Sargassum Thunbergii Özünün TRP-1 ve MMP'lerin İnhibisyonu Yoluyla Cilt Beyazlatma ve Kırışıklık Önleme Üzerindeki Etkileri

İletişim: ali.ma@wecistanche.com

Da-Hye Gam 1, Jae-Hyun Park 1, Ji-Woo Hong 1, Seong-Jin Jeon 1, Jun-Hee Kim 1 ve Jin-Woo Kim 1,2,*

Soyut: Sargassum thunbergiigeleneksel olarak doğu ülkelerinde yenilebilir ve tıbbi bir malzeme olarak kullanılmıştır. Ancakcilt beyazlatmakvekırışıklık önleyiciS. thunbergii'nin etkileri henüz araştırılmamıştır. Bu çalışma, S. thunbergii'de ultrason destekli ekstraksiyon (BAE) kullanılarak antioksidan aktiviteye sahip biyoaktif bileşiklerin yanı sıra cilt beyazlatma ve kırışıklık önleyici etkilere sahip biyoaktif bileşiklerin üretimi için optimal ekstraksiyon koşulları oluşturmak için yapılmıştır. Ana değişkenler olan ekstraksiyon süresi (5.30~18.7 dk), ekstraksiyon sıcaklığı (22.4~79.6 ◦C) ve etanol konsantrasyonu (0.0~%99.5). BAE, merkezi bir kompozit tasarım kullanılarak optimize edildi. Kuadratik regresyon denklemleri deneysel verilere dayalı olarak türetildi ve tahmin için uygunluğu gösteren yüksek bir belirleme katsayısı (R2 > 0.85) gösterdi. Radikal süpürücü aktivite (RSA), tirozinaz inhibe edici aktivite (TIA) ve kollajenaz inhibe edici aktivite (CIA) dahil olmak üzere tüm bağımlı değişkenleri en üst düzeye çıkarmak için en uygun BAE koşulu, 12.0 dakikalık bir ekstraksiyon süresi, 65.2 ◦C'lik bir ekstraksiyon sıcaklığı ve etanol olarak tanımlandı. yüzde 53,5. Bu koşullar altında, S. thunbergii özütünün RSA, TIA ve CIA'sı sırasıyla yüzde 86.5, yüzde 88.3 ve yüzde 91.4 idi. Ayrıca, S. thunbergii özütünün, melanin sentezi ve kollajen hidrolizinin ana genleri olan tirozinazla ilişkili protein-1, matris metalloproteinaz-1 ve matris metalloproteinaz-9'ın mRNA ifadesi üzerinde engelleyici etkileri olduğunu doğruladık. . S. thunbergii ekstraktındaki ana fenolik bileşikleri tanımlamak için sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi kullanıldı ve kafeik asit, yüksek katma değerli bileşenlerincilt beyazlatmakvekırışıklık önleyiciefektler S. thunbergii'den üretilebilir ve kozmetik malzemelerin geliştirilmesinde kullanılabilir.

Anahtar Kelimeler: S. thunbergii; optimizasyon;cilt beyazlatmak; kırışıklık önleyici; TRP-1; MMP-1; MMP-9

Cistanche özü beyazlatma cilt için faydaları için tıklayın

1. Giriş

Melanogenez, melanin pigmentlerinin sentezine yol açan fizyolojik bir süreçtir [1]. Melanin, epidermisin bazal tabakasında bulunan melanositlerden salgılanan siyah veya kahverengi bir pigmenttir ve cilt, gözler ve saç rengini belirler [2]. Bununla birlikte, melanin pigmentlerinin aşırı üretimi, malignite gibi hiperpigmentasyonla ilişkili hastalıklara yol açabilir. melanomlar [3]. Melanin biyosentez yolundaki ana enzim olan tirozinaz, L-tirozinin L-DOPA'ya (L-3,4-dihidroksifenilalanin) hidroksilasyonunu destekler ve daha sonra L-DOPA'nın dopakrom ve dopakinona oksidasyonunu destekler. tirozinaz ile ilişkili proteinler (TRP-1 ve 2) tarafından oto-oksidasyon süreci yoluyla melanini birkaç aşamada [4-6] sentezler. Bugüne kadar, tirozinazla ilgili proteinleri engelleyerek melanin oluşumunu engelleme yöntemleri, kozmetik endüstrisinde cilt beyazlatıcı ajanların geliştirilmesi için yaygın olarak kullanılmıştır [7,8]. Bununla birlikte, geleneksel olarak kullanılan kojik asit, azelaik asit ve hidrokinoncilt beyazlatmakbileşenlerinin alerjiye neden olduğu ve ayrıca cilt toksisitesine ve kansere neden olduğu bildirilmiştir [9]. Bu nedenle, doğal bileşenlere dayalı daha güvenli, daha etkili bir cilt beyazlatma maddesi üretmek zorunlu kabul edilir [10].

Kollajen, cildi kuvvet ve gerginlik vererek koruyan hücre dışı bir matris (ECM) proteinidir; ayrıca kırışıklıkları ve nem kaybını önleyerek yaşlanma sürecini geciktirmeye yardımcı olur. ECM, matris metalloproteinazlar (MMP'ler) tarafından ayrıştırılabilir [11]. Yaygın olarak kolajenaz olarak bilinen MMP-1, cildi oluşturan tip 1 kolajeni kısmen ayrıştırırken, jelatinaz olarak bilinen MMP-9 ayrıca MMP-1 tarafından hidrolize edilen kolajeni depolimerize eder [12]. Ek olarak, reaktif oksijen türlerinin (ROS) neden olduğu oksidatif stresin bu enzimlerin sentezini hızlandırarak ECM'nin bozulmasına ve nihayetinde kırışıklık oluşumuna yol açtığı bildirilmiştir [13]. Bu nedenle cildin pigmentasyonunu ve kırışmasını azaltarak cilt yaşlanmasını önlemek için TRP ve MMP'lerin ekspresyonunu engelleyebilen ve reaktif oksijen türlerini ortadan kaldırabilen antioksidanlar içeren doğal içeriklerin bulunması gerekmektedir [14]. Son zamanlarda, kozmetikler için fonksiyonel bileşenler esas olarak kara bitkilerinde geliştirildiğinden, yeni türler ve istikrarlı bir doğal içerik kaynağının keşfedilmesinde sınırlamalar ortaya çıkmaya başlamıştır [15]. Sonuç olarak, deniz bitkilerinden elde edilen doğal içeriklere olan ilgi ve talep artmış ve deniz kaynaklarından çeşitli yeni içerikler tanımlanmıştır [16].

