Adeno ile ilişkili Viral Vektör Preparatlarındaki ekstra viral DNA, İnsan Plazmasitoid Dendritik Hücrelerinde TLR9'a Bağlı Doğuştan Bağışıklık Yanıtlarını İndükler

İnsandan türetilmiş HEK hücrelerinde veya Spodoptera frugiperda (Sf9) böcek hücrelerinde üretilen adeno ile ilişkili viral (AAV) vektör süspansiyonları, artık konakçı hücre bileşenlerinin yanı sıra AAV kapsid proteinlerinde görüntülenen türe özgü translasyon sonrası modifikasyonlar açısından farklılık gösterir. . Burada bu farklılıkların vektörün immünojenik özellikleri üzerindeki etkisini analiz ettik. İnsan plazmasitoid dendritik hücrelerini, farklı üreticilerden elde edilen çeşitli HEK hücresi tarafından üretilen ve Sf9 hücresi tarafından üretilen AAVCMV-eGFP vektörleriyle uyardık. AAV8-CMV-eGFP'nin yanı sıra AAV2-CMV-eGFP vektörlerinin partiye özgü ancak üretim platformuna özgü veya üreticiye özgü inflamatuar sitokin yanıtlarını tetiklemediğini bulduk. Bunlar, geçiş ücreti benzeri reseptör 9 sinyalinin bloke edilmesiyle veya DNaz kullanılarak vektör partilerindeki DNA'nın enzimatik olarak azaltılmasıyla azaltılabilir veya ortadan kaldırılabilir. DNaz ile muamele edilmiş AAV lotları ve DNA analizleri ile başarılı HEK hücre transdüksiyonu, DNaz'ın vektörün bütünlüğünü etkilemediğini ancak ekstra viral DNA'yı bozduğunu gösterdi. Hem HEK hem de Sf9-hücresinden türetilen AAV preparatlarının, partiye özgü inflamatuar bağışıklık tepkilerini tetikleyebilen immünojenik ekstra viral DNA bileşenleri içerebileceği sonucuna vardık. Bu, ekstra viral DNA safsızlıklarını gidermek için geliştirilmiş stratejilerin, AAV vektör preparatlarının immünojenik özelliklerinin azaltılmasında etkili olabileceğini düşündürmektedir.

cistanche tubulosa-bağışıklık sistemini iyileştirir

Son on yılda hem temel araştırmalar hem de klinik uygulamalar için yeni rekombinant adeno-ilişkili virüs (AAV) bazlı stratejilerin geliştirilmesine büyük bir ilgi duyuldu1-3. Bunun başlıca nedeni, terapötik genleri hedef dokulara verimli ve güvenli bir şekilde iletme yetenekleri göz önüne alındığında, AAV vektörlerinin gen terapisi alanında son derece çok yönlü araçlar olduğu gerçeğinde yatmaktadır4. Bununla birlikte, giderek artan sayıda araştırmacı, klinik öncesi ve klinik çalışmalarda AAV'nin verilmesinden sonra lokal ve sistemik immün yanıtları düşündüren bulguları bağımsız olarak rapor etmektedir5-8.

AAV vektörlerinin, ücretli benzeri reseptör (TLR)2 ve TLR9 gibi doğuştan gelen bağışıklık modeli tanıma reseptörlerini aktive ettiği ve bunun sonucunda inflamatuar sitokinlerin ve tip I interferonların (IFN)9,10 salınmasına neden olduğu gösterilmiştir. AAV'nin bu yanıtları uyarabilecek immünojenik bileşenleri arasında kapsid proteinleri ve vektör genomu9,10 yer alır. AAV uygulamasından sonra bağışıklık tepkileri, vektör süspansiyonundaki safsızlıklar tarafından da tetiklenebilir5,11. Bu safsızlıklar, saflaştırılmış AAV vektör süspansiyonunda arzu edilen ürün12 dışında mevcut olan ve vektörün üretim prosesinden kaynaklanan herhangi bir bileşen olarak tanımlanmıştır. Klinik rekombinant AAV vektörlerinin üretilmesine yönelik başlıca yöntemlerden ikisi, plazmid DNA'nın HEK hücrelerine transfeksiyonu ve Spodoptera frugiperda (Sf9) böcek hücrelerinin bacoluvirus13 ile enfeksiyonunu içerir. Buna göre, AAV vektör süspansiyonlarında bulunan potansiyel olarak immünojenik safsızlıklar, endotoksinleri, hücre kültürü ortamı bileşenlerini, AAV saflaştırması için kullanılan reaktifleri, konakçı hücrelerden türetilen proteinleri ve DNA'yı ve artık bakuloviral DNA veya plazmit DNA5'i içerebilir. AAV vektör süspansiyonlarının immünojenitesini etkileyebilecek ek faktörler, farklı vektör üretim platformları5 tarafından kapside basılan translasyon sonrası modifikasyonlardır (PTM'ler). Daha da önemlisi, HEK hücresinden türetilen ve Sf9 hücresinden türetilen AAV vektörleri, PTM'leri, kalıntı konakçı hücre proteini safsızlıkları11 ve potansiyel olarak aynı zamanda DNA safsızlıkları (HEK hücre DNA'sına karşı Sf9 hücre DNA'sının yanı sıra artık plazmid DNA) açısından büyük farklılıklar gösterir. baküloviral DNA'ya karşı)14. Plazmasitoid dendritik hücreler (pCD'ler), viral enfeksiyonlar9,15 üzerine büyük miktarlarda tip I IFN ve proinflamatuar sitokinler salgılayan ve AAV vektörlerinin9 algılanmasında önemli bir rol oynayan özel bir doğuştan bağışıklık hücresi türüdür. Buna göre, HEK hücresi tarafından üretilen ve Sf{26}}hücresi tarafından üretilen AAV vektörleri arasındaki farkların immünojenik özelliklerinde farklılıklarla sonuçlanıp sonuçlanmadığını analiz etmek için, insan pDC'lerini iki üretim sisteminden elde edilen aynı AAV vektörünün farklı partileriyle uyardık. ve farklı üreticiler. İncelenen vektör partilerinin yarısının, ne vektör üretim sistemiyle ne de üreticiyle ilgili olmayan, partiye özgü proinflamatuar bağışıklık tepkilerini ortaya çıkardığını bulduk. Bu yanıtlara TLR9 sinyali aracılık etti ve vektör partilerinin DNase ile işlenmesine duyarlıydı. Hem tedavi edilmemiş hem de DNase ile tedavi edilmiş AAV vektör partileri ve AAV preparasyonlarının DNA analizleri ile başarılı HEK hücre transdüksiyonu, DNase'in AAV parçacık bütünlüğünü etkilemediğini, bunun yerine kapsüllenmemiş ekstra viral DNA'yı hedef aldığını gösterdi. Toplu olarak bu, AAV vektör preparatlarının, insan pDC'lerindeki AAV vektör preparatlarının immünojenik özelliklerini etkileyebilen kapsüllenmemiş ekstra viral DNA içerebileceğini göstermektedir.

Cistanche tubulosa'nın faydaları-Bağışıklık sistemini güçlendirmek

Sonuçlar

AAV, insan pDC'lerinde partiye özgü doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini indükler.

