İlgili Gıda Sınıfı Ticari Enzimler İçin Enzimatik Hidroliz Geliştirildi

Lütfen iletişime geçinoscar.xiao@wecistanche.comdaha fazla bilgi için

2.2. Kollajen Hidrolizat Özellikleri Üzerinde Ultrafiltrasyon Etkisi

Bir ultrafiltrasyon işlemi, başlangıç ​​hidrolizatının bileşimine ve çalışılan aktiviteye bağlı olarak, istenen moleküler boyuta ve yüksek biyoaktiviteye sahip küçük peptit fraksiyonları üretmek için faydalı, endüstriyel olarak avantajlı bir yöntem olabilir [19]. Çözünürlük, serbest amino grubu içeriği ve liyofilizasyondan sonra CH'lerin verimi gösterilmektedir (Tablo 1). Kontrolün çözünürlüğü ve serbest amino grubu içeriği sırasıyla yüzde 11.95 ve yüzde 0.79 idi. 3 kDa moleküler ağırlık kesme ile enzimatik hidroliz ve ultrafiltrasyondan sonra, en yüksek çözünürlük (yüzde 21.17) ve serbest amino grubu içeriği (yüzde 14.17) CH-Alcalase'de gözlendi.<3 kda.="" however,=""><3 kda="" was="" the="" lowest="" yield="" (12.42%)observed.="" therefore,="" although="" ultrafiltration="" is="" useful="" in="" separating="" chs="" with="" a="" low="" molecular="" weight="" it="" may="" cause="" a="" reduction="" in="">

Protein hidrolizatlarının ortalama moleküler ağırlığı, biyolojik özelliklerini belirleyen önemli bir faktördür [19]. Genel olarak, MW ile ortalama bir kesir<3 kda="" represents="" a="" collagen="" hydrolysate;="" an="" average="" fraction="" with="" mw="">50 kDa represents gelatin, and an average fraction with MW>300 kDa kollajeni temsil eder [20,21]. Kontrolün (ön işlem numunesi), CH-Alcalase ve CH-Alcalase'in bağıl moleküler ağırlık dağılımı<3 kda="" is="" depicted="" in="" figure="" 4.="" the="" molecular="" weight="" distribution="" was="" over="" 20,100="" da="" for="" the="" control,="" which="" did="" not="" include="" the="" collagen="" hydrolysate=""><3 kda).="" this="" could="" not="" be="" numerically="" provided="" in="" this="" study,="" as="" the="" detection="" limit="" of="" the="" index="" detector="" system="" only="" ranged="" from="" 106="" to="" 20,100="" da.="" however,="" ch-alcalase="" showed="" detectable="" values="" in="" a="" higher="" range="" of="" relative="" molecular="" weight="" distribution,="" which="" ranged="" from="" 20,100="" da="" to="" 4270="" da="" (maximum="" peak:12,600="" da).="" in=""><3 kda,="" the="" molecular="" weight="" distribution="" mainly="" showed="" three="" peaks:="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 4270="" da="" (maximum="" peak),="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 424="" da,="" and="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 222="" da="" and="" 102="" da.="" ultrafiltration="" is="" an="" effective="" purification="" method="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight="" peptides="" from="" crude="" hydrolysates.="" results="" indicated="" that="" enzymatic="" hydrolysis="" by="" alcalase="" clearly="" reduced="" the="" high="" mw="" of="" the="" control="" (either="" collagen="" or="" gelatin),="" and="" that="" ultrafiltration="" was="" an="" effective="" purification="" method="" that="" can="" be="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight=""><3 kda)="" from="" crude="" collagen="" hydrolysates.="" reportedly,="" low="" molecular="" weight="" peptides="" (2-20="" amino="" acids)="" are="" more="" biologically="" active="" compared="" to="" their="" parent="" polypeptide/proteins,="" which="" are="" larger="">

