Cistanche Deserticola'dan Feniletanoid Glikozit Açısından Zengin Bir Ekstraktın Caco-2 Hücre Tek Tabakalı Modelinde Bağırsakta Taşınmasının Değerlendirilmesi

giriiş

İnsan kolon adenokarsinomlarından türetilen Caco-2 hücre dizisi, enterosit benzeri özellikler sergiler. Normal koşullar altında Caco-2 hücreleri kendiliğinden olgun hücrelerden farklılaşır ve sağlam tek tabakalar oluşturur. Bitişik hücreler, tek tabakanın apikal tarafında oluşturulan ve pasif olarak ayırt edebilen sıkı bağlantılar yoluyla yapışır.ve ilaçları epitel tabakası boyunca aktif olarak taşıdı. Normal enterositlere morfolojik ve biyokimyasal benzerlik nedeniyle, Caco-2 hücre tek katmanları, ilaçların bağırsaktan emilim potansiyeli ve taşınma özelliklerinin incelenmesi için iyi kabul görmüş bir in vitro model olarak hizmet eder.

Kimyasalların aksine bitki ekstraktları (PE), biyolojik aktiviteleri ve aktif bileşenleri çoğu zaman iyi tanımlanamayan karışımlardır. Ayrıca PE'nin bağırsakta taşınma özellikleri, bileşenlerinin özelliklerinin aksine klinik kullanımla yakından ilişkilidir. Bir Caco-2 hücresi tek katmanı boyunca bir test numunesi için akı ölçümleri genellikle HPLC, LC/MS vb. gibi kimyasal yöntemleri içerir. Bu yöntemler güçlü araçlar olmasına rağmen karmaşık, zaman alıcı, pahalıdır ve bazen de gelişmiş ekipman gerektirir. Daha da önemlisi, ne tek bir bileşen ne de azınlık bir bileşen PE'yi bir bütün olarak yansıtabilir. Bu nedenle PE'nin taşınma özelliklerini tanımlamak ve değerlendirmek için bileşenlerin belirlenmesinden bağımsız yeni bir yaklaşımın oluşturulması gerekmektedir.

Holoparazit bir bitki olan Cistanche Deserticola YC Ma (CD), esas olarak böbrek yetmezliği, vücut zayıflığı ve kabızlığı tedavi etmek için kullanılan yaygın bir geleneksel Çin tıbbıdır ve bu kullanımlar resmi olarak Çin Farmakopesi'nde kaydedilmiştir.Feniletanoid glikozitler (PhG'ler)ekinekozit (EC), akteozit (AC) ve izoakteozit (IS) vb. dahil olmak üzere polifenolik bileşiklerin bir sınıfıdır. Cistanche türlerinin başlıca biyoaktif bileşenlerinden biri olarak kabul edilirler. Farmakolojik çalışmalar, PhG'lerin biyoaktivitesinin çeşitli olduğunu ve anti-oksidatif, anti-yorgunluk, hepatoprotektif, immünomodülatör, anti-inflamatuar ve nöroprotektif etkileri içerdiğini göstermiştir. Ancak PhG'lerin bağırsakta taşınma özellikleri araştırılmamıştır. Bu çalışmada, entegre bir sistem olarak CD'den PhG açısından zengin bir ekstraktın (PRE) bağırsak geçirgenliğini ve farklılaşmış Caco-2 hücrelerinde üç ana PhG'nin (AC, IS ve EC) geçirgenliğini araştırdık. Sonuçlarımız PRE'nin öncelikle zayıf emilen pasif difüzyon yoluyla akış olmadan bir konsantrasyon gradyanı boyunca taşındığını gösterdi; bu, PhG'lerin CD'de klinik uygulaması için farmakokinetik temeli sağlar.

CİNSEL FONKSİYONU GELİŞTİREN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Malzemeler ve yöntemler

Malzemeler

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS, and EC (>%98'i Must Bioteknoloji Co.'dan (Chengdu, Çin) satın alınmıştır. Dulbecco'nun değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM), fetal sığır serumu (FBS) ve esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), Gibco BRL (Grand Island, NY, ABD) tarafından üretildi. 6-kuyucuklu TranswellTM plakaları (ek membran büyüme alanı 4,67 cm2) Corning (Costar) Inc.'den (Tewksbury, MA, ABD) elde edildi. Sıçan kuyruğu kolajeni Sigma-Aldrich'ten (St. Louis, MO, ABD) elde edildi. HPLC analizine yönelik tüm reaktifler ve kimyasallar analitik saflıktaydı.

