Soyut

Amaç: Cistanche içeren bir formülün (orijinal kan besleyici ve böbrek tonlayıcı şifalı bitkilerin yerine geçen), kaveolin-1 (CAV1)/aquaporin 1 (AQP1) yolunu düzenleyerek form yoksunluğu miyopi (FDM) sıçanlarında büyüme faktörü- 2 (TGF- 2) ekspresyonunu dönüştürme, skleral yeniden modelleme ve su taşınması üzerindeki etkilerini araştırmak.

Yöntemler: Kırk SPF dereceli erkek SD sıçan seçildi ve bunların 30'u FDM modelini oluşturmak için kullanıldı. Başarılı modellemenin ardından sıçanlar, her grupta 10 sıçan olacak şekilde FDM grubuna, pirenzepin (PIR) grubuna ve Cistanche formül grubuna ayrıldı. Geriye kalan 10 modellenmemiş sıçan normal grup olarak görev yaptı. Normal grup ve FDM grubuna herhangi bir müdahale yapılmadı. PIR grubuna günde iki kez (sabah ve akşam) PIR göz damlası uygulanırken, Cistanche formülü grubuna Cistanche içeren formülün intragastrik uygulaması verildi. Retinoskop ve teşhis cihazı kullanılarak sıçanların kırılma kusuru ve aksiyal uzunluğu tespit edildi. Skleral dokudaki morfolojik değişiklikleri gözlemlemek için HE boyaması kullanıldı. Skleral dokuda TGF- 2 ekspresyonunu tespit etmek için immünohistokimyasal boyama kullanıldı. Skleral dokudaki AQP1 ve CAV1 proteinlerinin göreceli ekspresyon seviyelerini belirlemek için Western blot kullanıldı. Skleral dokudaki glutamat-aspartat taşıyıcı (GLAST) ve glutamat taşıyıcı 1 (GLT-1) mRNA'nın göreceli ekspresyon seviyelerini ölçmek için RT-PCR gerçekleştirildi. Bulgular: Normal grupla karşılaştırıldığında, FDM grubu, Cistanche formül grubu ve PIR grubunda AQP1 ve CAV1 proteinlerinin kırılma hatası, TGF- 2 ekspresyon seviyesi ve göreceli ekspresyon seviyeleri önemli ölçüde azalırken, GLAST mRNA ve GLT-1 mRNA'nın eksenel uzunluğu ve göreceli ekspresyon seviyeleri önemli ölçüde arttı (tümü P < 0.05). FDM grubuyla karşılaştırıldığında, Cistanche formül grubu ve PIR grubundaki AQP1 ve CAV1 proteinlerinin kırılma hatası, TGF- 2 ekspresyon seviyesi ve göreceli ekspresyon seviyeleri önemli ölçüde artarken, GLAST mRNA ve GLT-1 mRNA'nın eksenel uzunluğu ve göreceli ekspresyon seviyeleri önemli ölçüde azaldı (tümü P < 0,05). Cistanche formül grubuyla karşılaştırıldığında, PIR grubundaki AQP1 ve CAV1 proteinlerinin kırılma hatası, TGF- 2 ekspresyon seviyesi ve göreceli ekspresyon seviyeleri önemli ölçüde azalırken, GLAST mRNA ve GLT-1 mRNA'nın eksenel uzunluğu ve göreceli ekspresyon seviyeleri önemli ölçüde arttı (tümü P < 0.05). HE boyama sonuçları normal grupta her bir retina tabakasının yapısında anormal bir değişiklik olmadığını gösterdi; FDM grubunun retinası incelmiş ve ganglion hücre tabakasında ciddi vakuolar değişiklikler ortaya çıkmış; Cistanche formül grubu ve PIR grubunun retina kalınlığının arttığı, hücre dizilişinin temel olarak düzenli olduğu, ganglion hücrelerinin sayısının arttığı ve her katmandaki hücrelerin yoğun şekilde düzenlendiği, en belirgin performansın Cistanche formül grubunda olduğu görüldü. Sonuç: Cistanche içeren formülün FDM tedavisi üzerinde belirli bir olumlu etkisi vardır ve mekanizması, CAV1, AQP1 ve TGF- 2 ifadesinin düzenlenmesinin yanı sıra skleral yeniden yapılanma ve su taşıma işlevlerinin dengelenmesi ve iyileştirilmesiyle ilgili olabilir.

