Yüksek Hızlı Kesme Homojenizasyon Ekstraksiyonuyla Cistanche Tubulosa'dan Feniletanoid Glikozitlerin Ekstraksiyonu

Arka plan:

Cistanche tubulosa, Sincan kökenli, iyi bilinen bir geleneksel Çin tıbbıdır. Kuzey Afrika, Hindistan vb. bölgelerde yaygın olarak dağıtılmaktadır. Amaç: C. tubulosa'nın ana biyoaktif bileşenifeniletanoid glikozitler (PhG'ler). Ekinakozit ve akteozid, PhG'lerin belirlenmesi için gösterge bileşenlerdir ve esas olarak karaciğerin korunması, bağışıklık koruması vb. için kullanılır. Bu nedenle, PhG'lerin C. tubulosa'dan ekstrakte edilmesi çok önemlidir. Yöntemler: Bu çalışmada ultrason destekli ekstraksiyon (BAE), mikrodalga destekli ekstraksiyon (MAE) ve yüksek hızlı kesme homojenizasyon ekstraksiyonu (HSHE) yöntemleri karşılaştırıldı. Ayrıca HSHE yönteminin ekstraksiyon koşulları optimize edildi. Sonuçlar: Sonuçlar, HSHE yönteminin hem UAE hem de MAE yöntemlerinden daha iyi olduğunu ve HSHE'nin optimal ekstraksiyon parametrelerinin %50 etanol konsantrasyonu, 70 derece ekstraksiyon sıcaklığı, 16000 rpm dönüş hızı, bir ekstraksiyon olduğunu gösterdi. 2 dakikalık bir süre, 1:9 katı-sıvı oranı ve bir ekstraksiyon döngüsü. getirileriekinekozit ve akteozitsırasıyla %1,366 ve 0,519 idi ve ekinekosid ve akteozidin transfer oranları sırasıyla %87 ve %94'e ulaştı. Sonuçlar: HSHE yönteminin C. tubulosa'dan PhG'lerin ekstraksiyonu için basit, hızlı ve etkili bir teknik olduğu sonucuna varılabilir. Önemli Noktalar: PhG'lerin C. tubulosa'dan ekstraksiyonu için etkili ve çevre dostu bir HSHE yöntemi araştırılmıştır. C. tubulosa'dan PhG'lerin ekstraksiyonu için HSHE yönteminin optimum koşulları elde edildi. Bu araştırma, PhG'lerin C. tubulosa'dan endüstriyel olarak ekstraksiyonu için yeni bir yöntem sunmaktadır.

CİNSEL FONKSİYONU GELİŞTİREN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Cistanche tubulosaSincan kökenli yaygın bir geleneksel Çin tıbbıdır. Kuzey Afrika'da yaygın olarak dağıtılmaktadır.Arap Yarımadası, Pakistan ve Hindistan'da bulunmaktadır ve 2010 yılında Çin Farmakopesi'ne resmi olarak kaydedilmiştir. C'nin ana biyoaktif bileşeni. tübülozafeniletanoid glikozitler (PhG'ler), suda çözünebilen doğal ürünlerin bir sınıfıdır.ekinakozit, akteozit, izoakteozitve 2-asetillakteosid (1, 2). PhG'lerin yapısı sinnamik asit ve hidroksifeniletil kısımlarından oluşur ve bunların her ikisi de bir -glukopiranoz yoluyla esterve sırasıyla glikosidik bağlantılar (3). Farmakolojik çalışmalar PhG'lerinC. tubulosayorgunluk önleyici (4), nöroprotektif (5-7), karaciğer koruyucu (8-10) ve immün koruyucu etkiler (11) gibi birçok tıbbi işlevi vardır. Bu nedenle, PhG'lerin etkili bir şekilde ekstraksiyonuC. tubulosadoğal ürünlerin geliştirilmesi ve kullanılması açısından büyük önem taşımaktadır.

