Glutatyon Metabolizması, Eğitimli Bağışıklığın İndüksiyonuna Katkıda Bulunur

Soyut:

Doğuştan gelen bağışıklık sistemi, ikincil bir tehdide karşı daha güçlü tepkiler ile karakterize edilen heterolog hafıza özellikleri gösterir. Eğitimli bağışıklık olarak adlandırılan bu fenomen, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin epigenetik ve metabolik yeniden bağlantılarına dayanır. Reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimi, eğitimli bağışıklık fenotipi ile ilişkilendirildiğinden, artan ROS seviyelerinin ve ana hücre içi redoks molekülü glutatyonun, eğitimli bağışıklığın indüklenmesinde rol oynadığını varsaydık. Burada, eğitimli bağışıklığın in vitro bir modelinde ROS'un farmakolojik inhibisyonunun hücre yanıtını etkilemediğini gösteriyoruz; glutatyon seviyelerinin modülasyonu, insan monositlerinde proinflamatuar sitokin üretimini azaltmıştır. Glutatyon metabolizmasında yer alan genlerdeki tek nükleotid polimorfizmlerinin (SNP'ler), eğitimli bağışıklık üzerine proinflamatuar sitokin üretim kapasitesindeki değişikliklerle ilişkili olduğu bulundu.

Ayrıca, plazma glutatyon konsantrasyonları, BCG ile aşılanmış bireylerin monositleri tarafından üretilen, eğitimli bağışıklığın bir biyobelirteci olan ex vivo IL-1 üretimi ile pozitif olarak ilişkiliydi. Sonuç olarak, glutatyon metabolizması, eğitimli bağışıklığın uyarılmasında yer alır ve insan hastalıklarındaki fonksiyonel sonuçlarını araştırmak için gelecekteki çalışmalar garanti edilir.

İnsan bağışıklığı çok önemlidir çünkü bizi hastalıklardan ve enfeksiyonlardan korur. Bağışıklık sistemi, birçok farklı hücre, doku ve organdan oluşan karmaşık bir sistemdir. İçeride ve dışarıda çeşitli patojenlerle başa çıkmak için birlikte çalışırlar. Araştırmada, Cistanche Deserticola polisakkariti ve verbascoside'nin kalp ve beyin dokusu enzimlerinin aktivitesini artırabildiğini ve karın boşluğunu güçlendirebildiğini bulduk. Hücrelerin fagositik fonksiyonu ve lenfositlerin proliferasyon yanıtı, bağışıklığı iyileştirmede bariz etkilere sahiptir.

Cistanche Deserticola ek ürününü tıklayın

anahtar kelimeler:

glutatyon; eğitimli bağışıklık; makrofajlar; metabolizma; doğuştan gelen bağışıklık hafızası.

1. Giriş

Yakın zamana kadar, adaptif bağışıklığın, T ve B hücre yanıtlarını belirli bir antijene uyarlayarak belleği tutma kapasitesi ile karakterize edilen konakçı savunmasının tek bileşeni olduğu düşünülüyordu.

Bununla birlikte, son zamanlarda giderek artan sayıda araştırma, heterolog belleğin özelliklerini, eğitimli bağışıklık olarak adlandırılan bir süreç olan doğuştan gelen bağışıklık sistemine bağlamıştır [1]. Kısa bir süre için Candida albicans'a, mantar hücre duvarı bileşeni -glukan'a veya hatta oksitlenmiş düşük yoğunluklu lipoprotein (ox-LDL) olarak steril uyaranlara maruz bırakılan monositler, hastalıktan uzun süre sonra ilgisiz bir ikincil uyarı üzerine proinflamatuar sitokinlerin artmış üretimini gösterir. ilk uyaran kaldırıldı [2,3].

Ek olarak, epidemiyolojik çalışmalar, tüberküloza karşı Bacillus Calmette-Guérin (BCG) aşılamasının doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin antimikrobiyal fonksiyonunu artırdığını, ardından ilgisiz enfeksiyonlara karşı spesifik olmayan koruma sağladığını ve tüm nedenlere bağlı ölümleri azalttığını göstermiştir [4].

Eğitimli bağışıklığın kökleri, hücrenin transkripsiyonel mekanizması için proinflamatuar yanıtın genlerinin erişilebilirliğini modüle eden epigenetik değişikliklere dayanmaktadır. Eğitimli doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinde epigenetik yeniden bağlantıya, glikoliz, oksidatif fosforilasyon ve kolesterol biyosentezi gibi yolları destekleyen metabolik değişiklikler eşlik eder [5,6]. Bu yollardan türetilen metabolitler, sırayla kromatin değiştirici enzimlerin aktivitesini modüle edebilen sinyal molekülleri ve kofaktörlerdir. Glutatyon (GSH), hücre içi redoks dengesini koruyan ana antioksidandır ve epigenetik değişikliklere katkıda bulunduğu öne sürülmüştür [7].

Ek olarak, BCG ve oxLDL gibi eğitimli bağışıklığı indükleyen uyaranlar, ikincil uyarım üzerine makrofajların reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini artırır [8-10]. Eğitimli makrofajların artan metabolik aktivitesinin ayrıca ROS seviyelerini artıracağını ve GSH'yi modüle edeceğini ve bunun da eğitimli bağışıklık tepkilerinin gücünü etkileyeceğini varsaydık.

2. Malzemeler ve Yöntemler

2.1. İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin (PBMC) ve Monositlerinin İzolasyonu

Yazılı bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra sağlıklı donörlerden buffy coatlar alındı ​​(Sanquin Blood Bank, Nijmegen, Hollanda). Etik onay, CMO Arnhem-Nijmegen'den (NL32 357.091.10) alınmıştır. İzolasyon, Ficoll-Paque (GE Healthcare, Chalfont St Giles, UK) üzerinde diferansiyel yoğunluk santrifüjlemesiyle gerçekleştirildi. Daha sonra, hiper-ozmotik bir Percoll (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABD) yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile monositlerin izolasyonu gerçekleştirildi ve bir kez pirojen içermeyen soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkandı. Hücreler yeniden süspanse edildi ve daha sonra 5 ug/mL gentamisin (Centraform, Etten-Leur, Hollanda), 2 mM Glutamax (Gibco, Waltham, MA, ABD) ile desteklenmiş RPMI 1640 Dutch modifiye ortamında (Invitrogen, Waltham, MA, ABD) kültürlendi. ) ve 1 mM piruvat (Gibco). Maksimum saflığı sağlamak için, Percoll ile izole edilmiş monositler polistiren düz tabanlı plakalara (Corning, Sigma-Aldrish, New York, NY, ABD) 1 saat 37°C %5 CO2'de yapışmaya bırakıldı ve ardından bir kez ılık PBS ile yıkandı.

