Küçük Ekstrasellüler Veziküller İçinde Kapsüllendiğinde Delphinidin'in Anti-Anjiojenik Etkilerinin Arttırılması Bölüm 1

Lütfen iletişime geçinoscar.xiao@wecistanche.comdaha fazla bilgi için

Soyut:(1)Arka plan: Antosiyanin delphinidin, hem in vitro hem de in vivo anjiyogenez modellerinde anti-anjiyojenik özellikler sergiler. Bununla birlikte, in vivo delphinidin zayıf bir şekilde emilir, bu nedenle mütevazı biyoyararlanımı ve stabilitesi, anti-anjiyojenik etkilerini azaltır. Mevcut çalışma, delphinidin'in hem stabilitesini hem de etkinliğini arttırmak için küçük hücre dışı vezikül (EV) özelliklerinden yararlanmaktadır. sEV'ler içinde kapsüllendiğinde, delphinidin insan aort endotel hücreleri (HAoEC'ler) üzerindeki farklı anjiyogenez aşamalarını inhibe eder.(2) Yöntemler: olgunlaşmamış dendritik hücrelerden sEV'ler üretildi ve delphinidin ile yüklendi. sEV'ler içindeki delphinidin metabolitlerini değerlendirmek için UHPLC-HRMS'ye dayalı bir yöntem uygulandı. Çoğalma testi, nitrik oksit(NO) üretimi ve Matrigel testi HAoEC'lerde değerlendirildi.(3)Sonuçlar: Delphinidine, 3-O- -rutinosit ve Peonidin-3-galaktozid her ikisinde de bulundu. delphinidin ve delphinidin yüklü sEVs.sEV yüklü delphinidin, serbest delphinidin potensini endotelyal proliferasyon için 2-kat, endotelyal NO üretimi için10-kat ve kılcal damar benzeri oluşum için 100-kat artırdı . Bu nedenle, sEV yüklü delphinidin, anjiyogenezin farklı basamakları üzerinde etkiler gösterir. (4) Sonuçlar: sEV'ler, kanser ve aşırı vaskülarizasyonla ilişkili patolojiler de dahil olmak üzere, anjiyogenez ile ilgili hastalıkları hedeflemek için delphinidin sağlamak için umut verici bir yaklaşım olarak düşünülebilir.

Daha fazla bilgi için lütfen buraya tıklayın

anahtar kelimeler: delfinidin; endotel hücreleri; damarlanma; küçük hücre dışı veziküller; kanser; kardiyovasküler hastalıklar

1. Giriş

Polifenoller esas olarak bitki türevli yiyecek ve içeceklerde bulunur ve bitkisel besinlerin tat ve rengini sağlar. Ayrıca, epidemiyolojik çalışmalar, polifenoller açısından zengin diyetlerle ilişkili kardiyovasküler risk ve kanserde daha büyük bir azalma olduğunu bildirmiştir [1-3.

Delphinidin (2-(3,4,5-tri-hidroksifenil)kromenilyum-3,5,7-triol), pigmentli sebze ve meyvelerde, özellikle de meyvelerde bol miktarda bulunan bir antosiyanindir. ve kırmızı üzüm. Daha önce delphinidin'in, hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun artışını ve tirozin kinazların aktivasyonunu teşvik etmek için toplam kırmızı şarap polifenolik bileşikleri ekstresi ile aynı farmakolojik profile sahip olduğunu ve östrojen reseptörü alfanın ardından endotelyal nitrik oksit (NO) üretimine yol açtığını bildirmiştik. (ERo)stimülasyon [4]. Ek olarak, ERo aracılığıyla delphinidin'in kardiyovasküler risk faktörleri olan hastalarda T lenfosit proliferasyonunu ve farklılaşmasını değiştirebilen immünomodülatör ve antiinflamatuar bir molekül gibi davrandığını bildirdik [5].