Daha fazla bilgi için lütfen buraya tıklayın

CH'lerdeki amino asit bileşimi gösterilmektedir (Tablo 2). Farklı proteazlar tarafından oluşturulan CHS, farklı amino asit bileşimlerine ve antioksidan özelliklere sahipti [23]. Kollajenin amino asit bileşimi glisin(Gly), prolin (Pro) ve glutamik asit (Glu) açısından zengindi. CHs(CH-Alcalase ve CH-Alcalase) amino asit içeriği<3 kda)="" increased="" more="" than="" that="" of="" the="" control,="" following="" enzymatic="" hydrolysis="" with="" or="" without="" ultrafiltration.="" in="" particular,="" the="" content="" of="" gly,="" pro,="" and="" glu="" was="" much="" higher="" in=""><3 kda(gly="" 218="" mg/g,="" pro="" 152="" mg/g,="" and="" glu="" 120="" mg/g)="" than="" ch-alcalase(gly149="" mg/g,="" pro="" 95="" mg/g,="" and="" glu78="" mg/g).="" an="" increase="" in="" the="" content="" of="" these="" amino="" acids="" is="" strongly="" related="" to="" enhanced="" antioxidant="" capabilities="" [16,20].="" gly="" and="" pro="" contain="" hydrophobic="" amino="" acid="" groups,="" and="" glu="" contains="" negatively="" charged="" amino="" acid="" groups.="">cistanche sapıBu amino asitlerin, lipidlerdeki artan çözünürlükleri veya serbest radikal reaksiyonları yoluyla antioksidan aktiviteyi arttırdığı bildirilmiştir [1,24].

2.3. Kollajen Hidrolizatların Antioksidan ve Yaşlanma Karşıtı Aktiviteleri

CH'lerin antioksidan aktiviteleri 2,2'-ve-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit)(ABTS)radikal süpürücü aktivite testi ve indirgeme gücü testi kullanılarak ölçüldü. Kontrolün (kollajen süspansiyonu), CH-Alcalase ve CH-Alcalase'in ABTS radikal süpürücü aktivitesi<3 kda="" at="" different="" concentrations="" is="" shown="" (figure="" 5a).abts="" radical="" scavenging="" activity="" of="" peptides="" assay="" is="" important="" to="" exclusively="" measure="" the="" ability="" of="" an="" antioxidant="" peptide="" to="" induce="" a="" hydrogen="" atom="" transfer="" [25].="" abts="" radical-scavenging="" effects="" of="" all="" treatments="" increased="" in="" a="" concentration-dependent="" manner=""><0.05). ch-alcalase="" and=""><3 kda="" showed="" much="" higher="" abts="" radical-scavenging="" activity="" values,="" with="" 41.4%-88.2%="" compared="" to="" the=""><8.5%. both="" ch-alcalase="" and=""><3 kda="" had="" high="" abtsradical-scavenging="" abilities="" of="" ~60%="" when="" concentrations="" were="" greater="" than="" 2.5="" mg/ml.=""><3 kda="" showed="" a="" significantly="" higher="" abts="" radical-scavenging="" activity="" value="" than="" ch-alcalase.="">cistanche salsa özüGenel olarak, peptitlerin antioksidan aktivitesi, amino asit dizilerinden, mevcut serbest amino asitlerin sayısından, hidroliz derecesinden ve peptitlerin moleküler ağırlığından etkilenebilir [26,27]. Özellikle, düşük moleküler ağırlıklı hidrolizatlar, yüksek moleküler ağırlıklı hidrolizatlara kıyasla daha güçlü antioksidan özelliklere sahipti [2.26].

Şekil 5. Kollajen hidrolizatlarının (CH) 2,2'-ve-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit)(ABTS)radikal süpürme(A)ve indirgeme gücü (B) içindeki antioksidan aktiviteleri tahliller. Farklı harflerle (ac) gösterilen veriler, farklı tedavilere bağlı olarak istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar göstermektedir (p<0.05).>cistanche tubulosa faydaları ve yan etkileriFarklı harflerle (AD) gösterilen veriler, konsantrasyona bağlı olarak istatistiksel olarak önemli farklılıklar gösterir (p < 0.05).