2.2. In Vitro Eğitimli Bağışıklık Modeli

Yapışık monositler, daha önce tarif edildiği gibi [11] kültürlendi. Kısaca, 105 monosit, düz tabanlı 96-kuyulu plakalara (Greiner, Kremsmünster, Avusturya) ekildi ve 1 ug/mL -glukan veya 5 ug/mL BCG aşısı (InterVax, Toronto, ON, Kanada) ile inkübe edildi. Yüzde 10 insan havuzlanmış serum ile RPMI. Candida albicans'tan -1,3-(D)-glucan ( -glucan) Profesör David Williams (College of Medicine, Johnson City, TN, ABD) tarafından sağlanmıştır.

Belirtildiğinde, hücreler {{0}.5uM difenileniyodonyum (DPI), 50 uM a-tokoferol (AT) (Sigma-Aldrich), 0.5 uM askorbik asit (AA), 1 mM N-asetil ile ön kuluçkaya yatırıldı -glukan ilavesinden 1 saat önce sistein (NAC) (Sigma-Aldrich) veya 100 uM DL-butiyonin sülfoksimin (BSO) (Sigma-Aldrich). 24 saat sonra, hücreler bir kez ılık PBS ile yıkandı ve 5 gün boyunca yüzde 10 havuzlanmış insan serumu ile desteklenmiş RPMI'de farklılaşmaya bırakıldı. Ortam, kültürün 3. gününde yenilendi. 6. günde makrofajlar, 24 saat daha 10 ng/mL Escherichia coli lipopolisakarit (LPS; serotip 055:B5, Sigma-Aldrich) ile yeniden uyarıldı.

2.3. Reaktif Oksijen Türleri (ROS) Ölçümü

Monositler/makrofajlar 2 saat, 24 saat veya 6 gün süreyle kültürlendi, yıkandı, soğuk PBS ile ayrıldı ve PBS içinde 5 uM H2DCFDA (Life Technologies, Waltham, MA, ABD) ile 30 dakika süreyle inkübe edildi. 37 ◦C. Hücreler, akış sitometrisi (CytoFlex, Beckman Coulter, Brea, CA, ABD) ile analiz edildi. Veri analizi Kaluza 2.1 yazılımı kullanılarak yapıldı. Hücre agregatları, ileri dağılım (FSC)-yüksekliğine karşı FSC-alan grafiğine dayalı olarak kontrol edildi ve monosit/makrofaj popülasyonu, FSC ve yan dağılıma (SSC) göre kontrol edildi. Veriler, ortalama ± SEM olarak sunuldu ve Friedman testi ve ardından Dunn çoklu karşılaştırma testleri ile analiz edildi. 0.05'in altındaki bir p değeri, yıldızlarla gösterildiği gibi istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi (* p < 0.05).

2.4. İn Vitro Olarak Uyarılan İnsan Monositlerinin RNA Sıralama Verileri

İn vitro olarak -glukana maruz kalan monositlerin gen ekspresyon analizi, daha önce yayınlanmış RNA-seq verileri kullanılarak yapıldı [12]. Kısaca, PBMC'ler, Ficoll-Paque (GE Healthcare) içinde santrifüjleme yoluyla izole edildi. Monositler, CD3 artı (T hücreleri), CD19 artı (B hücreleri) ve CD56 artı (NK hücreleri) pozitif hücreler (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Almanya) için boncuklu negatif seçim kullanılarak saflaştırıldı. Hücreler, açıklanan in vitro eğitimli bağışıklık modeli izlenerek kültürlendi ve 5 ug/mL -glukan'a maruz bırakıldı. Monositler, maruziyetten 4 saat ve 24 saat sonra toplandı. Antioksidan yanıtı ve glutatyon metabolizması ile ilgili genler, in vitro monositten makrofaja eğitilmiş bağışıklık modelinde önemli ölçüde dinamik genler listesinden (p < 0.05, FC > 2.5, RPKM > 1) çıkarıldı. Veriler, -glukan ile tedavi edilen monositler ve uyarılmamış monositler arasındaki oranın log10'u olarak sunulur.

2.5. Glutatyon Kantifikasyonu

Hücre içi indirgenmiş (GSH) ve oksitlenmiş (GSSG) glutatyonun kantitatif analizi, daha önce tarif edildiği gibi nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi kullanılarak yapıldı [13].

Kısaca büyüme ortamı çıkarıldı ve kültürlenen hücreler, ılık PBS (37°C) ile yıkandı ve metabolizmayı durdurmak için sıvı nitrojen ile söndürüldü. Hücreler daha sonra plakalardan sıyrıldı ve soğuk (-80 ◦C) metanol/kloroform/su çözeltisi, 8.1:0.9:1 (hacim/hacim/hacim) kullanılarak özümlendi. . Ekstraktlar en az 30 dakika süreyle kuru buz üzerinde donmuş halde tutuldu ve ardından 20 dakika süreyle 18,{{1{{30}}}× g'de santrifüjlendi. -4 ◦C'de. Hücre içi metabolitleri içeren süpernatanlar hafif bir nitrojen akışı altında kurutulurken protein peleti protein ölçümü için tutuldu ve NMR numuneleri, kurutulmuş materyalin 0.05 içeren döteryumlu su içinde 0.22 mL 0.15 M fosfat tamponu (pH 7.4) ile çözülmesiyle hazırlandı. mM trimetilsilil propiyonik-d4-sodyum tuzu, NMR referanslaması ve ölçümü için dahili bir standart olarak. Noesygppr1d darbe dizisi (Topspin v3.0, Bruker Biospin Ltd, Karlsruhe, Almanya) kullanılarak bir 14.1 T (1H için 600 MHz) Bruker Avance II NMR'de her numune için bir İD 1H NMR spektrumu toplandı. Tüm spektrumlar, glutatyon miktarının belirlenmesi için Chenomx NMR paketi 8.4'te (Chenomx NMR paketi, v8.0, Edmonton, AB, Kanada) işlendi ve içe aktarıldı.

Tüm konsantrasyonlar, her numunenin toplam protein kütlesine göre normalleştirildi. Sonuncusu, sonikasyon ile tamponda (1:1, yüzde 1 SDS: 8M Üre (0.25M Tris pH:8)) protein topağının çözülmesiyle ölçüldü. Protein konsantrasyonu daha sonra kılavuzuna göre PierceTM BCA protein tahlil kiti (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) kullanılarak ölçüldü.

