FAIMS Bölüm 1 ile Beyin Dokusunun Yukarıdan Aşağıya Proteomiklerinin Geliştirilmesi

Soyut

Alzheimer ve Parkinson hastalığına ilişkin proteomik araştırmalar, nörodejeneratif bozukluklara ilişkin değerli bilgiler sağlamıştır. Şimdiye kadar bu araştırmalar büyük ölçüde aşağıdan yukarıya yaklaşımlarla sınırlıydı ve bu da bir proteinin "sağlam" durumunun karakterize edilebilmesini engelledi.

Alzheimer hastalığı, kişinin hafızası ve bilişsel yetenekleri üzerinde geri dönüşü olmayan etkileri olan nörodejeneratif bir hastalıktır. İnsanlar hastalığı tamamen iyileştiremese de dikkatli tedavi ve önleme yoluyla hastalığın ilerlemesi mümkün olduğu kadar yavaşlatılabilir ve hastanın fiziksel ve ruhsal sağlığı korunabilir.

Bellek, Alzheimer hastalarının etkilediği en belirgin yönlerden biridir. Kendi isimleri, sevdiklerinin isimleri, önemli tarihler gibi önemli bilgileri sıklıkla unutabilirler. Ayrıca soyut kavramlar ve eşanlamlılar gibi kendi kendine öğrenilebilen bazı gelişmiş sözcükler de unutulabilir. Ancak bazı bilişsel eğitim ve tedavilerle Alzheimer hastaları bazı yönlerden hafızalarını hâlâ koruyabilirler.

Alzheimer hastalığı her ne kadar olumsuz etkiler getirse de olaya olumlu bakmalıyız. Birincisi, hastalığa ilişkin farkındalığı ve anlayışı artırarak onu daha iyi önleyebilir ve tedavi edebiliriz. İkinci olarak, Alzheimer hastalarının bakıcıları ve aile üyeleri, hastaların özsaygılarını korumalarına ve mümkün olduğunca mutlu yaşamalarına yardımcı olmak için onlarla nasıl etkili bir şekilde iletişim kuracaklarını ve etkileşime gireceklerini de öğrenebilirler.

Genel olarak Alzheimer hastalığı hafıza ve bilişsel yetenekler üzerinde geri dönüşü olmayan etkilere neden olabilse de iyimser bir tutum sergilemeli ve tedavi ve önleyici tedbirlerle hastalığın ilerlemesini yavaşlatmaya çalışmalıyız. Aynı zamanda Alzheimer hastalarına bakım verenlere daha fazla yardım ve destek sağlamalı ve hep birlikte daha sıcak ve etkileşimli bir topluluk yaratmalıyız. Belleği geliştirmemiz gerektiği görülebilir. Cistanche hafızayı önemli ölçüde geliştirebilir çünkü birçok benzersiz etkiye sahip geleneksel bir Çin tıbbi malzemesidir ve bunlardan biri hafızayı geliştirmektir. Cistanche'nin etkisi içerdiği tanik asit, polisakkaritler, flavonoid glikozitler vb. gibi çeşitli aktif bileşenlerden gelir. Bu bileşenler beyin sağlığını birçok yönden geliştirebilir.

Belleği geliştirmenin 10 yolunu bilin'e tıklayın

Yukarıdan aşağıya proteomik (TDP) bu sınırlamanın üstesinden gelir; ancak genellikle yalnızca nispeten küçük boyutlu, en bol bulunan proteoformların gözlemlenmesiyle sınırlıdır.

Bu nedenle numune karmaşıklığını azaltmak için parçalama teknikleri yaygın olarak kullanılır. Burada, TDP dahilinde yüksek alan asimetrik dalga biçimi iyon hareketlilik spektrometresi (FAIMS) yoluyla gaz fazı fraksiyonasyonunu araştırıyoruz.