Cistanche yaşlanmayı geciktirebilir

Kontrolün indirgeme güçleri, CH-Alcalase ve CH-Alcalase<3 kda="" are="" shown="" (figure="" 5b).="" the="" reducing="" power="" of="" peptides="" may="" also="" serve="" as="" a="" significant="" indicator="" of="" their="" antioxidant="" potential="" [28,29].="" the="" reducing="" power="" of="" chs="" ranged="" from="" 0.074="" to="" 0.424="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.05). the="" control="" group="" had="" the="" lowest="" reducing="" power,="" which="" did="" not="" change="" significantly="" with="" increasing="" concentrations="" of="" the="" control.="" in="" contrast="" to="" abts="" radical-scavenging="" activity,="" the="" reducing="" power="" of="" ch-alcalase="" was="" higher="" than="" that="" of=""><3 kda.="">cistanche tubulosa özüBenzer gözlemler, ham kolajen hidrolizatın gücü azaltmada ultrafiltrelenmiş kolajen peptitlerinden daha etkili olabileceğini öne sürdü [30].

Tirozinaz, kollajenaz ve elastaz aktivitesinin inhibisyonu, bunların in vitro yaşlanma karşıtı etkilerini doğrulamak için kullanıldı [20]. Kontrol, CH-Alcalase ve CH-Alcalase'in tirozinaz, kollajenaz ve elastaz aktivitesinin inhibisyonunun sonuçları<3 kda="" are="" summarized="" (table="" 3).="" tyrosinase,="" collagenase,="" and="" elastase="" inhibitors="" have="" been="" used="" as="" important="" ingredients="" of="" cosmetics="" for="" skin="" whitening,="" anti-aging,="" and="" anti-wrinkling,="" respectively.="" collagenase="" and="" elastase,="" especially,="" are="" known="" to="" be="" major="" enzymes="" responsible="" for="" dehydration="" and="" wrinkle="" formation="" on="" the="" skin="" surface[31].="" the="" results="" indicated="" that="" the="" tyrosinase="" inhibition="" effect="" of="" vitamin="" c(95.50%,1="" mg/ml,="" positive="" control)="" was="" higher="" than="" that="" of="" the="" other="" treatments(table="" 4).="" tyrosinase="" inhibition="" effects="" of="" control,="" ch-alcalase,="" and=""><3 kda="" groups="" were="" 28.21%,="" 15.44%,="" and="" 30.20%,="" respectively.="" thus,="" the="" chs="" did="" not="" show="" a="" better="" skin="" whitening="" effect="" compared="" to="" the="" control.="" collagenase="" inhibition="" by="" the="" control,="" ch-alcalase,="" and=""><3 kda="" groups="" were="" 6.45%,54.37%,="" and="" 61.90%,="" respectively.="" in="" addition,="" ch-alcalase="" and=""><3 kda="" inhibition="" of="" collagenase="" corresponded="" to="" that="" of="" vitamin="" cat="" 1="" mg/ml.="" thus,="" chs="" obtained="" from="" this="" study="" may="" be="" effective="" collagenase="" inhibitors="" that="" may="" possibly="" play="" an="" important="" role="" in="" anti-aging="" activities.="" however,="" all="" collagen="" samples="" did="" not="" display="" elastase="" inhibition="" effects,="" which="" may="" result="" from="" a="" lack="" of="" skin="" elasticity.="" overall,="" vitamin="" c(1="" mg/ml)="" inhibited="" various="" activities="" of="" the="" enzymes="" in="" the="" following="" order:="" tyrosinase(95.50%)="">collagenase(48.09)> elastase(2/.00%o).CH-Alcalase(5 mg/mL)inhibited various activities of the enzymes in the following order: collagenase (54.37%)> tyrosinase (15.44%)>elastaz (aktivite yok). CH-Alkalaz<3 kda="" (5="" mg/ml)="" inhibited="" these="" activities="" in="" the="" following="" order:="" collagenase="" (61.90%)="">tyrosinase (30.20%)>elastaz (aktivite yok). Başka bir çalışmada bildirilen benzer eğilimler, kolajen hidrolizatlarının yaşlanma karşıtı ajanlar ve kolajenaz inhibitörleri olarak hareket etme potansiyeli gösterdiğini göstermiştir [20].

