Tek Taraflı Böbrek İskemi-reperfüzyon Hasarı Sonrası Kontralateral Nefrektomi Zamanlamasının ve İskemik Durumların Böbrek Fibrozu Üzerine Etkileri
Oct 27, 2023
giriiş
görülme sıklığıAkut böbrek hasarı(AKI) son yıllarda dünya çapında dramatik bir şekilde artmıştır [1]. Klinik pratikte ABH'ye organ nakli, postoperatif perfüzyon, kanama, dehidratasyon, şok ve sepsis neden olabilir. Son epidemiyolojik ve deneysel çalışmalar ABH'nin ciddiyeti, sıklığı ve süresinin daha sonraki insidans ile yakından ilişkili olduğunu göstermiştir.kronik böbrek hastalığı(CKD). AKI sonrası böbrek fibrozu KBH'ye ve hattason dönem böbrek hastalığı(ESKD) [3-5], AKI ve KBH'nin bağlantılı sendromlar olduğunu ima etmektedir [6]. Ancak AKI'dan KBH'ye geçişin altında yatan mekanizmalar çok sayıda deneysel ve klinik çalışmaya rağmen bilinmemektedir. Hayvan modelleri AKI'nin KBH'ye yol açtığı mekanizmaları araştırmak için önemli araçlardır. Böbrek iskemi-reperfüzyon hasarı (IRI), AKI'nin ana nedenlerinden biridir ve iki taraflı IRI (bIRI) modeli, sağlam karşı taraf böbreği olan tek taraflı IRI modeli dahil olmak üzere, IRI kaynaklı AKI'nin çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiştir [7] , eşzamanlı kontralateral nefrektomili uIRI modeli ve gecikmiş kontralateral nefrektomili uIRI modeli.
bIRI modeli daha az tutarlıdır çünkü her iki böbreğin iskemik hasarı çok hafif olduğunda uzun vadede anlamlı fibrotik değişiklikler olmaz. AKI çok şiddetli olduğunda fareler akut yaralanma aşamasında ölebilir. Ayrıca, iki böbreğin hasarındaki küçük farklılıklar, birkaç hafta sonra kronik böbrek patolojisinde önemli farklılıklara yol açabilir [8,9]. Eş zamanlı kontralateral nefrotomili uIRI modeli, diğer taraftaki nefrektomi nedeniyle yalnızca yaralı böbreğin kalması nedeniyle bIRI modeline benzer [10]. Sağlam bir kontralateral böbreğe sahip IRI modelinde iskemik böbreğin fibrozisi şiddetlidir [11,12]. Bu model, araştırmacıların uzun vadeli gözlemleri için oldukça tutarlı ve güvenilirdir. Bununla birlikte, karşı taraftaki hasarsız böbreğin varlığı nedeniyle tahmini glomerüler filtrasyon hızının (eGFR), serum kreatinin (SCr) ve kan üre nitrojeninin (BUN) değerlendirilmesi için kullanılamaz [11-14]. Yukarıda bahsedilen iki uIRI modeliyle karşılaştırıldığında, gecikmiş kontralateral nefrektomili uIRI modeli bu sorunların üstesinden gelir ve hem AKI sonrası uzun süreli gözlemler hem de böbrek fonksiyonunun izlenmesi için kullanılabilir. Bu nedenle bu model AKI-CKD geçişini incelemek için uygundur [15].
CISTANCHE ÖZETİNİ ALMAK İÇİN BURAYA TIKLAYINAKUT BÖBREK HASARI
Bununla birlikte, farklı iskemik koşullar ve kontralateral nefrektomi ile uIRI arasındaki sürenin AKI sonrası KBH'nin ilerlemesi ve şiddeti üzerinde önemli etkileri olabilir. Önceki çalışmalar iskemik sürenin AKI sonrası böbrek fibrozisi üzerindeki etkisine odaklanmış ve iskemi sırasında çekirdek vücut sıcaklığına çok fazla dikkat edilmemiştir. Örneğin Skrypnyk ve ark. [12], iskemik sıcaklığı, 30 dakikalık iskemik süre ile bir su banyosu sistemi ile 38°C'de kontrol etti ve kontralateral sağlam böbrek, uIRI'den 8 gün sonra çıkarıldı. Sonuç, iskemik böbreğin uIRI'den 28 gün sonra önemli fibrotik değişikliklere sahip olduğunu gösterdi. Aynı iskemik süreye sahip olan Xiao ve ark. [8], iskemik sıcaklığın 37°C 38°C'de kontrol edildiği ve uIRI ile kontralateral nefrektomi arasındaki zaman aralığının 10 gün olduğu uIRI'den 11 gün sonra anlamlı fibrotik değişikliklerin meydana geldiğini gösterdi. Colombaro ve diğerleri gibi bazı araştırmacılar. [14] ve Li ve ark. [16] çalışmalarında iskemik sıcaklıktan bahsetmemişlerdir.