PRE'nin CD'den hazırlanması

Havayla kurutulmuş CD malzemesi toz haline getirildi ve %70 etanol ile süzülerek özü çıkarıldı. PhG açısından zengin fraksiyon daha önce anlatıldığı gibi hazırlandı ve suyla doyurulmuş n-bütil alkolle özü çıkarıldı. Ekstrakt sıvısı konsantre edildi ve indirgenmiş basınç altında kurutuldu. Makro gözenekli reçine-UV spektrofotometrisi %78,4'lük bir PhG içeriğini ölçtü. Nihai numune, kuru ağırlığa göre %1,75'lik bir ham madde verimini temsil ediyordu. Elde edilen örnek bir sonraki kullanıma kadar -20 derecede saklandı.

AC, IS ve EC'nin HPLC ile belirlenmesi

PRE'deki AC, IS ve EC içeriğini test etmek için LC çözüm yazılımıyla donatılmış bir Shimadzu HPLC sistemi kullanıldı. Ters fazlı bir Intersil C18 kolonu (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) kullanıldı ve oda sıcaklığında tutuldu. Mobil fazlar asetonitril ve 1.0 ml/dakika akış hızında gradyan elüsyonu (Tablo 1) ile %0.1 fosforik asit (h/h) içeren suydu. UV spektrofotometre detektörü 334 nm'ye ayarlandı. AC ve IS akışını doğru bir şekilde belirlemek için yeni bir HPLC-floresan algılama (HPLC-FLD) yöntemi geliştirdik. Yapısal bir analiz ve floresans dalga boyu taramasından (veriler gösterilmemiştir) sonra, AC (Örn: 338 nm, Em: 448 nm) ve IS (Örn: 320 nm, Em: 434 nm) için en uygun floresans saptama koşullarını elde ettik.

HPLC analitik yöntemi şu performans özellikleri kullanılarak doğrulanmıştır: kararlılık, doğrusallık, duyarlılık, kesinlik (gün içi ve günler arası değişkenlik) ve doğruluk. Taşıma tamponundaki analitler 25 derecede karanlıkta 24 saat bekletilerek stabiliteleri ölçüldü. Analitler C vitamini (%0.4%) varlığında oldukça stabildi çünkü pik alanlardaki bağıl standart sapma (RSD) değerleri < %3.5 idi. AC, IS ve EC için doğrusal regresyon denklemi, korelasyon katsayısı, doğrusallık aralığı, LOD ve LOQ Tablo 2'de gösterilmektedir. LOD'ler (18–30 nM) ve LOQ'lar (60–100 nM) değerler HPLC-FLD ve HPLC-UV yöntemlerinin oldukça hassas olduğunu göstermektedir. Yöntemin kesinliğini ifade eden RSD değerlerinin tümü, gün içi ve günler arası değişkenlik için <%2 idi; bu da iyi bir kesinliğe işaret ediyordu. Geri kazanım değerlendirmesi için, üç (yüksek, orta ve düşük) konsantrasyon seviyesi elde etmek üzere taşıma tamponuna AC, IS ve EC eklendi. Yöntemin analitler için geri kazanım değerleri Tablo 3'te özetlenmiştir. Ortalama geri kazanımlar %90,0 ile %96,4 arasında değişmiştir ve bu da iyi bir doğruluğu göstermektedir. Sonuç olarak, belirlenen HPLC yöntemleri, taşıma tamponundaki AC, IS ve EC'nin miktarının belirlenmesi için doğrusallık, hassasiyet, kesinlik ve doğruluk açısından tatmin edicidir.