Son olarak, delphinidinin hem in vitro hem de in vivo anjiyogenez modellerinde anti-anjiyojenik özellikler gösterdiğini ve melanomun in vivo tümör büyümesini azalttığını gösterdik [6-10]. Gerçekten de delphinidin, siklin D1- ve A'ya bağlı yolakların [6,7] katılımıyla endotel hücre proliferasyonunu inhibe eder. Ayrıca, VEGF'nin neden olduğu mitokondriyal biyogenezin Akt yolu yoluyla delphinidin tarafından inhibisyonu ile anti-anjiyogenik etkisi arasında olası bir ilişki olduğunu bildirdik [8]. Ayrıca delphinidin, spesifik olarak endotelyal hücre proliferasyonu üzerinde etki ederek melanom tümör hücrelerinin in vivo tümör büyümesini azaltır. Mekanizma, VEGFR2 sinyali, MAPK, PI3K yoluyla ve CREB/ATF1 faktörleri üzerindeki transkripsiyon seviyesinde VEGF ile indüklenen proliferasyonun inhibisyonu ile phopsphodiesterase2[9]'nin inhibisyonu arasında bir ilişkiye işaret eder. En ilginç olarak, yüksek dozlarda delphinidin, bir sıçan femoral arter ligatür modeli kullanılarak iskemi tarafından tetiklenen bir in vivo anjiyogenez modelinde neovaskülarizasyonu azaltmıştır [10]. Birlikte, bu veriler, delphinidin'in kardiyovasküler bozukluklar ve tümörijenez ile ilişkili patolojileri önlemek için umut verici bir bileşik olduğunu göstermektedir.

Bununla birlikte, delphinidin, özellikle endotel bağımlı NO aracılı vazodilatasyonu indüklemede, toplam kırmızı şarap polifenol özleri ile karşılaştırıldığında bu yararlı etkileri indüklemede daha az etkilidir [11]. Gerçekten de delphinidin ışığa duyarlıdır ve yalnızca pH'ta kararlıdır.<3; therefore,="" it="" degrades="" rapidly="" under="" physiological="" conditions.="" moreover,="" delphinidin="" is="" poorly="" absorbed,="" and="" thus="" its="" modest="" bioavailability="" and="" stability="" reduce="" its="" effects="" both="" in="" vitro="" and="" in="" vivo.="" the="" measurement="" of="" delphinidin="" and="" its="" conjugated="" metabolites="" in="" plasma="" indicates="" its="" low="" bioavailability="" [12].="" hence,="" it="" is="" important="" to="" find="" new="" strategies="" to="" enhance="" delphinidin="" bioavailability="" and="">

Bu tür sorunların üstesinden gelmek için bir strateji, bir ilaç dağıtım sistemi olarak hücre dışı veziküllerin (EV'ler) kullanılmasıdır. Yakın zamanda, büyük ve küçük EV'ler (sEV'ler) dahil olmak üzere EV'lerin, klasik nano formülasyonların sınırlamalarının üstesinden gelen farklı hücre altı bölme özelliklerinden kaynaklanan nano yapılar olduğunu bulduk. sEV'ler kararsızlığı ve immünojenisiteyi azaltır, biyoyararlanımı ve hedef seçiciliği geliştirir [13]. Bazı raporlar, polifenollerle tedavi edilen hücreler tarafından salınan EV'lerin koruyucu etkilerinin altını çiziyor. Gerçekten de, kurkumin ile tedavi edilen hücrelerden miR-21 ile zenginleştirilmiş sEV'ler, tümör hücresi büyümesini ve anjiyogenezi azalttı, endotel geçirgenliğini düzeltti ve farklı kanser hücre dizilerinin hücre canlılığını azalttı [14]. Ek olarak, epigallocatechin gallate ile tedavi edilen hücrelerden elde edilen miR-16-zenginleştirilmiş sEV'ler, tümör büyümesini baskıladı [15].

Cistanche bağışıklığı artırabilir

Bu çalışmada, insan aort endotel hücreleri (HAoEC'ler) kullanılarak delphinidin.sEV yüklü delphinidin kaynaklı anjiyogenez inhibisyonunun hem stabilitesini hem de etkinliğini arttırmak için sEV özelliklerinden faydalandık. Bu EV'ler içindeki metabolitler açısından delphinidin içeriği de belirlendi.

2. Malzemeler ve Yöntemler

2.1.Hücre Kültürü

HAoEC'ler (Promocell, Heidelberg, Almanya), yüzde 1 penisilin/streptomisin (Sigma-Aldrich, St. Quentin Fallavier, Fransa) ile takviye edilmiş endotel hücre büyüme ortamı MV2 (Promocell) içinde 37 derecede ve yüzde 5 CO2'de kültürlendi. Hücreler yüzde 70/80 konfluensta tripsinize edildi ve tüm deneyler için pasajlar 3 ve 6 arasında kullanıldı.