Bu arada, bu modelde kontralateral nefrektomi ile uIRI arasındaki zaman aralığının etkisini çok az kişi araştırdı; bu da farklı laboratuvarlar arasında çok farklı sonuçların ortaya çıkmasına neden oldu ve bu da sonraki deneyleri önemli ölçüde etkiledi. Bu çalışmada kontralateral nefrektomi ile uIRI arasındaki zaman aralığı, iskemi sırasındaki çekirdek vücut sıcaklığı ve iskemik süre dahil olmak üzere AKI sonrası böbrek fibrozisini etkileyen ana faktörlerin etkilerini araştırdık. AKI CKD geçişini incelemek için uygun bir hayvan modeli oluşturmak için bir referans sağlamayı amaçladık.
Malzemeler ve yöntemler Hayvan modelleri
Erkek C57BL/6J farelerine (8-10 haftalık, yaklaşık 22 g ağırlık; GemPharmatech Co., Ltd., Nanjing, Çin), Shanxi Tıp Üniversitesi Hayvan Deney Merkezi'nde yiyecek ve suya ücretsiz erişim sağlandı. Üreme koşulları şu şekildeydi: nem %40-70, sıcaklık 23 C, hava temizliği sınıfı 7, patojen içermeyen koşullar altında kontrollü 12-saat aydınlık/karanlık döngüsü, Co60 ışınlaması ve arıtılmış su ile besleme. Bu çalışmaya yönelik tüm prosedürler, Shanxi Tıp Üniversitesi İkinci Hastanesinin Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylandı (etik numarası: DW2022028).
Protokoller
İskemik sürelerin, iskemi sırasındaki çekirdek vücut sıcaklıklarının ve karşı taraftaki hasar görmemiş böbreğin rezeksiyon zamanlarının tümünün ABH'nin ciddiyeti ve ardından gelen böbrek fibrozisi üzerinde etkili olabileceğini göz önünde bulundurarak, yukarıdaki üç faktörün etkilerini diğer ikisi sabit olmak üzere ayrı ayrı araştırdık. Üç deney aşağıdaki gibi gerçekleştirildi.
Protokol 1: Kontralateral nefrektomi ile uIRI arasındaki sürenin böbrek fonksiyonu ve AKI sonrası fibrozis üzerindeki etkisini gözlemlemek için sol böbreğin iskemik süresi 24 dakikada sabitlendi ve böbrek sırasında çekirdek vücut sıcaklığı 37 C'de sabitlendi. bu arada iskemi. Sağ böbrek rezeksiyonu, sol böbrek IRI'sinden sonra sırasıyla 7. günde, 10. günde ve 14. günde (grup başına n=8) gerçekleştirildi. İskemi ve böbrek rezeksiyonunun süresini önceki çalışmaların sonuçlarına [8,10,12,15] ve deney öncesi sonuçlarımıza dayanarak belirledik. Çalışma protokolü için Şekil 1(A-C)'ye bakın.
Protokol 2: İskemi sırasında çekirdek vücut sıcaklığının AKI-CKD geçişi üzerindeki etkisini gözlemlemek için sol böbreğin iskemik süresi 24 dakikada sabitlendi ve sağ böbrek, sol böbrek IRI'sinden 14 gün sonra çıkarıldı. Çekirdek vücut sıcaklığı sırasıyla 36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C ve 38 C'de kontrol edildi (grup başına n=8). Çalışma protokolü için Şekil 1(D)'ye bakınız.