2.6. Genetik ve Metabolik Analiz için In Vitro ve In Vivo Eğitimli Bağışıklık Modelleri

İn vitro modelde yapışık monositler, ya sadece negatif kontrol olarak kültür ortamı, 2 µg/mL -1,3-(D)-glukan veya 5 µg/mL BCG (300BCG kohort) ile inkübe edilmiştir. : BCG-Bulgaria suşu, Intervax, Kanada), yüzde 10 havuzlanmış insan serumu mevcudiyetinde 37 ◦C'de 24 saat. 6. günde, hücreler 24 saat boyunca 200 uL RPMI veya LPS 10 ng/mL (serotip 055: B5; Sigma-Aldrich) ile yeniden uyarıldı.

İn vivo modelde, sağlıklı yetişkinler sol üst kola intradermal olarak standart dozda 0.1 mL BCG ile aşılanmış ve aşılamadan önce, aşılamadan 14 ve 90 gün sonra kan alınmıştır. Her ziyarette 5 x 105 PBMC, ısıyla öldürülmüş Staphylococcus aureus (106 CFU/mL) ile uyarıldı veya yüzde 5 CO2 ile 37 ◦C'de uyarılmadan bırakıldı. Salgılanan sitokinler, her iki modelde de 24 saatlik stimülasyondan sonra ölçüldü ve eğitim stimulusu tarafından indüklenen sitokin yanıtını artıran kat, eğitilmiş bağışıklık için bir ölçü olarak kullanıldı [14].

2.7. Genetik Analiz

Genetik analiz, İnsan Fonksiyonel Genomik Projesi'nden Batı Avrupa kökenli sağlıklı bireylerden oluşan bir kohort kullanılarak yapıldı [15]. 300BCG grubu, Hollanda'dan 325 yetişkinden oluşuyor (yüzde 44 erkek ve yüzde 56 kadın, yaş aralığı 18-71). Çalışma, yerel CMO bölgesi Arnhem-Nijmegen, NL58553.091.16 tarafından onaylandı. Bireylerin (n=325) DNA örnekleri, Illumina'dan ticari olarak temin edilebilen SNP çipi, Infinium Global Screening Array MD v1.0 kullanılarak genotiplendi. Genotip çağırma için varsayılan ayarlarla optik 0.7.0 kullanıldı [16]. Hardy-Weinberg dengesi (HWE) 0,0001'den küçük veya buna eşit ve küçük alel frekansı (MAF) Küçük veya eşit olan değişkenler gibi çağrı hızı 0,99'a eşit veya daha az olan örnekler hariç tutuldu 0.001'e. Varyant dizileri, Genotype Harmonizer [17] kullanılarak 1000 Genom referans paneline göre hizalandı ve tanımlandı. Daha sonra, referans paneli olarak insan referans konsorsiyumunu (HRC r1.{28}}) kullanarak Michigan değerlendirme sunucusundaki örnekleri belirledik ve değerlendirme kalitesi için R2 < 0,3 ve MAF < yüzde 5 olan genetik değişkenleri filtreledik [18], takip QTL haritalaması için yaklaşık 4 milyon tek nükleotid polimorfizmi (SNP'ler) ile sonuçlanır. 300 BCG kohortundan toplam 267 birey için in vitro eğitimli bağışıklık yanıtlarına ilişkin hem genotip hem de sitokin verileri elde edildi. İlaç kullanımı nedeniyle (bunlardan biri genetik aykırı olarak tanımlandı) üç örnek hariç tutuldu ve bir örnek, çalışma sırasında tip 1 diyabetin başlangıcından kaynaklanıyordu.

İlk olarak, eğitilmiş ve eğitilmemiş hücreler arasındaki sitokin üretiminin kat değişimi, eğitilmiş bağışıklık tepkisinin büyüklüğü için bir ölçüm olarak alınmıştır. Sitokin dağılımı için kalite kontrolünün ardından ve genetik aykırı değerleri hariç tuttuktan sonra, sitokin üretiminin kat değişiminin dağılımlarını düzeltmek için ortak değişkenler olarak yaş ve cinsiyetle doğrusal bir regresyon modeli kullanarak sitokin üretiminin log-dönüştürülmüş kat değişikliklerini genotip verilerine eşledik. Eğitilmiş bağışıklık yanıtlarını etkileyen anlamlı nicel özellik lokusları (QTL) ilişkilerini belirlemek için p < 9.99 × 10−3'lük bir kesme kullandık. İn vivo eğitimli bağışıklık modeli kullanılarak toplam 296 birey için hem genotip hem de sitokin verileri elde edildi.

İn vitro QTL eşlemesi için açıklanan aykırı değerlere ek olarak, akşam aşılanmış 18 kişi hariç tutuldu ve QTL eşlemesinden önce 278 örnek elde edildi. İlk olarak, ham sitokin seviyeleri log-dönüştürüldü ve ziyaretler arasındaki sitokin üretimi oranları, sitokin üretiminin kat değişimi olarak alındı. Sitokin üretiminin kat değişimi, ortak değişkenler olarak yaş ve cinsiyet ile doğrusal bir regresyon modeli kullanılarak genotip verilerine eşlendi. Eğitilmiş bağışıklık yanıtlarını etkileyen anlamlı QTL ilişkilerini belirlemek için p < 9.99 × 10−3'lük bir kesme kullandık. R-package Matrix-eQTL, sitokin QTL haritalaması için kullanıldı [19].

2.8. Metabolomik Analiz

300 BCG kohortundan bireylerin metabolit seviyeleri BCG aşılamasından önce ölçüldü. Metabolik özellikler, akış enjeksiyon uçuş süresi kütle (flow enjeksiyon TOF-M) spektrometresi [20] kullanılarak General Metabolics (Zürih, İsviçre) tarafından ölçüldü ve açıklandı. Hedeflenmeyen metabolitler, insan metabolitleri veri tabanına (HMDB) göre açıklanmıştır. Tüm metabolomik ölçümler çiftler halinde gerçekleştirildi ve metabolit başına her numune için ortalama değer hesaplandı. Spearman korelasyon analizi, metabolitler ve aşılama öncesi tepkiler hakkında ex vivo sitokin kat değişiklikleri üzerinde yapıldı. Glutatyon seviyeleri ile genetik analizde tanımlanan ilgili SNP'ler arasındaki ilişkiyi test etmek için, her bir SNP için ortak değişkenler olarak dahil edilen yaş ve cinsiyet ile doğrusal bir regresyon analizi yapıldı.