Çalışmalar, HEK hücresinden türetilen ve Sf9 hücresinden türetilen AAV vektörlerinin, PTM'leri ve viral süspansiyonlarda bulunan safsızlıklar açısından farklılık gösterdiğini göstermiştir11. Bu faktörlerin, HEK hücresi ve Sf9 hücresinden türetilen vektör lotları arasındaki immünojenik özelliklerde farklılıklara yol açabileceğini varsaydık. Bu hipotezi test etmek için, sitomegalovirüs promotörünün (CMV) aynı DNA dizisini ve geliştirilmiş yeşil floresans proteini (eGFP) (AAV8-) için aynı transgeni içeren toplam sekiz AAV serotip 8 (AAV8) vektör lotunu analiz ettik. CMV-eGFP; üç farklı üreticiden [imalatçı A; Iowa Üniversitesi'nin (Iowa, ABD) Viral Vektör Çekirdek Tesisi, üretici B; Virovek (CA, ABD) ve üretici C; Vigene Biosciences (MD, ABD)]. Lotlar arasındaki benzerlikleri en üst düzeye çıkarmak için, üretici A ve üretici B'ye ait yedi AAV8 lotu (Tablo 1), aynı orijinal plazmid kullanılarak üretildi. Ek olarak, AAV vektör lotlarının vektör genomlarının (vg) damlacık dijital PCR (ddPCR) kaydı, iki farklı hedef kullanılarak yan yana ölçümde gerçekleştirildi: biri CMV sekansı içinde ve diğeri eGFP sekansı içerisinde. vektörler. CMV hedefinin ölçülmesiyle elde edilen sonuçlar, aşağıdaki deneylerde AAV vektör partilerinin titrasyonu için kullanıldı (Tablo 1). pDC'ler, AAV vektörleri9 dahil olmak üzere viral enfeksiyon15 üzerine büyük miktarda tip I IFN'ler üreten özel viral sensörlerdir9. HEK hücresi tarafından üretilen ve Sf9- hücresi tarafından üretilen AAV vektörlerinin, bağışıklık sistemi yeterli hücrelerde doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini ortaya çıkarma kapasiteleri açısından farklılık gösterip göstermediğini araştırmak için, insan pDC'lerini yukarıda listelenen AAV vektör partileriyle uyardık. Bu amaçla pDC'ler, bireysel sağlıklı insan donörlerin periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler), manyetik aktifleştirilmiş hücre sınıflandırma (MACS) kullanılarak negatif seçim yoluyla saflaştırıldı. Akış sitometri analizi, izole edilmiş pDC'lerin saflığının% 90'ın üzerinde olduğunu doğruladı (Şekil S1). On, bireysel bir donörün pDC'leri, 18 saat boyunca 1:1 x 106 vg/hücre MOI'de AAV8 ve AAV2 vektör lotlarıyla tohumlandı ve uyarıldı. 50 ul/kuyucukta toplam 12.500 hücreye uygulanan 1:106 vg/hücre MOI, 2,5x 1011 vg/ml titreye dönüşür. Bu titreyi kullandık çünkü insanlarda (örneğin 1×1012 vg/ml16 veya 4 × 1011–1,3 × 1012 vg/ml17) ve insan olmayan primatlarda (örneğin 5 ×) retinal gen terapisi çalışmalarında uygulanan aralıkta yer alır. 1011–5 × 1012 vg/ml6). Araçla stimülasyon kontrol görevi gördü. AAV8 ve AAV2 vektör partileriyle inkübasyon, pDC'lerde herhangi bir tespit edilebilir transgen ekspresyonuyla sonuçlanmadı. Bununla birlikte, sekiz AAV8 lotundan dördü (A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf9-1 partileri) ve dört AAV2 lotu (B-Sf9-1, B-Sf9-2 lotları) uyarılmış pDC'lerde reaktif hücre proliferasyonunu indükledi (Şekil 1a). Buna proinflamatuar sitokinlerin (IP-10, MIP-1 ve TNF-) ve tip I IFN'nin (IFN-) salınımı eşlik etti. Tersine, kalan AAV8 (partiler A-Sf9-1, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK{{92}) tarafından ne hücre çoğalması ne de sitokin salınımı uyarıldı. }) ve AAV2 lotları (partiler C-HEK-1, C-HEK-2). Bu sonuçlar, her biri tek bir donörün hücreleriyle gerçekleştirilen üç ila dört bağımsız deneyde doğrulandı (Şekil 1a-c ve Tablo S1). Bu bağımsız deneylerde sitokin konsantrasyonlarındaki partiye özel farklılıklar, doğrusal bir karışık etki modeli ve post hoc Dunnett testi (Q=2.6) kullanılarak, farklı AAV vektör partilerinin en küçük kare ortalamaları karşılaştırılarak istatistiksel olarak analiz edildi. araç kontrolü (Tablo S2 ve S3). Bu, "immünojenik" AAV vektör lotları (AAV8 lotları A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf{) arasındaki sitokin yanıtlarında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar olduğunu gösterdi. {114}} veya AAV2 lotları B-Sf9-1, B-Sf9-2 sırasıyla) ve kontrol, ancak "immünojenik olmayan" AAV vektör lotları (AAV8 lotları A-Sf{{) arasında anlamlı fark yok 123}}, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK-1 veya AAV2 lotları C-HEK-1, C-HEK-2 sırasıyla) ve kontrol (Tablo S3). Multipleks teste dahil edilen ölçülen sitokinlerin geri kalanının konsantrasyonları da test aralığının altındaydı (yani, IL-1 , IL-2, IL-4, IL-5 , IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, GM-CSF, IFN- ) veya ne "immünojenik" ne de "immünojenik olmayan" vektör partileri bunların salınımında herhangi bir önemli artışa neden olmuştur (yani, IL-7, IL-8, G-CSF, MCP-1) (Şekil S2), bu da şunu düşündürmektedir: AAV aracılı sitokin yanıtında bir özgüllük derecesi. Daha erken bir zaman noktasında sitokin tepkilerini araştırmak için pDC'ler "immünojenik" AAV8 vektör partisi A-HEK-1 ile uyarıldı. PDC stimülasyonundan 2 saat sonra süpernatandaki TNF- konsantrasyonunda önemli bir artış gözlemledik. Bu yanıt modeli, her biri tek bir donörün hücreleriyle gerçekleştirilen üç deneyde doğrulanabilir (Şekil S3). Daha yüksek dozda "immünojenik olmayan" bir AAV8 vektör lotunun bir bağışıklık tepkisini tetikleyip tetikleyemediğini araştırmak için pDC'leri teknik olarak maksimum uygulanabilir MOI (1:4,61x 106 vg) ile uyardık. İlginç bir şekilde, bu artan titre ile uyarılma üzerine ne reaktif hücre proliferasyonu ne de sitokin tepkileri tespit edilmedi (Şekil S4). Hipotezimizin aksine bu sonuçlar, pDC'lerde AAV'ye karşı doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinin partiye özgü olduğunu ve belirli bir üretim sistemi veya üretici/saflaştırma yöntemiyle ilişkili olmadığını göstermektedir.

Tablo 1. Bu çalışmada kullanılan farklı AAV8 ve AAV2 viral vektörleri.