Sargassum thunbergiikörfez ailesine ait bir kahverengi makroalg türüdür ve Kore ve Çin kıyılarına özgüdür [17]. Çözünmüş oksijeni tüketerek deniz yosunu ve balık çiftliklerine zarar veren bir deniz kirleticisi olarak kabul edilmektedir [18]. Bunlardan birkaçı geleneksel tedavide antelmintik ilaçlar veya kompost olarak kullanılmaktadır [19]. 1995'te ekstrakt; O zamandan beri, yeni biyoaktif bileşiklerin üretiminde kullanım için yüksek potansiyele sahip bir makroalg olarak dikkat çekmiştir [20]. Mekanik uzaklaştırma, süper kritik ekstraksiyon, mikrodalga ekstraksiyon ve ultra yüksek basınçlı ekstraksiyon dahil olmak üzere geleneksel prosesler kullanılarak biyoaktif bileşiklerin ekstraksiyonu, fazla solvent kullanma ihtiyacı, düşük ekstraksiyon verimi ve yüksek enerji tüketimi gibi sınırlamalarla ilişkilidir [21]. Yeni ekstraksiyon yöntemleri geliştirmek, makroalglerden biyoaktif bileşikleri güvence altına almak için teknolojik yeniliklerdeki en büyük zorluklardan biridir [22]. Geleneksel ekstraksiyon prosesleri arasında, ultrason destekli ekstraksiyon (BAE), basitliği, düşük ekipman maliyeti, farklı matrislerden yüksek ekstraksiyon verimi, düşük enerji tüketimi, daha düşük miktarda solvent gerekliliği ve daha kısa süreden dolayı özellikle çekicidir [23]. BAE'nin 20-100 kHz'lik yüksek frekanslı ses dalgalarını içerdiği bilinmektedir [24]. Ekstraksiyon verimi ultrason kullanılarak arttırılır ve bu, bitki dokularının bozulmasına, partikül boyutundaki azalmaya ve tekrarlanan akustik kavitasyon tarafından üretilen kabarcıkların çökmesinden kaynaklanan ekstraktların çözücüye artan kütle transferine bağlanır [25,26]. . Bu avantajlar nedeniyle BAE, gıda endüstrisinde karasal ve suda yaşayan biyokütleden fonksiyonel bileşenleri çıkarmak için yaygın olarak kullanılan ucuz, yenilenebilir ve verimli bir süreç olarak kabul edilmektedir [27].

Bu nedenle, bu çalışmada, S. thunbergii'den biyoaktif bileşikleri çıkarmak için BAE'yi uyguladık ve maksimum antioksidan ekstraksiyonuna izin veren optimal BAE koşullarını elde ettik.cilt beyazlatmakve istatistiksel tabanlı optimizasyon kullanılarak kırışık önleyici bileşenler ve S. thunbergii özütü ile TRP-1, MMP-1 ve MMP-9gen ekspresyonunun çeşitli önleyici etkileri cildi doğrulamak için değerlendirildi. -beyazlatma vekırışıklık önleyicitüretilmiş biyoaktif bileşiklerin etkileri ve fonksiyonel bir kozmetik bileşen olarak S. thunbergii özütünün kullanılma olasılığını teyit eder.

cistanche özü

2. Sonuçlar ve Tartışma

2.1. Deneyin Tasarımı

Modeli uydurmak, radikal süpürücü aktiviteyi (RSA), tirozinaz inhibe edici aktiviteyi (TIA) ve kollajenaz inhibe edici aktivitesini (CIA) tahmin etmek için yanıt yüzeyi metodolojisi (RSM) matematiksel modelinin doğruluğunu yorumlamak için çok önemlidir.S. thunbergiiAyıkla. RSM'nin merkezi kompozit tasarımı (CCD), bağımsız olarak veya yanıtları etkileyen iki bağımsız değişkenin etkileşimi ile üretilen yanıt yüzeyini istatistiksel olarak analiz eden deneysel bir tasarım yöntemidir. CCD, optimal koşulları [28–30] tahmin etmek için merkez noktayı ve çoklu eksen noktalarını kullanarak eğriliği etkili bir şekilde tahmin etme avantajına sahiptir. Bu çalışmada, S. thunbergiiextract'ın RSA, TIA ve CIA dahil olmak üzere yanıtlarını en üst düzeye çıkarmak için en uygun BAE koşullarını tahmin etmek için CCD uygulandı. 5 seviye (− , −1, 0, 1, ) kodlanmış ve CCD'ye dayalı olarak 17 deneysel çalıştırma gerçekleştirilmiştir (Tablo 1). Önceki çalışmalarımıza dayanarak, maksimum bağımlı değişken seviyesini elde etmek için ekstraksiyon süresi (5.30~18.7 dk), ekstraksiyon sıcaklığı (22.4~79.6 ◦C) ve etanol konsantrasyonu (yüzde 0~99.5) dahil olmak üzere 3 temel bağımsız değişken seçildi. [31]. İkinci dereceden regresyon modelinin geliştirilmesinde deneysel değişkenler aşağıdaki denkleme göre kodlanmıştır.

xi {{0}} (Xi − X0)/∆X (1)

burada xi, Xi değişkeninin kodlanmış değeridir; X0, X'in merkez noktasındaki değeridir ve ∆X, adım değişim değeridir.

Ekstraksiyon süresi, ekstraksiyon sıcaklığı ve etanol konsantrasyonu farklılıkları olan 17 koşul için deneysel değerler Tablo 2'de gösterilmiştir.