Protokol 3: Böbrek iskemik sürelerinin AKI'den KBH'ye geçiş üzerindeki etkisini gözlemlemek için iskemi sırasında çekirdek vücut sıcaklığı 37 C'de sabitlendi ve sağ böbrek, sol böbrek IRI'sinden 14 gün sonra çıkarıldı. Bu zaman noktasını seçtik çünkü AKI'den KBH'ye doğru tipik değişiklik olan böbrek fibrozisi raporlara [8,10,12,15] ve deney öncesi sonuçlarımıza göre çok açıktı. Sol böbreğin iskemik süresi sırasıyla 21 dakika, 24 dakika, 27 dakika ve 30 dakika olarak kontrol edildi (grup başına n=8). Çalışma protokolü için Şekil 1(E)'ye bakın.
Tüm farelere sol böbreğin IRI'sinden 8 hafta sonra ötenazi uygulandı. Sol böbrek dokusunun bir kısmı daha sonraki RT-PCR ve western blot analizi için 70°C'de saklandı ve diğer kısmı histopatolojik analiz için nötr formalinde sabitlendi. Biyokimyasal testler için retro-orbital sinüs yoluyla kan örnekleri toplandı.
Şekil 1. Gecikmiş kontralateral nefrektomi ile tek taraflı iskemi-reperfüzyon hasarının (uIRI) protokolleri. (A–C): Sol böbrek 0. günde IRI'ye tabi tutuldu ve sağ böbrek rezeksiyonu iskemik süre ile farklı zaman noktalarında (7. gün, 1. gün0 ve 14. gün) gerçekleştirildi. böbrek iskemisi sırasında çekirdek vücut sıcaklığı 37°C'de sabitlenerek 24 dakikada sabitlendi. (D): Sol böbrek 0. günde IRI'ye tabi tutuldu ve sağ böbrek rezeksiyonu farklı vücut sıcaklıkları (36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C ve 38 C) altında iskemik hastayla gerçekleştirildi. Sol böbreğin süresi 24 dakikada sabitlendi ve sağ böbrek, sol böbrek IRI'sinden 14 gün sonra çıkarıldı. (E): Sol böbrek 0. günde IRI'ye tabi tutuldu ve böbrek sırasında 37 C'de sabit vücut sıcaklığı ile farklı iskemik sürelerde (21 dakika, 24 dakika, 27 dakika ve 30 dakika) sağ böbrek rezeksiyonu gerçekleştirildi. iskemi oluştu ve sağ böbrek, sol böbrek IRI'sinden 14 gün sonra çıkarıldı. Böbrek ağırlığı, böbrek fonksiyonu, böbrek histolojik hasarı ve böbrek fibrozisi 56. güne kadar değerlendirildi.
Ameliyat prosedürü
Ameliyattan önce, tüm fareler 12 saat süreyle aç bırakıldı ve suya serbest erişim sağlandı ve intraperitoneal olarak %3 pentobarbital sodyum 50 mg/kg enjekte edildi. Anestezi sırasında rektal sıcaklık, farklı deney gruplarında sırasıyla 36°C, 36,5°C, 37°C, 37,5°C veya 38°C'de tutuldu. Bunu başarmak için fare, sırtı bir ısıtma yastığının (CW{{10}}, BARBAROUS GROWTH, Zhejiang, Çin) üzerine, hava yolunun açık kalmasını sağlamak için başı ve boynu uzatılmış olacak şekilde yerleştirildi. işlem sırasında kurumayı önlemek için gözler ılık tuzlu gazlı bezle kapatıldı. Anestezi sonrasında farenin sol sırt bölgesindeki kıllar saç kesme makinesi ile tıraş edildi. Daha sonra cerrahi bölgedeki cilt %75'lik alkollü bezle silinerek temizlendi. Genellikle farenin vücut ısısı saç tıraşından sonra düşer. Cerrahi işlem çekirdek vücut ısısı sabit hale gelince gerçekleştirildi ve bu yaklaşık 15 dakika sürebildi. Sol böbrek, farenin göğüs kafesinin orta hattının 0,5 cm alt kenarından ve orta hattın 0,5 cm yanından sol sırt derisi kesilerek görülebildi. Daha sonra sol böbreği vücut boşluğundan çıkarmak için tek elimizle sol karnı sıktık, böbreği künt kavisli forseps ile kaldırdık (böbreğe zarar vermemeye dikkat ederek), böbreğin pedikülünü ayırıp hızla klempledik ve klemp yerleştirdik. Böbrekleri sıcak ve nemli tutmak için derinin altına yerleştirilir. Başarılı iskemi, farklı deney gruplarında sırasıyla 21 dakika, 24 dakika, 27 dakika ve 30 dakika süren böbreğin kırmızıdan koyu mora kademeli renk değişimi ile karakterize edildi. Klemp serbest bırakıldıktan 2-5 dakika sonra böbreğin rengi tekrar kırmızıya döndü. Daha sonra karın boşluğunu katlı dikişlerle kapattık. Farklı deney gruplarında uIRI'den sonra sağ sırt derisi ve kas sırasıyla 7. günde, 10. günde ve 14. günde kesildi ve sağ böbrek rezeke edildi. Daha sonra yarayı standart dikişlerle kapatın. Her ameliyattan sonra ameliyat sırasındaki sıvı kaybını telafi etmek için intraperitoneal olarak 500 L salin enjekte edildi. Aynı zamanda fare, mahfaza kafesine nakledilmeden önce tam bilincini kazanana kadar yaklaşık 2-3 saat boyunca bir ısıtma yastığı üzerinde tutuldu. Sahte grup böbrek pedikülünü klemplemedi ve cerrahi operasyonların geri kalanı uIRI grubununkilerle aynıydı. Tüm cerrahi operasyonlar bu modelin operasyonunda 2 yıldan fazla deneyime sahip aynı kişi tarafından gerçekleştirildi.