Şekil 1. İnsan pDC'lerinde AAV vektörüne özgü bağışıklık tepkilerinin indüksiyonu. İnsan pDC'leri, 18 saat boyunca farklı sayıda AAV8-CMV-eGFP ve AAV2-CMV-eGFP (MOI: 1:1× 106 vg) ile uyarıldı (a) ile uyarılan pDC'lerin temsili parlak alan görüntüleri araç kontrolü (üst resim) veya immünojenik AAV vektör lotu (alt resim). Ölçek çubuğu 100 mikrondur. (b) AAV8-uyarılmış pDC'ler tarafından IP-10, MIP-1, TNF- ve IFN- 2'nin sitokin salınımı. (C) AAV{16}}uyarılmış pDC'ler tarafından sitokin salınımı. Üç ila dört bağımsız deneyden birinin temsili grafikleri. IFN- 2 ölçümlerinde (b,c) ve TNF- ölçümünde (c) bazı değerler test aralığının altına düştüğünden, sunum amacıyla ölçülen tüm IFN- 2 ve TNF- değerlerine sabit 1 eklendi yarı logaritmik bir grafikte. Medyanlar ve çeyrekler arası aralıklar gösterilmiştir. Bireysel vektör partilerinin etiketlerinde üç üretici A, B ve C harfleriyle temsil edilir; HEK hücresinden türetilmiş ve Sf9-hücresinden türetilmiş vektörler "HEK ve "Sf9" ile gösterilir ve aynı üreticinin ve aynı üretim sisteminin karşılık gelen partileri "1, 2, 3" olarak numaralandırılır. Daire: HEK'den türetilmiş vektör partisi; üçgen: Sf9-türetilmiş vektör partisi; siyah: A üreticisinden vektör partisi; turuncu: B üreticisinden vektör partisi; yeşil: C üreticisinden vektör partisi.

pDC'lerde AAV stimülasyonuna verilen bağışıklık tepkisi, kapsid/VG oranındaki farklılıklardan etkilenmez.

Klinik öncesi çalışmalar, AAV vektör süspansiyonlarındaki dolu ve boş vektör parçacıklarının sayısındaki farklılıkların bağışıklık tepkisini etkileyebileceğini göstermiştir18. Analiz edilen vektör partileri arasındaki immünojenik özelliklerdeki farklılıkların dolu ve boş vektör parçacıklarının oranındaki farklılıklardan kaynaklanıp kaynaklanmadığını değerlendirmek için tüm AAV partilerindeki vektör kapsidlerinin titresini AAV titrasyonu ELISA ile belirledik ve kapsid/VG'yi hesapladık. oran. İlginç bir şekilde, tüm AAV lotları arasında kapsid/vg oranında büyük farklılıklar bulundu (Şekil 2). AAV8-CMV-eGFP lotları A-HEK-1, A-HEK-3, A-Sf{{11}'de vg'den (2:1) yaklaşık iki kat daha fazla kapsid bulundu } ve AAV2-CMV-eGFP B-Sf9-1; ve AAV8 lot A-Sf9-1'de dört kat daha fazla (4:1). Partilerin geri kalanında 1:1 oranı gözlendi. Bununla birlikte, "immünojenik" ve "immünojenik olmayan" AAV vektör lotlarının kapsid/vg oranları arasında, AAV8'de (P=0.27) veya AAV2'de (P=0.37) anlamlı bir fark bulunmadı. vektör partileri (Şekil 2). Bu, analiz edilen AAV vektör partilerinin immünojenik özelliklerindeki farklılıkların aynı zamanda dolu ve boş vektör parçacıklarının oranındaki farklılıklarla da ilişkili olmadığını göstermektedir.

cistanche takviyesi faydaları-bağışıklık sistemi nasıl güçlendirilir

"İmmunojenik" AAV8 vektör partilerinin TLR9 tarafından tanınması.

AAV'nin murin ve insan pDC'leri tarafından doğuştan gelen immün tanınmasına, TLR99'u algılayan DNA'nın aracılık ettiği gösterilmiştir. Buna göre TLR9'un "immünojenik" AAV8 vektör gruplarımızın tanınmasında da yer alıp almadığını değerlendirdik. Bu amaçla, pDC'ler tarif edildiği gibi tohumlandı ve TLR9 antagonisti H154 (50 uM) ile kültürlendi, ardından "immünojenik" AAV8 vektör partileri A-HEK-1, A-HEK-2, A ile uyarıldı. -HEK-3 ve A-Sf9-1 (MOI: 1:1× 106 vg). 18 saat sonra hücre çoğalmasına dair hiçbir kanıt gözlenmedi (Şekil 3a) ve IP-10, MIP-1, TNF- ve IFN- salınımında önemli bir azalma ölçüldü (Şekil 3a). 3b). Bu, insan pDC'lerindeki "immünojenik" AAV8 vektör partilerine karşı bağışıklık tepkilerine TLR9 sinyallemesinin aracılık ettiğini gösterir.

Şekil 2. Farklı AAV8-CMV-eGFP ve AAV2-CMV-eGFP vektör lotları arasındaki kapsid/vg oranlarının karşılaştırılması. Kapsid/vg oranları, (a) sekiz AAV8 vektör lotunun ve (b) dört AAV2 vektör lotunun absorbans ölçümlerinden (ELISA) ve ddPCR sonuçlarından elde edilir. Kesikli çizgiler "immünojenik"i "immünojenik olmayan" AAV vektör lotlarından ayırır. Çubuklar, kopyaların ortalamalarını ve standart sapmalarını gösterir. İstatistiksel anlamlılık, eşleştirilmemiş Öğrenci t-testi kullanılarak belirlendi.

Şekil 3. "İmmünojenik" AAV8-CMV-eGFP vektör lotlarının pDC'ler tarafından tanınması TLR9'a bağlıdır. İnsan pDC'leri, TLR9 antagonisti H154 (50 μM) ile tedavi edildi, ardından 18 saat boyunca "immünojenik" AAV8 vektör partileri (MOI: 1:1x106 vg) ile uyarıldı. (a) "İmmunojenik" AAV vektör lotları (üst görüntü) veya "immünojenik" AAV vektör lotları ve H154 (alt görüntü) ile tedavi edilen saflaştırılmış pDC'lerin temsili parlak alan görüntüleri. Ölçek çubuğu 100 μm'dir. (b) Uyarılmış pDC'ler tarafından IP-10, MIP-1, TNF- ve IFN- 2'nin sitokin salınımı. IFN- 2 ölçümlerinde bazı değerler test aralığının altına düştüğünden, yarı logaritmik bir grafikte sunulmak üzere ölçülen tüm IFN- 2 değerlerine sabit 1 eklendi. Gösterilenler ortalamalar ve standart sapmalardır. İstatistiksel anlamlılık, tek yönlü ANOVA ve Holm-Sidak'ın post hoc analizi kullanılarak belirlendi. P değerleri: 0,05'ten küçük veya eşit: *; 0,01'den küçük veya eşit: **; 0,001'den küçük veya eşit: ***.

DNaz tedavisi, "immünojenik" AAV8 ve AAV2 vektör partilerinin bağışıklık tepkilerini azaltır.