Alzheimer hastalığı (AD) beyin dokusundan elde edilen yüksek karmaşıklıktaki bir örneği kullanarak, FAIMS'nin TDP'ye eklenmesinin proteom kapsamının derinliğini nasıl güçlü bir şekilde geliştirebileceğini açıklıyoruz.

Örneğin, FAIMS'in -50, -40 ve -30 CV'ye adımlayan harici dengeleme voltajı (CV) ile uygulanması, FAIMS'siz ile karşılaştırıldığında yedekli olmayan proteoformların, genlerin ve proteom dizisi kapsamının ortalama sayısını iki katından fazla artırabilir.

FAIMS'in proteoformların ve yük zarflarının boyutlarına bağlı olarak iletimini etkileyebileceğini de bulduk. Daha da önemlisi, FAIMS, AD'ye güçlü bir şekilde bağlı olan, toplanmaya yatkın A 1-42 varyantı dahil olmak üzere, sağlam amiloid beta (A) proteoformlarının tanımlanmasını mümkün kılmıştır.

Ham veriler ve ilgili dosyalar, PXD023607 veri seti tanımlayıcısına sahip MassIVE veri havuzu aracılığıyla ProteomeXchange Konsorsiyumu'na depolandı.

GİRİİŞ

Son 20 yılda, nörodejeneratif hastalıkların görülme sıklığı dünya çapında iki kattan fazla arttı; Alzheimer hastalığı (AD) en yaygın form oldu.1 İki protein türü, amiloid beta (A) peptidleri ve fosforile mikrotübülle ilişkili protein tau(tau), 2-5 AD ile güçlü bir şekilde ilişkilidir.

Bu nedenle, AD'nin ayrıntılı proteomekarakterizasyonu özel bir öneme sahiptir.6,7 Kütle spektrometrisi, ağırlıklı olarak aşağıdan yukarıya yaklaşımlarla8 bu araştırmalarda merkezi bir rol oynamıştır.9-16

Bununla birlikte, aşağıdan yukarıya analizler için gerekli olan proteaz sindirimi, bir proteinin tam durumunun yakalanmasını engeller; bu durum, genetik aleller, alternatif birleştirme, proteolitik işleme ve translasyon sonrası modifikasyonlara ("proteoformlar" olarak anılır) bağlı olarak değişebilir.17– 20

Yukarıdan aşağıya proteomik (TDP) yaklaşımlar, proteinleri sağlam bir durumda analiz ettiğinden, belirli patolojilerle ilişkili proteoformları yakalama olasılığı daha yüksektir ve genotip ile fenotip arasında daha güçlü, daha doğrudan bir bağlantıya izin verir.20-22

Örneğin, TDP, Alzheimer patolojisiyle bağlantılı olan tau gibi proteinlerden türetilen endojen proteolitik fragmanların yakalanması için özellikle çok uygundur.23-26 Daha önceki birkaç TDP uygulaması, bölgesel beyin proteom heterojenliğini ve çeşitli uyaranlara yanıt olarak oluşan nöronal değişiklikleri ortaya çıkarma konusunda büyük umut vaat etmiştir. 0,27–30

Bununla birlikte, karmaşık örneklerin TDP'si tipik olarak örnek karmaşıklığını azaltmak için çevrimdışı parçalama teknikleri gerektirir, çünkü insan proteomu büyüklük ve bolluk açısından birkaç büyüklük sırasına yayılır ve proteinler genellikle ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (LC) ile iyi bir şekilde çözülmez.31

Bu çevrimdışı fraksiyonlama, birkaçını saymak gerekirse, jel ile ayrıştırılmış sıvı fraksiyon tuzak elektroforezi, boyut dışlama kromatografisi, iyon değişim kromatografisi veya afinite saflaştırması ile gerçekleştirilebilir.22,32–35

Ne yazık ki, çevrimdışı fraksiyonlama tipik olarak daha uzun numune işleme gerektirerek verimi ve verimi azaltır.36 Gaz fazı iyon hareketliliği ayrımı, ek numune işleme adımları gerektirmeden LC ve MS boyutları arasına eklenebilecek çekici bir fraksiyonlama alternatifidir.

