Echinacoside Rb1, Gas6 Yolunu Modüle Ederek Yaşa Bağlı Vasküler Bozukluğu Azaltır

SOYUT

Bağlam:ekinekosidRb1 (Rb1) birçok yararlı etki gösterir ve kardiyovasküler hastalığa karşı korur.

Amaç: Rb1'in yaşa bağlı vasküler bozukluğu azaltıp azaltamayacağını araştırmak ve mekanizmayı belirlemek. Gereçler ve yöntemler: Young, Young + 20 mg/kg Rb1, Old+ aracı, Old + 10 mg/kg Rb1 ve Old + 20 mg/kg Rb1 gruplarına rastgele atanan 2 ve 18 aylık dişi C57BL/6J fareleri, günlük olarak 3 ay boyunca araç veya Rb1 ile intraperitoneal enjekte edildi. Torasik aort segmentleri, endotele bağımlı vazorelaksasyonu incelemek için kullanıldı. Yaşlanma ile ilgili proteinler, kalsifikasyon ve fibroz ile ilgili belirteçler ve Gas6/Axl ifadesi dahil olmak üzere histolojik veya moleküler ifade analizleri için sol torasik aort dokuları toplandı.

Bulgular: Old+ araç grubunda, yaşlanma proteinlerinin ve hücresel adezyon moleküllerinin ekspresyonunun, Young grubuna (yüzde 88,84 ± yüzde 1,20) göre daha kötü endotele bağımlı torasik aort gevşemesiyle (yüzde 58,35 ± yüzde 2,50) önemli ölçüde arttığını bulduk. ). Bununla birlikte, Rb1 tedavisi, bu proteinlerin ekspresyon seviyelerini önemli ölçüde azalttı ve yaşlı farelerde endotel bağımlı gevşemeyi korudu. Ayrıca, Rb1 tedavisi, yaşlı farelerde kalsiyum birikimini, kolajen birikimini ve kolajen I ve kolajen III'ün protein ekspresyon seviyelerini de azaltmıştır. Ayrıca, genç farelere kıyasla yaşlı farelerde Gas6 protein ekspresyonunun yüzde 41.72 ve mRNA ekspresyonunun yüzde 52.73 oranında aşağı regülasyonunun Rb1 tedavisi ile ortadan kaldırıldığını bulduk. Ancak Axl ifadesinde gruplar arasında anlamlı fark yoktu.

Sonuçlar: Çalışmamız, Rb1'in vasküler hasarı iyileştirebileceğini doğrulayarak, Rb1'in potansiyel bir potansiyel olabileceğini düşündürmektedir.yaşlanma karşıtı vasküler bozukluk ajanı.

Cistanche Rich In Echinacoside Satın Alın

giriiş

Çin'de önümüzdeki 30 yıl içinde, 65 yaş ve üstü yetişkinlerin yüzde 12,6'sından yüzde 26'sına tahmini bir artış var (Zhou ve Walker 2021). İnsan ömrünün uzamasına rağmen yaşa bağlı hastalıklar endişe konusu olmaya devam ediyor.Kardiyovasküler hastalıklarbunlaren yaygın hastalıklaryaşlı bireyleri etkileyen.vasküler yaşlanmavasküler yapısal ve fonksiyonel değişikliklerin eşlik ettiği önemli bir bağımsız risk faktörüdür.kardiyovasküler hastalıklar(Lakatta ve Levy 2003). Epidemiyolojik araştırmalar, kardiyovasküler hastalıklardan ölen hastaların yüzde 82'sinin 65 yaş ve üzerinde olduğunu göstermiştir (Moslehi ve ark. 2012). Bu nedenle, yaşa bağlı vasküler bozukluğun mekanizmasının araştırılması ve vasküler fonksiyonu yaşa bağlı azalmaya karşı koruyabilecek ajanların bulunması, yaşlı bireylerde yaşa bağlı kardiyovasküler bozuklukların insidansını ve prevalansını azaltmada önemli roller oynayabilir.