"İmmünojenik" AAV8 vektörleri, pDC'lerde TLR9-bağımlı bir bağışıklık tepkisi ortaya çıkarırken, "immünojenik olmayan" gruplar tarafından böyle bir tepki tetiklenmedi. TLR9, DNA'ya, özellikle de metillenmemiş CpG motifleri9 içeren DNA'ya yanıt olarak etkinleştirilir. Önemli olarak, ddPCR ölçümlerimiz aynı viral DNA bileşenlerinin hem "immünojenik" hem de "immünojenik olmayan" vektör lotlarında mevcut olduğunu doğruladı. Toplu olarak bu, "immünojenik" AAV vektör partilerine karşı gözlemlenen bağışıklık tepkilerinin nedensel maddesinin intra-viral DNA yerine viral süspansiyondaki paketlenmemiş/serbest DNA olabileceğini ortaya koydu. Bu nedenle, "immünojenik" AAV8 vektör partilerinin viral süspansiyonunda artık serbest DNA mevcutsa, doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin DNaz tarafından zayıflatılması gerekir. Bu hipotezi test etmek için "immünojenik" AAV8 ve AAV2 vektör lotları, AAV stimülasyonundan önce 30 dakika boyunca DNase I (100 µg/ml) ile ön işleme tabi tutuldu. DNaz tedavisinin pDC'ler veya AAV parçacıkları üzerindeki spesifik olmayan etkilerini dışlamak için, yalnızca AAV uyarımlarında vektörler, pDC uyarımından önce DNasemock tedavisine tabi tutuldu. DNase içermeyen bu sahte tedavilerde, AAV parçacıkları, DNase ile tedavi edilen AAV'lerle aynı süre boyunca aynı DNase sindirim ortamında 37 derecede inkübe edildi. On, pDC'ler, DNase ile önceden işlenmiş veya sahte olarak işlenmiş "immünojenik" AAV vektör lotlarıyla (MOI: 1:1x 106 vg) tohumlandı ve uyarıldı. Yalnızca DNase ile inkübe edilen veya bir araçla sahte olarak tedavi edilen pDC'ler kontrol olarak görev yaptı. İlginç bir şekilde, "immünojenik" AAV8 ve AAV2 vektör lotlarının DNaz tedavisi, reaktif hücre proliferasyonunu azalttı (Şekil 4a) ve ya tamamen ortadan kalktı (AAV8 lotları A-HEK-2 ve A-Sf9-1; AAV2 lotları) B-Sf9-1 ve B-Sf9-2) veya IP'nin serbest bırakılmasını önemli ölçüde azalttı (AAV8 lot A-HEK-1 ve A-HEK-3){{40} }, MIP-1, TNF- ve IFN-, AAV stimülasyonundan sonra (Şekil 4b,c). Gözlemlenen DNaz etkisinin aslında DNaz'ın vektörün bütünlüğü üzerindeki etkisinden değil, ekstra viral DNA'nın sindiriminden kaynaklandığını doğrulamak için, AAV vektör lotlarının DNaz tedavisinin AAV'nin transdüksiyon kapasitesini etkileyip etkilemediğini araştırdık. AAV uygulaması herhangi bir saptanabilir pDC transdüksiyonuyla sonuçlanmadığından, HEK hücreleri, AAV transdüksiyonu19üzerinde transdüksiyon verimliliğini analiz etmek için iyi bilinen bir hücre modeli olduğundan bu tahliller için HEK hücreleri kullanıldı. HEK293T hücrelerini DNase ile tedavi edilmiş ve sahte olarak tedavi edilmiş AAV8 ve AAV2 vektör lotlarıyla (MOI: 1:8x 104 vg) uyardık ve vektör uygulamasından 3 gün sonra floresan mikroskobu ile transdüksiyon verimliliğini değerlendirdik. Açıklandığı gibi AAV2 vektörleri, AAV8 vektörlerine kıyasla daha yüksek bir transdüksiyon potansiyeli gösterdi. Daha da önemlisi, ayrıca DNase ile ön işlem, ne HEK'den türetilen ne de Sf9-hücresinden türetilen AAV8 ve AAV2 vektör lotlarında transdüksiyon verimliliğini azaltmadı (Şekil S5a,b). Bu sonuçlar, vektör partilerinin immünojenik özellikleri üzerindeki DNaz etkisinin, ekstra viral DNA'nın bozulmasından kaynaklandığına dair daha fazla kanıt sağlar. TLR9 antagonisti H154, dört immünojenik AAV8 grubunun tamamı için proinflamatuar sitokinlerin salınımını esasen ortadan kaldırmış olsa da (Şekil 3), DNaz ön tedavisi aynı zamanda AAV8 grupları A-HEK{{75} için proinflamatuar sitokin tepkisini de ortadan kaldırabilir. } ve A-Sf9-1, ancak AAV8 lotları A-HEK-1 ve A-HEK-3 için tamamen kaldırmadı (Şekil 4). Artan DNaz tedavi süresinin bu sitokin tepkisini ortadan kaldırıp kaldıramayacağını test etmek için, ilgili partilerin (A-HEK-1 ve A-HEK{{87}) DNaz inkübasyon süresinde on kat artış sonrasında pDC'lerin simülasyon deneylerini tekrarladık. }). Vektörlerin 5 saat boyunca DNaz tedavisinden sonra, AAV ile uyarılmış hücrelerin süpernatanındaki ortalama sitokin konsantrasyonlarının, artık araç kontrolünden önemli ölçüde farklı olmayacak şekilde azaldığını gözlemledik. Bu yanıt modeli, her biri tek bir donörün hücreleriyle gerçekleştirilen üç deneyde doğrulanabilir (Şekil S6). Bu, pDC'lerdeki TLR{91}}bağımlı proinflamatuar bağışıklık tepkisinin merkezi nedeninin gerçekten de ekstraviral DNA olduğunu göstermektedir. İntraviral DNA salınımının, AAV vektörlerinin immün sistemi uyarıcı aktivitesini arttırıp artırmadığını test etmek amacıyla, "immünojenik" AAV8 A-HEK-1 partisinin viral kapsidlerini, 95 derecede 10 dakika boyunca ısıl işlemle kasıtlı olarak açtık. . Isıl işleme tabi tutulmuş vektör partisi daha sonra pDC'leri uyarmak için kullanıldı. Isıl işlem uygulanmış ve uygulanmamış AAV8 lot A-HEK{103}} stimülasyonu üzerine reaktif hücre çoğalmasında herhangi bir fark olmamasına rağmen IP{104}}, MIP{105}} salınımında önemli bir artış oldu , TNF- ve IFN-'nin ısıtmalı işlem görmüş durumda olması, kapsüllenmiş viral DNA'nın vektör süspansiyonuna salınmasının, bağışıklık tepkilerinin indüklenmesine katkıda bulunabileceğini gösterir (Şekil 5). Birlikte bu veriler, AAV vektör preparatlarının, pDC'lerde partiye özgü bağışıklık tepkilerini tetikleyebilen ekstra viral DNA kirletici maddeleri içerebileceğini göstermektedir. Bu yanıtlara TLR9 sinyali aracılık eder ve vektör partilerinin DNase ile işlenmesiyle azaltılabilir/yok edilebilir.

Şekil 4. DNaz ön tedavisi, "immünojenik" AAV8-CMV-eGFP ve AAV2-CMV-eGFP vektör lotları tarafından indüklenen bağışıklık tepkilerini azaltır. İnsan pDC'leri, 18 saat boyunca DNaz ile muamele edilmiş "immünojenik" AAV8 vektör partileri ile uyarıldı (MOI: 1:1x 106 vg). (a) "İmmünojenik" AAV vektör lotları (üstteki resim) ve 1{{30}}0 ug/ ml DNase ile ön işleme tabi tutulmuş "immünojenik" AAV vektör lotları ile uyarılan saflaştırılmış pDC'lerin temsili parlak feld görüntüleri I (alt resim). Ölçek çubuğu 500 mikrondur. (b) AAV8-uyarılmış pDC'ler tarafından IP-10, MIP-1, TNF- ve IFN- 2'nin sitokin salınımı. (c) AAV{20}}uyarılmış pDC'ler tarafından sitokin salınımı. IFN- 2 ölçümlerinde (b ve c) ve TNF- ölçümünde (b), bazı değerler test aralığının altına düştüğünden, ölçülen tüm IFN- 2 ve TNF- değerlerine sabit 1 eklendi. yarı logaritmik bir grafikte sunum. Gösterilenler ortalamalar ve standart sapmalardır. İstatistiksel anlamlılık, tek yönlü ANOVA ve Holm-Sidak'ın post hoc analizi kullanılarak belirlendi. P değerleri: 0,05'ten küçük veya eşit: *; 0,01'den küçük veya eşit: **; 0,001'den küçük veya eşit: ***.