Böbrek fonksiyon tahlili
SCr düzeyleri Kreatinin Kiti (Jaffe Yöntemi, 100020170, Biosino Biyoteknoloji ve Bilim) kullanılarak ölçüldü. BUN düzeyleri Üre Kiti (Üreaz-Glutamat Dehidrojenaz Yöntemi, Biosino Biyoteknoloji ve Bilim) kullanılarak ölçüldü.
Böbrek ağırlığı tahlili
İdrar yaptıktan sonra farelerin vücut ağırlıkları hassas bir elektronik terazi ile ölçüldü. Taze böbrekler önceden soğutulmuş salin içinde üç kez durulandı, ardından böbreklerdeki fazla su filtre kağıdıyla kurutuldu. Böbrek kapsülleri buz üzerinde soyuldu ve böbrekler hemen tartıldı. Böbrek ağırlığının vücut ağırlığına oranı, düzeltilmiş böbrek ağırlığını mg/g cinsinden değerlendirmek için hesaplandı.
Hematoksilen-eozin (HE) boyama ve böbrek hasarı skoru
Nötr formalinle sabitlenmiş böbrek dokuları rutin olarak dehidre edildi, parafine gömüldü, bölümlere ayrıldı (3 um) ve böbrek dokularındaki hasarı gözlemlemek için HE ile boyandı. Her bölümün böbrek korteksinden rastgele seçilen on alan, 400 büyütmede ışık mikroskobu ile yakalandı. İki patolog glomerulus ve böbrek tübüllerindeki hasarı ayrı ayrı puanladı. Tübüler yaralanma, aşağıdaki kriterler kullanılarak {{20}}–4 ölçeğinde puanlandı [17]: 0, yaralanma yok; 1, böbrek alanının %1-25'ini etkiliyor; 2, böbrek alanının %26–50'ini etkiliyor; 3, böbrek bölgesinin %51-75'ini etkiliyor; ve 4, böbrek alanının %75-100'ünü etkiliyor. Tübüler hasarın derecesi, böbrek tübüler hasarının alanı hesaplanarak yarı kantitatif olarak değerlendirildi. Glomerüler hasar değerlendirildi ve aşağıdaki kriterler kullanılarak mezenjiyal genişleme veya skleroz yüzdesine göre 0-4 arası bir ölçekte puanlandı [17]: 0, normal glomerüller; 1, yaralanan alanın %1-25'i; 2, yaralanan alanın %26-50'si; 3, yaralanan alanın %51-75'i; ve 4, alanın %76-100'ü yaralandı. Nihai glomerüler hasar skoru=0 (%derece 0 glomerül) + 1 (%derece 1 glomerül) + 2 (%derece 2 glomerül) + 3 (%derece 3 glomerül) + 4 (%derece 4 glomerül). Fare başına 50'den fazla glomerül puanlandı.
Masson'un trikrom boyaması
Nötr formalinle sabitlenmiş böbrek dokuları rutin olarak dehidre edildi, parafine gömüldü, bölümlere ayrıldı (3 um) ve böbrek fibrozisini gözlemlemek için Masson trikromu ile boyandı. Masson'un trikrom boyalı dilimlerinde, böbrek korteksinin birbiriyle örtüşmeyen yirmi alanı 200 büyütme altında yakalandı. Otomatik ölçüm ve analiz için Image-Pro Plus Görüntü Analiz Yazılımı kullanıldı. Fibrotik alanın yüzdesi, böbrek interstisyel fibrozunun düzeyini belirlemek için kullanıldı [8].