Arteriyel yaşlanma, vasküler disfonksiyon ve çeşitli kardiyovasküler hastalıkların patogenezinde rol oynamaktadır ve yaşlanmanın bir özelliğidir (Minamino ve Komuro 2007). Yaşlanmadan kaynaklanan vasküler değişiklikler değişkenlik gösterir ve endotel disfonksiyonu, vasküler düz kas hücrelerinin (VSMC'ler) hipertrofisi, arteriyel dilatasyon, hücre dışı matrisin (ECM) yeniden düzenlenmesi, vasküler kalsifikasyon ve parçalanma ile kollajen-elastin oranındaki artışı içerir. ve damar sertliği (Tolle ve ark. 2015). Brandes ve ark. (2005), yaşa bağlı endotel disfonksiyonunun genellikle endotel kaynaklı gevşeme ve kontraktil faktörlerde bir dengesizlik ile karakterize edildiğini bildirmiştir. Herrera ve ark. (2010) ayrıca endotel disfonksiyonunun endotele bağlı vazodilatasyonda ilerleyici bir düşüşle yakından ilişkili olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, yaşlanmanın vazodilatasyonu nasıl etkilediği veya ilgili faktörlerde dengesizlikleri nasıl tetiklediği ve nihayetinde vasküler fonksiyon bozukluğuna neden olduğu hala net değildir. Acosta ve ark. (2008), yaşlanan vasküler hücrelerin, plazminojen aktivatör inhibitörü 1 (PAI-1), bir vasküler hücre yapışma proteini 1 (VCAM-1) ve hücreler arası hücre yapışma molekülü{{ 14}} (ICAM-1). Tüm bu adezyon moleküllerinin, aterosklerotik bölgelere monosit alımında önemli roller oynadığı ve ardından vasküler yeniden şekillenmeyi başlattığı ve sonuçta uyumda azalma ve sertlikte artışla sonuçlandığı düşünülüyordu (Acosta ve ark. 2008; Kovacic ve ark. 2011). Damar sertliği, damar yaşlanmasının en önemli belirtisidir. ECM'nin yeniden şekillenmesine atfedilir ve vazodilatasyonda bir düşüşe katkıda bulunur. Önceki çalışmalar vasküler sertliğin ve VSMC yaşlanmasının medial kalsifikasyon ve kollajen birikimine atfedildiğini göstermiştir (Mauriello ve ark. 1992; McClelland ve ark. 2006; Nakano-Kurimoto ve ark. 2009; Wendorff ve ark. 2015; Kim ve ark. 2018 ). Bu nedenle vazodilatasyon disfonksiyonu kalsifikasyon ve fibrozdan kaynaklanabilir. Kalsiyum veya kollajen birikimini azaltmak, yaşlanmaya bağlı arteriyel bozukluğu geciktirebilir.

ekinekosidRb1 (Rb1), ginseng'de bulunan aktif bileşenlerden biridir. Araştırmalar, Rb1'in özellikle miyokardiyum ve endoteli korumada birçok yararlı yaşlanma karşıtı ve anti-apoptotik etki gösterdiğini bildirmiştir (Zheng ve diğerleri. 2017; Zhou ve diğerleri. 2017; Zheng ve diğerleri. 2020). Son araştırmalar, Rb1'in sıçanlarda kronik böbrek hastalığı ile ilişkili vasküler kalsifikasyonu ve tip I kollajen ekspresyonunu azaltabileceğini göstermiştir (Zhou ve ark. 2019b). Bulgular ayrıca Rb1'in tip I kollajen ekspresyonunu azalttığını ileri sürmüştür (Kwok ve ark. 2012). Bununla birlikte, Rb1'in yaşa bağlı vasküler bozukluk üzerindeki etkileri araştırılmamıştır.