 

 

BÖBREK FONKSİYONUNUN GELİŞTİRİLMESİ İÇİN CISTANCHE BİTKİ TAKVİYESİ

 

 

Anahtar Kelimeler

Biçim yoksunluğu miyopisi; Cistanche içeren formül; Dönüştürücü büyüme faktörü- 2; Aquaporin 1; Kaveolin-1; Skleral yeniden yapılanma; Su taşımacılığı

 

Son yıllarda insanların yaşam tarzlarının değişmesi ve elektronik cihazların sürekli gelişmesiyle birlikte miyop görülme sıklığı da artıyor. Yaygın bir hastalık olarak küresel bir sağlık sorunu haline gelmiştir. Form yoksunluğu miyopisi (FDM), genellikle gözlere gelen görsel uyarının yoksunluğu veya azalmasından kaynaklanan özel bir miyopi türüdür. FDM sadece skleral yeniden yapılanma sürecine müdahale etmekle kalmaz, aynı zamanda göz küresi şeklinde anormal değişikliklere ve su taşıma fonksiyonu bozukluklarına da yol açar, bu da skleral doku hasarını ve deformasyonu daha da kötüleştirebilir. Aquaporin 1 (AQP1), ana işlevi su moleküllerinin hücre zarları boyunca hızlı taşınmasını desteklemek olan, yaygın olarak bulunan bir proteindir. AQP1'in gözdeki dağılımı ve işlevi, göz içi sıvısının dinamik dengesiyle ilişkilidir. Caveolin-1 (CAV1), hücre zarı mikro yapılarının oluşumunda ve sinyal iletiminde rol oynayan bir proteindir. Gözde CAV1 esas olarak retina pigment epitel hücrelerinde ve fotoreseptör hücrelerinde bulunur ve görsel sinyallerin iletimi ve göz içi ortamın stabilitesi ile ilgilidir. Dönüştürücü büyüme faktörü- 2 (TGF- 2), hücre çoğalmasını, farklılaşmasını ve göçünü teşvik etmek gibi çoklu biyolojik etkileri olan pleiotropik bir sitokindir. Göz içi ortamda TGF- 2, kornea ve skleranın gelişiminde ve korunmasında önemli bir rol oynar. Günümüzde FDM'nin ana tedavisi ilaç tedavisidir.

Geleneksel Çin tıbbında (TCM), miyopi oluşumunun yetersiz qi ve kan, böbrek özü eksikliği gibi faktörlerle ilişkili olduğuna inanılmaktadır. Böbrek "doğuştan temel" olarak kabul edilir ve gözlerin işleviyle yakından ilişkilidir. Geleneksel Çin Tıbbı, "böbreğin özü yönettiğini ve özün gözleri beslediğini; karaciğerin gözlere açıldığını ve yeterli karaciğer kanının net görmeyi sağladığını" savunur. Bu nedenle böbreği tonlamak ve kanı beslemek, geleneksel Çin tıbbındaki eksiklik sendromlarının neden olduğu göz hastalıkları için her zaman önemli bir tedavi prensibi olmuştur.

"Çöl ginseng'i" olarak bilinen ve geleneksel Çin Tıbbı'ndaki "dokuz ölümsüz ilaçtan" ​​biri olan Cistanche'nin, tıbbi bir içerik olarak 2000 yılı aşkın bir geçmişi vardır. Antik TCM klasiklerinde birinci sınıf besleyici tıbbi malzeme olarak kaydedilen Cistanche, böbreği tonlama, özü yenileme, kanı besleme ve kuruluğu nemlendirme etkileri nedeniyle oldukça değerlidir. Diğer birçok geleneksel Çin bitkisinin aksine, Cistanche yalnızca çöllerde yetişir ve esas olarak Sincan, İç Moğolistan ve Çin'deki Gansu gibi bölgelerde Tamarix ramosissima'nın köklerinde parazit olarak yetişir. Eşsiz çöl ortamı, güçlü antioksidan özelliklere sahip olduğu, hücre apoptozunu azalttığı ve hücre çoğalmasını desteklediği bilimsel olarak kanıtlanmış ekinakozit, verbaskosit ve flavonoidler dahil olmak üzere zengin aktif bileşenlerle donatır.