2.2. BAE Koşullarının RSA Üzerindeki Etkileri

Ekstraksiyon için uygulanan 17 koşula göreS. thunbergiiBAE kullanıldığında RSA, 12.0 dakika ekstraksiyon süresi, 51.0 ◦C ekstraksiyon sıcaklığı ve 50'de maksimum değer ile yüzde 2.37~89.9 idi.{{11} } yüzde etanol konsantrasyonu ve 12.0 dakika ekstraksiyon süresindeki minimum değer, 51.0 ◦C ekstraksiyon sıcaklığı ve yüzde 99,5 etanol konsantrasyonu; bu, etanol konsantrasyonunun RSA üzerinde en büyük etkiye sahip olduğunu gösterir (Tablo 2). Design-Expert yazılımı tarafından önerildiği gibi, ikinci dereceden bir regresyon denklemi seçildi ve üç bağımsız değişken ve yanıtın tümü için uygun hale getirildi. Kodlanmış değerler açısından, RSA, TIA ve CIA için öngörülen yanıtlar, çoklu regresyon analizi yoluyla ikinci dereceden regresyon denklemleri kullanılarak ifade edilebilir (Tablo 3). CCD model katsayıları Tablo 4'te özetlenen kuadratik regresyon modellerinin yanıt değişkenleri için varyans analizi (ANOVA) kullanılarak doğrulanmıştır. Deneysel ve tahmin edilen değerler arasındaki uyuşmayı temsil eden belirleme katsayısı (R2) 1'e yakınsa, şu anlama gelir. kabul edilebilir uyum iyiliği [32]. RSA ile optimal BAE koşulunu tahmin etmek için ikinci dereceden regresyon denkleminin R2'si 0.8554'tür ve elde edilen tahmin edilen değerin yüzde 85,5'inden büyük veya buna eşit olduğunun tam olarak açıklanabileceğini ve böylece ikinci dereceden regresyon denkleminin uygunluğunun fark edilmesini sağlar (Tablo 3).

Her model değişkeninin önemi, p değerleri kullanılarak belirlendi; bir p-değeri<0.05 indicates="" significance="" whereas="" a="" p-value="" of="">0.05, RSA [33] üzerinde önemsizliği gösterir. Optimizasyon çalışmasının ANOVA sonuçları, modelin anlamlı olduğunu gösterdi (p=0.0283), bu da belirlenen anlamlılık seviyesinden daha azdı ve anlamlılığın yüzde 5 içinde tanındığını gösteriyordu. Bu nedenle, sonuçlar, bağımsız değişkenler burada gösterilen aralıklar içinde olduğunda, modellerin S. thunbergii özütünün RSA, TIA ve CIA'sını verimli bir şekilde tahmin edebileceğini göstermektedir. Her bağımsız değişkenin önemini kontrol ettikten sonra, etanol konsantrasyonunun RSA(p=0.0025) üzerinde en fazla etkiye sahip olduğunu, buna karşın ekstraksiyon süresinin (p=0.7418) ve sıcaklığın (p) etkilerinin olduğunu bulduk.=0.1622)önemsizdi (Tablo 4).

Her bağımsız değişkenin bağımlı değişken üzerindeki etkisini değerlendirmek için, ekstraksiyon süresine, ekstraksiyon sıcaklığına ve andetanol konsantrasyonuna göre RSA'daki değişikliği bir pertürbasyon grafiği olarak ifade ettik (Şekil 1A).

Sonuç olarak, en yüksek değer 14.1 dakikalık ekstraksiyon süresinde ortaya çıktı ve daha sonra azaldı; maksimum değer, ekstraksiyon sıcaklığı ve etanol konsantrasyonu için sırasıyla 60.7 ◦C ve yüzde 46.2'de doğrulandı. Ancak, üç boyutlu yanıt yüzey eğrisi kullanılarak değişkenler arasındaki etkileşimler nedeniyle RSA'daki değişim oranı görselleştirilirken, ekstraksiyon süresindeki ve sıcaklıktaki değişimin RSA üzerinde çok az etkisi olurken, etanol konsantrasyonunun önemli bir etkisi oldu (Şekil 2A, B)

Bu, Kim ve arkadaşlarının çalışmasının sonuçlarına benzerdi. çözücü konsantrasyonunun Gynostemma pentaphyllum özütünün RSA'sı üzerindeki etkisinin belirlenmesi [34]. RSA bir maksimuma yükselme eğilimindeydi ve ardından etanol konsantrasyonu ile birlikte azaldı ve maksimum değeri etanol konsantrasyonunun yüzde 48.1'inde gösterdi. Distile su ve etanolün karıştırılmasından dolayı ekstraksiyon çözeltisinin polarite değişimi, G'nin antioksidan etkisinde bir artışa yol açar. pentaphyllum ve S. thunbergii özleri. Ek olarak, bu, alglerden sıcak su ekstraksiyonu ile üretilen suda çözünür biyoaktif bileşiklerin daha az antioksidan aktivite gösterdiğini ve yüzde 50 etanol kullanan ekstraktların daha yüksek antioksidan aktivite gösterdiğini bildiren sonuçlarla tutarlıdır, bu da ikili bir solventin (su ve etanol) biyoaktif bileşiklerin üretilmesi, ekstraksiyon veriminin arttırılmasında faydalıdır [35,36].

2.3. BAE Koşullarının TIA Üzerindeki Etkileri

TIA'nınS. thunbergiideneye uygulanan 17 BAE koşuluna göre ekstreler Tablo 2'de gösterilmektedir. Yüzde 92.6'lık maksimum TIA değeri 12.0 dk, 79.6 derece ve 50 olarak belirlendi.{{13} yüzde } ve minimum yüzde 55,3 değeri 12.0 dk, 51.0 derece ve 0 çıkarma yüzdesi olarak tahmin edildi.{{20}} çıkarma yüzdesi sırasıyla süre, ekstraksiyon sıcaklığı ve etanol konsantrasyonu. Sonuç olarak, ekstraksiyon sıcaklığı ve etanol konsantrasyonunun TIA üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğu doğrulandı. Deneysel sonuçlara dayanarak, CCD kullanarak ikinci dereceden bir regresyon denklemi türettik ve bunu optimal BAE koşullarını tahmin etmek için kullandık (Tablo 3). R2 0,8591'di ve tahmin edilen modelin değerleri ile deneysel veriler arasında yüzde 85,91'lik bir eşleşme olduğunu gösteriyordu ve ikinci dereceden regresyon denkleminin TIA tahmini için uygun olduğunu ima ediyordu. RSA, TIA ve CIA yanıtları için, hesaplanan F değerleri tablodaki F değerinden büyük olduğunda ve olasılık değerleri düşük olduğunda modeller oldukça anlamlıydı (p < 0,001);="" bu,="" her="" bir="" yanıt="" modelindeki="" bireysel="" terimlerin="" etkileşim="" etkisi="" açısından="" önemli="" olduğunu="" gösterir="" [37].="" ikinci="" dereceden="" regresyon="" denkleminin="" anlamlı="" etkisini="" istatistiksel="" olarak="" değerlendirmek="" için="" anova="" uygulandı.="" deneysel="" model="" anlamlıydı="" (p="0.0262)," bu="" da="" yüzde="" 5="" içinde="" bir="" anlamlılık="" düzeyine="" işaret="" ediyor="" (tablo="">