JAWS II dendritik hücre çizgisi, American Type Culture Collection'dan (CRL-1194; ATCC; Manassas, VA, ABD) satın alındı. JAWS II hücreleri, ribonükleositler ve deoksiribonükleositler içeren ve yüzde 20 fetal sığır serumu (FBS) (Gibco, Life) ile takviye edilmiş alfa minimum esansiyel ortamdan (Lonza; Basel, İsviçre) oluşan eksiksiz bir kültür ortamında 37 derece ve yüzde 5 CO'de büyütüldü. Teknolojiler; Grand Island, NY, ABD),4 mM L-glutamin(Lonza),1 mM sodyum piruvat(Lonza), yüzde 1 penisilin/streptomisin(penisilin/-streptomisin, Sigma-Aldrich) ve 5ng/mL murin GM-CSF (Miltenyi Biotec; San Diego, CA, ABD). Hücreler yüzde 70/80 konfluensta tripsinize edildi ve tüm deneyler için pasajlar 8 ve 16 arasında kullanıldı.

2.2.sEVİZOLASYON

JAWS II hücreleri, tam bir büyüme ortamı içinde bir T175 hücre kültürü şişesi içinde 5x10 derecelik bir hücre yoğunluğunda ekildi ve herhangi bir izolasyondan önce FBS'de aç bırakıldılar. Hücre ortamı, sırasıyla hücreleri ve hücre kalıntılarını çıkarmak için 300xg ve 2000xg'de 10 dakika boyunca santrifüjlendi. Ortaya çıkan süpernatan, büyük EV'leri hariç tutmak için 30 dakika boyunca 20000× g'de santrifüjlendi. Süpernatan, sEV'leri pelet haline getirmek için 200,000×g'de (Optima MAX-XP ultrasantrifüj ve MLA-50 rotor, Beckman Coulter, Villepinte, Fransa) santrifüjlendi. Daha sonra, sEV'ler fosfat tamponlu tuzlu su (PBS)(NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HP0410 mM, KH2P041.8 mM, pH=7.4) içinde yıkandı ve 200.000 x g'de yeniden santrifüjlendi. Son olarak, sEVpelletler 1 mL PBS içinde yeniden süspanse edildi ve sonraki kullanıma kadar 4 derecede saklandı. sEV'lerin miktarı, standart olarak sığır serum albümini (Sigma-Aldrich) ile Lowry yöntemi kullanılarak belirlendi. sEV'ler 10 ug/mL'de kullanıldı.

2.3. Delphinidin Yükleniyor

Delphinidin, 10 ug/mL konsantrasyona ulaşmak için yüzde {{10}},1 DMSO ile pH{{0}} su içinde hazırlandı. sEV'ler (2 mg) eklendi ve çözelti karıştırıldı ve ardından 10 dakika vortekslendi. 200,{8}}xg'de 2 saatlik ultrasantrifüjden sonra, elde edilen pelet 1 mL yüzde 0.1 DMSO veya PBS içinde yeniden oluşturuldu. Delphinidin absorbansı 530 nm'de ölçüldü ve farklı konsantrasyonlarda (0,1 ila 10 ug/mL) serbest delphinidin ile standart bir eğri yapıldı. sEV yüklemesinin etkinliğinin yüzdesi, kullanılan delphinidin konsantrasyonundan bağımsız olarak yüzde 9'du (veriler gösterilmemiştir). Böylece, delphinidin miktarı, 10 ug/mL sEV içinde istenen konsantrasyonu (0,1 ila 5 ug/mL) elde edecek şekilde ayarlandı. Serbest delphinidin'i çıkarmak için bu veziküller iki kez yıkandı.

2.4. Nanoparçacık İzleme Analizi (NTA)

sEV örnekleri steril NaCl0%0,9 içinde seyreltildi ve boyut dağılımı NanoSight NS300 (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK) kullanılarak analiz edildi. Videolar kaydedildi. NTA yazılımı, Stokes-Enstein denklemini kullanarak boyut dağılımını belirledi.

2.5. İletim Elektronik Mikroskobu

sEV'ler ilk olarak 0.1 M PBS'de yüzde 2.5 glutaraldehit (LFG Distribution, Lyon, Fransa) ile 4 derecede 4 derecede sabitlendi. Daha sonra, sEV'ler iki kez 100 ile PBS'de yıkandı, 000×g 70 dakika santrifüjleme. sEV'ler 2 dakika boyunca bakır ızgaralar üzerinde biriktirildi ve 20 μL uranil asetat ile negatif olarak boyandı ve yüzde 5 etanolde yüzde 50 seyreltildi ）30 sn. Izgaralar daha sonra 120 keV'de çalıştırılan bir Jeol JEM 1400 mikroskobu (Jeol, Croissy sur Seine, Fransa) ile gözlemlendi.