3. Malzemeler ve Yöntemler

3.1. Domuz Derisi Ön Tedavisi

Domuz derisi yerel bir tedarikçiden (Seul, Kore) satın alındı ​​ve domuz derisinin tüm görünür yağ ve bağ dokuları bir tıraş bıçağı kullanılarak çıkarıldı. Bu çalışmada kullanılan domuz derisi, biyolojik varyasyonu en aza indirmek için bir domuzdan elde edilmiştir. Kesilmiş domuz derisi, yağ ve artık maddeleri uzaklaştırmak için dört kez 90 derecede 1 dakika suda yıkandı. Deri daha sonra 1 cm kare kesitler halinde kesildi ve dört kanatlı bıçaklı bir blender (CNHR-26, Bosch, Hong Kong, Çin) kullanılarak damıtılmış suda 3 dakika boyunca toz haline getirildi. Toz haline getirilmiş domuz derisi, bir Ultra Turrax(T25, IKA Labotechnik, Staufen, Almanya) kullanılarak 5 dakika boyunca yüksek hızda (25,000rpm) homojenleştirildi. Yaklaşık 100 g domuz derisi karışımı (yüzde 50 nihai katı içerik) vakumla paketlendi ve -20 derecede donduruldu ve 1 ay içinde kullanılmak üzere saklandı.

3.2. Ticari Proteazlar ve Reaktifler

Alcalase, Flavorzyme, Neutrase ve Protamex, Novozymes'ten (Bagsvaerd, Danimarka) satın alındı. Bromelain ve Papain, Daesong Sangsa'dan (Seul, Kore) satın alındı. Antioksidan ve yaşlanma karşıtı testler için tüm kimyasallar Sigma-Aldrich Chemical Company'den (St.Louis, MS, ABD) satın alındı. Bu çalışmada kullanılan diğer tüm reaktifler ve solventler analitik derecedeydi.

3.3. enzim hidrolizi

Kullanılan ilgili gıda sınıfı ticari enzimler için enzimatik hidroliz geliştirilmiştir (üreticinin tavsiyelerine göre; Tablo 4). Hazırlanan domuz derisi karışımı, yüzde 5'lik bir nihai katı içeriğine kadar damıtılmış su ile seyreltildi. Bu konsantrasyon, düşük viskozitesi nedeniyle akış davranışını sağlamak için seçilmiştir. Yüzde 5 domuz derisi karışımı, kolajen süspansiyonu (veya kontrol) olarak adlandırıldı. Kollajen süspansiyonu, 1:100 enzim:substrat oranında altı gıda sınıfı ticari enzim kullanılarak reaktörlerde hidrolize edildi. Numune alikuotları (5 mL) 1, 3, 6, 12 ve 24 saatlik hidrolizde çekildi ve enzimi inaktive etmek için hemen 100 derecede 10 dakika ısıtıldı, ardından buzlu su kullanılarak 0 dereceye soğutuldu. Numune alma süresi boyunca pH, uygun şekilde 1 M NaOH kullanılarak kontrol edildi. Soğutulduktan sonra numuneler 4000 x g'de 15 dakika santrifüjlendi ve süpernatan (kollajen hidrolizat; CH) toplandı. CH, bir AmiconStirred Cells sistemi (Katalog No. UFSC 20001, EMD Millipore Corporation, Burlington, MA, ABD) kullanılarak 3 kDa moleküler ağırlık kesmesi (MWCO) (UltracelMembrane, EMD Millipore Corporation, Burlington, MA, ABD) 60 psi nitrojen gazında, 20 derecede.cistanche tubulosa incelemeleriHazırlanan CH dondurularak kurutuldu ve analize kadar 20 derecede hava geçirmez kaplarda tutuldu.