PRE'nin biyoanaliz sistemi ile belirlenmesi

Biyoanaliz (toplam anti-oksidatif kapasite), daha önce tanımladığımız FRAP (ferrik indirgeme/antioksidan güç) testine dayanıyordu [16] ve doğrusallık ve kesinlik (gün içi ve günler arası değişkenlik) açısından doğrulanmıştır. Biyoanaliz yönteminin doğrusallığı kalibrasyon eğrilerine göre belirlendi. Doğrusallığın konsantrasyon aralığı 0.0625 − 40 ug/ml (y=0.0258x+0.0968, R2=0.996) idi. Kurulan biyoanaliz yönteminin kesinliği, PRE (10.0 ug/ml) analizi için gün içi ve günler arası değişkenlik açısından belirlendi. Yöntemin gün içi tekrarlanabilirliği, aynı gün içinde ardı ardına yapılan beş tespite dayanılarak belirlendi. Günler arası tekrarlanabilirlik, üç farklı günde ardışık beş tespite dayanarak ölçülmüştür. Yöntemin kesinliğine ilişkin RSD değerleri, gün içi ve günler arası değişkenlik için sırasıyla %1,014 ve %4,72 olup, bu da iyi bir kesinliğe işaret etmektedir. Bu nedenle oluşturulan biyoanaliz yöntemi, bir taşıma tamponundaki PRE'nin miktarının belirlenmesi için doğrusallık, kesinlik ve doğruluk açısından tatmin edicidir.

Hücre kültürü

Caco{{0}} hücreleri, %5 CO2 içeren bir atmosferde ve DMEM, %10 FBS, %1 NEAA, %1 L-glutamin, penisilin içeren bir ortamda 37 derece ve %95 bağıl nemde kültürlendi. (100 U/ml) ve streptomisin (100 ug/ml). Ortam, hücre büyümesi ve farklılaşması sırasında günaşırı değiştirildi. Hücreler 75-cm2'lik plastik şişelerde büyütüldü ve her 3-5 günde bir %0,05 EDTA-tripsin ile toplandı. Taşıma deneyleri için hücreler, kolajen ile kaplanmış Transwell ekleri üzerine 1x105 hücre/cm2 yoğunlukta ekilmiştir. Tohumlamadan yaklaşık 21 gün sonra, tek tabakalar taşıma deneyleri için kullanıldı. Bütünlükleri, ENDOHM-SNAP (World Precision Instruments, Inc., ABD) ile donatılmış bir EVOM ile tek katmanlar boyunca trans-epitelyal elektrik direncinin (TEER) ölçülmesiyle belirlendi. Caco-2 hücre tek katmanının TEER değerlerinin 500 O∙cm2'yi aşması gerekiyordu.

RAHATLATICI VE MEŞHİL PHGS İÇİN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA %75 ECH %30 ACT %12

Taşıma deneyleri

Tek katman, taşıma tamponu (10 mM HEPES, 1 mM sodyum piruvat, 10 mM glikoz, 3 mM CaCl2 ve 145 mM NaCl içeren P-tamponu, pH 7,4) ile yıkandı ve daha sonra 20 dakika boyunca önceden inkübe edildi 37 derecede. Taşıma tamponunun çıkarılmasından sonra, bazolateral (BL) yönlü çalışmalara AP'deki apikal (AP) bölmesine (1,5 mi) veya AP yönlü çalışmalara BL'deki BL bölmesine (2,5 mi) test numuneleri içeren taze taşıma tamponu eklendi. HPLC kullanılarak AC, IS ve EC analizleri için, her bir alıcı odasından farklı zaman aralıklarında (30, 60, 90 ve 120 dakika) bir kısım (300 ul) çıkarıldı. Alıcı bölmesi, her örneklemeden sonra aynı hacimde taze önceden ısıtılmış (37 derece) taşıma tamponu ile dolduruldu. Toplanan örnekler daha sonra kullanılmak üzere -20 derecede saklandı. Biyoanaliz kullanılarak PRE tespiti için yalnızca 120 dakikadaki numuneler alındı. PRE, AC, IS ve EC'nin kararsızlığı nedeniyle AC, IS ve EC içeriklerini HPLC ile belirlemek üzere örnekleri stabilize etmek için %0,4 (a/h) C vitamini eklendi ve PRE biyoanalizi için örnekler numune alındıktan hemen sonra test edilir. Her örneğin görünür geçirgenlik katsayısı (Papp veya 'Papp) değeri hesaplandı.