Rb1'in in vitro büyüme durdurmaya özgü gen 6 (Gas6) işlemi yoluyla vasküler kalsifikasyonu inhibe ettiği bildirilmiştir (Nanao-Hamai ve ark. 2019). K vitaminine bağımlı protein ailesinin bir üyesi olan Gas6, bir membran reseptörü tirozin kinaz olan reseptörü Axl'e bağlandıktan sonra çoklu hücresel fonksiyonların düzenlenmesinde yer alır (Nakano ve diğerleri 1997; Fridell ve diğerleri 1998; Yanagita ve diğerleri .2001). Bazı çalışmalar, Gas6/Axl yolağının vasküler biyolojide ve vasküler kalsifikasyon, vasküler yeniden şekillenme ve ateroskleroz gibi hastalıklarda çok önemli bir rol oynadığını göstermiştir (Korshunov ve ark. 2006; Hurtado ve ark. 2010; Son ve ark. 2010). Rb1'in potansiyel olarak Gas6/Axl yolağının düzenlenmesi ile ilişkili olan kalsifikasyon ve fibrozu baskılayarak yaşa bağlı vasküler bozukluğu azaltabileceğini varsayıyoruz.

Malzemeler ve yöntemler

deneysel reaktifler

Rb1 (yüzde 98'in üzerinde saflık) Victory'den (Sichuan, Çin) elde edildi. p21Cip1 (ab188224), p16INK4a (ab51243), ICAM-1 (ab179707), VCAM-1 (ab134047), PAI-1 (ab222754) ve GAPDH'ye (ab181603) karşı antikorlar Abcam'dan satın alındı (MA, ABD). Kollajen I (14695), kollajen III (22734) ve Axl'e (13196) karşı antikorlar, Proteintech Group'tan (MA, ABD) satın alınmıştır. Gas6 (A8545) ve p16INK4a'ya (A0262) karşı antikorlar, ABclonal Technology'den (Hubei, Çin) satın alınmıştır. Modifiye Krebs-Henseleit (KH) tamponu, fenilefrin (güçlü bir vazokonstriktör) ve asetilkolin (Ach, endotele bağımlı bir NO donörü) Sigma-Aldrich'ten (MO, ABD) satın alındı. Kullanılan diğer tüm reaktifler analitik derecedeydi.

Hayvanlar ve yönetim

Bu çalışma, Sun Yat-Sen Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Uzun ömür çalışmalarının çoğu kadınlar üzerinde etki göstermiştir (Hsu ve diğerleri 2018; Qin ve diğerleri 2018); bu nedenle uzun süreli çalışmamızı dişi fareler kullanarak gerçekleştirdik. 2 ve 18 aylık dişi C57BL/6J fareleri, Sun Yat-Sen Üniversitesi Deney Hayvanları Merkezi'nden temin edildi. Fareler normal bir diyetle beslendi ve kontrollü koşullar altında (24 ± 2 C ve yüzde 50 ± 5 nem) 12 saat aydınlık/karanlık fotoperiyotlarla, spesifik patojen içermeyen koşullar altında barındırıldı. 2 aylık 40 genç dişi C57BL/6J faresi, Young ve Young + 20 mg/kg Rb1 (Young + Rb1-20) gruplarına (her biri n=20) rastgele ayrıldı. Bu fareler, 5 aylıkken CO2 boğulmasıyla ötenaziden önce 3 ay boyunca araç içinde çözülmüş 20 mg/kg Rbl veya günlük intraperitoneal araç enjeksiyonu (steril salin solüsyonu) ile tedavi edildi. 18 aylık 60 yaşlı dişi C57BL/6J faresi rastgele Eski + araç, Eski + 10 mg/kg Rb1 (Eski + Rb1-10) ve Yaşlı + 20 mg/kg Rb1 (Eski + Rb) grubuna ayrıldı. 1-20) grup (her biri n=20). Bu deneyin sonuna kadar hayatta kalan fareler, 3 ay boyunca tek başına aracın veya Rbl'in (10 veya 20 mg/kg) günlük intraperitoneal enjeksiyonlarını aldı, ardından farelere 21 aylıkken ötenazi uygulandı. Deneyler, grup başına 4-5 fare ile en az üç kez tekrarlandı.