2.6. sEV'lerde Delphinidin Metabolitlerinin Belirlenmesi

Numune hazırlama aşağıdaki gibidir -250 μL metanol （MeOH） PBS'de sulandırılmış 10 ug sEV'ye ilave edildi ve numuneler 20 dakikalık bir ultrasonikasyona tabi tutuldu. Ayrıca iki yüz uL MeOH ilave edildi ve numuneler santrifüjlendi (10,000×g, 10 dakika,4 derece) ve bir miVac ikili yoğunlaştırıcısında (Genevac Ltd., Ipswich, UK) buharlaştırıldı. Kuru ekstrakt, yüzde 1 formik asit içeren 200 uL LC-MS dereceli su ile sulandırıldı. Karışım, analiz etmek için yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi (UHPLC-HRMS) analizine bağlı ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisinden önce ikinci santrifüjlemeye (10, 000 × g, 5 dakika, 4 derece) tabi tutuldu. doğru kütle ölçümleri ile delphinidin metabolitleri.

Kromatografik ayırma, karşılık gelen SecurityGard C18 sütunu (Phenomenex) ile birlikte bir Kinetex@ 1.7 um XB C18,150×2.1 mm sütunu ile sağlandı. Mobil fazlar, her ikisi de yüzde 0.1 oranında formik asit içeren kanal A'da H20 ve kanal B'de asetonitrilden oluşuyordu. Elüsyon gradyanı（A∶B, o/ø） aşağıdaki gibidir∶ 2 dakika boyunca 95:5 başlangıç ​​koşullarını, ardından 95:5 ila 0:100 üzerinde doğrusal bir gradyan takip eder. 6 dakikalık bir süre, 0:100'de 3 dakika tutun, 95:5 başlangıç ​​koşullarına dönün ve bu koşulları 3,5 dakika tutun. 0.300 mL/dk'lık sabit bir akış hızı kullanıldı; enjeksiyon hacmi 10 μL idi.

Tam tarama ve hedeflenen SIM kütle spektrumları, pozitif iyonizasyon modunda, çözünürlük 70,000 Tam Genişlik Yarı Maksimumda (FWHM) otomatik kazanç kontrolü (AGC) hedefi ile 3 × 10 derece iyon ve maksimum iyon enjeksiyonu kullanılarak elde edildi 200 ms'lik süre (IT). Veriye bağlı MS/MS deneyleri, 'Top5'in veriye bağlı modunda elde edildi.

Literatürde [16-18] bildirilen metabolitler izlendi: Delphinidin, alde-hyde, phloroglucinol aldehyde, gallic acid, chalcone, petunidin-3-galaktozid, petunidin-3-arabinosid,petunidin {{4} }O-rutinosid, delphinidin-3-arabinosid, delphinidin-3-galaktozid, delphinidin 3-O-(6-kumaroylglucoside),delphinidin 3-O- - rutinosid, siyanidin-3-galaktosid, siyanidin 3-O- -rutinosid, Peonidin-3-galaktosid ve malvidin-3-galaktosid.

Günlük cihaz kalibrasyonu, üretici tarafından tavsiye edildiği şekilde Pierce LTO Velos ESI pozitif/negatif kalibrasyon kitlerinin infüzyonu ile yapıldı. Veri toplama için Xcalibur 2.2 yazılımı (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, ABD) ve veri işleme için TraceFinder 3.0 yazılımı (Thermo Fisher Scientific) kullanıldı.

2.7. Hücre Canlılığı Testi

1 x 104 HAoEC, bir 96-kuyu plakasına ekildi ve 24 saat kültürlendi ve delphinidin （1 ila 10 ug/mL） ile işlendi. Ardından, 5 ug/mL 3-（4,5-dime-thylthiazol-2-yl）-5-（3-karboksimetoksifenil)-2-({ {15}}sülfofenil)-2H-tetrazolyum (MTS reaktifi, Promega, WI, ABD) her bir kuyucuğa ilave edildi ve 37 derecede 120 dakika inkübe edildi. Absorbans, bir CLARIOstar(BMG LABTECH, Ortenberg, Almanya) spektrofotometresinde 490 nm'de ölçülmüştür.