2.9. Sitokin Ölçümü ve Analizi

Sitokin üretimi, üreticinin talimatları izlenerek IL{{0}}, IL-6 ve TNF (R&D Systems, Minneapolis, MN, ABD) için ticari ELISA kitleri kullanılarak belirlendi. Veriler, ortalama ± SEM olarak sunulur ve iki yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA ve ardından Sidak'ın çoklu karşılaştırma testleri ile analiz edilir. 0.05'in altındaki bir p değeri, yıldızlarla gösterildiği gibi istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi (* p < 0.05).

3. Sonuçlar

3.1. -Glucan- ve BCG-İndüklenmiş Eğitimli Bağışıklık, Sürekli Reaktif Oksijen Türlerinin Üretimini Tetikler

Artan ROS salınımı daha önce eğitimli bağışıklık fenotipinin bir özelliği olarak tarif edilmiştir [21]. 2 saat ve 24 saat boyunca -glukan veya BCG'ye maruz kalan monositler, artan ROS sergiler. İlginç bir şekilde, bu artış devam etti ve kültür ortamında 5 gün dinlendikten sonra mevcuttu (Şekil 1A). Geliştirilmiş ROS seviyelerine, 24 saat boyunca -glukan'a maruz kalan monositlerde farklı antioksidan genlerin transkripsiyonel değişiklikleri eşlik eder (Şekil 1B). Mitokondriyal süperoksit dismutaz SOD2 ve farklı tiyol içeren moleküller, yani tioredoksin bağımlı peroksit redüktazlar 1-6 (PRDX 1-6) ve sülfiredoksin 1 (SRXN1) yukarı doğru düzenlenir. İlgili tiyol içeren ROS temizleyicileri olan tioredoksin (TXN) ve tioredoksin redüktazın (TXNRD) ifadesi de artar.

Şekil 1. Eğitimli monositlerin artan ROS seviyeleri, gelişmiş proinflamatuar sitokin üretimine katkıda bulunmaz. (A) monositlerin -glukan ve BCG'ye maruz kalmasından 2 saat, 24 saat ve 6 gün sonra ROS seviyeleri (n=6/9 donör, 2/3 bağımsız deneyden toplanmıştır. Fridman testi Dunn'ın çoklu karşılaştırma testi) . (B) Uyarılmamış hücrelere kıyasla 24 saat boyunca -glukan'a maruz kalan monositlerde antioksidan savunmada yer alan genlerin ekspresyon seviyeleri. İfade, log10(oran) olarak sunulur. (C) 0,5µM DPI (n=6 donör, 2 bağımsız deneyden toplanmıştır) ve (D) ile 1 saatlik bir ön muameleden sonra -glukanla eğitilmiş makrofajlar tarafından üretilen TNF ve IL-6 ) 1 mM NAC, 50 µM AT veya 0,5 µM AA (n=6 donör, iki bağımsız deneyden havuzlanmış, iki yönlü ANOVA, Sidak'ın çoklu karşılaştırma testi). (ortalama ± SEM, * p < 0.05).

Bununla birlikte, ne majör ROS üreticisi NADPH oksidazın difenileniyodonyum (DPI) ile inhibisyonu, ne de -glukan ile inkübasyondan önce antioksidan moleküller -tokoferol (AT) ve askorbik asit (AA) eklenmesi, artan makrofaj tepkisini modüle etmedi. LPS'den 24 saat sonra -glukan, TNF ve IL-6 salgısına maruz kalan makrofajlarda yeniden uyarma, bu farmakolojik yaklaşımla değiştirilmedi (Şekil 1C, D).

Ancak, tek başına DPI'ye maruz kalma, LPS uyarımı üzerine IL-6 üretimini artırdı. (Şekil 1C). Genel ROS temizleyici N-asetil sistein (NAC) ile ön tedavi, tek başına glukan uygulanan hücrelere kıyasla TNF ve IL-6 üretiminde bir azalmaya neden oldu (Şekil 1D). Birlikte ele alındığında, artan ROS üretiminin, -glukan kaynaklı eğitimli bağışıklığın artan sitokin üretiminde küçük bir rol oynadığını gösteriyoruz. Ek olarak, eğitimli bağışıklık, artan ROS seviyelerini sürdürdü, hücresel antioksidan glutatyonun modülasyonuyla ilişkilendirilebilir, çünkü NAC sadece bir ROS temizleyici değil, aynı zamanda glutatyon sentezi için bir öncü olarak da hareket edebilir.

3.2. Glutatyon Metabolizması Eğitimli Bağışıklık Tepkilerini Etkiler

24 saat boyunca -glukan'a maruz kalan monositler, bu zaman noktasında bulunan daha yüksek ROS seviyeleri ile olan glutatyonun (GSSG) oksitlenmiş formunun daha yüksek seviyelerini gösterir (Şekil 2A). Dinlenme periyodundan sonra, indirgenmiş glutatyon (GSH) formu, oksitlenmiş formun konsantrasyonlarında herhangi bir değişiklik olmaksızın eğitimli makrofajlarda artma eğilimindedir.

Şekil 2. Glutatyon seviyeleri, -glukan maruziyeti üzerine modüle edilir. (A) 1 µg/mL-glukan ile 24 saat maruz kaldıktan sonra ve dinlenme süresinden 5 gün sonra (n=4 donör, iki bağımsız deneyden toplanmıştır) monositlerde azaltılmış ve oksitlenmiş glutatyon hücre içi seviyeleri. (B) -glukan'a 4 saat ve 24 saat maruz kalan monositlerde glutatyon metabolizmasında yer alan genlerin ifadesi. İfade, log10(oran) olarak sunulur. (C) 100 uM BSO (n=9 donör, üç bağımsız deneyden toplanmış, * p < 0,05 iki yönlü ANOVA) ile 1 saatlik bir ön muameleden sonra -glukanla eğitilmiş makrofajlar tarafından üretilen TNF ve IL-6 , Sidak'ın çoklu karşılaştırma testleri) (ortalama ± SEM).

Hız sınırlayıcı enzim glutamat sistein ligazın (GCLC ve GCLM) alt birimlerini kodlayan genler, kontrol monositlerine kıyasla -glukan stimülasyonundan 4 saat sonra artan ekspresyon gösterir. Glutatyon redüktaz (GSR), glutatyon peroksidaz 7 (GPX7) ve glutaredoksin ailesinin (GLRX, 2, 5) enzimleri de 24 saatlik zaman noktasında (Şekil 2B) yukarı regüle edilir; glutatyon geri dönüşüm oranı. -glukan maruziyetinden önce butiyonin sülfoksimin (BSO) ile GCL aktivitesinin farmakolojik olarak inhibe edilmesi, LPS yeniden uyarılmasından sonra IL-6 üretiminde bir azalmaya yol açar (Şekil 2C). Bu nedenle, glutatyon seviyelerinin eksojen modülasyonu, ya öncü NAC'nin eklenmesiyle takviye ya da GCL enzimini BSO ile bloke ederek azalması, -glukanın ikincil stimülasyona karşı artan tepkisini azalttı.