Veri analizi

AC, IS ve EC'nin AP BL veya BLAP yönlerindeki Papp değerleri aşağıdaki denklem temel alınarak hesaplandı: Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC0), burada Papp, HPLC ile belirlenen görünür geçirgenlik katsayısıdır (cm/s). (4Q/4t), test bileşiğinin (AC, IS veya EC) alıcı tarafında görünme hızıdır (μmol/s); A, ek parçanın yüzey alanıdır (cm2); C0 donör tarafındaki başlangıç ​​test bileşiği konsantrasyonudur (μmol/ml). Özellikle 'Papp değerleri hesaplanırken 'μmol' yerine kütle birimi 'ug' kullanıldı. Veriler ortalama ± SD olarak ifade edildi.

Sonuçlar

CD'den PRE'de AC, IS ve EC'nin bileşimi

Çünkü AC, IS ve EC ana biyoaktif maddeler olarak kabul edilir.Cistanche türlerinin PhG'leri, içeriklerini HPLC-UV aracılığıyla PRE'de analiz ettik. Temsili kromatogram Şekil 1'de gösterilmektedir. Bu bileşenlerin tanımlanması, alıkonma sürelerinin ve UV spektrumunun 334 nm dalga boyundaki orijinal standartlarla karşılaştırılmasına dayanıyordu. PRE'deki AC, IS ve EC içerikleri sırasıyla %26,60, %1,84 ve %32,83 idi. Dolayısıyla bu üç bileşik PRE'nin %61,27'sini oluşturur; ayrıca yukarıdaki sonuçlar PRE'deki PhG içeriğinin %78,4 olduğunu göstermektedir. Bu nedenle AC, IS ve EC, PRE'deki PhG'lerin yaklaşık %80'ini oluşturur.

PRE, AC, IS ve EC'nin toplam anti-oksidatif kapasiteleri

ÇalışmalarPhG'lerin anti-oksidatif aktivitesiCD'den rapor edilmiştir ve AC, IS ve EC, PRE'deki PhG'lerin yaklaşık %80'ini oluşturur. Böylece PRE, AC, IS ve EC'nin toplam anti-oksidatif kapasiteleri test edildi ve FRAP değerleri (x 10-6 mmol) kullanılarak ifade edildi. Şekil 2'de gösterildiği gibi, FRAP değeri 8 x 10-6 mmol olduğunda, PRE, AC, IS ve EC'nin nihai konsantrasyonları 6,20 ug/ml, 3,14 ug/ml, 22,92 ug/ml ve 4,89 ug olmuştur. Sırasıyla /ml, bu dört örneğin toplam anti-oksidatif kapasitesinin şu şekilde sıralandığını gösterir: AC > EC > PRE > IS. PRE'nin biyoaktivitesi aktif bileşen gruplarına (AIG) atfedilir. PRE'nin yaklaşık %60'ı için AC ve EC, PRE ve IS'den daha güçlü toplam anti-oksidatif aktivite gösterdi. IS (%1,84) PRE'nin çok küçük bir kısmını oluşturduğundan, zayıf antioksidatif IS gibi diğer bileşenler de PRE'de açıkça aktiftir. Şaşırtıcı bir şekilde, toplam anti-oksidatif aktivite, AC ve izomeri IS arasında neredeyse 7- kat farklılık gösterdi; bu, yalnızca fenolik hidroksil gruplarının sayısının değil, aynı zamanda moleküldeki fenolik hidroksil gruplarının konumunun da anti-oksidatif etkiyi etkilediğini gösterir. .

Caco-2 tek katmanlarının doğrulanması

Caco-2 hücre tek katmanlı sistemini doğrulamak için, Caco-2 tek katmanları boyunca AP'den BL'ye propranolol (iyi taşınan bir işaretleyici) ve Lucifer sarısının (zayıf taşınan bir işaretleyici) Papp değerleri ölçüldü. sırasıyla 1,51 × 10–5 cm/s ve 2,8 × 10–7 cm/s olarak belirlendi ve bu değerler önceki raporlarda yayınlanan değerlerle uyumluydu. Alkalin fosfataz aktivite deneyi ayrıca Caco-2 hücre tek katmanlarının niteliksel olarak ince bağırsak epiteliyle karşılaştırılabilir olduğunu doğruladı.