3.4. pH, Protein Geri Kazanımı, Çözünürlüksüz Amino Grubu İçeriği ve Üretim Veriminin Belirlenmesi Numunelerin pH'ı (kontrol ve CH'ler) bir pH metre (Model S220, Mettler Toledo GmbH, Columbus, OH, ABD) kullanılarak belirlendi. Protein geri kazanımı veya çözünürlüğü, standart olarak serum albümin ile üreticinin talimatlarına (Sigma-Aldrich, St. Louis, MS, ABD) göre bisinkoninik asit (BCA) protein tahlili kullanılarak protein içeriği tahmin edilerek belirlendi. Serbest amino grubu içeriği, standart olarak L-lösin kullanılarak üreticinin talimatlarına göre (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) bir 2,4,6-trinitrobenzen sülfonik asit(TNBSA) tahlili ile belirlendi. Üretim alanını hesaplamak için hem yaş hem de kuru ağırlıklar ölçülmüştür.

3.5. Moleküler Ağırlık Dağılımı

3.5.1.Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE)

Numunelerin (kontrol ve CH'ler) SDS-PAGE kalıpları, daha önce bildirilen bir yönteme [10] göre ölçüldü. Örnekler 8 M üre ile seyreltildi (nihai protein konsantrasyonu, 4 mg/mL). Her numune, KOMA Biotech Inc.'den bir kısım KTG 020 numune tamponu (yüzde 10 gliserol, yüzde 2 SDS, yüzde 0.003 bromofenol mavisi, yüzde 5 -merkaptoetanol ve 63 mM Tris-HCl, pH6.8) ile karıştırıldı. ., （Seul, Kore） ve 2 dakika kaynatıldı. Numune karışımı -20 uL, EzWayTM PAG yüzde 6 akrilamid jellerine (KOMA Biotech Inc., Seul, Kore) yüklendi. Elektroforezi takiben jel sabitlendi, boyandı ve lekesi çıkarıldı. Molekül ağırlıkları, 10 ile 210 kDa arasındaki geniş aralıklı moleküler ağırlık standartları kullanılarak belirlendi.

3.5.2. Jel Geçirgenlik Kromatografisi (GPC)

Numunelerin moleküler ağırlık dağılımı, daha önce bildirilen bir yönteme göre belirlendi [3]. Jel geçirgenlik kromatografisi (GPC), üç Ultrahidrojel TM 120 sütunu ile donatılmış bir YL9100 yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) sistemi (YL9100, Youngling Instrument Co., Ltd, Gyeonggi-do, Kore) kullanılarak yapıldı. 7.8×3000 mm) Waters'dan (Milford, MA, ABD). Mobil faz, 1.0 mL/dk'lık bir akış hızında damıtılmış/deiyonize su olmuştur ve kolajen peptitlerin moleküler ağırlık dağılımları, 40 derecede bir YL 9100 kırılma indeksi detektörü kullanılarak izlenmiştir. Standart olarak bir moleküler ağırlık standartları kiti (106-67,500 Da, Polymer Standards Service, Mainz, Almanya) kullanıldı.

3.6.Amin0 Asit Bileşimi

Numunelerin amino asit bileşimi, bir Ultimate 3000 HPLC sistemi üzerinde {{0}}florenil etoksi karbonil (FMOC)-klorür ve o-ftalik dialdehit (OPA) ile türevlendirme yoluyla analiz edildi ( Dionex, Idstein, Almanya)iki dedektörle (bir floresan dedektörü ve bir UV dedektörü） ve bir VDSpher 100 C18-E （4,6 mm × 150 mm, 3,5 μm parçacık boyutu, VDS Optilab, Berlin, Almanya) donatılmıştır. Enjeksiyon hacmi 1.0 L idi ve mobil faz iki eluentten oluşuyordu: 40 mM sodyum fosfat dibazik (pH 7) ve yüzde 45 (o/v)asetonitril/yüzde 45 (h/v) metanol solüsyonu. Bir UV detektörü ve floresan detektörü bağlanarak, 338 nm'de ultraviyole ışınları tespit edildi, 450 nm emisyon dalga boyunda ve 340 nm uyarma dalga boyunda OPA türevi tespit edildi, 305 nm emisyon dalga boyunda ve 266 nm'de FMOC türevi tespit edildi. bir uyarma dalga boyunun nm'si. Kalibrasyon için bir amino asit karışımı (her amino asit için 1.0 nmol mL-I) kullanıldı.

burada Atotalamino asit, 6 M HC1 (130 derecede 24 saat) kullanılarak hidrolizden sonraki içeriktir ve Afree amino asit, damıtılmış suda çözündürüldükten sonraki içeriktir.