2.8. Proliferasyon Deneyi

Proliferasyon deneyleri, üreticinin tavsiyelerine göre CyQUANT Cell proliferasyon Tahlili kiti (Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Kısaca, bir 96-kuyu plakasına 1.5 x 106* hücre ekildi. Hücreler 2 saat serum açlığına maruz bırakıldı ve daha sonra delphinidin, doğal sEV'ler veya farklı konsantrasyonlarda delphinidin yüklü sEV'ler ile tedavi edildi. 24 saatlik inkübasyondan sonra hücreler PBS ile yıkandı ve bir boya bağlayıcı solüsyon ilave edildi. Hücreler 37 derecede 30 dakika inkübe edildi. Floresan ölçümü için 485 nm eksitasyon ve 530 nm emisyon için filtrelere sahip bir floresan mikroplaka okuyucu (CLARIOstar9, BMG LABTECH, Ortenberg, Almanya) kullanıldı.

2.9.NO Üretim Testi

HAoEC'ler, bir 8-kuyu slaytı （Ibidi, Gräfelfing, Almanya） üzerine oyuk başına 3 x 104 hücre oranında (yani, 300 μL ortam içinde 3 x 104 hücre/cm²）) ekildi. Yüzde 70-80 birleşmede hücreler, delphinidin, doğal sEV'ler veya sEV yüklü delphinidin ile 24 saat boyunca uyarıldı. Adenozin trifosfat（ATP）, NO üretimini uyarmak için pozitif kontrol （10 μM, Sigma-Aldrich） olarak kullanıldı. 24 saat sonra, her bir kuyunun ortamı çıkarıldı ve diaminofloresein diasetat （DAF-2 DA）probu, 30 dakika boyunca （5 uM ilave edildi, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, ABD). Daha sonra kuyucuklar PBS ile yıkandı. Hücreler paraformaldehit ile sabitlendi(yüzde 4, 20 dakika). Floresans, konfokal mikroskopi ile okundu (Zeiss, Jena, Almanya, LSM700). Dört resim elde edildi ve miktar tayini için ImageJ yazılımı kullanıldı.

2.10.Matrigel Testi

HAoEC'ler Matrigel (Engelbreth-Holm-Swarm, Sigma-Aldrich） murin sarkomunun hücre dışı matrisinin jeli) ile kaplanmış kuyucuklara ekildi. slayt Anjiyogenez plakası （lbidi）ve sonra bir jel oluşturmak üzere 37 derecede 45 dakika inkübe edildi.HAoEC'ler daha sonra tohumlandı ve delphinidin, doğal sEV'ler veya sEV yüklü delphinidin ile muamelelerden önce 45 dakika boyunca 37 derecede ve yüzde 5 CO'de inkübe edildi ardından 37 derece ve yüzde 5 CO'de 12 ila 14 saat inkübasyon yapıldı. "Kılcal damar benzeri yapıların" oluşumu bir optik mikroskop (Olympus CK40) ile gözlendi. Görüntü Yazılımı.

2.11.İstatistiksel Analiz

Sonuçlar ortalama ± SEM olarak ifade edilir. Gruplar arasındaki farklılıkların önemi, varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi ile belirlendi. p-değerleri<0.05 were="" considered="">

3. Sonuçlar

3.1.sEV Delphinidin Karakterizasyonu ve Yüklenmesi

Literatürle uyumlu olarak, sEV'ler içine yüklenen delphinidin, veziküllerin boyutunda değişikliklere neden olmadı; Nanopartikül İzleme Analizi ile belirlendiği üzere, boş sEV'ler ve delphinidin yüklü sEV'ler için sırasıyla 118.7 ± 2.9 ve 111,7 ± 1.8 nm'dir (Şekil). 1A) ve elektron mikroskobu analizi ile onaylandı (Şekil 1B). Ek olarak, hem doğal hem de delphinidin yüklü olanlar, benzer seviyelerde ALIX, CD63 ve TSG101 gibi eksozomal belirteçleri ifade ederken (Şekil 1C), büyük EV'lerin bir belirteci olan ß-aktin'i eksprese etmediler.

Şekil 1. sEV'lerin karakterizasyonu.(A) NTA ölçümlerine dayalı olarak delphinidin ile yüklenen doğal sEV'lerin ve sEV'lerin boyut dağılımları. (B) Delphinidin ile yüklenen yerel sEV'lerin ve sEV'lerin Temsili İletim Elektron Mikroskobu görüntüsü. Ölçek çubuğu=100 nm.(C) Alix, CD63, TSG101 ve ß-Actin'in sEV'lerde ve delphinidin ile yüklenmiş sEV'lerde ifadesini gösteren Western Blot analizi.

Bu makale Nutrients 2021, 13, 4378'den alınmıştır. https://doi.org/10.3390/nu13124378