Feniletanoid Glikozitlerin Cistanche Tubulosa'dan Yüksek Hızlı Kesme Homojenizasyon Ekstraksiyonu ile Ekstraksiyonu

İletişim: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com

Wenjing Pei ve Ruili Guo

Arka fon:

Cistanche tübülozaXinjiang menşeli iyi bilinen bir geleneksel Çin tıbbıdır. Kuzey Afrika, Hindistan, vb.'de yaygın olarak dağılmıştır. Amaç: Başlıca biyoaktif bileşenC. tübülozafeniletanoid glikozitlerdir (PhGs). Ekinakozit ve akteosit, PhG'lerin belirlenmesi için belirleyici bileşenlerdir ve esas olarak karaciğer koruması, bağışıklık koruması vb. için kullanılır. Bu nedenle, PhG'leri C. tubulosa'dan çıkarmak çok önemlidir. Yöntemler: Bu çalışmada, ultrason destekli ekstraksiyon (UAE), mikrodalga destekli ekstraksiyon (MAE) ve yüksek hızlı kesme homojenizasyon ekstraksiyon (HSHE) yöntemleri karşılaştırıldı. Ayrıca, HSHE yönteminin ekstraksiyon koşulları optimize edilmiştir. Sonuçlar: Sonuçlar, HSHE yönteminin hem BAE hem de MAE yöntemlerinden daha iyi olduğunu ve HSHE'nin optimal özütleme parametrelerinin yüzde 50 etanol konsantrasyonu, 70 derecelik bir özütleme sıcaklığı, 1°C'lik bir dönüş hızı olduğunu gösterdi. 16000 rpm, 2 dakikalık ekstraksiyon süresi, 1:9 katı/sıvı oranı ve bir ekstraksiyon döngüsü. Ekinakozit ve ateozit verimleri sırasıyla yüzde 1.366 ve 0.519, ekinakozit ve akteozit aktarım oranları sırasıyla yüzde 87 ve yüzde 94'e ulaştı. Sonuçlar: HSHE yönteminin, C. tubulosa'dan PhG'leri çıkarmak için basit, hızlı ve etkili bir teknik olduğu sonucuna varılabilir. Önemli Noktalar: C. tubulosa'dan PhG'lerin ekstraksiyonu için verimli ve çevre dostu bir HSHE yöntemi araştırılmıştır. C. tubulosa'dan PhG'lerin ekstraksiyonu için HSHE yönteminin optimum koşulları elde edildi. Bu araştırma, PhG'lerin endüstriyel olarak çıkarılması için yeni bir yöntem sağlar.C. tübüloza.

Cistanche tübüloza

Cistanche tübülozaXinjiang'da ortaya çıkan yaygın bir geleneksel Çin tıbbıdır. Kuzey Afrika, Arap Yarımadası, Pakistan ve Hindistan'da yaygın olarak dağılmıştır ve resmi olarak 2010 yılında Çin Farmakopesinde kaydedilmiştir.C. tübülozafeniletanoid glikozitler (PhG'ler), ekinakozit, akteozit, izoakteozit ve 2-asetillakteozit (1, 2) dahil olmak üzere suda çözünür doğal ürünlerin bir sınıfıdır. PhG'lerin yapısı, her ikisi de sırasıyla ester ve glikosidik bağlantılar yoluyla bir -glukopiranoz'a bağlanan sinnamik asit ve hidroksifeniletil parçalarından oluşur (3). Farmakolojik çalışmalar, C. tubulosa'nın PhG'lerinin yorgunluk önleyici (4), sinir koruyucu (5-7), karaciğer koruyucu (8-10) ve bağışıklık koruyucu etkiler (11) gibi birçok tıbbi işlevi olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, C. tubulosa'dan PhG'lerin etkin bir şekilde ekstraksiyonu, doğal ürünlerin geliştirilmesi ve kullanılması için büyük önem taşımaktadır.