PhG'lerin mevcut geleneksel ekstraksiyon yöntemleri, sıcak geri akış ekstraksiyonu, ultrason destekli ekstraksiyon (BAE) ve mikrodalga destekli ekstraksiyondur (MAE; 12-16). Bu yöntemlerin verim düşüklüğü, ekstraksiyon sürelerinin uzun olması ve maliyetlerin yüksek olması gibi farklı dezavantajları bulunmaktadır. Geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, yüksek hızlı kesme homojenizasyon ekstraksiyonu (HSHE) yöntemi yeni ortaya çıkan, yeni bir ekstraksiyon yöntemidir ve daha hızlı ekstraksiyon süreleri, daha az solvent atığı, daha yüksek verim, daha basit cihazlar ve daha kolay operasyon avantajlarına sahiptir (17). HSHE yönteminin çalışma prensibi, yüksek hızlı bir motor tarafından tahrik edilen, dönen bir iç kesiciye dayanmaktadır. Numuneleri parçalamak ve karıştırmak için iç ve dış kesiciler tarafından güçlü bir kesme kuvveti üretilir. Bu arada, yüksek hızlı dönüşe sahip kesici, kesicinin iç ve dış boşlukları arasında basınç farklılıklarına neden olarak numuneler ve solventler arasında kütle aktarımına neden olur. Yüksek kesme kuvveti, çarpışma kuvveti, basınç ve diğer kuvvetlerin birleşimi ile katı numuneler ve çözücüler arasında çözünebilir bir denge hızla elde edilebilir (18). Böylece HSHE'nin ekstraksiyon işlemi birkaç dakika içinde, hatta onlarca saniye kadar kısa bir sürede (19-22) tamamlanabilmektedir.

Son zamanlarda HSHE, çeşitli doğal ürünlerden biyoaktif bileşenlerin ekstraksiyonunda araştırılmaktadır (23-25). Cheng ve diğerleri. Schisandra chinensis'in meyvesinden beş lignan çıkarmak için HSHE kullandı (26). Sonuçlar, optimal koşulların %75'lik bir etanol konsantrasyonu, 1 dakikalık bir ekstraksiyon süresi, 1:19'luk bir katı-sıvı oranı, 180 V'luk bir ekstraksiyon voltajı ve bir numune parçacığı olduğunu gösterdi. 120 mesh boyutunda. Beş lignanın toplam verimi, optimize edilmiş koşullar altında 13,89 ± 0,014 mg/g idi. Tang ve ark. perilla tohumlarından biyoaktif yağ elde etmek için HSHE kullandı (27). Optimum koşullar, 2 dakikalık ekstraksiyon süresi, 1:10 katı-sıvı oranı, 150 V ekstraksiyon voltajı ve iki ekstraksiyon döngüsüydü. Perilla tohumu yağı verimi %59,3'e ulaştı. Yukarıdaki sonuçlar HSHE'nin kısa ekstraksiyon süreleri, düşük maliyetler ve yüksek verim avantajlarına sahip olduğunu göstermektedir. Ancak PhG'lerin HSHE ile ekstraksiyonuna ilişkin araştırma eksikliği vardır.

Bu çalışmada HSHE, PhG'lerin C. tubulosa'dan ekstraksiyonundaki potansiyel uygulamasını araştırmak için kullanıldı. PhG'lerin verimi HPLC ile belirlendi. Üç ekstraksiyon yöntemi (HSHE, UAE ve MAE) aynı koşullar altında karşılaştırıldı. Etanol konsantrasyonunun, ekstraksiyon sıcaklığının, dönüş hızının, ekstraksiyon süresinin, katı-sıvı oranının ve ekstraksiyon döngüsü sayısının verim üzerindeki etkileri araştırıldı. Bu çalışmanın avantajları, dezavantajları ve referanslar karşılaştırılarak tartışılmıştır.

DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA ÇİN GELENEKSEL İLAÇLARI%75 ECH %30 ACT %12

Malzemeler ve yöntemler

Malzeme ve Kimyasal Reaktifler

C. tubulosa, Xinjiang Congrongtang Biological Technology Co., Ltd'den (Xinjiang, Çin) satın alındı. Ekinekosit (%98'den büyük veya eşit saflıklar) ve %98'den büyük veya eşit saflıklar (%98'e eşit saflıklar) standartları, Shanghai Standard Biological Technology Co., Ltd'den (Şangay, Çin) satın alınmıştır. Asetonitril, metanol ve asetik asit, HPLC derecesindeydi (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). Analitik dereceli etanol, Tianjin Yongsheng Fine Chemical Co., Ltd'den (Tianjin, Çin) satın alındı. Deneyler boyunca deiyonize su kullanıldı.

HPLC Analizi

Bir 2489 UV/Görünür Dedektör ve bir Simetri C18 Kolonu (Waters), 250 x 4,6 mm, 5 um parçacık boyutu ile donatılmış bir Waters e2695 sıvı kromatografı (Waters, Milford, MA) üzerinde bir HPLC analizi gerçekleştirildi. Ekinakozit ve akteozit konsantrasyonları HPLC yöntemiyle analiz edildi. Mobil faz (1) asetonitril ve (2) %2 buzlu asetik asit sulu çözeltisinden oluşuyordu. Degrade elüsyon programı Tablo 1'de sunulmaktadır.

Tespit edilen dalga boyu 330 nm, akış hızı 1 mL/dakika, enjeksiyon hacmi 10 μL ve fırın sıcaklığı 30 dereceye ayarlandı. Analitin kromatografik zirvesi, alıkonma süresi standartlarınkiyle karşılaştırılarak doğrulandı. Niceleme, pikin harici bir standart yöntem kullanılarak entegre edilmesiyle gerçekleştirildi.

Hassasiyet testi, aynı ekstraksiyon numunelerinin beş kez enjekte edilmesiyle gerçekleştirildi. Stabilite testi için aynı numuneler 0, 1, 2, 4, 12, 24 ve 48 saatlik artışlarla analiz edildi.

Ekstraksiyon örneklerine standartlar eklenerek ekinakozit ve akteozidin geri kazanım testleri gerçekleştirilmiştir. Ekinekozit ve akteozidin tüm pik alanları ve alıkonma süreleri kaydedildi. Ekinakozit ve akteozit için kalibrasyon eğrilerinin sonuçları Tablo 2'de listelenmiştir.

Getirinin Hesaplanması

PhG'lerin belirlenmesinde gösterge bileşenler olarak ekinakozit ve akteozit kullanıldı. Ekinakozit veya akteozit verimi aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplandı:

burada Y=ekinakozit veya akteozit verimi (%); C=ekinekozit veya akteozit konsantrasyonları (mg/mL); Ekstraksiyon çözeltisinin V=hacmi (mL); ve C. tubulosa tozunun W=ağırlığı (mg).

PhG'lerin Ekstraksiyon Yöntemleri C. tubulosa'nın sapları ilk olarak bir elektrikli öğütücü (JC-500g; Yongkang Kaiyuan Industry & Trade Co., Ltd, Yongkang, Çin) ile öğütüldü ve bir filtre eleği (yaklaşık 380 μm) ile filtrelendi. ). Daha sonra C.tubulosa tozu 70 derecelik fırında ağırlık sabit oluncaya kadar kurutuldu. Beş gram C.tubulosa tozu ekstraksiyon solventi ile karıştırıldı ve bir ekstraksiyon şişesine yerleştirildi. Daha sonra sıvı karışım, sabit sıcaklıktaki bir su banyosunda (DF-101S; Jintan Analytical Instrument Co., Ltd, Jintan, Çin) 5 dakika süreyle önceden ısıtıldı (30–80 derece).

(a) HSHE yöntemi.-HSHE, dönen kesici, yüksek hızlı motor ve kontrol cihazından oluşan bir FA25 sistemi (FLUKO Co., Ltd, Şangay, Çin) tarafından gerçekleştirildi. İç kesicinin dönüş hızı 10000-28000 rpm aralığında, ekstraksiyon süreleri ise 2-15 dk aralığında ayarlanmıştır.