AAV8 vektör preparasyonlarındaki ekstra viral DNA kirleticilerinin araştırma amaçlı analizi.

AAV vektör lotlarındaki ekstra viral DNA bileşenlerinin ilk keşif amaçlı karakterizasyonunu gerçekleştirmek için temsili bir "immünojenik" (A-HEK-1) ve "immünojenik olmayan" (B-HEK-1) HEK hücresinden türetilen vektör lotu analiz edildi. Bu partiler ya yukarıda açıklandığı gibi 37 derecede 30 dakika boyunca pDC ortamında DNaz ile işleme tabi tutuldu ya da 100 kDa'lık bir kesme filtreleme cihazı kullanılarak sahte işleme tabi tutuldu ve ultra filtrelendi ya da yalnızca sahte işleme tabi tutuldu (Şekil S7a-) G). Ardışık Bioanalyzer LabChip ayrımı ve saflaştırılmış DNA'nın değerlendirilmesi, her partinin işlenmiş ve sahte işlenmiş numunelerinde karşılaştırılabilir miktarlarda vektör DNA'nın (Şekil S7b-g) varlığını ortaya çıkardı; bu, ne ultra filtrelemenin ne de DNaz tedavisinin DNA içeriğini etkilemediğini doğruladı. kapsidin içinde. Ek olarak, yalnızca "immünojenik" (Şekil S7a-d) ancak "immünojenik olmayan" vektör lotunun (Şekil S7a,e-g) 100 ila 450 bp arasında değişen ek DNA molekülleri içerdiğini gösterdi (Şekil S7a-d) S7c,d ve h). Önemli olarak, bu ek DNA molekülleri, sahte işleme tabi tutulmuş numunede ve ultra filtrelenmiş numunede tespit edilebildi, ancak DNaz ile muamele edilmiş numunede neredeyse hiç yoktu (Şekil S7a-d). Bu, bu DNA moleküllerinin, DNaz tarafından parçalanabilen ancak ultra filtreleme yoluyla vektör süspansiyonundan çıkarılamayan ekstra viral DNA kirleticilerini temsil ettiğini gösterir. Bu kirletici maddelerin yalnızca "immünojenik" vektör lotunda tespit edilebildiğini ancak "immünojenik olmayan" vektör lotunda tespit edilemediğini desteklemek, bu ekstra viral DNA moleküllerinin oluşumunun lota özgü olduğunu kanıtlar ve ayrıca bu moleküllerin indüklediğini veya katkıda bulunduğunu da öne sürebilir. vektörün immünostimülatör özelliklerine. HEK'in "immünojenik" (A-HEK-1) ve "immünojenik olmayan" (B-HEK-1) çok sayıda kantitatif (q)PCR analizinde kirletici DNA'nın potansiyel kaynağını değerlendirmek hücre DNA'sı, plazmid DNA ve AAV vektör DNA'sı gerçekleştirildi. DNase ile muamele edilmiş, sahte muameleye tabi tutulmuş ve ultra filtrelenmiş ve her partinin yalnızca sahte muameleye tabi tutulmuş numunelerinden elde edilen şablon DNA, Alu tekrarının, nükleer genom çoklu kopya NPIP geninin ve HEK hücre kökenli mitokondriyal 16S rRNA gen sekanslarının (mt16S) amplifikasyonu için kullanıldı. , bir AAV8 ters çevrilmiş terminal tekrar amplikonunun (ITR2; vektör ve transgen plazmid DNA orijini) amplifikasyonu için ve blah (ampisilin direnci) geni (Amp; plazmid DNA orijini) için bir amplikonun amplifikasyonu için (Tablo S4). HEK hücresi DNA'sına özgü amplikonun ΔCt değerlerinin ITR2 amplikonuna (yani Alu'ya karşı ITR2, NPIP'ye karşı ITR2 ve mt16S'ye karşı ITR2) ve plazmit DNA'ya özgü amplikonun ITR2 amplikonuna (Amp) oranlarının karşılaştırılması vs. ITR2), sırasıyla iki partinin ihmal edilebilir miktarlarda HEK hücresi nükleer ve mitokondriyal DNA içerdiğini gösterir. Buna karşılık, analiz hem "immünojenik" hem de "immünojenik olmayan" vektör lotunda yeterli miktarda plazmid DNA ortaya çıkardı (AAV DNA'ya göre kopya sayısı açısından sırasıyla yaklaşık 1/32 ve 1/50), diğer AAV vektörleri12 için bildirilen değerler aralığında olan bir oran (Şekil S7). Bununla birlikte, her iki vektör lotunun DNaz ile muamele edilmiş ve sahte muamele edilmiş veya ultra filtrelenmiş ve sahte muamele edilmiş numuneleri arasında vektör DNA'nın plazmid ve HEK hücre DNA'sına nispi oranında belirgin bir fark yoktu (Şekil S8). Bu, paketlenmemiş kirletici DNA'nın hedef sekans bileşimi açısından paketlenmiş DNA'nınkine benzer olduğunu gösterebilir. Bununla birlikte, qPCR analizinin bir sınırlaması, eksik hedef sekansa sahip yeterli miktarda fragman içeren kirletici DNA'nın boyutudur (100-450 bp).

Şekil 5. Vektörlerin ısıl işlemiyle intraviral DNA'nın salınması, pDC'lerde proinflamatuar sitokin tepkilerini arttırır. Isıl işlem görmüş AAV8 lot A-HEK-1 ile stimülasyondan 18 saat sonra pDC'ler tarafından IP-10, MIP{-1, TNF- ve IFN- 2'nin sitokin salınımı (MOI: 1:1× 106 vg). Yatay çizgiler ortalamaları ve standart sapmaları gösterir. Isıl işleme tabi tutulmuş ve işlenmemiş vektörler tarafından indüklenen sitokin yanıtları arasındaki istatistiksel olarak anlamlı farklar, Öğrenci t-testi kullanılarak belirlendi. P değeri: 0.01'den küçük veya ona eşit: **; 0,001'den küçük veya eşit: ***.