Malzemeler ve yöntemler Deneysel reaktifler

Rb1 (yüzde 98'in üzerinde saflık) Victory'den (Sichuan, Çin) elde edildi. p21Cip1 (ab188224), p16INK4a (ab51243), ICAM-1 (ab179707), VCAM-1 (ab134047), PAI-1 (ab222754) ve GAPDH'ye (ab181603) karşı antikorlar Abcam'dan satın alındı (MA, ABD). Kollajen I (14695), kollajen III (22734) ve Axl'e (13196) karşı antikorlar, Proteintech Group'tan (MA, ABD) satın alındı. Gas6 (A8545) ve p16INK4a'ya (A0262) karşı antikorlar, ABclonal Technology'den (Hubei, Çin) satın alınmıştır. Modifiye Krebs-Henseleit (KH) tamponu, fenilefrin (güçlü bir vazokonstriktör) ve asetilkolin (Ach, endotele bağımlı bir NO donörü) Sigma-Aldrich'ten (MO, ABD) satın alındı. Kullanılan diğer tüm reaktifler analitik derecedeydi.

Hayvanlar ve yönetim

Bu çalışma, Sun Yat-Sen Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Uzun ömür çalışmalarının çoğu kadınlar üzerinde etki göstermiştir (Hsu ve diğerleri 2018; Qin ve diğerleri 2018); bu nedenle uzun süreli çalışmamızı dişi fareler kullanarak gerçekleştirdik. 2 ve 18 aylık dişi C57BL/6J fareleri, Sun Yat-Sen Üniversitesi Deney Hayvanları Merkezi'nden temin edildi. Fareler normal bir diyetle beslendi ve kontrollü koşullar altında (24 ± 2 C ve yüzde 50 ± 5 nem) 12 saat aydınlık/karanlık fotoperiyotlarla, spesifik patojen içermeyen koşullar altında barındırıldı. 2 aylık 40 genç dişi C57BL/6J faresi, Young ve Young + 20 mg/kg Rb1 (Young + Rb1-20) gruplarına (her biri n=20) rastgele ayrıldı. Bu fareler, 5 aylıkken CO2 boğulmasıyla ötenaziden önce 3 ay boyunca araç içinde çözülmüş 20 mg/kg Rbl veya günlük intraperitoneal araç enjeksiyonu (steril salin solüsyonu) ile tedavi edildi. 18 aylık 60 yaşlı dişi C57BL/6J faresi rastgele Eski + araç, Eski + 10 mg/kg Rb1 (Eski + Rb1-10) ve Yaşlı + 20 mg/kg Rb1 (Eski + Rb) grubuna ayrıldı. 1-20) grup (her biri n=20). Bu deneyin sonuna kadar hayatta kalan fareler, 3 ay boyunca tek başına aracın veya Rbl'in (10 veya 20 mg/kg) günlük intraperitoneal enjeksiyonlarını aldı, ardından farelere 21 aylıkken ötenazi uygulandı. Deneyler, grup başına 4-5 fare ile en az üç kez tekrarlandı.

Torasik aort halkalarında vazorelaksasyonun belirlenmesi

Hayvanlara ötenazi uygulandıktan sonra torasik aort halkaları hızla çıkarıldı ve soğuk KH tampon çözeltisine (118 mmol/L NaCl, 4.75 mmol/L KCI, 25 mmol/L NaHC03, 1.18, mmol/L MgSO4 1) ​​yerleştirildi. 18 mmol/L KH2PO4, 2,54 mmol/L CaCl2 ve 11,1 mmol/L glukoz) ve çevresindeki yağ ve doku dikkatlice debride edildi. Aort halkalarının uzunluğu yaklaşık 3 mm idi. Aort segmentleri paslanmaz çelik kancalara asıldı, KH tamponunda havalandırıldı ve 37°C'de yüzde 95 O2 ile sürekli olarak oksijenlendi. Aort halkaları daha sonra MacLab veri toplaması için FORT-10 kuvvet dönüştürücülerine bağlandı. Aort halkalarındaki ilk pasif gerilim, ileri deneylerden önce damar halkası stabilitesini elde etmek için 30 dakika boyunca 3 mN olarak ayarlandı. KH tamponu her 10 dakikada bir değiştirildi. Vazokonstriksiyonu indüklemek için doku banyosuna 105 mol/L'lik bir konsantrasyonda fenilefrin eklendi. Damar halkası stabilitesine ulaşıldıktan sonra, doz-yanıt eğrisini elde etmek için doku banyosuna hemen ardı ardına vazorelaxant Ach (10 9 – 10 5 mol/L) ilave edildi. Her konsantrasyondaki gevşeme ölçüldü ve fenilefrine yanıt olarak üretilen kuvvetin yüzdesi olarak ifade edildi.