PhG'lerin mevcut geleneksel ekstraksiyon yöntemleri, sıcak geri akışlı ekstraksiyon, ultrason destekli ekstraksiyon (UAE) ve mikrodalga destekli ekstraksiyondur (MAE; 12-16). Bu yöntemlerin düşük verim, uzun ekstraksiyon süreleri ve yüksek maliyetler gibi farklı dezavantajları vardır. Geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, yüksek hızlı kesme homojenleştirme ekstraksiyonu (HSHE) yöntemi gelişmekte olan, yeni bir ekstraksiyon yöntemidir ve daha hızlı ekstraksiyon süreleri, daha az solvent atığı, daha yüksek verim, daha basit cihaz ve daha kolay kullanım avantajlarına sahiptir (17). HSHE yönteminin çalışma prensibi, yüksek hızlı bir motor tarafından tahrik edilen dönen bir iç kesiciye dayanmaktadır. Numuneleri bozmak ve karıştırmak için iç ve dış kesiciler tarafından güçlü bir kesme kuvveti üretilir. Bu arada, yüksek hızda dönen kesici, kesicinin iç ve dış boşlukları arasında basınç farklılıklarına neden olarak numuneler ve çözücüler arasında bir kütle aktarımına neden olur. Yüksek kesme kuvveti, çarpışma kuvveti, basınç ve diğer kuvvetlerin kombinasyonu ile katı numuneler ve çözücüler arasında hızla çözülebilir bir denge sağlanabilir (18). Böylece, HSHE'nin ekstraksiyon işlemi birkaç dakika içinde ve hatta onlarca saniye kadar kısa bir sürede tamamlanabilmektedir (19–22).

Son zamanlarda, HSHE, çeşitli doğal ürünlerden biyoaktif bileşenlerin ekstraksiyonunda araştırılmıştır (23-25). Cheng et al. Schisandra Chinensis'in (26) meyvesinden beş lignan çıkarmak için HSHE kullandı. Sonuçlar, optimal koşulların yüzde 75'lik bir etanol konsantrasyonu, 1 dakikalık bir ekstraksiyon süresi, 1:19'luk bir katı-sıvı oranı, 180 V'lik bir ekstraksiyon voltajı ve bir numune partikülü olduğunu gösterdi. 120 ağ boyutunda. Beş lignanın toplam verimi, optimize edilmiş koşullar altında 13.89 ± 0.014 mg/g idi. Tang et al. perilla tohumlarından biyoaktif yağ elde etmek için HSHE kullandı (27). Optimal koşullar, 2 dakikalık bir ekstraksiyon süresi, 1:10'luk bir katı-sıvı oranı, 150 V'luk bir ekstraksiyon voltajı ve iki ekstraksiyon döngüsüydü. Perilla tohumu yağı verimi yüzde 59.3'e ulaştı. Yukarıdaki sonuçlar, HSHE'nin kısa ekstraksiyon süreleri, düşük maliyetler ve yüksek verim avantajlarına sahip olduğunu göstermektedir. Ancak, HSHE tarafından PhG'lerin çıkarılması konusunda araştırma eksikliği vardır.

Bu çalışmada, HSHE, PhG'lerin ekstraksiyonundaki potansiyel uygulamasını araştırmak için kullanıldı.C. tübüloza. PhG'lerin verimi HPLC ile belirlendi. Üç ekstraksiyon yöntemi, HSHE, BAE ve MAE, aynı koşullar altında karşılaştırıldı. Etanol konsantrasyonunun, ekstraksiyon sıcaklığının, dönüş hızının, ekstraksiyon süresinin, katı-sıvı oranının ve verimin ekstraksiyon döngü sayısının etkileri araştırıldı. Bu çalışmanın avantajları ve dezavantajları ile referanslar karşılaştırılarak tartışılmıştır.

Malzemeler ve yöntemler

Malzeme ve Kimyasal Reaktifler

C. tübülozaXinjiang Congrongtang Biological Technology Co., Ltd'den (Xinjiang, Çin) satın alındı. Ekinakozit (yüzde 98'e eşit veya daha büyük saflıklar) ve ateosit (yüzde 98'den büyük veya eşit saflıklar) standartları Shanghai Standard Biological Technology Co., Ltd'den (Shanghai, Çin) satın alındı. Asetonitril, metanol ve asetik asit, HPLC derecesindeydi (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). Analitik dereceli etanol, Tianjin Yongsheng Fine Chemical Co., Ltd'den (Tianjin, Çin) satın alındı. Deneyler boyunca deiyonize su kullanılmıştır.

HPLC Analizi

Bir HPLC analizi, bir 2489 UV/Görünür Dedektör ve bir Simetri C18 kolonu (Waters), 250 x 4.6 mm, 5 um partikül boyutu ile donatılmış bir Waters e2695 sıvı kromatografisi (Waters, Milford, MA) üzerinde yapıldı. Ekinakozit ve asteozit konsantrasyonları, HPLC yöntemiyle analiz edildi. Mobil faz, (1) asetonitril ve (2) yüzde 2'lik bir buzlu asetik asit sulu çözeltisinden oluşuyordu. Gradyan elüsyon programı Tablo 1'de sunulmuştur.