Diğer değişkenlerin değerlerini sabitlerken tek bir değişkenin değişmesiyle TIA değişim oranını görselleştirdiğimizde, etanol konsantrasyonuna bağlı TIA değişimi en büyüktü ve maksimum TIA yüzde 76,8 etanol konsantrasyonunda bulundu (Şekil 1B). Bağımsız değişkenlerin etkileşimleri, iki değişken aynı anda değiştirilerek üç boyutlu yanıt yüzey eğrisi kullanılarak görselleştirilir (Şekil 3).

Ekstraksiyon sıcaklığı ve süresi arttıkça TIA başlangıçta artar; ancak, varyasyon aralığı geniş değildir, bu nedenle ekstraksiyon sıcaklığı ve süresinin etkileşimli etkisinin ANOVA kullanılarak belirlendiği gibi önemli olmadığını yeniden doğruladık (Şekil 3A). Tersine, TIA yüzde 75,6 etanol konsantrasyonunda olduğu tahmin edilen maksimum TIA ile etanol konsantrasyonu ile tekrar arttı ve azaldı (Şekil 3B). Bu sonuç, Park ve diğerleri tarafından, yabani pirinç ekstraktından biyoaktif bileşiklerin ekstraksiyonunda yüzde 70~80 etanol konsantrasyonunun sudan daha yüksek bir TIA'ya yol açtığını gösteren çalışmanın sonuçlarıyla tutarlıdır [38]. Bu çalışma, etanol konsantrasyonunun TIA'da önemli bir değişken olduğunu ve etanol konsantrasyonu ile orantılı olarak değişme eğiliminde olduğunu bildirdi.

2.4. BAE Koşullarının CIA Üzerindeki Etkileri

CIA'i 17 koşulun her biri altında ölçtüğümüzde, maksimum CIA değerinin 16.0 dak, 63.0 derece ve 80'de yüzde 92,3 olduğunu bulduk.{{ yüzde 12}} ve minimum CIA 12.0 dak, 51.0 derece ve 0'de yüzde 48.1'di. Ekstraksiyon süresinin yüzde 0, ekstraksiyon sıcaklığı, ve etanol konsantrasyonu sırasıyla (Tablo 2). Ekstraksiyon süresi, sıcaklık ve etanol konsantrasyonuna göre oluşturulan ikinci dereceden regresyon denklemi, 0.9237'lik bir R2'ye sahipti; bu, yüzde 92.37'lik örnek varyasyonunun bağımsız değişkenlere atfedildiğini ve toplam varyasyonların yalnızca yüzde 7.63'ünün açıklanamadığı anlamına geliyordu. modeli (Tablo 3). Bu, CIA'in tahmin edilen ve deneysel değerleri arasında iyi derecede bir korelasyon olduğunu gösterir ve deneysel modeli tahmin etmedeki uygunluğunu tanır [39]. ANOVA, yüzde 1'lik bir anlamlılık seviyesinin altında istatistiksel anlamlılık (p=0.0037) gösterdi ve ekstraksiyon sıcaklığının (p=0.0030) ve etanol konsantrasyonunun (p=0.0006) olduğunu doğruladı. doğrusal terimler arasında CIA'yı önemli ölçüde etkileyen bağımsız değişkenler vardı (Tablo 4).

Her bağımsız değişkenin CIA üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, bir pertürbasyon grafiği kullanarak CIA'yı bir değişkendeki değişiklikle karşılaştırdık (Şekil 1C). Bağımsız değişken arttıkça, CIA başlangıçta maksimum değere yükseldi ve etanol konsantrasyonunun en etkili olduğu bulundu. Üç boyutlu tepki yüzey eğrisi, ekstraksiyon süresi ve etanol konsantrasyonu ile artma ve azalma eğiliminde olan bağımsız değişkenlerin etkileşimli etkileri nedeniyle CIA değişimini temsil ediyordu. CIA, artan ekstraksiyon süresi ve etanol konsantrasyonu ile arttı ve maksimum CIA'yı 12.1 dakikalık ekstraksiyon süresinde ve yüzde 73.6 etanol konsantrasyonunda gösterdi. Sabit bir ekstraksiyon süresinde ekstraksiyon sıcaklığı ve etanol konsantrasyonu ile CIA'deki değişiklikler de aynı olma eğilimindeydi; ancak, CIA'deki etanol konsantrasyonundaki değişikliklerin daha önemli olduğu doğrulandı (Şekil 4B).

CCD tarafından tahmin edilen maksimum CIA değeri, 14,5 dakikalık bir ekstraksiyon süresi, 65.1 ◦C'lik ekstraksiyon sıcaklığı ve yüzde 69,3'lük bir etanol konsantrasyonu ile yüzde 93,8 idi. Bu, daha önceki bir çalışmada bulunan yeşil çay ve beyaz çay-sıcak su özleri için CIA'nın yüzde 39,4'ü ve yüzde 40,3'ünün iki katından fazlaydı [40]. Sonuç olarak,S. thunbergiiözütün, kolajenaz aktivitesini sınırladığı için kırışıklıkları azaltmak için fonksiyonel bir kozmetik bileşen olarak kullanılabileceği kabul edildi.