Tartışma

AAV vektörleri gen terapisinde en umut verici araçlardan biridir. Ancak, biriken kanıtlar, AAV'nin immünojenitesinin ihmal edilebilir olduğu görüşüne meydan okuyor5. Bunun ışığında, AAV'ye karşı bağışıklık tepkilerinin oluştuğu mekanizmaları daha iyi anlamak giderek daha önemli hale geldi. Bu çalışmada, (1) AAV8 ve AAV2'nin insan pDC'lerinde ne kapsid/vg oranına, ne üretim platformuna ne de üretici/saflaştırma yöntemine özgü olmayan partiye özgü doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarını indüklediğini gösterdik; (2) pDC'lerdeki doğuştan gelen bağışıklık tepkileri TLR9 sinyallemesine bağlıdır ve DNase ile ön tedaviyle azaltılabilir; (3) DNaz tedavisi, HEK293T hücrelerinde AAV8 ve AAV2 vektör partilerinin transdüksiyon oranını azaltmadığından vektör partikülünün bütünlüğünü etkilemez; ve (4) AAV vektör partileri, vektör partisinin DNase ile işlenmesiyle uzaklaştırılabilen ekstra viral DNA molekülleri içerebilir. Bu, hem HEK hem de Sf9-hücresinden türetilen AAV preparatlarının, doğuştan gelen bir bağışıklık tepkisini uyaran ekstra viral DNA safsızlıkları içerebileceğini göstermektedir. Yakın zamanda yapılan bir çalışmada, farklı konakçı hücre türlerinden (HEK hücreleri ve Sf9 hücreleri) AAV vektörleri kullanılarak karşılaştırmalı bir analiz gerçekleştirilmiştir11. Yazarlar, HEK- ve Sf{21}}türetilmiş vektörlerin, test ettikleri tüm AAV serotipleri ve üreticiler arasında PTM'leri ve kalıntı konakçı hücre proteini safsızlıkları açısından farklılık gösterdiğini bulmuşlardır. Ayrıca, birincil insan fibroblastlarının AAV transdüksiyonuna sitokin tepkisini analiz ettiler ve HEK- ve Sf9-türevli vektörlerin immünojenik özellikleri açısından farklılık gösterebileceğini buldular. Çalışmamızda aynı zamanda farklı üreticilere ait aynı AAV yapısının farklı partilerini ve iki farklı serotipi kullanarak bu iki ana üretim sistemini karşılaştırdık. Ancak insan pDC modelimizde gözlemlediğimiz vektör kaynaklı bağışıklık tepkileri belirli bir üretim sistemi, üretici veya serotiple spesifik olarak ilgili değildi; bunun yerine lota özeldi. Retinal gen terapisine ilişkin önceki klinik öncesi ve klinik çalışmalar, oküler inflamasyon veya immün hücre infiltrasyonu gibi AAV vektörlerine karşı immün yanıtların kapsid/vg oranlarındaki18 veya doz farklılıklarından5 etkilenebileceğini bildirmiştir. Timmers ve ark.18, insan olmayan primatlarla yapılan bir klinik öncesi çalışmada boş AAV kapsidlerinin viral süspansiyondan çıkarılmasının inflamasyonu azalttığını ve viral transdüksiyonu iyileştirdiğini gösterdi. Ancak sonuçlarımız, hem "immünojenik" hem de "immünojenik olmayan" AAV vektör partileri arasında yüksek kapsid/vg oranlarının mevcut olduğunu gösterdi; bu, viral süspansiyondaki daha fazla sayıda kapsidin (boş kapsidler) indüksiyondan sorumlu olmadığı anlamına gelir. insan pDC modelimizde vektör partisine özgü bağışıklık tepkileri. Bunun yanı sıra, AAV8'in insan olmayan primatlarda doza bağlı bir şekilde bağışıklık tepkilerini indüklediğini daha önce göstermiştik6,8. Ancak bu çalışmada "immünojenik olmayan" AAV vektörlerinin dozunun arttırılması, insan pDC'lerinde bir bağışıklık tepkisinin tetiklenmesi için yeterli değildi. Bu nedenle vektörlerin immünojenik özelliklerindeki farklılıkların nedenini anlamak için "immünojenik" AAV gruplarının tanınmasında yer alan mekanizmayı araştırdık. İn vitro immün yeterliliğe sahip hücre modellerinin kullanılması, bilim adamlarının, AAV vektörleri9,10 tarafından oluşturulan doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinde TLR yollarının rolünü daha doğru bir şekilde incelemelerine olanak sağlamıştır. Zhu ve ark.9önce pDC'lerin, geleneksel DC'ler veya pDC olmayanların değil, AAV stimülasyonuna yanıt olarak büyük miktarlarda tip I IFN ve pro-inflamatuar sitokinler saldığını tanımladı ve AAV8 ve AAV2'nin tanınmasında TLR9 yolunun katılımını gösterdi. fare pDC'lerini kullanma. Yazarlar ayrıca AAV2'nin insan pDC'lerinde TLR{49}}bağımlı bağışıklık tepkilerini indüklediğini de gözlemledi. Çalışmamızda, en spesifik TLR9 antagonistlerinden biri olan H1549,21–24'ün kullanımıyla, dolaylı olarak yalnızca AAV2'nin değil, aynı zamanda AAV8 vektörlerinin de insan pDC'lerinde TLR9-bağımlı doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini tetiklediğini gösterdik. ama çok spesifik bir şekilde. TLR9 bir DNA reseptörü olduğu için bu, "immünojenik" AAV vektör partilerine karşı bağışıklık tepkilerinin DNA bileşenleri tarafından indüklendiğini ortaya koydu. Bununla birlikte, ddPCR ölçümlerimiz aynı paketlenmiş DNA bileşenlerinin hem "immünojenik" hem de "immünojenik olmayan" vektör lotlarında mevcut olduğunu doğrulamış olsa da "immünojenik olmayan" lotlar, pDC'lerde immün yanıtları tetiklemedi. Ek olarak, DNaz tedavisi "immünojenik" AAV vektör partilerinin immün sistemi uyarıcı özelliklerini azalttı veya ortadan kaldırdı, ancak bu vektörlerin HEK hücrelerindeki transdüksiyon potansiyelini azaltmadı; bu, AAV'nin DNaz tedavisinin kapsüllenmemiş ekstra viral DNA'yı hedeflediğini ortaya koydu. vektör süspansiyonu, ancak sağlam kapsid içindeki vektör genomunun bütünlüğünü etkilemedi. Bu, temsili DNase ile tedavi edilen ve sahte olarak tedavi edilen "immünojenik" ve "immünojenik olmayan" vektör partilerinin karşılaştırmalı DNA analizleriyle de doğrulandı.