RT-PCR
Her grubun böbrek dokusundan Trizol ile toplam mRNA ekstrakte edildi ve konsantrasyonu ölçüldü, ardından cDNA'ya (Taka Reverse Transcription Kit) dönüştürüldü. Böbrek dokularındaki fibronektin (FN) ve kollajen I (COL-I) RNA ekspresyonlarını ölçmek için Taqman floresans yöntemi (TB Green Premix Ex Taq II Gerçek zamanlı RT-PCR) kullanıldı. FN (ileri: 50 -GGAGTGGCACTGTCAACCTC-30 ve ters: 50 -ACTGGATGGGGTGGGAAT-30 ) ve COL-I (ileri: 50 -ACATGTTCAGCTTTGTGGACC{) için spesifik primerler kullanıldı {9}} ve tersi: 50 -TAGGCCATTGTGTATGCAGC-30 ) [18] (Sangon Biotech Co., Ltd., Şangay, Çin tarafından sağlanmıştır). Amplifikasyon koşulları şu şekildedir: 30 saniye için 95°C, 5 saniye için 95°C, 30 saniye için 60°C, 40 döngü; 10 s için 95 C, 5 s için 65 C ve 95 C/5 C. Ürünlerin amplifikasyon eğrileri ve çözünürlük eğrileri analiz edildikten sonra, karşılaştırmalı CT yöntemi (2-DDCt) ile bağıl mRNA seviyeleri belirlendi. dahili referans olarak 18SrRNA (ileri: 50 - CGGACACGGACAG GATTGACAG-30 ve geri: 50 -AATCGCTCCACCAACT AAGAACGG-30 ) ile.
Batı lekesi
Böbrek dokularını lize etmek için radyo-immüno-çökeltme-tahlili (RIPA) lizis tamponu kullanıldı ve protein konsantrasyonu BCA yöntemiyle belirlendi. Proteinleri 50 ug numuneden ayırmak için gradyan jel elektroforezi kullanıldı. Daha sonra proteinler bir nitroselüloz membrana aktarıldı. 2 saat boyunca %5 yağsız süt ile bloke edildikten sonra membranlar, a-düz kas aktinine (a-SMA) karşı tavşan anti-fare monoklonal antikoru (1:1000, No.19245, Cell Signaling Technology) ile gece boyunca 4°C'de lekelendi. ), FN (1:1000, No.ab2413, ABCam) veya COL-I (1:1000, No.72026, Hücre Sinyal Teknolojisi). Ertesi gün membranlar oda sıcaklığında 0,5 saat süreyle yeniden ısıtıldı. Membranlar TBST ile yıkandıktan sonra HRP Konjuge AffiniPure Keçi Anti-tavşan IgG(H + L)(1:1000, No.BA1054, BOSTER Biological Technology) ile 2 saat süreyle inkübe edildi. Tekrar TBST ile yıkandıktan sonra immünoblotları görselleştirmek için ultra yüksek hassasiyetli ECL kemilüminesans reaktifi ile boyandılar. b-aktin dahili referansla aynı membran üzerinde ölçülmüştür. Protein ifadeleri, hedef proteinlerin b-aktin'e karşı göreceli ifadelerinin ölçülmesiyle belirlendi.
Veri ve istatistiksel analiz
İncelenen tüm veriler ortalama ± standart sapma olarak ifade edildi. İki grup arasındaki karşılaştırmalara bağımsız bir t-testi ile erişildi. Çoklu gruplar arasındaki karşılaştırmalara, veri dağılımı normal ve varyans homojen olduğunda tek yönlü ANOVA ile erişildi; varyans heterojen olduğunda istatistiksel anlamlılığı değerlendirmek için Welch ANOVA kullanıldı ve ardından çoklu karşılaştırmalar için Tukey'in post hoc testi kullanıldı. Tüm istatistiksel analizler GraphPad Prism 8.0 yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. p < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Wecistanche Destek Hizmeti-Çin'deki en büyük cistanche ihracatçısı:
E-posta:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Daha Fazla Özellik İçin Alışveriş Yapın Detaylar:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