2.5. BAE Sürecinin Optimizasyonu

çıkarılması için en uygun BAE koşulunu belirlemek içincilt beyazlatmakve S. thunbergii ekstraktından elde edilen kırışıklık önleyici biyoaktif bileşikleri kullanarak, RSA, TIA ve CIA'in bireysel yanıt yüzeylerini örtüştürerek bağımlı değişkenleri maksimize etmek için optimal bir nokta elde ettik (Şekil 5).

Bağımsız değişkenlerin aralığı, 5.30~18.7 dakikalık ekstraksiyon süresi, 22.4~79.6 ◦C ekstraksiyon sıcaklığı ve yüzde 0~99,5'lik etanol konsantrasyonu ile sınırlandırıldığında, optimal BAE koşulu tahmin edildi. 12.0 dk ekstraksiyon süresi, 65.2 ◦C ekstraksiyon sıcaklığı ve yüzde 53.5 etanol konsantrasyonu olacak. Optimal BAE koşulu, ekstraksiyon süresini en aza indirme kriterlerine dayalı olarak türetilmiştir, çünkü kısa bir işlem süresi, işlem maliyetlerini düşürmede faydalıdır. Elde edilen optimal BAE koşulu altında, RSA, TIA ve CIA'nın sırasıyla yüzde 86 yüzde 0,5'i, yüzde 88,3'ü ve yüzde 91,4'ü tahmin edildi. Daha önceki çalışmalarda, Yuan ve ark. S. thunbergii'den biyoaktif bileşiklerin ekstraksiyonu için optimal koşulların şu şekilde olduğunu bildirmiştir: 120 mL/g sıvı/katı oranı, 210 dakikalık ekstraksiyon süresi ve 97 ◦C ekstraksiyon sıcaklığı [41]. Yuan ve ark. biyoaktif bileşiklerin ekstraksiyonu için sıcak su ekstraksiyon koşullarını optimize etti, bu çalışmada biyoaktif bileşiklerin ekstraksiyonu için BAE koşulları optimize edildi. Bu nedenle, kısa ekstraksiyon süresi ve düşük sıcaklık altındaki BAE koşullarının, önceki sıcak su ekstraksiyon proseslerine kıyasla biyoaktif bileşikler için etkili bir ekstraksiyon prosesi olduğu kanıtlanmıştır.

Sonuçları doğrulamak için, CCD modeli tarafından tahmin edildiği gibi optimum koşulda üç tekrar ile bir doğrulama deneyi yapıldı. RSA, TIA ve CIA'in deneysel değerleri optimal koşul altında değerlendirildiğinde, sırasıyla yüzde 88,9 ± yüzde 3,11, yüzde 85,1 ± yüzde 2,76 ve yüzde 89,7 ± 4,09 idi ve bir tahmine dayalı model değerleriyle güçlü bir uyum (p > 0.05). Bu nedenle, deneysel değerler, BAE optimizasyon sonuçlarının güvenilirliğini kanıtlayan tahmin edilen değerlerle uyumludur.

2.6. TRP-1, MMP-1 ve MMP-9'nin mRNA İfadesi

TRP-1, epitel hücrelerinde tirozinaz stimülasyonu ve eumelaninsentezi ile etki gösteren cilt pigmentasyonunun önde gelen nedeni olduğu bilinen 5,6-dihidroksiindol-2-karboksilik asit oksidaz olarak işlev görür [42]. Buna karşılık, MMP-1 ve MMP-9, dermal tabakanın yüzde 90'ını oluşturan tip 1 kollajeni parçalayarak kollajen bozulmasına, elastikiyet kaybına ve cilt yaşlanmasına neden olur [43].

Bu çalışmada,S. thunbergiiekstrakt, istatistiksel tabanlı bir optimizasyon yoluyla oluşturulan optimal BAE koşulları kullanılarak üretildi ve ekstrakt, değerlendirmek için B{{0}}F0 hücre hatlarında test edildi.cilt beyazlatmakvekırışıklık önleyiciözellikleri, TRP{{0}}, MMP-1 ve MMP-9'nin RNA ifade düzeylerini karşılaştırarak. Melanin sentezi ile ilgili önemli bir gen olan TRP-1'nin ekspresyon seviyesinin, S'de konsantrasyona bağlı olduğu bulundu. thunbergii özütü ve kontrol grubu ile karşılaştırıldığında 1 ve 2 mg/mL özüt ile tedaviden sonra önemli ölçüde azaldı (p < 0.05)="" (şekil="">

Ayrıca MMP{{{{10}}} ve MMP-9 ifadelerinin S. thunbergii özü konsantrasyonuyla orantılı olarak azaldığını da bulduk (Şekil 6B, C). Özellikle, MMP-1 ve MMP-9 ekspresyon seviyeleri, kontrol grupları ile karşılaştırıldığında, 2 mg/mL S. thunbergii özütü ile tedavi edilen grupta sırasıyla yüzde 58.6 ve yüzde 78.8 oranında inhibe edildi (p < 0.05).="" yukarıdaki="" sonuçlardan,="" optimal="" bae="" koşulları="" altında="" üretilen="" s.="" thunbergii="" özütünün,="" b16-="" içinde="" trp-1,="" mmp-1="" ve="" mmp-9="" mrna="" ifadelerini="" etkili="" bir="" şekilde="" engelleyebildiği="" doğrulandı.="" f0="" hücre="" çizgileri,="" böylece="" melanin="" üretimini="" ve="" kollajen="" ayrışmasını="" inhibe="">

2.7. S. thunbergii Ekstraktında Kafeik Asit Tanımlanması

Önceki bir deneyde, BAE, antioksidan, cilt beyazlatma vekırışıklık önleyiciS. thunbergii özütünün etkileri optimize edildi; ancak ekstrakttaki biyoaktif bileşenleri keşfetmek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardı. Bu nedenle fenolik bileşiklerinS. thunbergiiözüt, sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) kullanılarak tanımlanmıştır, çünkü bu teknoloji, fenolik bileşiklerin yapısal karakterizasyon ile doğru bir şekilde tanımlanmasını ve doğal kaynaklardaki küçük moleküllerin saptanmasını sağlar. Piklerin tanımlanması, standartların alıkonma süresine (RT), öncü iyonlara ve ilgili parça iyonlarına dayanıyordu. LC-MS/MS sisteminde, kafeik asit, oda sıcaklığında 1.95 dakikalık bir zirve gösterdi (Şekil 7).