Yüksek alan asimetrik dalga biçimi iyon hareketlilik spektrometresi (FAIMS), modüler tasarımı iyon hareketliliğinin çeşitli mevcut Orbitrap cihazlarına kolayca dahil edilmesine olanak tanıyan FAIMS Pro cihazının yakın zamanda piyasaya sürülmesiyle bu göreve özellikle çok uygundur.37

Diferansiyel hareketlilik spektrometrisi olarak da adlandırılan FAIMS, yüksek ve düşük elektrik alanlarına sahip asimetrik bir dalga formunun eklenmesi yoluyla boyut, yük veya şekil gibi faktörlerin kombinasyonlarına dayalı olarak bir taşıyıcı gazdaki iyonları ayırır.38 İyonların gazla çarpışmasını önlemek için elektrotta, bir DC dengeleme voltajının (CV)39 uygulanması yoluyla iyonun yolunda bir sapma meydana gelir ve bu iyonun seçici iletilmesine izin verir.38

FAIMS'in bozulmamış protein analizine uygulanması büyük ölçüde tek tek proteinlerin konformerlerinin veya küçük protein kombinasyonlarının ayrılmasıyla sınırlandırılmıştır;40-45

ancak FAIMS yakın zamanda sıvı ekstraksiyon yüzey analizi kullanılarak sağlam ve doğal protein analizlerine uygulanmıştır.46-50 Burada, FAIMS-TDP analizini bir Alzheimer hastasının medial frontalkorteksinden (MFC) alınan tam doku örneğine uyguluyoruz.

Harici adımlama ile −50 ila −20 CV CV aralığını taramak, FAIMS CV modülasyonunun silindirik FAIMS ünitesi aracılığıyla iletilen iyonların özelliklerini nasıl etkilediğini ve boyuta dayalı proteoformları hedeflemek için bu ilişkiden nasıl yararlanılabileceğini belirlememize olanak sağladı.

FAIMS-TDP, FAIMS'siz ile karşılaştırıldığında tek bir CV'de proteoform tanımlamalarını iki kattan fazla artırdı ve -, - ve -sinükleinler, PARK7, tau splice izoformları ve çeşitli sağlam A proteoformları dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıklarla ilgili proteoformların daha derin sorgulanmasını sağladı.

Birlikte ele alındığında bu çalışma, TDP'de FAIMS ile gaz fazı fraksiyonlaması yoluyla proteoformların ve proteomekapsamın daha iyi tanımlanmasının nasıl tekrarlanabilir bir şekilde elde edilebileceğini açıklamaktadır.

YÖNTEMLER

Numune Hazırlama

MFC örneği Rush Üniversitesi Alzheimer Hastalığı Merkezi'nden alındı. Katılımcılar, 1992'den 2005'e kadar hafıza şikayetleri ve/ordemans şikayetleriyle kayıt yaptıran, klinikte çalışan yaşlı kişilerdi.

Rush Bellek Kliniğinde olası demans açısından değerlendirildiler ve Rush Alzheimer Hastalığı Temel Merkezi'nin klinik çekirdeğinin bir parçası olarak beyin bağışı yapmayı kabul ettiler. Çalışma Rush Üniversitesi Tıp Merkezi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı.

Ölümün ardından yakınları otopsi için onay verdi. Hastanın genel bilişsel tanı kategorisi, bilişsel bozulmanın başka hiçbir nedeni olmayan Alzheimer demansıydı51 ve ölüm sonrası aralık 230 dakikaydı.

Tüm numune işleme adımları BSL{{0}} önlemleriyle gerçekleştirildi. -80 derecede saklanan 33 mg MFC dokusu, 8 M üre, 10 mMamonyum bikarbonat (ABC) ve 10 mM'den oluşan 0,5 mL homojenizasyon tamponu ilavesiyle 1,5 mL LoBind Eppendorf tüplerine (Eppendorf, Cat# 022431081) aktarıldı. tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP), pH7,5'te.