(b) UAE yöntemi. - Beş gram kurutulmuş numune ve 300 mL metanol doğru bir şekilde tartıldı ve bir ekstraksiyon şişesine eklendi. Ekstraksiyon şişesi ultrasonik bir banyoya daldırıldı ve 300 W ultrasonik güçte 10 dakika süreyle gerçekleştirildi. Ekstraksiyon sıcaklığı 30 dereceye ayarlandı.

(c) MAE yöntemi. - Beş gram kurutulmuş numune ve 300 mL metanol doğru bir şekilde tartıldı ve bir ekstraksiyon şişesine eklendi. Ekstraksiyon şişesi mikrodalga reaktörüne yerleştirildi ve 180 W'de 10 dakika süreyle gerçekleştirildi. Ekstraksiyon sıcaklığı 30 dereceye ayarlandı.

HSHE yöntemi, aynı ekstraksiyon solventi, ekstraksiyon süresi, ekstraksiyon sıcaklığı, katı-sıvı oranı ve ekstraksiyon döngü numarası ile UAE ve MAE yöntemleriyle karşılaştırıldı. Ekstraksiyon çözeltisi, 0,22 μm'lik bir membrandan filtrelendi ve ekinakozit ve akteozit konsantrasyonlarını belirlemek için HPLC yoluyla analiz edildi. Tüm ekstraksiyon işlemleri üç kez tekrarlandı.

BAĞIŞIKLIĞI GELİŞTİRMEK İÇİN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Transfer Oranlarının Belirlenmesi

2015 Çin Farmakopesi'ndeki standart yönteme dayanarak, C. tubulosa tozundaki ekinakozit ve akteozit içerikleri belirlendi (28). Bir gram C.tubulosa tozu ve 50 mL %50 metanol doğru bir şekilde tartıldı ve 50 mL'lik kahverengi bir ölçülü şişeye eklendi. Sıvı karışım tartıldı ve 30 dakika süreyle suda bekletildi. Daha sonra kahverengi balon joje ultrasonik banyoya daldırıldı ve 250 W ultrasonik güçte ve 35 kHz frekansta 40 dakika süreyle gerçekleştirildi. Sıvı karışım yeniden tartıldı ve solvent kaybını karşılamak için %50 metanol ilave edildi. Ekstraksiyon çözeltisi 0,22 um'lik bir membrandan filtrelendi ve ekinakozit ve akteozit konsantrasyonlarını belirlemek için HPLC kullanılarak analiz edildi. Ekstraksiyon işlemleri üç kez tekrarlandı.

Ekinakozit veya akteozidin transfer oranları aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplandı:

burada X=ekinekosid veya akteozidin aktarım hızı (%); Ekstrakttaki M1=kalitesindeki ekinekozit veya akteozit (mg); ve C. tubulosa tozunda (mg) M2=kalitesinde ekinakozit veya akteozit.

Sonuçlar ve tartışma

HPLC Yönteminin Doğrulanması

HSHE kullanılarak C. tubulosa'dan ekinekosid ve akteozidin HPLC profilleri Şekil 1'de gösterilmektedir. Ekinakozit ve akteozidin pik alanlarının RSD'si sırasıyla %1,89 ve %1,40 idi. Sonuçlar, HPLC yönteminin ekinakozit ve akteozidin kantitatif analizinde iyi bir hassasiyete sahip olduğunu gösterdi. Çeşitli zamanlarda (0-48 saat), ekinekosid ve akteozidin pik alanlarının RSD'leri sırasıyla %1,71 ve %1,70 olmuştur; bu da numunenin 48 saat içinde stabil olduğunu gösterir. Ekinekozit ve akteozidin geri kazanımı sırasıyla %99,3 ve %99,1 idi ve RSD'leri sırasıyla %0,70 ve %0,67 idi; bu da HPLC yönteminin güvenilirliğini doğruladı.