Negatif iyon modunda, kütle spektrumundaki iki iyon zirvesinden birini gösteren m/z 179.10 iyonu, kafeik asit moleküler formülüne ve m/z 135.56'nın ayrı fragman iyonuna karşılık gelir. Genel olarak, çarpışma kaynaklı ayrışmadan sonra fenolik bileşikler, karboksilik asit grubundan CO2 (44 Da) kaybı ile karakterize edilen bir fragman iyonu üretir. Bu kayıp nedeniyle, 44-Da CO2'nin m/z 179.10'da teiyondan sonraki bölünmesi, m/z 135.56'da iyonu verdi. Kafeik asit, bitkiler tarafından ikincil metabolizmanın şikimat yolu yoluyla fenilalanin veya tirozinden üretilen bir C6-C3 fenolik bileşiktir ve sinnamik asit (veya fenilpropanoid) sınıfının bir temsilcisidir. İnsan diyetine çeşitli sebze ve meyveler yoluyla girer [44]. Son yıllarda, çok sayıda çalışma, kafeik asit tüketiminin, oksidatif stres ile ilişkili çeşitli hastalıkları önlemeye yardımcı olan antioksidan özellikleri nedeniyle sayısız sağlık yararına sahip olduğunu göstermiştir [45]. Bu nedenle, fenolik bileşiklerle ilgili bu çalışma çok faydalıdır ve kalite kontrol sürecinde ve S. thunbergiias'ın gelecekteki keşiflerinde önemli bir rol oynayabilir.cilt beyazlatmakvekırışıklık önleyiciözellikleri.

3. Malzemeler ve Yöntemler

3.1. Malzemeler ve Reaktifler

S. thunbergii2 Ekim'de Kore, Jeju Adası'nın güney kıyısından toplandı019 Para Jeju'da (Jeju, Kore) satın alındı. Deneyden önce, S. thunbergii bir öğütücü (HMF-3000S, Hanil Co., Wonju, Kore) kullanılarak 0.42 mm'nin altında toz haline getirildi ve -5◦C'de buzdolabında saklandı. Çözücü ekstraksiyonu için etanol SamchunChemical Co.'dan (yüzde 95.0 v/v, Pyungtaek, Kore) satın alındı. Kontrol testleri için standart olarak kullanılan askorbik asit (C vitamini), arbutin ve kojik asit, Sigma-Aldrich Co., Ltd.'den (St. Louis, MO, ABD) satın alındı. Bu deneyde kullanılan diğer tüm kimyasallar analitik saflıktaydı.

3.2. BAE Süreci

Numunenin kurutulmuş tozu (1 g), 10 mL çözücü ile bir basınçlı kaba (XF100, AntonPaar Co., Ltd., Graz, Avusturya) yerleştirildi. ve bir vorteks karıştırıcı (VM-10, Daihan sci. Co., Wonju, Kore) kullanılarak 1 dakika karıştırıldı. Bu numuneler, 5.30~18.7 dakikalık bir ekstraksiyon süresi, 22.4~79.6 ◦C'lik ekstraksiyon sıcaklığı ve yüzde 0.0~99.5'lik etanol konsantrasyonu ile CCD'den türetilen 17 ayrı BAE koşulu altında ekstrakte edildi. BAE, bir dijital zamanlayıcı ve sıcaklık kontrolörü ile donatılmış 200 W elektrik gücü ve 40 kHz frekansa sahip bir ultrason cihazı (SD-D250H, Sungdong Co., Seul, Kore) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ekstraksiyondan sonra süpernatan, bir santrifüj (1236R, Labogene Co., Daejeon, Kore) kullanılarak 10 dakika boyunca 10 000 rpm'de ayrıldı. Daha sonra çözelti 0.45 µm gözenekli selüloz asetat disk filtreden süzüldü ve RSA, TIA ve CIA analizleri için kullanıldı (Şekil 8).

3.3. Deney Tasarımı

Design-Expert yazılımı (Ver. 8.0, Stat-Ease, Minneapolis, MN, ABD) biyoaktif bileşiklerin ekstraksiyonunu maksimize etmek için kullanıldı.S. thunbergiiCCD kullanarak BAE koşullarının optimizasyonu yoluyla. Bağımsız değişkenler olarak ekstraksiyon süresi (X1), ekstraksiyon sıcaklığı (X2) ve etanol konsantrasyonu (X3) gibi anahtar değişkenler seçilmiş ve bunlar 5 (−1,68, −1, 0, 1, 1,68) seviyede kodlanmıştır. , Tablo 1'de gösterildiği gibi RSA, TIA ve CIA, ana bağımsız değişkenlerden etkilenen bağımlı değişkenler olarak belirlendi. Deneysel değerler, CCD tarafından oluşturulan 17 koşul altında elde edildi ve her bağımsız ve bağımlı değişkenin korelasyonu, bir kuadratik regresyon denklemi kullanılarak nicelendirildi. [46]. Bağımsız değişkenlerdeki değişimlere göre bağımlı değişken değerlerini hesaplamak için aşağıdaki ikinci dereceden regresyon denklemi kullanılmıştır:

Y = β0 + k ∑ i = 1 βiXi + k ∑ i = 1 βiiX 2 i + k ∑ i>1 ijXiXj(2)

burada Y bağımlı değişkenleri (RSA, TIA, CIA) temsil eder, 0 bir sabit katsayıdır ve k bir test değişkenidir. i, ii ve ij sırasıyla doğrusal, ikinci dereceden ve etkileşim terimleri için regresyon katsayılarıdır.

Tahmin edilen modeli bağımsız değişken üzerinde değerlendirmek için, ekstraksiyon sıcaklığı, süresi ve etanol konsantrasyonu dahil olmak üzere her bir değişkenin etkisini değerlendirmek için yüzde 95 güven düzeyine sahip bir varyans analizi (ANOVA) gerçekleştirilmiştir. Ayrıca regresyon modelinin uygunluğunu belirlemek için regresyon modelinin p değeri olan regresyon katsayısı (R2) kullanılmıştır [47].