AC, IS ve EC'nin geçirgenliği

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1.0 × 10–5 cm/s), zayıf emilen ilaçlarınki ise düşüktü (< 1.0 × 10–6 cm/s) [3]. As shown in Table 4, the Papp values of AC, IS, and EC were nearly on the order of 10–7 cm/s, indicating that these compounds were poorly permeable. Furthermore, efflux or active transport was not observed because the ratios of Papp BL to AP / Papp AP to BL for AC, IS, and EC were between 0.90 ~ 1.55, and the criterion of net efflux proposed by the FDA Guidance is a ratio less than 2. Based on the kinetic curves presented in Fig. 3, the bidirectional transport percentages of AC, IS, and EC at 200 μM increased linearly with time. The transport rate (TR) values of the three compounds increased linearly in both directions between approximately 100 and 300 μM (Fig. 4). These results indicate that the main transport mechanism of AC, IS, and EC is also passive diffusion. 

PRE'nin geçirgenliği

Yukarıdaki sonuçlar, PRE'nin toplam anti-oksidatif kapasitesinin, PRE'den gelen AIG'nin en az %61,27'sinden kaynaklandığını göstermektedir. Bu nedenle, toplam anti-oksidatif kapasitenin konsantrasyon-etki eğrisine dayanarak PRE'nin TR'sini değerlendirdik ve PRE'nin taşıma özelliklerini yansıtacak 'Papp değerlerini hesapladık. AP!BL ve BL!AP için PRE'nin Papp değerleri (2,16 ± 0,26) × 10–7 cm/s ve (3,13 ± 0,29) × 10–7 cm/s idi. sırasıyla bu bileşiğin zayıf geçirgen olduğunu gösterir. Ayrıca, akış veya aktif taşıma belirgin değildi çünkü 'Papp BL'nin AP'ye / 'Papp AP'nin BL'ye oranı PRE için 1.45 idi. Ayrıca PRE'nin çift yönlü TR'si yaklaşık 300 ila 900 ug/ml arasında doğrusal olarak arttı (Şekil 5). Sonuçların yön tercihinin olmaması, pasif difüzyonun PRE'nin ana taşıma mekanizması olduğunu göstermektedir.

BAĞIŞIKLIĞI GELİŞTİRMEK İÇİN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Tartışma

Yüksek oranda saflaştırılmış ilaç ürünleriyle karşılaştırıldığında PE, genellikle çok farklı fizyokimyasal özelliklere sahip yüzlerce bileşenden oluşan karışımlardır. Bu nedenle PE, karmaşık AIG'leri [21] nedeniyle sistematik, çok hedefli ve çok kanallı sinerjistik etki uygular ve bu da PE'nin taşıma özelliklerinin analizini engeller. PE'nin taşınma özelliklerini daha bilimsel olarak değerlendirmek için bazı araştırmacılar PE'de tek bir bileşen yerine birden fazla bileşen tanımlamıştır [22-24]. Ancak sınırlı sayıda bileşen PE'yi bir bütün olarak yansıtamaz. Ancak PE'deki tüm bileşenlerin belirlenmesi mümkün değildir. Ayrıca, eğer PE'deki farklı bileşenler tamamen farklı taşıma özellikleri sergiliyorsa, PE'nin bütünsel taşıma özelliklerini tanımlamak zor olacaktır.

1990'lı yıllarda antimikrobiyal ajanların TR'sini değerlendirmek için biyoanaliz sistemleri kullanıldı [25]. 2005 yılına gelindiğinde, Eguchi ve meslektaşları [26], farklılaşmış Caco-2 hücrelerinden elde edilen BL ortamını kullanarak havuç ekstraktının anti-oksidatif aktivitesini değerlendirdiler; bu yaklaşım in vivo durumları yansıtmak için daha uygundur.