cistanche tubulosa-bağışıklık sistemini iyileştirir

Cistanche Enhance Immunity ürünlerini görüntülemek için buraya tıklayın

【Daha fazlasını isteyin】 E-posta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Toplu olarak, bu deneylerin tümü, pDC'lerdeki "immünojenik" vektör partilerine karşı bağışıklık tepkisinin, AAV parçacıklarında bulunan DNA (yani vektör genomu veya AAV kapsidlerinde paketlenmiş potansiyel DNA safsızlıkları) tarafından değil, erişilebilir ekstra viral DNA tarafından düzenlendiğini gösterir. viral süspansiyonlarda bulunan bileşenler (yani dışarıda kalan veya viral kapsid tarafından korunmayan DNA). Ayrıca, bir "immünojenik" vektör partisinin viral kapsidlerinde bulunan DNA, vektörün ısıl işlemi yoluyla hücrelere maruz bırakıldığında, bağışıklık tepkisinde bir artış olduğunu da gözlemledik. Kapsidlerin açılmasından sonra immün sistemi uyarıcı aktivitedeki artışın, vektörün tek sarmallı DNA'sından mı yoksa kalıntı konakçı hücre nükleik asitleri, kalıntı yardımcı DNA dizileri, omurga dizisi gibi AAV kapsidlerinde paketlenmiş potansiyel safsızlıklardan mı kaynaklandığı açık değildir. parçalar kasetle birlikte paketlenir veya ITR'lerden ters hazırlama, AAV12,25'e paketlenen küçük omurga parçalarıyla sonuçlanır. pDC'ler tarafından ekstraviral DNA alımının kesin mekanizması bilinmemektedir. pDC'lerin CpG oligonükleotitlerine karşı duyarlılığı, pDC'lerin serbest DNA26'ya reaksiyona girebileceğini göstermektedir. Bu, pDC'lerdeki bağışıklık tepkisinin, vektör süspansiyonunda bulunan serbest kirletici DNA'nın alımıyla tetiklenebileceğini göstermektedir. Ek olarak, pDC'lerin AAV vektörlerini27 alabileceği gösterilmiştir; bu da alternatif olarak potansiyel kapside bağlı DNA'nın, AAV parçacıklarının alınması sırasında hücreye taşınabileceğini düşündürmektedir. AAV vektör preparatlarında ekstra viral DNA kontaminasyonunun varlığı, vektörlerin üretim ve saflaştırma işleminden kaynaklanan ilgili vektör lotunun doğal bir özelliği olabilir veya uygun olmayan saklama koşulları nedeniyle kapsüllenmiş DNA'nın salınmasından kaynaklanabilir. . Bu deneylerde incelenen tüm vektör partileri aynı zaman diliminde elde edilmiştir (incelenen 8 AAV8 vektör partisinden 5'i, bunlardan ikisi "immünojenik"tir (A-HEK-2; A-HEK-3) ve üçü "immünojenik olmayan"dı (A-Sf9-2; B-Sf9-1; B-Sf9-2) hatta özellikle bu çalışma için paralel olarak üretildi), partiler her üretici aynı taşıma kutularında gönderildi ve teslim alındıktan sonra tüm partiler, sıcaklık alarmı korumalı -80 derecelik bir dondurucunun aynı çekmecesinde yan yana saklandı ve ardından tüm partilerin porsiyonları aynı anda çözülüp pDC'lere uygulandı. yan yana deneylerde. Bu durum, bu partilerin ekstraviral DNA içeriği ve immün sistemi uyarıcı özelliklerindeki farklılıklardan uygunsuz depolamadan ziyade AAV üretim ve saflaştırma sürecinin sorumlu olduğunu güçlü bir şekilde ortaya koymaktadır. Geçmişte, gen terapisi (alipogene tiparvovec, Glybera) için üretilen klinik dereceli AAV vektör lotlarına, potansiyel olarak immünojenik kalıntı konakçı hücre DNA28 dahil olmak üzere yüksek miktarda safsızlık nedeniyle artık izin verilmiyordu. DNA safsızlıklarının viral süspansiyonlardan uzaklaştırılması genellikle üretim prosesi sırasında gerçekleştirilir. Burada Benzonase29 veya DNase30 tedavisi, nihai viral süspansiyondan kalan DNA'yı ortadan kaldırmak için rutin olarak uygulanır. Bu tedavi, protokole bağlı olarak 30 dakika ile 3 saat arasında sürer ve daha sonra enzim, sezyum klorür tuzları30gibi kimyasallar tarafından etkisiz hale getirilir. Deneylerimizde, Iowa Üniversitesi Viral Vektör Çekirdek Tesisi'nden türetilen beş AAV8 lotundan dördü ve Virovek'ten elde edilen her iki AAV2 vektör lotunun pDC'lerde immünojenik olduğu bulundu. "Malzemeler ve yöntemler" bölümünde açıklandığı gibi, bu üreticilerin her ikisine ait vektör partilerinin saflaştırma işlemi, bazıları birbirinden büyük ölçüde farklı olan birkaç saflaştırma adımını içerir. Bu nedenle, Iowa'daki Çekirdek Tesisindeki saflaştırma işlemi, Turbonükleaz tedavisini, ardından iyodiksanol gradyanlı ultrasantrifüjlemeyi, anyon değişim kolon kromatografisini, flutter sterilizasyonunu ve santrifüj filtreleri kullanılarak tampon değişimini içerir. Buna karşılık Virovek, Benzonaz tedavisini, CsCl'de ultrasantrifüjlemeyi ve ardından tuz giderme ve filtre sterilizasyonunu uyguluyor. Öte yandan Vigene'nin saflaştırma işlemi, DNase işlemini içermez ancak Iowa'daki Core Facility tarafından kullanıldığı gibi, iyodiksanol gradyanlı ultrasantrifüjlemeyi içerir. Bununla birlikte şaşırtıcı bir şekilde, Vigene'den türetilen üç vektör lotunun hiçbiri (AAV8: C-HEK-1; AAV2: C-HEK-1 ve 2) pDC'lerde immün yanıtları tetiklemedi; bu da "immünojenik olmayan" olduğunu öne sürüyor "Vektör partileri, DNaz tedavisini içermeyen üretim süreçleriyle de oluşturulabilir.

cistanche takviyesi faydaları-bağışıklık sistemi nasıl güçlendirilir

Genel olarak, üç üretici tarafından kullanılan kısmen benzer ve kısmen farklı saflaştırma adımları, pDC'de gözlemlenen vektörlerin immünojenik özelliklerinin üretim sürecindeki tek bir adıma bağlanmasını zorlaştırmaktadır. Klinik denemelerde sıkı kalite kontrollerine tabi tutulan iyi üretim uygulamaları (GMP) dereceli vektörler kullanılır. Bu çalışmada kullanılan üç üreticiye ait vektörlerin hiçbiri iyi laboratuvar uygulaması (GLP) dereceli değildir ve bu nedenle klinik dereceli vektörlerden daha düşük saflıkta olabilir. Bu nedenle, insanlarda yapılan klinik çalışmalarda kullanılan GMP vektörlerinin, bu çalışmada gözlemlediğimiz farklılıkları sergileyebileceğini veya göstermeyebileceğini ve bulgularımızın gen terapilerinin klinik kullanımıyla ilişkisinin açık olmadığını bilmek önemlidir. Bununla birlikte, kendi deneyimlerimize göre, konakçı hücre proteinleri gibi kirletici bileşenlerin konsantrasyonunda, GMP dereceli vektörlerde bile partiye özgü önemli farklılıklar meydana gelebilir ve hatta GMP dereceli vektörlerde bile, hangi seviyelerin olduğu konusunda tekdüze olarak kabul edilen spesifikasyonlar yoktur. kabul edilebilir5. Toplu olarak, AAV vektörlerinin üretim sürecinin iyileştirilmesi, istenmeyen bağışıklık tepkileri potansiyelini en aza indirmek amacıyla viral süspansiyonlarda artık safsızlıkların varlığından kaçınmanın anahtarıdır. Sonuç olarak, ekstra viral DNA safsızlıklarının insan pDC'lerindeki AAV vektörlerinin immünojenik özelliklerini etkileyebileceğini gösterdik. Bu bulguların, hayvan modellerinde veya insan hastalarda AAV aracılı gen terapisinin güvenliği açısından etkilerini araştırmak için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.

Referanslar

1. Gaj, T., Epstein, BE & Schafer, DV Adeno ile ilişkili virüs kullanılarak genom mühendisliği: Temel ve klinik araştırma uygulamaları. Mol. Ter. 24, 458–464 (2016).

2. Garita-Hernandez, M. ve diğerleri. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden türetilen 3D retinal organoidlere AAV aracılı gen aktarımı. Uluslararası J. Mol. Bilim. 21, 994 (2020).

3.Russell, S. ve ark. RPE65-aracılı kalıtsal retina distrofisi olan hastalarda voretigene neparvovec'in (AAV2-hRPE65v2) etkinliği ve güvenliği: Randomize, kontrollü, açık etiketli, faz 3 çalışma. Lancet 390, 849–860 (2017).