Tespit edilen dalga boyu 330 nm, akış hızı 1 mL/dak, enjeksiyon hacmi 10 μL ve fırın sıcaklığı 30 dereceye ayarlandı. Analitin kromatografik zirvesi, alıkonma süresinin standartlarınkiyle karşılaştırılmasıyla doğrulandı. Miktar belirleme, pikin harici bir standart yöntem kullanılarak entegre edilmesiyle gerçekleştirildi.

Hassasiyet testi, aynı ekstraksiyon numunelerinin beş kez enjekte edilmesiyle gerçekleştirilmiştir. Stabilite testi için aynı numuneler 0, 1, 2, 4, 12, 24 ve 48 saatlik artışlarla analiz edildi. Ekstraksiyon örneklerine standartlar eklenerek ekinakozit ve akteozit geri kazanım testleri gerçekleştirilmiştir. Ekinakozit ve ateozitin tüm pik alanları ve alıkonma süreleri kaydedildi. Ekinakozid ve ateozid için kalibrasyon eğrilerinin sonuçları Tablo 2'de listelenmiştir.

Verimin Hesaplanması

PhG'lerin belirlenmesi için gösterge bileşenleri olarak ekinakozit ve akteozit kullanılmıştır. Ekinakozit veya ateozit verimi, aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplandı:

Y=CV/W×100 yüzde (1)

burada Y=ekinakozit veya ateozit verimi ( yüzde ); C=ekinakozit veya akteozit konsantrasyonları (mg/mL); V=ekstraksiyon çözeltisinin hacmi (mL); ve C. tubulosa tozunun W=ağırlığı (mg).

PhG'lerin Ekstraksiyon Yöntemleri

C. tubulosa'nın gövdeleri ilk olarak bir elektrikli öğütücü (JC-500g; Yongkang Kaiyuan Industry & Trade Co., Ltd, Yongkang, Çin) ile öğütüldü ve bir filtre elek (yaklaşık 380 µm) ile süzüldü. Daha sonra C. tubulosa tozu, ağırlık sabit olana kadar etüvde 70 derecede kurutuldu. Beş gram C. tubulosa tozu, özütleme çözücüsü ile karıştırıldı ve bir özütleme şişesine yerleştirildi. Daha sonra sıvı karışım, sabit sıcaklıktaki bir su banyosunda (DF-101S; Jintan Analytical Instrument Co., Ltd, Jintan, Çin) 5 dakika süreyle önceden ısıtıldı (30-80 derece).

(a) HSHE yöntemi.—HSHE, döner kesici, yüksek hızlı motor ve kontrolörden oluşan bir FA25 sistemi (FLUKO Co., Ltd, Şanghay, Çin) tarafından gerçekleştirildi. İç kesicinin dönüş hızı 10000–28000 rpm aralığında, ekstraksiyon süreleri 2–15 dakika aralığında ayarlanmıştır.

(b) BAE yöntemi.—Beş gram kurutulmuş numune ve 300 mL metanol hassas bir şekilde tartıldı ve bir ekstraksiyon şişesine ilave edildi. Ekstraksiyon şişesi bir ultrasonik banyoya daldırıldı ve 10 dakika boyunca 300 W'lık bir ultrasonik güçte gerçekleştirildi. Ekstraksiyon sıcaklığı 30 dereceye ayarlandı.

(c) MAE yöntemi.—Beş gram kurutulmuş numune ve 300 mL metanol hassas bir şekilde tartıldı ve bir ekstraksiyon şişesine ilave edildi. Ekstraksiyon şişesi mikrodalga reaktörüne konuldu ve 10 dakika boyunca 180 W'da gerçekleştirildi. Ekstraksiyon sıcaklığı 30 dereceye ayarlandı.

HSHE yöntemi, aynı özütleme çözücüsü, özütleme süresi, özütleme sıcaklığı, katı-sıvı oranı ve özütleme döngü sayısı ile UAE ve MAE yöntemleriyle karşılaştırıldı. Ekstraksiyon solüsyonu 0.22 um'lik bir zar ile süzüldü ve ekinakozit ve akteosit konsantrasyonlarını belirlemek için HPLC ile analiz edildi. Tüm ekstraksiyon işlemleri üç kez tekrarlandı.