3.4. Radikal Temizleme Aktivitesi (RSA) Testi

Antioksidan etkisiS. thunbergiiözü, değiştirilmiş DPPH tahlili [48] kullanılarak 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH, Sigma-Aldrich) serbest radikalleri üzerindeki süpürme aktivitelerine göre değerlendirildi. Stok çözelti, 0.1 M DPPH'nin metanol ile çözülmesiyle hazırlandı ve daha sonra oda sıcaklığında saklandı. Metanol ile seyreltilmiş DPPH çözeltisi, bir UV-visspektrofotometre (Optizen 2120UV, Mecasys, Daejeon, Kore) kullanılarak 517 nm'de 1.0 ± 0.02'lik bir absorbans elde etmek için hazırlandı. . 1.25 mL DPPH solüsyonu, 0.25 mL seyreltilmiş S. thunbergii özü (50-500 mg/mL) ile karıştırıldı ve oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika beklemeye bırakıldı. Absorbans değişimi 517 nm'de izlendi ve RSA aşağıdaki formül kullanılarak hesaplandı:

RSA ( yüzde )={1 −Abs (örnek) / Abs (kontrol)} × 100 (3)

burada Abs(kontrol) kontrolün absorbansı ve Abs(numune) ekstraktın absorbansıdır. Apozitif kontrol olarak aynı konsantrasyonda askorbik asit (50-500 mg/mL) kullanıldı.

3.5. Tirozinaz İnhibitör Aktivitesi (TIA) Testi

TIA, Yagi [49] tarafından bildirilen yönteme göre ölçüldü. Reaksiyon karışımı, 0.4 mL sodyum fosfat tamponu (67 mM, pH 6.8), 0.2 mL 10 mM3,{{10}} içeriyordu. dihidroksi fenilalanin (L-DOPA, Sigma-Aldrich), 0.2 mL mantar tirozinaz (125 birim/mL, Sigma-Aldrich) ve 0.2 mL özüt çözeltisi. Reaksiyon 25 ◦C'de 30 dakika süreyle gerçekleştirildi. Reaksiyondan sonra 475 nm'de absorbans ölçüldü ve sonuçlar kontrol ile karşılaştırıldı. TIA aşağıdaki denkleme göre hesaplanmıştır:

TIA ( yüzde )={1 −Abs (örnek) / Abs (kontrol)}× 100 (4)

burada Abs(kontrol) kontrolün absorbansı ve Abs(numune) ekstraktın absorbansıdır.

cistanche tirozinaz aktivitesini azaltır

3.6. Kolajmaz İnhibitör Aktivitesi (CIA) Testi

CIA testi, Wünsch ve Heindrich [50] tarafından bildirilen yönteme göre yapıldı. Kollajenaz (0.2 mg/mL, Sigma-Aldrich), 0.1 M Tris–HCl(pH 7.5) içinde çözüldü. Substrat, 4-fenilazobenziloksikarbonil-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg (0.4 mg/mL,Sigma-Aldrich), 0.1 M Tris–HCl içinde çözüldü. (pH 7.5) 4 mM CaCl2 içerir. Kollajen hidrolizini değerlendirmek için reaksiyon karışımı, kolajenaz (75 µL), numune (50 µL) ve substrat çözeltileri (125 µL) içeriyordu. Kontrol grubu için ekstrakt yerine reaksiyon karışımına 50 µL distile su ilave edildi. Karışım 37 ◦C'de 30 dakika inkübe edildi ve enzim reaksiyonlarının sonlandırılması için 0.25 mL 25 mM sitrik asit ilave edildi. Etil asetat ile karıştırıldıktan sonra süpernatan ayrılmış ve absorbans 320 nm'de ölçülmüştür. İnhibisyon yüzdesi aşağıdaki formüle göre hesaplandı:

CIA ( yüzde ) ={1 −Abs (örnek)/Abs (kontrol)}× 100 (5)

burada Abs(kontrol) kontrolün absorbansı ve Abs(numune) ekstraktın absorbansıdır.

3.7. Modelin Doğrulanması

BAE için optimize edilmiş koşullar (ekstraksiyon süresi, ekstraksiyon sıcaklığı ve andetanol konsantrasyonu), antioksidan aktivitenin in vitro değerlendirmesi ile doğrulandı,cilt beyazlatmak, ve kırışıklık önleyici etkileri (RSA, TIA ve CIA) CCD'den elde edilen değerlere göre. Tüm yanıtlar, BAE'nin optimize edilmiş koşulu altında yeniden belirlendi. Geçerliliğini değerlendirmek için deneysel değerler, model tarafından tahmin edilen değerlerle karşılaştırıldı. Ana bileşenleri bulmak için optimal koşul altında üretilen ekstraktlar üzerinde LC-MS/MS analizi yapıldı.S. thunbergiiAyıkla.

3.8. Hücre kültürü

B{{0}}F0 melanom hücreleri Korean Cell Line Bank Co.'dan (KCLB, Seul, Kore) satın alındı ​​ve Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM, Gibco BRL Co., Ltd., Gaithersburg) kültürlendi. , MD, USA) içeriği yüzde 10 fetal sığır serumu ve yüzde 1 penisilin (Thermo Fisher Sci. Inc., Waltham, MA, ABD). Hücreler 37°C'de yüzde 5 CO2(MCO-5AC, Sanyo Co., Ltd., Tokyo, Japonya) ile inkübe edildi ve 25 cm2'lik kültür şişelerinde tek tabakalı olarak büyütüldü. Bir hücre çizgisi yaklaşık yüzde 80 birleşme noktasına ulaştığında, hücrelerin uygun şekilde büyümesini ve sağlığını sağlamak için tek hücreler elde etmek için tripsin-EDTA ile muamele edilerek alt kültürleme yapıldı.

