin RAGE ve NF-κB Protein İfade Düzeyleri Üzerindeki Etkisi

LC-540 Leydig hücrelerinde RAGE varlığını doğrulamak için Western blot analizi yapıldı. ECH'nin AGE'ler ile uyarılmış Leydig hücrelerinde RAGE (Şekil 5a) ve NF-κB (Şekil 5b) protein ekspresyon seviyeleri üzerindeki etkisi Şekil 5'te gösterilmiştir. Sonuçlar, 50 µg/mL AGE konsantrasyonunun daha yüksek RAGE ve NF-'yi indüklediğini gösterdi. LC-540 Leydig hücrelerinde κB ekspresyonu ve 10 µM ECH ve RES konsantrasyonu, RAGE ve NF-κB ekspresyonunu önemli ölçüde azalttı. NF-κB'nin ekspresyonu RES ve ECH'de RAGE antagonistlerine göre anlamlı derecede düşüktü. Dolayısıyla sonuçlar, ECH'nin RAGE ve NF-κB seviyesini azaltarak inflamasyon seviyesini azalttığını doğruladı.

3.1.6. AGE ile Uyarılan LC-540 Leydig hücrelerinde ECH'nin Testosteron Sentezi yolu üzerindeki etkisi.

Spermatogenez ve erkek kısırlığı süreci testosteronun varlığına bağlıdır. Şekil 6'da gösterildiği gibi, StAR (Şekil 6a), CYP11A1 (Şekil 6b), CYP17A1 (Şekil 6c) ve HSD17 3 (Şekil 6d) proteinlerinin ifadeleri, AGE ile uyarılan LC{{11'de önemli ölçüde azaldı }} Leydig hücreleri (kontrol grubu). RAGE antagonisti, RES ve ECH eklendiğinde StAR, CYP11A1, CYP17A1 ve HSD{16}} proteinlerinin ifadeleri önemli ölçüde arttı. Hem ECH hem de RES ile tedavi edilen gruplarda StAR ve CYP11A1 proteinlerinin artan ekspresyonu görüldü. CYP17A1'in ekspresyon düzeyi RES ve ECH gruplarında neredeyse benzerdi. ECH ile tedavi edilen Leydig hücrelerinde HSD17 3 proteininin ifadeleri, RES ve RAGE antagonisti ile tedavi edilen hücrelerinkinden çok daha yüksekti. StAR, CYP11A1, CYP17A1 ve HSD{30}} proteinlerinin artan ifadesi, testosteronun normal üretimine işaret ediyordu.