Farklı Ekstraksiyon Yöntemlerinin Karşılaştırılması Ekinekozit ve akteozit verimleri açısından HSHE yönteminin MAE ve UAE yöntemleriyle karşılaştırılması

sonuçları Şekil 2'de gösterilmektedir. HSHE ile elde edilen ekinakozit ve akteozit verimlerinin hem MAE hem de BAE ile elde edilenlerden daha yüksek olduğu görülmüştür. MAE ile karşılaştırıldığında, HSHE ile elde edilen ekinekozit ve akteozit verimleri sırasıyla %20,5 ve %20,8 oranında daha yüksekti. BAE ile karşılaştırıldığında, HSHE ile elde edilen ekinakozit ve akteozit verimleri sırasıyla %6,6 ve %7,4 oranında daha yüksekti. Bu sonuçlar HSHE'nin PhG'lerin verimini önemli ölçüde artırabildiğini göstermektedir.

HSHE Yönteminin Optimizasyonu

PhG'lerin HSHE ile ekstraksiyon parametreleri arasında etanol konsantrasyonu, ekstraksiyon sıcaklığı, dönüş hızı, ekstraksiyon süresi, katı-sıvı oranı ve ekstraksiyon döngüsü sayısı yer alır (26, 29)

Etanol Konsantrasyonunun PhG'lerin Ekstraksiyonuna Etkisi

Etanol konsantrasyonu PhG'lerin verimini etkileyen önemli bir faktördür. Şekil 3'te gösterildiği gibi, farklı etanol konsantrasyonları altında C. tubulosa'dan ekinakozit ve akteozit verimleri araştırılmıştır. Artan etanol konsantrasyonları ile ekinekosid veriminin %0'den %30'ye arttığını ve daha sonra %30'dan %90'a düştüğünü ortaya çıkardı. Etanol konsantrasyonunun artmasıyla birlikte akteosid verimi %0'dan %70'e artmış ve daha sonra %70'den %90'a düşmüştür. Etanol konsantrasyonu ne zaman

%50 iken ekinakozit ve akteozit verimlerinin toplamı maksimumdaydı. Farklı etanol konsantrasyonları farklı polaritelere sahiptir, bu da ekinakozit ve akteozidin farklı çözünürlüklerine yol açar. Böylece optimal etanol konsantrasyonu %50 idi.

Ekstraksiyon Sıcaklığının PhG'lerin Ekstraksiyonuna Etkisi

Ekstraksiyon sıcaklığının PhG'lerin verimi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için farklı ekstraksiyon sıcaklıkları (30-80 derece) incelenmiştir. Ekinekozit ve akteozitin farklı sıcaklıklardaki verimleri Şekil 4'te gösterilmektedir. Ekstraksiyon sıcaklığı 30 dereceden 70 dereceye çıkarıldığında ekinakozit ve akteozit verimlerinin arttığı görülmektedir. Sıcaklık 80 dereceye yükseldiğinde ekinakozit ve akteozit verimleri azalmıştır. Bu, PhG'lerin bozulmasını hızlandıran daha yüksek bir sıcaklığa atfedilir. Bu nedenle optimum ekstraksiyon sıcaklığı 70 dereceydi.

Dönme Hızının PhG'lerin Ekstraksiyonuna Etkisi

Şekil 5, farklı dönme hızlarının PhG'lerin verimleri üzerindeki etkilerini göstermektedir. Ekinakozit ve akteozit verimleri, dönüş hızının artmasıyla arttı. Dönme hızındaki artış, iç ve dış kesicinin kesme kuvvetini artırabilir, böylece PhG'lerin verimi artar. Optimum dönüş hızı 16000 rpm idi.

Ekstraksiyon Süresinin PhG'lerin Ekstraksiyonu Üzerindeki Etkisi

Farklı ekstraksiyon süreleri altında ekinakozit ve akteozit verimleri Şekil 6'da gösterilmektedir. Ekinakozit ve akteozit verimleri, ekstraksiyon sürelerinin artmasıyla stabildi. Bu nedenle PhG'lerin C. tubulosa'dan 2 dakikada tamamen ekstrakte edilebileceği ve optimal ekstraksiyon süresinin 2 dakika olduğu sonucuna varılabilir.