Transfer Oranlarının Belirlenmesi

2015 Çin Farmakopesi'ndeki standart yönteme göre, C. tubulosa tozundaki ekinakozit ve akteozit içerikleri belirlenmiştir (28). Bir gram C. tubulosa tozu ve 50 mL yüzde 50 metanol, doğru bir şekilde tartıldı ve 50 mL'lik kahverengi bir ölçülü balona ilave edildi. Sıvı karışım tartıldı ve 30 dakika süreyle ıslatıldı. Daha sonra kahverengi ölçülü balon ultrasonik banyoya daldırılmış ve 250 W ultrasonik güçte ve 35 kHz frekansta 40 dakika süre ile gerçekleştirilmiştir. Sıvı karışım yeniden tartıldı ve solvent kaybı sağlamak üzere yüzde 50 metanol eklendi. Ekstraksiyon çözeltisi, 0.22 um'lik bir zar ile filtrelendi ve ekinakozit ve ateosit konsantrasyonlarını belirlemek için HPLC kullanılarak analiz edildi. Ekstraksiyon işlemleri üç kez tekrarlandı.

Ekinakozit veya ateozid transfer oranları aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanmıştır:

X= M1/M2 × yüzde 100 (2)

burada X=ekinakozit veya ateozit transfer oranı (yüzde); Ekstrakttaki M1=echinacoside veya acteoside kalitesi (mg); ve C. tubulosa tozunda (mg) ekinakozit veya akteositin M2=kalitesi.

Sonuçlar ve tartışma

HPLC Yönteminin Doğrulanması

HSHE kullanılarak C. tubulosa kaynaklı ekinakozit ve akteozitin HPLC profilleri Şekil 1'de gösterilmektedir. Sonuçlar, HPLC yönteminin, ekinakozit ve ateozitin nicel analizinde iyi bir kesinliğe sahip olduğunu göstermiştir. Çeşitli zamanlarda (0–48 saat), ekinakozit ve akteositin pik alanlarının RSD'leri sırasıyla yüzde 1,71 ve 1,70 idi, bu da numunenin 48 saatte stabil olduğunu gösterir. Ekinakozit ve ateozid geri kazanımı sırasıyla yüzde 99.3 ve yüzde 99,1 ve bunların RSD'si sırasıyla yüzde 0.70 ve yüzde 0.67 idi, bu da HPLC yönteminin güvenilirliğini doğruladı.

Farklı Ekstraksiyon Yöntemlerinin Karşılaştırılması

Sonuçları Şekil 2'de gösterilen HSHE yönteminin MAE ve BAE yöntemleri ile ekinakozit ve akteosit verimleri açısından bir karşılaştırması yapılmıştır. MAE ve BAE tarafından. MAE ile karşılaştırıldığında, HSHE tarafından elde edilen ekinakozit ve akteozit verimleri sırasıyla yüzde 20,5 ve yüzde 20,8 daha fazlaydı. Ve BAE ile karşılaştırıldığında, HSHE tarafından elde edilen ekinakozit ve akteozit verimleri sırasıyla yüzde 6,6 ve yüzde 7,4 daha yüksekti. Bu sonuçlar, HSHE'nin PhG'lerin verimini önemli ölçüde artırabileceğini göstermektedir.

HSHE Yönteminin Optimizasyonu

HSHE tarafından PhG'lerin ekstraksiyon parametreleri, etanol konsantrasyonu, ekstraksiyon sıcaklığı, dönüş hızı, ekstraksiyon süresi, katı-sıvı oranı ve ekstraksiyon döngülerinin sayısını içerir (26, 29).

Etanol Konsantrasyonunun PhG'lerin Ekstraksiyonuna Etkisi

Etanol konsantrasyonu, PhG'lerin verimini etkileyen önemli bir faktördür. Şekil 3'te gösterildiği gibi, farklı etanol konsantrasyonları altında C. tubulosa'dan echinacoside ve acteoside verimleri araştırıldı. Ekinakozit veriminin yüzde 0'dan yüzde 30'e yükseldiğini ve ardından etanol konsantrasyonlarının artmasıyla yüzde 30'dan yüzde 90'a düştüğünü ortaya çıkardı. Acteoside verimi yüzde 0'dan yüzde 70'e yükseldi ve ardından artan etanol konsantrasyonlarıyla yüzde 70'ten yüzde 90'a düştü. Etanol konsantrasyonu yüzde 50 olduğunda, ekinakozit ve ateozit verimlerinin toplamı maksimumdaydı. Farklı etanol konsantrasyonlarının farklı polariteleri vardır, bu da ekinakozit ve ateozitin farklı çözünürlüklerine yol açar. Bu nedenle, optimal etanol konsantrasyonu yüzde 50 idi.