Modern araştırmalar Cistanche'nin önemli böbrek besleyici etkileri olduğunu göstermiştir. Böbrek hücresi apoptozunu azaltabilir, böbrek hücresi çoğalmasını teşvik edebilir, hasarlı böbrek hücrelerini onarabilir ve böbrek kan damarlarını genişleterek böbrek fonksiyonunu iyileştirebilir. Ayrıca Cistanche, lenfosit çoğalmasını teşvik ederek bağışıklığı güçlendirebilir, karaciğer glikojen üretimini artırarak yorgunluğa karşı direnç gösterebilir ve serbest radikalleri temizleyerek yaşlanma karşıtı etkiler gösterebilir. Bu biyolojik aktiviteler, "böbreği tonlama ve besleyici öz" şeklindeki TCM teorisiyle son derece tutarlıdır ve aynı zamanda göz hastalığı tedavisinde uygulanması için bilimsel bir temel sağlar. Böbreği tonlama ve kanı beslemeye yönelik TCM terapötik prensibine dayanan ve Cistanche'nin modern farmakolojik özelliklerini birleştiren bu çalışma, Cistanche içeren yeni bir formül oluşturmak için orijinal kan besleyici ve böbrek tonlayıcı bitkileri Cistanche ile değiştirdi ve miyopi için doğal bitkisel bazlı tedavilerin geliştirilmesi için yeni bir fikir sunmayı amaçlayan FDM tedavisindeki etkinliğini ve mekanizmasını araştırdı.

1 Malzemeler ve Yöntemler

1.1 Deney Hayvanları

180-200 g ağırlığında ve 6-8 haftalık kırk adet SPF dereceli erkek SD sıçan, Pekin Keyu Hayvan Yetiştirme Merkezi'nden satın alındı ​​[Lisans No.: SCXK (Jing) 2022-0004] ve Çin Tıp Bilimleri Akademisi Göz Hastanesi Hayvan Laboratuvarında rutin olarak yetiştirildi. Bu deney, "Deney Hayvanlarının Yönetimine İlişkin Yönetmelik"in ilgili hükümlerine uygundu ve Çin Tıp Bilimleri Akademisi Göz Hastanesi Tıbbi Etik Kurulu tarafından onaylandı (Seri No.: YKEC-KT-2024-017-P001).

1.2 Ana Reaktifler ve Cihazlar

Temel tıbbi malzeme olarak Cistanche tubulosa (Chengdu WeCistanche Bio-Tech. Co., Ltd.'den satın alınmıştır; %30,0'dan büyük veya eşit ekinekosid, %12,0'dan büyük veya eşit verbaskosid ve %75,0'den büyük veya eşit toplam fenetil alkol glikozitleri dahil olmak üzere aktif maddeler içerir) kullanılmıştır. Pirenzepin (PIR, Suzhou Hongsen Pharmaceutical Co., Ltd.); Bileşik Tropikamid Göz Damlaları (Hebei Jinyao Yongguang Pharmaceutical Co., Ltd., spesifikasyon 5 mL); 4 g·L⁻¹ Oksibuprokain Hidroklorür Göz Damlası (Shandong Bausch & Lomb Freda Pharmaceutical Co., Ltd.); AQP1 antikoru (Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.); CAV1 antikoru (Wuhan Botu Bioteknoloji Co., Ltd.); -aktin antikoru (Shanghai Jingke Chemical Technology Co., Ltd.); Keçi anti-tavşan IgG'si (Wenzhou Kemiao Bioteknoloji Co., Ltd.); HE Boyama Kiti (Shanghai Zeye Bioteknoloji Co., Ltd.).