Glutatyon metabolizmasında yer alan genlerdeki genetik varyasyonun eğitilmiş bağışıklığı etkileyip etkilemediğini daha fazla araştırmak için, 325 sağlıklı bireyden oluşan bir kohort kullanılarak QTL haritalaması yapıldı. Glutatyon metabolizması ile ilgili genlerde minör alel frekansı (MAF) > 0.05 olan yaygın SNP'lerin -glukan ve BCG in vitro eğitim üzerine monositlerin proinflamatuar sitokin üretim kapasitesindeki değişikliklerle ilişkili olup olmadığını test ettik (Şekil 3A, C).

Benzer şekilde, bu genetik varyantların 278 sağlıklı bireyin BCG aşılamasıyla indüklenen in vivo eğitimli bağışıklığı üzerindeki etkisini de değerlendirdik (Şekil 3B, C). Glutatyon metabolizmasında yer alan 250 kb'lik bir gen penceresindeki birkaç SNP, eğitimden sonra IL-1 , TNF ve IL-6 sekresyonunun yukarı regülasyonu ile anlamlı bir şekilde ilişkilendirildi (p-değeri < 9.99 × 10−3). (Şekil 3A, B).

Aynı kohortta, BCG aşılamasından önce glutatyon metabolizmasında yer alan plazma metabolitlerini ölçtük. İn vitro ve in vivo analizlerde tanımlanan SNP'ler, dolaşımdaki glutatyon konsantrasyonları ile önemli ölçüde ilişkiliydi (p-değeri < 0.05) (Şekil 3D). Ek olarak, plazma glutatyon konsantrasyonu ile ex vivo IL-1 üretimi arasında BCG aşılamasından 90 gün sonra heterolog uyaran Staphylococcus aureus'a in vitro maruz kalma üzerine pozitif bir ilişki bulduk (Şekil 3E). BCG aşılaması ile IL-1 üretiminin yukarı regülasyonu ayrıca, metionin, sistein, glutamat ve glisin gibi glutatyon metabolizmalarında yer alan diğer metabolitlerin dolaşımdaki konsantrasyonu ile pozitif olarak ilişkilidir (Şekil 3E). Genel olarak, LPS'ye (Şekil 3A) veya S. aureus'a (Şekil 3B) karşı doğuştan gelen heterolog yanıtlar için QTL'ler içeren glutatyon metabolizmasında yer alan genler ve glutatyon serum seviyeleri ile ex vivo IL-1 üretimi arasındaki korelasyon, her ikisi de eğitimli bağışıklığın kurulmasında bu yolun rolü.

Şekil 3. Glutatyon, eğitimli bağışıklık özellikleri ile ilişkilidir. Glutatyon metabolizmasında yer alan genlerle eşlenen SNP'ler ile in vitro (A)-glukan ve BCG (IL-6 için n=251 sağlıklı gönüllü ve TNF için n=238 sağlıklı gönüllü) ve (B) in vivo BCG eğitim yanıtları (n {{10}} sağlıklı gönüllüler). (C) Analiz başına en düşük p-değerli SNP'nin kutu grafiği (rs7768134, rs35568915). (D) rs2233294 (GPX3) ve rs10136944 (GLRX5, n=302) için genotipe göre sınıflandırılmış glutatyon plazma seviyelerini (yaş ve cinsiyete göre düzeltilmiş) gösteren kutu grafikleri. Her bir SNP için p-değeri, bağımsız değişken olarak ilgilenilen SNP ve bağımlı değişken olarak glutatyon (yaş ve cinsiyet için düzeltilmiş) ile doğrusal bir regresyon modelinden türetilir. (E) PBMC'den türetilen S. aureus'un neden olduğu IL-6, IL-1 ve TNF yanıtlarının 14 veya 90 gün sonra ölçülen kat değişikliklerine karşı glutatyon metabolizmasında yer alan başlangıçtaki dolaşımdaki metabolitler arasındaki Spearman korelasyonları BCG aşılamasının başlangıca kıyasla (n=297 sağlıklı gönüllü). Tablo, her korelasyon için Spearman'ın rho'sunu sunar ve kırmızıyla gösterilen korelasyonlar, önemli pozitif korelasyonları vurgular (* p < 0,05, ** p < 0,01). Glutatyon konsantrasyonu ile 90 gündeki IL-1 üretiminin 0. güne kıyasla kat değişimi arasındaki korelasyon, bir dağılım grafiğinde örnek olarak verilmiştir.

4. Tartışma

Makrofajlar, fenotiplerini farklı çevresel uyaranlara uyarlayan plastik hücrelerdir. Eğitimli makrofajlar, artan proinflamatuar sitokin üretimi ile bir yanıt oluşturmak için artan glikoliz, TCA döngüsü ve oksidatif fosforilasyon ile yüksek bir enerji metabolizmasına güvenirler [6,22].

Sitokin üretimine ek olarak, yeniden uyarılmış BCG eğitimli makrofajlarda hızlı ROS üretimi ile oksidatif patlama artar [8]. BCG ile tedavi edilen farelerden izole edilen splenik nötrofiller de artmış ROS üretimi göstermektedir [23]. Artırılmış metabolik hız ve oksidatif bir patlama oluşturma kapasitesinin artmasıyla paralel olarak, -glukan veya BCG'ye maruz kalan monositlerin ve makrofajların bazal ROS üretiminde bir artış sergilediğini gözlemledik. ROS salınımında benzer bir artış daha önce oxLDL ile eğitilmiş monositlerde rapor edilmişti [9]. ROS, patojenlerin temizlenmesinde efektör işlevlere sahiptir ancak aynı zamanda sinyal iletimine aracılık edebilir [24]. ROS üreten enzim NOX'in farmakolojik inhibisyonu veya antioksidan moleküller -tokoferol ve askorbik asit ile tedavi, -glukan artan sitokin üretimini ortadan kaldırmadı. Bununla birlikte, ROS temizleyici NAC, -glukan tarafından geliştirilmiş TNF üretimini inhibe ederek, ROS'un eğitimli bağışıklıkta olası bir rolüne işaret eder.