Dönme Hızının PhG'lerin Ekstraksiyonuna Etkisi

Şekil 5, farklı dönüş hızlarının PhG'lerin verimleri üzerindeki etkilerini göstermektedir. Ekinakozit ve ateozit verimleri artan dönüş hızları ile artmıştır. Dönme hızının artması, iç ve dış kesicinin kesme kuvvetini artırabilir, böylece PhG'lerin verimini arttırır. Optimum dönüş hızı 16000 rpm idi.

Ekstraksiyon Süresinin PhG'lerin Ekstraksiyonuna Etkisi

Farklı ekstraksiyon süreleri altında ekinakozit ve akteozit verimleri Şekil 6'da gösterilmektedir. Bu nedenle, PhG'lerin C. tubulosa'dan 2 dakikada tamamen ekstrakte edilebileceği ve optimal ekstraksiyon süresinin 2 dakika olduğu sonucuna varılabilir.

Katı-Sıvı Oranının PhG'lerin Ekstraksiyonuna Etkisi

Şekil 7'de gösterildiği gibi, farklı katı-sıvı oranları altında ekinakozit ve asteozit verimleri tartışıldı. Ekinakozit ve ateozit verimleri 1:3'ten 1:9'a yükseldi ve 1:9'dan 1:24'e stabil hale geldi. Az miktarda ekstraksiyon çözücüsü, ekinakozit ve ateoziti tamamen çözemediğinden, kütle aktarım hızları düşmüştür. Çözücülerin aşırı ekstraksiyonu gereksiz israfa neden oldu. Bu nedenle, optimal katı-sıvı oranı 1:9'du.

Ekstraksiyon Döngü Sayısının PhG'lerin Ekstraksiyonuna Etkisi

Şekil 8, bir dizi ekstraksiyon döngüsünün PhG'lerin verimi üzerindeki etkilerini göstermektedir. Ekinakozit ve akteozit verimleri, artan ekstraksiyon çevrimi sayısı ile artmıştır. Bununla birlikte, artan ekstraksiyon döngüleri ile ekstraksiyon süreleri önemli ölçüde arttı ve daha fazla enerji tüketildi. Optimum ekstraksiyon döngüsü sayısı birdi.

PhG'leri Ayıklamak için HSHE Yönteminin Diğer Ekstraksiyon Yöntemleriyle Karşılaştırılması

HSHE yönteminin, C. tubulosa'dan PhG'leri çıkarmak için diğer ekstraksiyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında sonuçları Tablo 3'te listelenmiştir. HSHE, ultrason destekli sulu iki fazlı ekstraksiyon ve ultrasonik mikrodalga ekstraksiyon teknolojisi gibi birleştirme yöntemlerinden daha basit ve kolaydır. yöntemler. Ayrıca HSHE'nin ekstraksiyon basıncı, basınçlı sıvı ekstraksiyon yöntemine göre daha düşüktür ve öncekinin çalışma koşulları daha güvenlidir. Daha da önemlisi, HSHE'nin tüm ekstraksiyon yöntemleri arasında en kısa ekstraksiyon süresini ve en az solvent tüketimini gösterdiği Tablo 3'ten görülebilir. HSHE yönteminin doğal ürünlerin ekstraksiyonu için yüksek verim, ılıman çalışma koşulları, düşük tüketim seviyeleri, basit ekipman ve kolay kullanım gibi birçok avantajı olduğu sonucuna varılabilir.

Sonuçlar

Bu çalışmada, C. tubulosa'dan PhG'lerin ekstraksiyonu için verimli ve çevre dostu bir HSHE yöntemi araştırılmıştır. BAE ve MAE yöntemleriyle karşılaştırıldığında, yeni HSHE yöntemi aynı koşullar altında daha yüksek PhG verimi üretir. MAE yöntemiyle karşılaştırıldığında, ekinakozit ve akteozit verimleri sırasıyla yüzde 20,5 ve yüzde 20,8 arttı. BAE ile karşılaştırıldığında, ekinakozit ve ateozit verimleri sırasıyla yüzde 6,6 ve yüzde 7,4 arttı. C. tubulosa'dan PhG'lerin HSHE ekstraksiyon parametreleri optimize edildi. Optimize edilmiş parametreler altında, ekinakozit ve akteozit verimleri sırasıyla yüzde 1.366 ve 0.519'a, ekinakozit ve akteozit aktarım oranları ise sırasıyla yüzde 87 ve yüzde 94'e ulaştı. HSHE yöntemi, yüksek verimlilik, ılımlı çalışma koşulları, düşük tüketim seviyeleri, basit ekipman, kolay kullanım ve düşük maliyet avantajlarına sahiptir. Bu araştırma, PhG'lerin C. tubulosa'dan endüstriyel ekstraksiyonu için yeni bir yöntem sunmaktadır.