İmmünohistokimya

Torasik aort dokuları formalinde sabitlendi, kurutuldu, parafine gömüldü ve 4 lm'lik enine kesitler halinde kesildi. Bu bölümler, sitrat tamponunda (pH 6.0) inkübe edildi ve deparafinizasyon ve rehidrasyondan geçtikten sonra iki kez 10 dakika mikrodalgaya tabi tutuldu. Keçi serumu (%10) (Gibco, BRL, NY, ABD), 37°C'de 1 saat boyunca spesifik olmayan bağlanmayı bloke etmek için kullanıldı, ardından p21Cip1 (1:1000) ve p16INK4a'ya (1:200) karşı birincil antikorlarla gece boyunca inkübasyon yapıldı. ) 4 C'de nemli bir kutuda. PBS içinde üç yıkamadan sonra yaban turpu peroksidaz (HRP)-konjuge sekonder antikorlar (Abcam) ilave edildi ve 60 dakika 37°C'de inkübe edildi, ardından diaminobenzidin (1:100, Abcam) boyaması yapıldı. Hücre çekirdeklerini zıt boyamak için hematoksilen uygulandı. Kesitler nötr sakızla kaplandı ve bir Zeiss mikroskobu altında fotoğraflandı.

Hematoksilen-eozin (HE) boyama

Parafine gömülmüş torasik aort kesitleri, 2 dakika boyunca hematoksilin ile boyandı. Yıkandıktan ve yüzde 1'lik asidik alkol ile işlendikten sonra, kesitler 3 dakika boyunca eozin boyama ile muamele edildi. Daha sonra kesitler yıkandı, kurutuldu ve mikroskobik incelemeden önce ksilen ile işlendi. Torasik aort bölümleri bir Zeiss mikroskobu altında fotoğraflandı.

Masson'un trikrom boyaması

Parafine gömülmüş torasik aort kesitleri, deparafinizasyon ve rehidrasyondan geçtikten sonra 10 dakika Weigert'in demir hematoksileninde boyandı ve ardından 5 dakika PBS ile yıkandı. Dokular daha sonra Biebrich kırmızı asit fuksin solüsyonunda 5 dakika boyandı ve distile su ile yıkandı. Kesitler daha sonra birkaç kez farklılaştırma ve yüzde 75 ve yüzde 90'lık alkolde dehidrasyona tabi tutuldu, ardından musluk suyunda durulandı. Son olarak, kesitler ksilen içinde temizlendi ve bir montaj ortamı ile monte edildi. Kesitler mikroskopla görüntülendi. İnterstisyel kollajen birikimi, mavi-yeşil boyama ile gösterildi.

Alizarin kırmızısı S boyama

Aort kalsifikasyon boyaması için torasik aort kesitleri yüzde 2'lik alizarin red S solüsyonu ile 10 dakika boyandı ve PBS ile yıkandı. Daha sonra kesitler 30 saniye susuz asetonda, 15 saniye susuz aseton ve ksilen (hacim oranı=1:1) karışımı ve 1 dakika susuz ksilen içinde bekletildi. İnterstisyel kalsiyum fosfat tuzları kırmızı boyama ile belirtilmiştir.