4. He, X., Urip, BA, Zhang, Z., Ngan, CC & Feng, B. AAV'nin sunduğu terapötikleri nihai tedavilere doğru geliştirmek. J. Mol. Med. 99, 1–25. https://doi.org/10.1007/s00109-020-02034-2 (2021).

5. Bucher, K., Rodríguez-Bocanegra, E., Dauletbekov, D. & Fischer, MD Adeno ile ilişkili viral vektörler kullanılarak retinal gen terapisine bağışıklık yanıtları - Tedavi başarısı ve güvenliğine yönelik çıkarımlar. Prog. Retin. Göz Arş. 83, 100915 (2020).

6. Reichel, FF ve diğerleri. AAV8 primat gözünde doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık tepkilerini indükleyebilir. Mol. Ter. 25, 2648–2660 (2017).

7. Boyd, RF ve diğerleri. Köpeklerde arka vitrektomiyi takiben rAAV'nin intravitreal iletimi ile azalmış retinal transdüksiyon ve arttırılmış transgene yönelik immünojenite. Gene Ter. 23, 548–556 (2016).

8. Rodríguez-Bocanegra, E. ve diğerleri. İnsan olmayan primatlarda adeno ilişkili virüsün subretinal dağıtımını takiben retinadaki hiper-yansıtıcı odakların uzunlamasına değerlendirilmesi. Çeviri Vis. Bilim. Teknoloji. 10, 15 (2021).

9. Zhu, J., Huang, X. & Yang, Y. Te TLR9-MyD88 yolu, farelerde adeno-ilişkili virüs gen terapisi vektörlerine karşı uyarlanabilir bağışıklık yanıtları için kritik öneme sahiptir. J. Clin. Araştır. 119, 2388–2398 (2009).

10. Hösel, M. ve ark. Ücret benzeri reseptör 2-aracılı, insan parankimal olmayan karaciğer hücrelerinde adeno ile ilişkili viral vektörlere karşı doğuştan gelen bağışıklık tepkisi. Hepatoloji 55, 287–297 (2012).

11. Rumachik, NG ve diğerleri. Yöntemler önemlidir: Rekombinant AAV için standart üretim platformları, kimyasal ve işlevsel olarak farklı vektörler üretir. Mol. Ter. Yöntem Kliniği. Dev. 18, 98–118 (2020).

12. Wright, JF Klinik düzeyde rekombinant AAV vektörlerinde ürünle ilgili safsızlıklar: Karakterizasyon ve risk değerlendirmesi. Biyotıplar 2, 80–97 (2014).

13. Clément, N. & Grieger, JC Klinik denemeler için rekombinant adeno-ilişkili viral vektörlerin üretimi. Mol. Ter. Yöntem Kliniği. Dev. 3, 16002 (2016).

14. Penaud-Budloo, M., François, A., Clément, N. & Ayuso, E. Rekombinant adeno-ilişkili virüs üretiminin farmakolojisi. Mol. Ter. Yöntem Kliniği. Dev. 8, 166–180 (2018).

15. Ye, Y., Gaugler, B., Mohty, M. & Malard, F. Plazmasitoid dendritik hücre biyolojisi ve immün aracılı hastalıklardaki rolü. Klin. Çeviri İmmünol. 9, e1139 (2020).

16. Fischer, MD ve ark. Koroideremili hastalar için adeno-ilişkili virüs vektörü kullanılarak retinal gen tedavisinin etkinliği ve güvenliği: Randomize bir klinik çalışma. JAMA Oftalmol. 137, 1247–1254 (2019).

17. Weleber, RG ve diğerleri. RPE65-eksikliği olan Leber konjenital amarozisi ve şiddetli erken çocukluk döneminde başlayan retinal distrofi için gen tedavisinden 2 yıl sonra elde edilen sonuçlar. Oftalmoloji 123, 1606–1620 (2016).

18. Timmers, AM ve diğerleri. Adeno ile ilişkili virüs vektörünün intravitreal enjeksiyonuna oküler inflamatuar yanıt: Genom ve kapsidin göreceli katkısı. Hımm. Gene Ter. 31, 80–89 (2020).

19. Ran, G. ve diğerleri. Sahaya yönelik mutajenez, kapsid kütüphanesinden türetilen rekombinant AAV vektörlerinin transdüksiyon verimliliğini artırır. Mol. Ter. Yöntem Kliniği. Dev. 17, 545–555 (2020).

20. Ellis, BL ve diğerleri. Dokuz doğal adeno-ilişkili virüs (AAV1-9) ve bir mühendislik ürünü adeno-ilişkili virüs serotipi ile memeli primer hücrelerinin ve hücre hatlarının ex vivo/in vitro transdüksiyon verimliliğinin araştırılması. Virol. J. 10, 1–10 (2013).

21. Yamada, H. ve ark. Baskılayıcı DNA'nın CpG'nin neden olduğu immün aktivasyon üzerindeki etkisi. J. Immunol. 169, 5590–5594 (2002).

22.Zhang, P. ve diğerleri. Toll benzeri reseptör 9 antagonisti, deneysel otoimmün miyastenia gravis'te humoral bağışıklığı baskılar. Mol. İmmünol. 94, 200–208 (2018).

23. Chan, YK ve diğerleri. Doğuştan gelen bağışıklık ve inflamatuar tepkilerden kaçınmak için adeno ile ilişkili viral vektörlerin mühendisliği. Bilim. Çeviri Med. 13, eabd3438 (2021).

24. Bayık, D., Gürsel, I. ve Klinman, DM İmmünsüpresif oligonükleotidlerin yapısı, mekanizması ve terapötik kullanımı. Farmakol. Res. 105, 216–225 (2016).

25. Brimble, MA ve diğerleri. 547. AAV preparatları, doğrudan ITR'lerin dışındaki üretim plazmitlerindeki DNA dizilerinden kaynaklanan kontaminasyonu içerir. Mol. Ter. 24, S218–S219 (2016).

26. Latz, E. ve diğerleri. TLR9, ER'den lizozomdaki CpG DNA'ya translokasyondan sonra sinyal verir. Nat. İmmünol. 5, 190–198 (2004).

27. Veron, P. ve diğerleri. İnsan dendritik hücrelerinin ana alt kümeleri, kendi kendini tamamlayan adeno-ilişkili virüs vektörleri 1 ve 2 tarafından verimli bir şekilde transdüksiyona tabi tutulur. J. Virol. 81, 5385–5394 (2007).

28. Değerlendirme raporu: Glybera. https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/glybera-epar-public-assessment raporu_en.pdf. Erişim tarihi: 3 Mart 2022 (2012)

29. Arden, E. & Metzger, J. Yerli ve biyomühendislik ürünü rekombinant adeno-ilişkili virüs saflaştırması için ucuz, serotipten bağımsız protokol. J. Biol. Yöntem 3, e38 (2016).

30. Grieger, JC, Choi, VW & Samulski, RJ Adeno ile ilişkili viral vektörlerin üretimi ve karakterizasyonu. Nat. Protokol. 1, 1412–1428 (2006).

31. Kimura, T. ve diğerleri. İn vitro ve in vivo uygulamalar için adeno-ilişkili virüs vektörlerinin üretimi. Bilim. Temsilci 9, 13601 (2019).

32. Ayuso, E. ve diğerleri. Yüksek AAV vektör saflığı, transdüksiyon verimliliğinin serotip ve dokudan bağımsız olarak arttırılmasıyla sonuçlanır. Gene Ter. 17, 503–510 (2010).