3.9. Ters Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR)

RT-PCR gerçekleştirmek için, bir 24-kuyulu plakanın oyuğu başına 1.0 × 106 hücre kaplandı. TotalRNA, bir AccuPrep evrensel RNA ekstraksiyon kiti (BioneerCo., Daejeon, Kore) ile hücrelerden ekstrakte edildi. Ters transkripsiyon, amfiRivert cDNA sentezi platin ana karışımı (GenDEPOTCo., TX, ABD) kullanılarak 0.5 ug toplam RNA forcDNA sentezi ile gerçekleştirildi. cDNA, TRP-1, MMP-1, MMP-9 ve -aktin gibi her bir primer ile amplifiye edildi (Tablo 5). PCR, 1 uL cDNA, 10 uLTaq Premix (Genet bio, Daejeon, Kore) ve 9 uL dietilpirokarbonat (DEPC) içeren 20 uL'lik bir hacimde gerçekleştirildi. PCR koşulları aşağıdaki gibidir: 5 dakika boyunca 94 ◦C, ardından 95 ◦C'de 5 saniye, 60 ◦C'de 31 saniye (TRP-1 için) veya 30 saniye için 55 ◦C (MMP{ için) {26}}) veya 30 s için 59 ◦C (MMP-9 için) ve 30 s uzatma için 72 ◦C. Her PCR ürünü yüzde 1 agaroz jel üzerinde elektroforezlendi ve Gel Doc TM XR plus sistemi ve nicelik bir yazılımı (Bio-Rad Co., Hercules, CA, ABD) kullanılarak görselleştirildi. Bir temizlik geni olarak -aktin, TRP-1, MMP-1 ve MMP-9 ekspresyon seviyelerini normalleştirmek için kullanıldı.

3.10. LC-MS/MS Analizi

S. thunbergii özütünün kromatografik ayrımı, bir Finni gan Surveyor Plus HPLC Sistemi (Thermo Electron Corporation, San Jose) kullanılarak yapıldı. Ayırma, 150 mm kolon uzunluğuna, 3 mm iç çapa ve 3 µm partikül boyutuna (RESTEK Co., Bellefonte, PA, ABD) sahip bir ROC C18 kolonu ve 0 gradyan elüsyonu kullanılarak gerçekleştirildi. sudaki yüzde formik asit (hareketli faz A) ve asetonitrilde (mobil faz B) yüzde 0,1 formik asit 0.2 mL/dk'lık bir akış hızında, aşağıdaki gibi: yüzde 5 ila 11 dakika için yüzde 100 mobil faz B, 4 dakika için yüzde 100 ila yüzde 5 mobil faz B, 2 dakika için yüzde 37 mobil faz B, 0,1 dakika için yüzde 37 ila yüzde 10 mobil faz B ve 2,4 dakika için yüzde 10 mobil faz B . Enjeksiyon hacmi 10 µL idi ve kolon 30 ◦C'de tutuldu. Kütle spektrometrik deneyleri, bir Thermo Finnigan TSQ Quantum Ultra EMR üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi (Thermo Fisher Sci. Inc., Waltham, MA, ABD) kullanılarak yapıldı. S. thunbergii özütü, özellikle turbo iyon püskürtme modunu kullanarak, elektrosprey iyonizasyon (ESI) kullanılarak negatif iyon elektrosprey iyonizasyonu ile analiz edildi. Negatif modda S. thunbergii ekstraksiyonunun iyonizasyonu için ESI kaynak ayarları aşağıdaki gibidir: gaz sıcaklığı, 270 ◦C;gaz akışı, 19 L/dak; kılıf gazı sıcaklığı, 400 ◦C; kılıf gazı akışı, 10 L/dak; kılcal voltaj, 3000 V; meme voltajı, 1000 V. Kütle spektrumları, çarpışma gazı olarak nitrojen kullanılarak 100 ve 500 m/z arasında negatif iyon modunda kaydedildi. Ana bileşenlerin analiziS. thunbergiiekstrakt, LC-MS/MS sonuçlarının elde edilen moleküler iyonları ve parçalanma modellerini literatürdeki verilerle ve standart bileşikler için bir kütle kütüphanesi ile karşılaştırarak gerçekleştirildi.

4. Sonuçlar

Bu çalışma, BAE süreci için antioksidanı en üst düzeye çıkarabilecek en uygun koşulları önerdi,cilt beyazlatmak, vekırışıklık önleyiciGüneydoğu Asya'nın subtropikal kıyılarında yaygın olan, deniz kirliliğine ve ekolojik rahatsızlığa neden olan S. thunbergii'den katma değerli biyoaktif bileşiklerin üretimi için etkiler. BAE optimizasyonunu gerçekleştirmede en etkili değişken, su ve etanolden oluşan ikili çözücülerin kullanımının ve konsantrasyon tayininin BAE'de önemli bir husus olduğunu doğrulayan etanol konsantrasyonuydu. RSA, TIA ve CIA'in eşzamanlı optimizasyonu için her bir yanıt yüzeyi örtüşürken, 12.0 dakikalık bir ekstraksiyon süresi, 65.2 ◦C'lik bir ekstraksiyon sıcaklığı ve yüzde 53,5'lik bir etanol konsantrasyonu tahmin edildi, bu koşullar altında RSA yüzde 86,5 değerleri, yüzde 88,3 TIA değerleri ve yüzde 91,4'lük CIA değerleri belirlendi.

TRP-1, MMP-1 ve MMP-9'nin ekspresyon üzerindeki etkileri, optimal BAE koşulları altında üretilen S. thunbergii özütü kullanılarak mRNA düzeyinde değerlendirildiğinde, S. thunbergii özütünün doğrulandı. TRP-1, MMP-1 ve MMP-9 mRNA seviyelerini azaltabilir ve böylece melanin üretimini ve ayrıca cilt kollajen ayrışmasını önleyebilir.

Böylece,S. thunbergiiözütün, kozmetik, gıda ve ilaçlar için fonksiyonel bileşenlerin üretiminde deniz biyokütlesinden yeni bir kaynak olarak yaygın bir şekilde kullanılması beklenmektedir. Ek olarak, BAE kullanılarak biyoaktif bileşiklerin çıkarılması sürecinin, süreç geliştirme hakkında temel veriler sağladığına ve katkıda bulunduğuna inanılmaktadır. S.thunbergii ve diğer makroalglerden yeni fonksiyonel bileşenlerin üretiminde optimal ekstraksiyon koşullarının belirlenmesi.