Graham-2023-Öğrenim Benzersiz Metni Sağlar

Soyut:
Öğrenme, işitsel kortekste birden fazla zaman ölçeğinde nörofizyolojik esnekliği tetikleyebilir. İşitsel kortikal fonksiyonda günler, haftalar ve hatta ömür boyu devam eden kalıcı değişiklikler, öğrenmenin tetiklediği gen ekspresyonunu gerektirir. Gerçekten de novo transkripsiyon, geçici deneyimlerin davranış üzerinde kalıcı bir etki bırakacak şekilde uzun vadeli anılara dönüşüp dönüşmeyeceğini belirleyen moleküler bir belirleyicidir.

Bilim ve teknolojinin sürekli gelişmesiyle birlikte, insan yaşamının seyri boyunca, araştırma açısından en değerli olanı hafıza olan birçok büyülü yaşam olgusu ortaya çıkmıştır. Bellek, insanın gelişmiş sinirsel aktivitesinin önemli bir parçasıdır ve aynı zamanda insanın evriminden bu yana meydana gelen çeşitli olayların kaydı ve birikimidir. Peki gen ifadesi ile hafıza arasında bir ilişki var mı? Cevap Evet.

Öncelikle genlerin hafıza üzerindeki etkisi açıktır. Tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler) ve diğer yöntemlerle hafızayla ilgili çeşitli moleküllerin ve proteinlerin ekspresyonunu düzenleyebilir. Bu, nöronlar arasındaki iletişim verimliliğini etkileyebilir, dolayısıyla kişinin bilişsel, kavramsal, duygusal ve diğer özelliklerini etkileyerek hafızanın kalitesini gösterebilir.

İkincisi, hafızanın gen ifadesi üzerinde de belirli bir etkisi olabilir. Öğrenme, hafıza ve düşünme sürecimizde sadece beynin sinirsel aktivitesinde meydana gelen değişiklikler değil aynı zamanda birçok gen ve molekülün düzenlenmesi ve müdahalesi de söz konusudur. Bu genlerin ve moleküllerin düzenlenmesi, uzun süreli hafızamızda var olan duygu ve deneyimlere karşılık gelen izleri kaydedecek ve sonunda genlerde depolanacaktır.

Son olarak, olumlu tutum ile uzun süreli hafıza yeteneği arasında karşılıklı bir bağımlılık vardır. Mutlu bir ruh hali, öğrenme ve düşünme sürecinde daha fazla odaklanmamıza ve konsantre olmamıza yardımcı olarak hafıza yeteneğinin gelişmesine yardımcı olabilir. Uzun vadeli kasıtlı hafıza aynı zamanda beyinde yeni sinirsel bağlantıların ve yapıların oluşumunu da teşvik edebilir; bu da gelecekteki öğrenme ve hafıza için çok faydalıdır.

Dolayısıyla gen ifadesi ile hafıza arasında bir ilişki olduğu sonucuna varabiliriz. Bilinçli hafıza, iyimserlik ve pozitif düşünme yoluyla hafıza yeteneğimizi geliştirebilir ve geliştirebiliriz; bu aynı zamanda daha iyi fiziksel ve zihinsel sağlığa ulaşmamıza da yardımcı olabilir. Ancak bu şekilde topluma ve insani gelişmeye daha iyi hizmet edebiliriz. Belleği geliştirmemiz gerektiği görülebilir ve Cistanche Deserticola hafızayı önemli ölçüde geliştirebilir çünkü Cistanche Deserticola, birçok benzersiz etkiye sahip olan geleneksel bir Çin tıbbi malzemesidir ve bunlardan biri hafızayı geliştirmektir. Kıymanın etkinliği asit, polisakkaritler, flavonoidler vb. dahil olmak üzere içerdiği çeşitli aktif bileşenlerden gelir. Bu bileşenler beyin sağlığını çeşitli şekillerde geliştirebilir.

Belleği geliştirmek için ekleri bil'e tıklayın

Ancak işitsel öğrenmeyi, hafızayı ve edinilmiş sese özgü davranışı destekleyen işitsel kortikal genler büyük ölçüde bilinmemektedir. Bu rapor, işitsel hafızanın oluşumunun altında yattığı düşünülen işitsel korteks içindeki öğrenmeye bağlı gen ifadesindeki genom çapında değişiklikleri tanımlayan ilk rapordur. RNA dizilemesinden elde edilen gen zenginleştirme profilleri üzerine yapılan biyoinformatik analizler, kolinerjik sinapsları ve nöroaktif reseptör etkileşimlerini içeren biyolojik yolları tanımladı.