1.3 Modelleme Yöntemi ve Gruplandırma

FDM modelini oluşturmak için 30 sıçan kullanıldı. Sıçanlara intraperitoneal pentobarbital sodyum (30 mg·kg⁻¹) enjeksiyonu yoluyla anestezi uygulandı. Sağ gözü povidon-iyotla temizleyip dezenfekte ettikten sonra sağ göze opak bir göz maskesi yapıştırıldı. Göz maskesi, ayrılma veya ışık sızıntısı açısından günlük olarak kontrol edildi ve gevşekse yeniden yapıştırıldı. Sol göz tedavi edilmeden bırakıldı. Sıçanlara 4 haftalık monoküler form yoksunluğunun ardından binoküler retinoskopi ve aksiyal uzunluk ölçümü yapıldı. Modelleme için başarı kriteri: sikloplejiden sonra, kırılma hatası bir retinoskop veya otomatik refraktometre ile ölçüldü ve yoksun göz, kırılma durumunda önemli bir miyopik kayma gösterdi [yani, binoküler kırılma hatasındaki 2 D'den büyük veya ona eşit olan fark, başarılı modelleme olarak kabul edildi ve yoksun gözün ortalama miyop kayması, kontrol gözüyle karşılaştırıldığında yaklaşık (-4,5 ± 1,2) D idi]. 30 sıçanın tümü başarılı bir şekilde modellendi ve her grupta 10 sıçan olacak şekilde FDM grubuna, PIR grubuna ve Cistanche formül grubuna bölündü. Geriye kalan 10 modellenmemiş sıçan normal grup olarak görev yaptı.

1.4 Müdahale Yöntemleri

Normal grup ve FDM grubuna herhangi bir müdahale yapılmadı. PIR grubuna 15 gün boyunca 2 dakika arayla günde iki kez (sabah ve akşam) sağ göze 5 damla PIR göz damlası verildi. Cistanche formül grubuna Cistanche içeren formülle müdahale edildi. Cistanche tubulosa (50 g, temel bileşen) su ile kaynatıldı ve 1000 g·L⁻¹ konsantrasyona sahip bir tıbbi çözelti halinde konsantre edildi. Sıçanlara 15 gün boyunca günde bir kez 12,70 g·kg⁻¹ dozunda intragastrik uygulama yapıldı. Cistanche'nin dozajı, klinik uygulama deneyimine ve modern farmakolojik araştırmalara dayanarak, ekinakozit ve verbaskosid gibi aktif bileşenlerin etkili konsantrasyonları sağlanarak belirlendi.

1.5 Tespit Yöntemleri

1.5.1 Kırılma Hatası ve Eksenel Uzunluk Değişikliklerinin Değerlendirilmesi

Morfolojik ve kırma kusurlarının tespiti: Form yoksunluğunun sona ermesinden yirmi dört saat sonra, tespit için her gruptan rastgele 3 sıçan seçildi. Deneyden önce, sıçanlar 30 dakika boyunca karanlığa adapte edilmiş bir ortama yerleştirildi, ardından izofluran inhalasyonuyla uyuşturuldu ve özel bir hayvan braketine sabitlendi. Göz küresinin panoramik taraması için yüksek çözünürlüklü OCT görüntüleme sistemi kullanıldı. Tarama sırasında, retina ve merceğin net kesitsel görüntülerini elde etmek için prob, korneaya dik olacak şekilde ayarlandı. Her göz arka arkaya 3 kez tarandı ve ön kornea yüzeyinden retina pigment epitel tabakasına olan eksenel mesafe (yani eksenel uzunluk), küresel eşdeğer kırılma hatasını hesaplamak için sistemin yerleşik yazılımı tarafından otomatik olarak ölçüldü. Veri doğruluğunu sağlamak için, profesyonel olarak eğitilmiş iki araştırmacı, görüntüleri kör bir şekilde bağımsız olarak analiz etti. İki ölçüm sonucu arasındaki fark 0,50 D'den büyükse veriler atıldı ve yeniden ölçüldü. Eksenel uzunluğun doğrulayıcı tespiti: OCT ölçüm sonuçlarını doğrulamak için A-tarama ultrason teşhis cihazı da kullanıldı. İlk olarak topikal anestezi için sıçanların her iki gözüne oksibuprokain hidroklorür göz damlası damlatıldı ve ardından A-tarama probu kornea ile temas edecek şekilde nazikçe yerleştirildi. Cihaz manuel moda ayarlandı ve doğru ultrasonik yayılma hızı göz içi ortama göre ayarlandı: ön kamara ve vitreus için 1540 m·s⁻¹. Operasyon sırasında, her bir arayüz manuel olarak işaretlenerek konumlandırıldı ve ortalama değeri almak için her bir göz 3 kez tekrar tekrar ölçüldü. Bu deney kör bir şekilde gerçekleştirildi ve tüm operatörler tutarlı ölçüm teknikleri sağlamak için birleşik eğitim aldı. Cihaz, ölçümden önce kalibre edildi ve bazı örnekler, sınıf içi ve sınıflar arası korelasyon katsayılarını (ICC) değerlendirmek üzere tekrarlanabilirlik testi için rastgele seçildi. Verilerin bilimselliğini ve güvenilirliğini sağlamak için deney sırasında katı standartlaştırılmış çalışma prosedürleri takip edildi.