Homojenleştirme, oda sıcaklığında 0,5 mL homojenleştirme tamponu eklenmeden önce, 30 saniye süreyle (BioVortexer with SpiralPestle; Biospec 1083 ve 1017) elde taşınan, motorla çalıştırılan bir pelet tokmağı uygulanarak fiziksel parçalama yoluyla sağlandı.

Numune daha sonra hücresel proteinlerin ekstraksiyonuna ve denatürasyonuna izin vermek için bir ThermoMixer kullanılarak 1200 rpm'de 60 dakika boyunca 37 derecede inkübe edildi. Ürede çözünmeyen malzemenin peletlenmesi, 22 derecede 20 dakika boyunca 18 000g'de santrifüjleme ile gerçekleştirildi ve elde edilen süpernatan, daha sonra 3 mL yıkama tamponuna (WB; 8 M üre, 10 mM ABC, pH7) ilave edildi. .5) büyük MW türlerini çıkarmak için 4 mL 100 kDa moleküler ağırlık kesme (MWCO) filtresi içinde.

22 derecede ve 5000 g'de 1 saatlik santrifüjlemenin ardından, tutulan hacim 200 μL ve filtrat hacmi 3,8 mL oldu. Küçük moleküllü kirleticileri ve düşük molekül ağırlıklı peptitleri çıkarmak için 3,8 mL filtrat 3 kDa MWCO filtresine aktarıldı.

3 kDa MWCOfiltre, 22 derecede ve 7300 g'de 1 saat boyunca santrifüjlendi ve 200 μL'lik bir tutulan hacim elde edildi. 100 kDa MWCO filtresinden alınan 200μL filtrelenmemiş kısım, WB ile 4 mL'ye seyreltilerek ve tekrar aynı filtreden süzülerek bir kez daha yıkandı.

Bu akış yukarıda bahsedildiği gibi aynı 3 kDa MWCO filtresine eklendi ve bir kez daha konsantre edildi.

3 kDa MWCO filtre yıkamasından elde edilen son200 μL filtrelenmemiş kısım, 1,5 mL'lik bir LoBindEppendorf tüpüne aktarıldı. Numuneyi asitleştirmek için 10 μL %10 formik asit (FA) ilave edildi ve nihai numunede %0,5 FA konsantrasyonu elde edildi.

Numune, bisinkoninik asit (BCA) tahlili kullanılarak protein konsantrasyonunu ölçmeden önce çökelmiş materyali çıkarmak için 15 dakika boyunca 18000g'de santrifüjlendi.

Sığır serum albümin standartları, BCA tahliline herhangi bir potansiyel tampon katkısını hesaba katmak için 8 M üre, 10 mM ABC ve 0.5% FA içerisinde hazırlandı. BCA tahlili ile protein konsantrasyonunun 1,1 mg/mL olduğu belirlendi; bu, ∼200 μL numunedeki 0,22 mg toplam geri kazanılan proteinin nihai verimine karşılık gelir. Numune, %0,5 FA içeren WB ile 0,5 mg/mL'ye seyreltildi ve LC-MS analizine kadar -80 derecede saklandı.

Homojenleştirme tamponumuz içinde geleneksel bir proteaz/fosfataz inhibitör kokteyli kullanan ilk deneylerin (yayınlanmamış veriler), 3KMWCO filtresi tarafından çeşitli kokteyl bileşenlerinin tutulması nedeniyle yanıltıcı BCA tahlili ve LC-MS sonuçlarına yol açtığını not etmeliyiz.