3.7. Antioksidan Aktivitesinin Değerlendirilmesi

3.7.1.2,2'-Azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit) (ABTS)Radikal-Süpürme Aktivitesi

CH'nin ABTS radikal süpürücü aktivitesi, daha önce bildirilen bir yönteme [20] göre ölçüldü. ABTS radikal katyonu, ABTS stok çözeltisinin (7.0 mM) potasyum persülfat (2.45 mM) ile karıştırılması ve elde edilen karışımın karanlıkta oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edilmesiyle üretildi. ABTS radikal solüsyonu 5 0 mM fosfat tamponlu salin (pH7.4) içinde 734 nm'de 0.70±0.02 absorbans seviyesine seyreltildi. Seyreltilmiş ABTS radikal çözeltisinin bir mL'si, her numuneden 1 mL ile karıştırıldı. On dakika sonra numune (numuneli bir numune) ve kontrol (numunesiz bir kontrol) absorbansları 734 nm'de ölçüldü. ABTS radikal süpürücü aktivite (yüzde ) şu şekilde hesaplandı:

3.7.2.Gücü Azaltma

CH'nin indirgeme gücü, daha önce bildirilen bir yönteme [20] göre ölçüldü. Her numuneden bir mL, 1 mL 0.2 M fosfat tamponu (pH6.6) ve 1 mL yüzde 1 potasyum ferrisiyanür ile karıştırıldı. Karışım 50 derecede 20 dakika inkübe edildi ve ardından 1 mL yüzde 10 trikloroasetik asit ilave edildi. Bu inkübasyon karışımından 2 mL'lik bir kısım, 2 ml damıtılmış su ve 0.4 mL yüzde 0.1 demir klorür ile karıştırıldı. 10 dakika sonra, nihai çözeltinin absorbansı, bir spektrofotometre (OPTIZEN, Mecasys Co., Daejeon, Kore) üzerinde 700 nm'de ölçüldü.

3.8. Yaşlanma Karşıtı Etkisinin Değerlendirilmesi

3.8.1. Tirozinaz Aktivitesinin İnhibisyonu

Tirozinaz inhibisyonu, daha önce açıklanan bir yöntemle [20] belirlendi. 70 μL 0.1 M fosfat tamponu （pH6.8）,30uLof mantar tirozinaz（167U/mL içeren bir ön karışım çözeltisi; Sigma-Aldrich, USA) ve 20 L numune 30 derecede 5 dakika inkübe edildi. Daha sonra enzimatik reaksiyonu başlatmak için yaklaşık 100μL 3,4-dihidroksi fenil-L-alanin （L-DOPA） ilave edildi. L-DOPA oluşumunu izlemek için 20 dakika boyunca 492 nm'de absorbans ölçüldü. Askorbik asit (1 mg/mL), karşılaştırma için kullanılan pozitif kontrol olarak görev yaptı. İnhibisyon oranı şu şekilde hesaplandı:

burada A, numunesiz tirozinaz ile bir karışımdı; B, numune ve tirozinaz içermeyen bir karışımdı; C, numune ve tirozinaz içeren bir karışımdı ve D, numune içeren ancak tirozinaz içermeyen bir karışımdı.