PhG'lerin aktivitesine ilişkin önceki bir rapora ve sonuçlarımıza dayanarak (Şekil 2), PRE'deki AIG'nin TR'si, alıcı odacıktaki ortamın toplam anti-oksidatif kapasitesi belirlenerek değerlendirilebilir. Taşıma deneylerinden sonra, PRE'nin TR'sinin her iki yönde de benzer olduğunu ve bu taşımanın doymamış olduğunu ve zayıf bir şekilde emildiğini ('Papp < ​​1.0 × 10–6 cm/s) ve akışa işaret eder, bu da bir konsantrasyon gradyanı boyunca pasif difüzyonun PRE'nin ana taşıma mekanizması olduğunu düşündürür (Şekil 5). Ayrıca PRE'nin taşıma özellikleri, PRE'de anti-oksidatif aktivite sergileyen etkili bileşenler olan AC, IS ve EC'ninkilerle tutarlıdır (Şekil 4 ve Tablo 4). Bu sonuç beklenen bir sonuçtu ve mevcut biyoanaliz sisteminin, farklılaşmış Caco{10}} hücrelerinde PRE'deki AIG'nin taşıma özelliklerinin değerlendirilmesi için uygun ve güvenilir olduğunu gösterdi.

Tek bir bileşiğin taşınmasını yansıtmak için yaygın olarak kullanılan kanonik Papp değerinin aksine, konsantrasyon-etki eğrisine dayalı olarak TR'den elde edilen 'Papp değeri, yalnızca bozulmamış bir yapıya sahip tek katmanlara nüfuz eden bileşenleri yansıtmakla kalmaz, aynı zamanda ayrıca bileşenlerin metabolitleri, kimyasal olarak bozunmuş ürünler ve hatta hedef biyoaktiviteyi etkileyebilecek uyarıma yanıt olarak Caco-2 hücrelerinden salgılanan bazı sitokinler gibi hedef aktiviteyle ilgili diğer faktörleri de içerir. Dolayısıyla 'Papp değerini' yalnızca taşınan sağlam bileşenler değil, yukarıda bahsedilen çoklu faktör belirler. Bu nedenle 'Papp, in vivo durumlarla kanonik Papp değerinden daha güçlü bir şekilde ilişkili olabilir. Bu çalışmada PRE'nin 'Papp değerine dayanarak pasif olarak yayılan ve zayıf emilen yapısını açıkladık ve bu doğası ÇH'nin yüksek dozajı ve uzun klinik tedavi süresi ile ilişkili olabilir. Bununla birlikte, bu bulgular, yalnızca PhG'lerin değil, ÇH'deki çoğu AIG'nin taşıma özellikleri tanımlandığında, ÇH uygulamasında klinisyenlere daha sistematik rehberlik sağlayacaktır.

Bununla birlikte, seçilen biyoaktivite öğesinin, alıcı odacığının ortamında tespit edilebilmesi için yeterince hassas olması gerekir; bu, PE'nin taşıma özelliklerini değerlendirmek için bir biyoanaliz sisteminin kurulmasına zorluk teşkil eder. Ayrıca biyoaktivite mümkün olduğu kadar çok bileşene bağlı olmalıdır. Çalışmamızda toplam anti-oksidatif kapasite tahlili diğer birçok yöntemden daha uygundu (S1 Şekil). Ancak öyle olsa bile, tahlilimiz PRE'nin TR'sini yalnızca 120 dakikada tespit edebilir.

Toplu olarak mevcut çalışma, farklılaşmış Caco-2 hücrelerinde PRE'nin bağırsak geçirgenliğini değerlendirmek için yeni bir biyolojik tahlil sistemi oluşturdu. Elde edilen sonuçlar, akış olmadan bir konsantrasyon gradyanı boyunca zayıf bir şekilde emilen pasif difüzyonun, PhG'lerin CD'de klinik uygulaması için farmakokinetik temeli sağlayan PRE'nin ana taşıma mekanizması olduğunu gösterdi (Şekil 5). TR'yi değerlendirmek ve dolayısıyla PE'lerde AIG'nin bağırsaktan taşınma özelliğini değerlendirmek için 'Papp değerlerini hesaplamak için yeni bir biyoanaliz sisteminin kullanılması mümkündür. Bu yaklaşım, uygun biyoaktivite göz önüne alındığında diğer PE'ler için de uygun olabilir.

CİNSEL FONKSİYONU GELİŞTİREN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%