Katı-Sıvı Oranının PhG'lerin Ekstraksiyonuna Etkisi

Şekil 7'de gösterildiği gibi, farklı katı-sıvı oranları altında ekinakozit ve akteozit verimleri tartışılmıştır. Ekinakozit ve akteozit verimleri 1:3'ten 1:9'a yükseldi ve 1:9'dan 1:24'e kadar stabil hale geldi. Az miktarda ekstraksiyon solventi ekinakozit ve akteozidi tamamen çözemediğinden kütle aktarım hızları azalmıştır. Çözücülerin aşırı ekstraksiyonu gereksiz israfa neden oldu. Bu nedenle optimal katı-sıvı oranı 1:9'du.

Ekstraksiyon Döngüsü Sayısının PhG'lerin Ekstraksiyonuna Etkisi

Şekil 8, bir dizi ekstraksiyon döngüsünün PhG'lerin verimleri üzerindeki etkilerini göstermektedir. Ekinekozit ve akteozit verimleri ekstraksiyon çevrimi sayısı arttıkça arttı. Bununla birlikte, ekstraksiyon döngülerinin artmasıyla ekstraksiyon süreleri önemli ölçüde arttı ve daha fazla enerji tüketildi. Optimum ekstraksiyon döngüsü sayısı birdi.

PhG'lerin Ekstraksiyonunda HSHE Yönteminin Diğer Ekstraksiyon Yöntemleriyle Karşılaştırılması

HSHE yönteminin sonuçlarının diğer ekstraksiyon yöntemleriyle karşılaştırılmasıC. tubulosa'dan PhG'lerin çıkarılmasıTablo 3'te listelenmiştir. HSHE, ultrason destekli sulu iki fazlı ekstraksiyon ve ultrasonik mikrodalga ekstraksiyon teknolojisi yöntemleri gibi birleştirme yöntemlerinden daha basit ve kolaydır. Ayrıca HSHE'nin ekstraksiyon basıncı, basınçlı sıvı ekstraksiyon yöntemine göre daha düşük olup, ilkinin çalışma koşulları daha güvenlidir. Daha da önemlisi Tablo 3'te HSHE'nin tüm ekstraksiyon yöntemleri arasında en kısa ekstraksiyon süresini ve en az solvent tüketimini gösterdiği görülmektedir. Doğal ürünlerin ekstraksiyonunda HSHE yönteminin yüksek verim, ılımlı çalışma koşulları, düşük tüketim seviyeleri, basit ekipman ve kolay kullanım gibi birçok avantajı olduğu sonucuna varılabilir.

Sonuçlar

Bu çalışmada, C. tubulosa'dan PhG'lerin ekstraksiyonu için verimli ve çevre dostu bir HSHE yöntemi araştırılmıştır. BAE ve MAE yöntemleriyle karşılaştırıldığında yeni HSHE yöntemi, aynı koşullar altında daha yüksek PhG verimi üretir. MAE yöntemiyle karşılaştırıldığında, getirilerekinekozit ve akteozitsırasıyla %20,5 ve %20,8 arttı. BAE ile karşılaştırıldığında ekinakozit ve akteozit verimleri sırasıyla %6,6 ve %7,4 arttı. PhG'lerin HSHE'sinin C. tubulosa'dan ekstraksiyon parametreleri optimize edildi. Optimize edilmiş parametreler altında, ekinakozit ve akteozit verimleri sırasıyla %1,366 ve 0,519'a ulaştı ve ekinakozit ve akteozitin transfer oranları sırasıyla %87 ve 94'e ulaştı. HSHE yöntemi, yüksek verimlilik, ılımlı çalışma koşulları, düşük tüketim seviyeleri, basit ekipman, kolay kullanım ve düşük maliyet avantajlarına sahiptir. Bu araştırma, PhG'lerin C. tubulosa'dan endüstriyel olarak ekstraksiyonu için yeni bir yöntem sunmaktadır.

DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE BİTKİLERİ PHGS75% ECH 30% ACT 12%