Batı lekesi

Torasik aortlar, bir proteaz inhibitörü (MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, ABD) ile desteklenmiş RIPA lizis tamponuna (HaiGene, Haerbin, Çin) yerleştirildi ve daha sonra buz üzerinde ultrasonikasyonla homojenleştirildi. Doku lizatı 12,000 g'de 4°C'de 15 dakika santrifüjlendi ve süpernatan yeni bir tüpte toplandı. Daha sonra süpernatandaki protein konsantrasyonu, bir BCA protein tahlil kiti (Beyotime Biyoteknoloji Enstitüsü, Jiangsu, Çin) kullanılarak belirlendi. SDS PAGE, daha önce açıklandığı gibi (Zheng ve diğerleri 2020) her numuneden eşit miktarda protein ile gerçekleştirildi ve ardından proteinler, PVDF zarlarına (EMD Millipore, Billerica, MA, ABD) aktarıldı. Membranlar, oda sıcaklığında 1 saat süreyle yüzde 5 sığır serum albümini (Gibco) ile bloke edildikten sonra aşağıdaki birincil antikorlardan biri ile 4°C'de gece boyunca inkübe edildi: p21Cip1 (1:1000), p16INK4a (1:1000), ICAM{ {16}} (1:1000), VCAM-1 (1:5000), PAI-1 (1:1000), kolajen I (1:1000), kolajen III (1:300), Gas6 (1:1000), Axl (1:500) ve GAPDH (1:1000). Yıkandıktan sonra membranlar, HRP konjuge sekonder antikor (Boster, Wuhan, Çin) ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildi. İkincil antikor bağlanması, bir ECL kiti (EMD Millipore) kullanılarak test edildi ve bantların yoğunlukları, ImageJ yazılımı (versiyon 1.41; Ulusal Sağlık Enstitüleri, MD, ABD) kullanılarak analiz edildi. GAPDH ifadesi dahili kontrol olarak kullanıldı.

Gerçek zamanlı kantitatif RT-PCR (qPCR)

İlk olarak, üreticinin protokollerine uygun olarak bir TaKaRa MiniBEST Evrensel RNA Ekstraksiyon Kiti (9767, TaKaRa) kullanılarak torasik aortalardan toplam RNA izole edildi. RNA konsantrasyonu daha sonra bir DS-11 FX Spektrofotometre (DeNovix) ile ölçüldü. Daha sonra, ekstrakte edilen RNA (her biri 20 mL reaksiyon sistemi için 1000 ng), ProFlex PCR Sisteminde (Thermo Scientific) üreticinin talimatlarına göre PrimeScriptTM RT Ana Karışım (RR360A, TaKaRa) kullanılarak cDNA'ya ters kopyalandı. ). Son olarak, ters transkripsiyon ürünleri, SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa) ile daha ileri PCR amplifikasyonu için şablonlar olarak kullanıldı. Aşağıdaki primer dizileri kullanıldı: Gapdh: ileri 50 -CAGCAACTCCCA CTCTTCCAC-30 ve ters 50 - TGGTCCAGGGTTTCTTAC TC-30; ve Axl: ileri 50 -GGAACCCAGGGAATATCACAGG- 30 ve geri 50 -AGTTCTAGGATCTGTCCATCTCG-30; ve Gas6 ileri 50 -TGCTGGCTTCCGAGTCTTC-30 ve geri 50 -CGGGGTCGTTCTCGAACAC-30 geri. Her reaksiyon kuyucuğu, 0,4 pmol/lL ileri ve geri primerler, 1 SYBR Premix Ex Taq II (RR820A, TaKaRa) ve 10 ng cDNA içeren kuyucuklu şeffaf bir plaka (Thermo Scientific) içinde kuyucuk. Nihai reaksiyon hacmi 20 mL idi ve tüm numuneler üç kopya halinde analiz edildi. cDNA amplifikasyonu şu şekilde gerçekleştirildi: QuantStudio5'te (Thermo Scientific) 95 C'de 30 saniye ön denatürasyon, ardından 95 C'de 5 saniye 40 döngü denatürasyon ve 60 C'de 35 saniye tavlama. Toplanan verilerin göreceli nicel analizi için 2-DDCT yöntemi kullanıldı. Hedef genlerin nispi mRNA ifade düzeyi, deney grubundan alınan verilerin Gapdh referans alınarak kontrol grubundan alınan verilerle karşılaştırılmasıyla elde edildi.

E-posta:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp artı 86 15292862950