İlginç bir şekilde, NAC sadece bir antioksidan molekül değil, aynı zamanda ana endojen antioksidan molekül olan glutatyonun öncüsü olarak da işlev görür. İki ana hücresel redoks sistemi vardır, NAD artı /NADH gibi piridin nükleotidleri ve glutatyon ve tioredoksinleri içeren tiyol sistemleri. NAD artı /NADH oranı, ROS seviyeleri için bildirdiğimize benzer şekilde, eğitimli makrofajlardaki [22] farklılaşma döneminden sonra glukan-maruz kalan monositlerde sürekli bir şekilde artar. Burada GSH konsantrasyonlarının eğitilmiş bağışıklıkta da modüle edildiğini gösteriyoruz.

En çarpıcı şekilde, GSH-indirgenmiş formun konsantrasyonu yalnızca farklılaştırılmış eğitilmiş makrofajlarda artarken, oksitlenmiş GSSG seviyeleri stabildir. Bu, eğitimli makrofajların, NAD artı /NADH'nin aksine sürekli ROS üretimi ile ortak olmayan GSH depolarını artırdığını göstermektedir. Glutatyon metabolizmasının eğitilmiş bağışıklığa katkısı, sağlıklı bireylerden oluşan bir kohortun (300BCG) genetik ve metabolik analizi ile daha da güçlendirilmiştir. GSH ile ilişkili genlerdeki yaygın genetik polimorfizmlerin, in vitro ve in vivo eğitimli bağışıklık üzerindeki sitokin üretiminin büyüklüğünü etkilediği bulundu (p < 9.99 × 10−3). Ek olarak, bu QTL lokuslarından ikisinin, chr5'te GPX3 ve chr14'te GLRX5'in GSH plazma konsantrasyonları ile ilişkili olduğu bulundu (p < 0.05).

GSH bir antioksidan moleküldür, ancak farklı epigenetik mekanizmalar yoluyla gen ekspresyonunu düzenlediği de bilinmektedir. GSH, nükleozom proteini histon H3'ün S-glutatiyonilasyonunda gözlemlendiği gibi, post-translasyonel modifikasyonlara katılır ve nihai olarak s-adenosil metionin (SAM) üretimine yol açan metionin yolundan güç alır. Buna karşılık SAM, DNA ve histon metilasyonu için kullanılan başlıca metil vericidir [7]. TCA döngüsü metaboliti fumarat, eğitilmiş makrofajlarda birikir ve bunun türevi monometil fumarat, eğitilmiş bir bağışıklık fenotipini indükler [5]. Astrositlerde, dimetil fumarat türevine akut maruz kalma, hücre içi GSH'yi tüketir ancak daha sonraki zaman noktalarında toplam GSH'yi artırır [25]. Eğitilmiş bağışıklık, uzun süreli hafıza sağlayan epigenetik modifikasyonlar tarafından sabitlenir [26]. Eğitimli makrofajların burada gözlenen artmış GSH içeriği, doğuştan gelen bağışıklık belleğinin kurulması için gerekli olan epigenetik yeniden kablolamayı kolaylaştırabilir.

Burada, glutatyonun farmakolojik modülasyonunun ve hücrenin redoks durumunun, BSO veya NAC'nin -glukanla zenginleştirilmiş sitokin üretimi üzerindeki etkisiyle görüldüğü gibi, makrofajın heterolog tepkisini azalttığını gösteriyoruz. Ek olarak, sağlıklı bireylerden oluşan bir kohortta GSH metabolizması, eğitilmiş bağışıklık özellikleri ile ilişkilidir. GSH metabolizması tarafından şekillendirilen eğitilmiş bağışıklık mekanizmaları daha fazla keşfedilmeyi bekliyor, ancak hem metabolik hem de epigenetik manzaraların potansiyel katılımı, bu metabolik merkezi gelecekteki çalışmalarda araştırmak için heyecan verici bir yol haline getiriyor. Bu içgörüler, eğitimli bağışıklığın metabolik ve epigenetik bağlantılarının çözülmesine katkıda bulunarak, doğuştan gelen bağışıklığın sağlık ve hastalık üzerindeki etkisinin daha iyi anlaşılmasına olanak tanır. Sonuç olarak, daha iyi bir anlayış, doğuştan gelen bağışıklık süreçlerinin düzensizliği ile karakterize edilen hastalıklarda yeni tedavi hedeflerinin belirlenmesine yardımcı olacaktır.

Yazar Katkıları:

Kavramsallaştırma: AVF ve JD-A.; metodoloji: AVF, VACMK, VM ve JCA-B., MAG; biçimsel analiz: AVF, VACMK, VM ve JCA-B.; araştırma AVF, JCA-B., SK, LCJdB, SJCFMM, VPM ve BN; veri iyileştirme: AVF, VACMK, VM ve BN; yazma—orijinal taslak hazırlama, AVF; yazma—inceleme ve düzenleme: tüm ortak yazarlar; denetim: MAG, MGN ve JD-A.; fon temini: MAG ve MGN Tüm yazarlar makalenin yayınlanan versiyonunu okudu ve kabul etti.

Finansman:

JD-A. Hollanda Bilimsel Araştırma Kuruluşu (VENI hibe 09150161910024) tarafından desteklenmektedir. MGN. ERC Advanced Grant (833247) ve Hollanda Bilimsel Araştırma Kuruluşunun Spinoza Grant'i tarafından desteklenmektedir. AVF, Fundação para a Ciência ea Tecnologia (FCT, Ph.D. grant PD/BD/135449/2017) tarafından desteklenmektedir. JCAB, Kolombiya'daki İdari Bilim, Teknoloji ve Yenilik Departmanı COLCIENCIAS'tan bir hibe ile desteklenmektedir (Arama 756/2016). BN, bir NHMRC (Avustralya) Araştırmacı Bursu (APP1173314) tarafından desteklenmektedir.

Kurumsal İnceleme Kurulu Beyanı:

300BCG çalışması, yerel CMO bölgesi Arnhem-Nijmegen, NL58553.091.16 tarafından onaylandı.

Bilgilendirilmiş Onam Beyanı:

Çalışmaya katılan tüm deneklerden bilgilendirilmiş onam, etik kurul Arnhem-Nijmegen'in (nr. 2010-104) onayına göre alınmıştır.

Veri Kullanılabilirliği Bildirimi:

Bu çalışmada sunulan RNA sıralama verileri, GSE85243 erişim numarası altında NCBI Gene Expression Omnibus'ta mevcuttur.

Teşekkür:

Yazarlar, 300BCG çalışmasına katıldıkları için tüm gönüllülere teşekkür eder.