1.5.2 HE Boyama

Kırma kusuru ve aksiyel uzunluk tespit edildikten sonra sıçanlar aşırı anestezi ile sakrifiye edildi. Her iki gözün göz kapakları ve çevre dokuları dezenfekte edildi ve korneanın orta noktasına dik olan nazal ve temporal limbus işaretlendi. Konjonktiva işaretlere göre kesildi ve göz küresi çıkarıldı. Ön segment dokusu ve vitreusun çıkarılması için limbus kesildi ve skleral doku tutuldu. Sklera dokusu 24 saat boyunca 40 g·L⁻¹ paraformaldehid ile sabitlendi, gradyan etanol ile kurutuldu, rutin olarak parafine gömüldü, ksilen ile temizlendi, nötr balsam ile monte edildi, 5 μm'de kesitler alındı, HE ile boyandı ve optik mikroskop altında skleral dokudaki morfolojik değişiklikler açısından gözlemlendi.

1.5.3 Skleral Dokuda TGF- 2 İfadesi İçin İmmünohistokimyasal Boyama

Her gruptan iki sıçan seçildi. Skleral doku kesitleri antijen geri kazanımı ve bloke etmeye tabi tutuldu, fare anti-TGF- 2 (1:3000) ile 24 saat süreyle inkübe edildi, yıkandı, ikincil antikorla (1:2000) 1 saat süreyle inkübe edildi, rutin olarak geliştirilip zıt boyandı, nötr balsamla birleştirildi ve doku değişikliklerini gözlemlemek için optik mikroskop altında 2-3 görüntü alındı. Pozitif kısmın gri değeri bir görüntü analiz sistemi tarafından tespit edildi.

1.5.4 Skleral Dokuda AQP1 ve CAV1 Protein Ekspresyon Düzeylerinin Western Blot Tespiti

Her gruptan iki sıçan seçildi. Sklera dokusu eksize edildi, homojenleştirildi ve RIPA lizis tamponu eklenerek toplam protein ekstre edildi. Protein denatürasyonu, miktar tayini, elektroforez, membran transferi ve bloklama gerçekleştirildi. Birincil antikorlar AQP1 (1:1000), CAV-1 (1:3000) ve -aktin antikoru (1:2000) eklendi ve gece boyunca 4 derecede inkübe edildi. İkincil antikor (1:2000) eklendi ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildi. ECL reaktifi eklendi ve protein grisi değeri Image Lab yazılımıyla analiz edildi. Hedef bandın gri değerinin -aktin'inkine oranı, göreceli ifade düzeyiydi.

1.5.5 Skleral Dokuda GLAST ve GLT-1 mRNA İfadesinin RT-PCR Tespiti

Sıçanların geri kalan sklera dokusu alındı ​​ve toplam RNA, Trizol yöntemine göre ekstre edildi. Toplam RNA, bir spektrofotometre ile ölçüldü ve cDNA, kit talimatlarına göre ters kopyalandı. RT-PCR reaksiyon sistemi şu reaksiyon koşullarıyla hazırlandı: 75 derece 30 saniye, 85 derece 60 saniye, 80 derece tavlama için 30 saniye, 65 derece uzatma için 30 saniye olmak üzere toplam 40 döngü. Dahili referans olarak -aktin kullanılarak glutamat-aspartat taşıyıcının (GLAST) ve glutamat taşıyıcı 1'in (GLT-1) nispi ekspresyon seviyeleri 2⁻ΔΔCt yöntemiyle hesaplandı. Primer dizileri Tablo 1'de gösterilmektedir. Gruplar arası karşılaştırma için tek yönlü varyans analizi, gruplar arası ikili karşılaştırma için LSD-t testi kullanıldı. Test düzeyi:=0.05.