3.8.2.Kolajenaz Aktivitesinin İnhibisyonu

Kollajenaz inhibisyonu, daha önce açıklanan bir yöntemle [20] belirlendi. Kısaca, 10 mM kalsiyum klorür ve 400 mM sodyum klorür içeren 50 mM trisin tamponu (pH7.5) hazırlandı. Ardından, bir 1.0mM N-[3-(2-furil)akriloil]-Leu-Gly-Pro-Ala çözeltisi ve 0.2 mg/ml kolajenaz (Clostridium histolyticum'dan, Tip IA, 0.{ {19}} FALGPA U/mg katı; Sigma-Aldrich, ABD) numunelerin varlığında ve yokluğunda eklenmiştir. Reaksiyon, sitrik asit (%6) eklenerek durduruldu. Reaksiyon karışımı, etil asetat eklenerek ayrıldı. Süpernatantın absorbansı 345 nm'de ölçüldü. Askorbik asit (1 mg/mL) pozitif kontrol olarak kullanıldı ve karşılaştırma için kullanıldı. İnhibisyon yüzdesi şu şekilde hesaplandı:

burada A, numunesiz kolajenaz ile bir karışımdı; B, numune ve kolajenaz içermeyen bir karışımdı; C, numune ve kolajenaz içeren bir karışımdı ve D, bir numune içeren ancak kolajenaz içermeyen bir karışımdı.

3.8.3.Elastaz Aktivitesinin İnhibisyonu

Elastaz inhibisyonu, daha önce açıklanan bir yöntemle [20] belirlendi. N-süksinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid (Suc-Ala-Ala-Ala-pNA) substrat olarak görev yaptı ve p-nitroanilin salınımı 2{{20}} için izlendi. 25 derecede min. Tip IV domuz pankreas elastazının (PPE) bir kısmı (1 ug) 1 mL 0.2 M Tris-HCl tamponu(pH 8.0) içinde çözüldü. reaksiyon karışımı, 0.2 M Tris-HCl tamponu (pH8.0), 1 ppm PPE, 0.8 mM Suc-Ala-Ala-Ala-pNA, numune ve yukarıda bahsedilen substratı içeriyordu. 214 nm'de absorbans ölçüldü. Karşılaştırma için kullanılan pozitif kontrol olarak askorbik asit (1 mg/mL) kullanıldı. İnhibisyon oranı şu şekilde hesaplandı:

burada A, elastazlı ve numunesiz bir karışımdı; B, numune ve elastaz içermeyen bir karışımdı; C, numune ve elastaz içeren bir karışımdı ve D, numune içeren ancak elastaz içermeyen bir karışımdı.

3.9.İstatistiksel Analiz

Veriler ortalama±standart sapma (SD) olarak sunulmuştur. Gruplar arasındaki farklılıkların önemi, çoklu karşılaştırmalar ve varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey dürüst anlamlı fark (HSD) testi kullanılarak değerlendirildi. 0.05'ten küçük p değerlerine sahip farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

4. Sonuçlar

Bu çalışmada, fonksiyonel bir gıda bileşeni olan kolajen hidrolizatları, enzimatik hidroliz, ardından ultrafiltrasyon ve saflaştırma yoluyla başarıyla üretildi. Çeşitli ticari proteazlar, uygun kolajen hidrolizatlarının üretiminde potansiyel yararları açısından test edildi. Alcalase tarafından hidrolize edilen CHS, en etkili hidrolize CH'lerdi ve ultrafiltrasyon ve ardından saflaştırma, düşük moleküler ağırlıklı aktif peptitlerin üretilmesinde etkiliydi. Sonuçlar, CH'lerin mükemmel antioksidan ve kollajenaz inhibisyon aktiviteleri sergilediğini gösterdi. Bu nedenle, bu çalışma ile elde edilen CH'ler, gıda, kozmetik veya ilaç endüstrilerinde, antioksidan ve yaşlanma karşıtı özelliklere sahip doğal bir katkı maddesi olarak kullanılabilir. İnsan derisindeki aktif peptitlerin yaşlanma aktivitelerinin in vivo değerlendirmesini içeren ileri çalışmalar faydalı olabilir.

Bu makale Molecules 2019, 24, 1104; doi:10.3390/molecules24061104 www.mdpi.com/journal/molecules