Ayrıca yaygın olarak kullanılan fosfataz ve proteaz inhibitörlerinin çoğu, TCEP gibi indirgeyici maddelerle kimyasal olarak uyumsuzdur. Bu uyumsuzluklar ve 10 mM TCEP ile 8 M ürenin kuvvetli denatüre edici koşullarının çoğu proteazı etkisiz hale getirmesinin beklendiği göz önüne alındığında, proteolitik bozunmanın bu koşullar altında hala en aza indirilebileceğine inandık.

LC-MS/MS Analizleri ve FAIMS Ayarları

Numuneler, H2O'da (mobil faz A) %0,2 FA ve ACN'de (mobil faz B) %0,2 FA'dan oluşan mobil fazlara sahip bir Waters NanoACQUITY UPLC sistemi kullanılarak analiz edildi.

Hem yakalama ön kolonu (100 μm iç çap, 5 cm uzunluk) hem de analitik kolon (75 μm iç çap, 50 cm uzunluk), C2 paketleme malzemesi (tuzak/analitik için sırasıyla 5 ve 3 μm, 300 Å, Ayırma Yöntemleri Teknolojisi) ile paketlenmiş bulamaçlardı. . Numuneler, yüklenen malzeme miktarının 2,5 ug'sine karşılık gelen 5 uL döngüye yüklendi ve 20 dakika boyunca 3 uL/dakikada %5 b'lik izokratik bir akışla yakalama kolonuna enjekte edildi.

Ayırma, 300 nL/dakikada 180 dakika boyunca %5-50 b gradyanı ile gerçekleştirildi. Proteinlerin MS/MS analizi için NanoACQUITY sistemi, FAIMS Pro arayüzü ile donatılmış bir Thermo Scientific Orbitrap Fusion LumosTribrid kütle spektrometresine bağlandı.

Kaynak parametreleri arasında 2,2 kV'luk bir elektrosprey voltajı, 275 derecelik bir transfer kılcal sıcaklığı ve %60'lık bir iyon hunisi radyo frekansı genliği yer alıyordu. FAIMS, ek kullanıcı kontrollü taşıyıcı gaz akışı ve -5 kV'lik bir dağılım voltajı (-33,3 kV/cm'lik bir dağılım alanına eşdeğer)50 olmadan standart çözünürlüğe ayarlanmıştır; CV ise deneye bağlı olarak değişmektedir ("harici adımlama" olarak anılır) ").

Fusion Lumos, yüksek enerjili C-tuzak ayrışma (HCD) hücreN2 basıncını 2 mTorr'a düşüren "sağlam protein" uygulama moduna ayarlandı ve veriler tam profil olarak toplandı. MS1 ve MS2 verileri 120k ve 60k çözünürlükte, 3 ve 2'lik mikro taramalarla, 500–2,000 m/z ve 400–2,000 m/z aralığında ve AGC hedefleri sırasıyla 5 × 106 ve 5 × 105'tir.

MS1 ve MS2 de maksimum 400 ms enjeksiyon süresiyle elde edildi. Veriye bağlı ayarlar, en yoğun 6 iyonun seçimini, şarj durumundan5+ daha düşük olan iyonların hariç tutulmasını, belirlenmemiş şarj durumlarının dahil edilmesini ve 30 saniyelik bir gözlemin ardından dinamik hariç tutmayı içeriyordu.

MS2 için seçilen iyonlar ±1,5 m/z penceresinde izole edildi ve çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) yoluyla %35'lik bir çarpışma enerjisiyle parçalandı. Yorumlanabilir protein parçalanma spektrumları elde etmek için normalleştirilmiş çarpışma enerjisine daha az bağımlı olması nedeniyle HCD yerine CID'yi kullandık, böylece proteoform gözlemlerimizin genişliğini dizi kapsamına göre önceliklendirdik.52

Her FAIMS CV için veri setleri üç kopya halinde toplandı. Tüm ham dosyalar MassIVE veri deposuna depolanmıştır ve MSV000086696 erişimi yoluyla veya ProteomeXchange'teki PXD023607 ile erişilebilir.

For more information:1950477648nn@gmail.com