Çıkar çatışmaları:

MGN, TTxD'nin bilimsel kurucusudur. Geri kalan yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir. Finansörlerin çalışmanın tasarımında hiçbir rolü yoktu; verilerin toplanmasında, analiz edilmesinde veya yorumlanmasında; makalenin yazılmasında veya sonuçların yayınlanması kararında.

Referanslar

1. Netea, MG; Domínguez-Andrés, J.; Barreiro, LB; Chavakis, T.; Divangahi, M.; Fuchs, E.; Joosten, LAB; van der Meer, JWM; Mhlanga, MM; Mulder, WJM; et al. Eğitimli bağışıklığın tanımlanması ve sağlık ve hastalıktaki rolü. Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 375–388. [ÇaprazRef]

2. Quintin, J.; Saeed, S.; Martens, JHA; Giamarellos-Bourboulis, EJ; Ifrim, DC; Logie, C.; Jacobs, L.; Jansen, T.; Kullberg, BJ; Wijmenga, C.; et al. Candida albicans enfeksiyonu, monositlerin işlevsel olarak yeniden programlanması yoluyla yeniden enfeksiyona karşı koruma sağlar. Hücre Konağı Mikrop 2012, 12, 223–232. [ÇaprazRef]

3. Bekkering, S.; Quintin, J.; Joosten, Los Angeles; Van Der Meer, JW; Netea, MG; Riksen, NP Oksitlenmiş Düşük Yoğunluklu Lipoprotein, Monositlerin Epigenetik Yeniden Programlanması Yoluyla Uzun Süreli Proinflamatuar Sitokin Üretimini ve Köpük Hücre Oluşumunu İndükler. Arter. tromb. Vasc. Biol. 2014, 34, 1731–1738. [CrossRef] [PubMed]

4. Benn, CS; Netea, MG; Selin, LK; Aaby, P. Küçük Bir Jab-A Büyük Etki: Aşılarla Spesifik Olmayan İmmünomodülasyon. Trendler İmmunol. 2013, 34, 431–439. [ÇaprazRef]

5. Sanat, RJW; Novakoviç, B.; ter Horst, R.; Carvalho, A.; Bekkering, S.; Lachmandas, E.; Rodrigues, F.; Silvestre, R.; Cheng, SC; Wang, SY; et al. Glutaminoliz ve Fumarat Birikimi İmmünometabolik ve Epigenetik Programları Eğitilmiş Bağışıklıkta Entegre Eder. Hücre Metab. 2016, 24, 807–819. [CrossRef] [PubMed]

6. Keating, S.; Groh, L.; van der Heijden, C.; Rodriguez, H.; Dos Santos, J.; Fanucchi, S.; Okabe, J.; Kn, H.; Van Puffelen, J.; Helder, L.; et al. Set7 Lizin Metiltransferaz, Beta-Glukanın İndüklediği Eğitimli Bağışıklık için Gerekli Olan Oksidatif Fosforilasyonda Plastisiteyi Düzenler. Hücre Temsilcisi 2020, 31, 107548. [CrossRef] [PubMed]

7. García-Giménez, JL; Romá-Mateo, C.; Pérez-Machado, G.; Peiró-Chova, L.; Pallardó, FV Hastalıkta epigenetik mekanizmaların düzenlenmesinde glutatyonun rolü. Serbest Radikal. Biol. Med. 2017, 112, 36–48. [CrossRef] [PubMed]

8. Bekkering, S.; Blok, BA; Joosten, LAB; Riksen, NP; Van Crevel, R.; Netea, MG İnsanda Eğitimli Doğuştan Bağışıklığın İn Vitro Deneysel Modeli. klinik Aşı İmmünolü. 2016, 23, 926–933. [ÇaprazRef]

9. Sohrabi, Y.; Gecikme, SMM; Schnack, L.; Godfrey, R.; Kahles, F.; Bruemmer, D.; Waltenberger, J.; Findeisen, HM mTORBağımlı Oksidatif Stres, İnsan Monositlerinde oxLDL-İndüklenmiş Eğitimli Doğuştan Bağışıklığı Düzenler. Ön. immünol. 2019, 9, 3155. [CrossRef] [PubMed]

10. Van Der Heijden, CDCC; Keating, ST; Groh, L.; Joosten, LAB; Netea, MG; Riksen, NP Aldosteron, eğitimli bağışıklığı indükler: Yağ asidi sentezinin rolü. Kardiyovasküler Res. 2020, 116, 317–328. [ÇaprazRef]

11. Domínguez-Andrés, J.; Sanat, RJW; Bekkering, S.; Bahrar, H.; Blok, BA; de Bree, LCJ; Bruno, M.; Bulut, Ö.; Debisarun, PA; Dijkstra, H.; et al. Yapışık insan monositlerinde eğitimli bağışıklığın in vitro indüksiyonu. YILDIZ Protokolü 2021, 2, 100365. [CrossRef] [PubMed]

12. Novakoviç, B.; Habibi, E.; Wang, S.-Y.; Sanat, RJW; Davar, R.; Megchelenbrink, W.; Kim, B.; Kuznetsova, T.; Kox, M.; Zwaag, J.; et al. -Glucan, LPS'nin İndüklediği İmmünolojik Toleransın Epigenetik Durumunu Tersine Çeviriyor. Hücre 2016, 167, 1354–1368.e14. [ÇaprazRef]

13. Kostidis, S.; Addie, RD; Morreau, H.; Mayboroda, OA; Giera, M. Memeli hücrelerinin hücre içi ve hücre dışı metabolizmasının kantitatif NMR analizi: Bir öğretici. Anal. Chim. Açta 2017, 980, 1–24. [ÇaprazRef]

14. Koeken, VACM; de Bree, LCJ; Mourits, Başkan Yardımcısı; Moorlag, SJCFM; Yürü, J.; Ciroviç, B.; Sanat, RJW; Jager, M.; Dijkstra, H.; Lemmers, H.; et al. İnsanlarda BCG aşılaması, cinsiyete bağlı bir şekilde sistemik inflamasyonu inhibe eder. J. Clin. Araştırmak 2020, 130, 5591–5602. [ÇaprazRef]

15. İnsan Fonksiyonel Genomik Projesi. Çevrimiçi olarak erişilebilir: http://www.humanfunctionalgenomics.org/site/ (19 Nisan 2021'de erişildi).

16. Şah, TS; Liu, JZ; Floyd, JAB; Morris, JA; Wirth, N.; Barrett, JC; Anderson, CA OptiCall: Nadir, düşük frekanslı ve yaygın varyantlar için sağlam bir genotip çağırma algoritması. Biyoinformatik 2012, 28, 1598–1603. [ÇaprazRef]

17. Deelen, P.; Bağlayıcı, MJ; Van Der Velde, KJ; Westra, HJ; Sarıcı, E.; Hendriksen, D.; Franke, L.; Swertz, MA Genotip harmonizer: Genotip veri entegrasyonu için otomatik sarmal hizalama ve format dönüştürme. BMC Arş. Notlar 2014, 7. [CrossRef]

18. McCarthy, S.; Das, S.; Kretzschmar, W.; Delaneau, O.; Ahşap, AR; Teumer, A.; Kang, HM; Fuchsberger, C.; Danecek, P.; Keskin, K.; et al. Genotip ataması için 64.976 haplotipten oluşan bir referans paneli. Nat. Genet. 2016, 48, 1279–1283. [ÇaprazRef]

19. Shabalin, AA Matrix eQTL: Büyük matris işlemleri yoluyla ultra hızlı eQTL analizi. Biyoinformatik 2012, 28, 1353–1358. [ÇaprazRef]

20. Führer, T.; Heer, D.; Begemann, B.; Zamboni, N. Akış enjeksiyonu uçuş süresi kütle spektrometrisi ile hücresel ekstraktların yüksek verimli, doğru kütle metabolom profili. Anal. kimya 2011, 83, 7074–7080. [ÇaprazRef]

21. Kalafati, L.; Kourtzelis, I.; Schulte-schrepping, J.; Verginis, P.; Mitroulis, I. Granulopoiesis'in Doğal Bağışıklık Eğitimi, Anti-tümör Aktivitesini Teşvik Eder. Hücre 2020, 183, 771–785.e12. [ÇaprazRef]

22. Cheng, SC; Quintin, J.; Cramer, RA; Shepardson, KM; Saeed, S.; Kumar, V.; Giamarellos-Bourboulis, EJ; Martens, JHA; Rao, NA; Ağacanirefah, A.; et al. Eğitimli bağışıklığın metabolik temeli olarak MTOR- ve HIF-1 -aracılı aerobik glikoliz. Bilim 2014, 345, 1250684. [CrossRef]

23. Moorlag, SJCFM; Rodriguez-Rosales, YA; Gillard, J.; Fanucchi, S.; Theunissen, K.; Novakoviç, B.; de Bont, CM; Negishi, Y.; Fok, ET; Kalafati, L.; et al. BCG Aşılaması, İnsan Nötrofillerinin Uzun Süreli İşlevsel Yeniden Programlanmasına Neden Olur. Hücre Temsilcisi 2020, 33. [CrossRef]

24. Forrester, SJ; Kikuchi, DS; Hernandes MS; Xu, Q.; Griendling, KK Metabolik ve inflamatuar sinyalleşmede reaktif oksijen türleri. sirk. Res. 2018, 122, 877–902. [ÇaprazRef]

25. Brennan, MS; Matos, MF; Li, B.; Hronowski, X.; Gao, B.; Juhasz, P.; Rodos, KJ; Scannevin, RH Dimetil fumarat ve monoetil fumarat, in vitro olarak KEAP1, NRF2 aktivasyonu ve glutatyon tükenmesi üzerinde farklı etkiler sergiler. PLoS BİR 2015, 10, e0120254. [ÇaprazRef]

26. Kaufmann, E.; Sanz, J.; Dunn, JL; Han, N.; Mendonça, LE; Pacis, A.; Tzelepis, F.; Pernet, E.; Dumaine, A.; Grenier, J.-C.; et al. BCG, Tüberküloza Karşı Koruyucu Doğuştan Bağışıklık Oluşturmak için Hematopoietik Kök Hücreleri Eğitir. Hücre 2018, 172, 176–190.e19. [ÇaprazRef]

Anaisa V. Ferreira 1,2,* , Valerie ACM Koeken 1,3,4 , Vasiliki Matzaraki 1 , Sarantos Kostidis 5 , Juan Carlos Alarcon-Barrera 5 , L. Charlotte J. de Bree 1 , Simone JCFM Moorlag 1 , Vera P Mourits 1 , Boris Novakovic 6,7, Martin A. Giera 5 , Mihai G. Netea 1,8 ve Jorge Domínguez-Andrés.

1 Dahiliye Bölümü ve Radboud Bulaşıcı Hastalıklar Merkezi (RCI), Radboud Üniversitesi Nijmegen Tıp Merkezi, 6500 HB Nijmegen, Hollanda;

Valerie.Koeken@radboudumc.nl (VACMK); Vasiliki.Matzaraki@radboudumc.nl (VM);

Charlotte.deBree@radboudumc.nl (LCJdB); Simone.Moorlag@radboudumc.nl (SJCFMM);

Vera.Mourits@radboudumc.nl (VPM); Mihai.Netea@radboudumc.nl (MGN).

2 Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade do Porto, 4050-313 Porto, Portekiz.

3 TWINCORE, Helmholtz-Centre for Infection Research (HZI) ve Hannover Medical School (MHH), 30625 Hannover, Almanya arasındaki bir ortak girişim.

4 Bireyselleştirilmiş Enfeksiyon Tıbbı Merkezi (CiiM), Bireyselleştirilmiş Enfeksiyon Tıbbı için Hesaplamalı Biyoloji Bölümü, Helmholtz-Centre for Enfeksiyon Araştırması (HZI) ve Hannover Tıp Okulu (MHH), 30625 Hannover, Almanya arasındaki bir ortak girişim.

5 Proteomik ve Metabolomik Merkezi, Leiden Üniversitesi Tıp Merkezi (LUMC),2333 ZA Leiden, Hollanda; s.kostidis@lumc.nl (SK); jcalarcon_barrera@lumc.nl (JCA-B.);m.a.giera@lumc.nl (MAG)

6 Epigenetics Research, Murdoch Children's Research Institute, Parkville, VIC 3052, Avustralya;boris.novakovic@mcri.edu.au.

7 Pediatri Bölümü, Melbourne Üniversitesi, Melbourne, VIC 3052, Avustralya.

8 Genomik ve İmmün Düzenleme Bölümü, Yaşam ve Tıp Bilimleri Enstitüsü (LIMES), Bonn Üniversitesi, 53115 Bonn, Almanya.

* Yazışma: anaisa.validoferreira@radboudumc.nl (AVF); Jorge.dominguezandres@radboudumc.nl (JD-A.); Tel.: artı 31-2436-16636 (JD-A.).

For more information:1950477648nn@gmail.com