Bulgular, yetişkin beyninde uzun vadeli işitsel hafızanın oluşumunu destekleyen kortikal fonksiyondaki değişikliklerin altında yatan anahtar aday efektörleri karakterize ediyor. Tanımlanan moleküller ve mekanizmalar, yetişkinlikte işitsel fonksiyonda uzun vadeli ve sese özgü değişiklikleri kolaylaştıracak potansiyel terapötik hedeflerdir ve şimdi gelecekteki gen hedefli araştırmalar için önceliklidir.

El yazması:

Öğrenme ve bellek alanında kabul gören bir kavram da anıların işlendiği yerde saklanmasıdır (Nadel ve Hardt, 2011). Bellek konsolidasyonu olarak bilinen biyolojik olaylar, duyusal bir deneyimin uyandırdığı geçici sinirsel temsilleri stabilize edebilir (Lechner, Squire ve Byrne, 1999; McGaugh, 2000; Dudai, 2012). Bellek konsolidasyonunu başlatan temel ve evrimsel olarak korunmuş mekanizmalar, sırasıyla genlerin ve bunların ardından gelen protein ürünlerinin aktif ifadesi olarak tanımlanan transkripsiyon ve translasyondur (Alberini ve Kandel, 2014; Costa-Mattioli ve diğerleri, 2009).

Ses ayrımcılığını öğrenmenin işitsel kortekste de novo gen ifadesini tetiklediğini varsaydık. Ses işaretlerinin son derece spesifik temsilleri, daha sonra sesli işaret davranışını yönlendiren uzun süreli hafızada (saatlerden günlere) birleşerek deneyimin geçiciliğinden (saniyeler ve dakikalar) daha uzun süre dayanabilir. Ayırt edici bölgesel transkriptomik profillerin hafıza konsolidasyonundan sorumlu olduğu düşünülürken (Katzman ve diğerleri, 2021), merkezi işitsel sistemde hafıza oluşumunu destekleyen öğrenmenin neden olduğu transkripsiyon olayları ciddi şekilde az açıklanmıştır.

Bunun aksine, işitsel korteks, özellikle alıcı alanlar ve tonotopik haritalardaki nörofizyolojik değişiklikler düzeyinde işitsel öğrenme ve hafızaya ilişkin çalışmalarda son derece iyi tanımlanmıştır (Schreiner ve Polley, 2014; Weinberger NM, 2015; Pienkowski ve Eggermont, 2011), kortiko- kortikal ve kortiko-fugal bağlantı (Souffi ve diğerleri, 2021; Lesicko ve Geffen, 2022; Schreiner ve Polley, 2014; Liu ve diğerleri, 2011; Xiong, Znamenskiy ve Zador, 2015), birden fazla zaman ölçeğinde (Froemke ve Martins) , 2011; Froemke ve Schreiner, 2015; Fritz, Elhilali, David ve Shamma, 2007;Tchernichovski ve Margoliash, 2013). Dahası, nörofizyolojik değişiklikler, örneğin işarete yönelik eylem (Letzkus, Wolff ve Lüthi, 2015), dikkat (Fritz ve diğerleri, 2007;Elhilali ve diğerleri, 2007) ve ses sinyalleri için hafıza (Bieszczad ve Weinberger 2010; Grosso ve diğerleri,2015; Aschauer ve Rumpel, 2016; Concina, Renna, Grosso ve Sacchetti, 2019; Letzkus, Wolff, &Lüthi, 2015; Ghosh ve Zador, 2021).

İşitsel kortekste öğrenmeye bağlı nörofizyolojik plastisiteye dair onlarca yıldır elde edilen kanıtlar, işitsel hafızanın ortak davranışsal özelliklerini göstermiştir (Weinberger 2007a; 2007b), bu da burayı işitsel hafıza birleştirme için en iyi aday bölge haline getirmektedir. İşitsel korteksi biyoinformatik olarak araştırarak, adaptif işitsel fonksiyonun altında yatan nöroplastisitenin beyin çapında ortak veya farklı biyolojik bekçilerini ortaya çıkarmak için tarafsız bir fırsattan da yararlanıyoruz. Daha geniş bir perspektiften bakıldığında, bölgesel transkriptomik profilleme, duyusal sistemin hafıza hizmetindeki deneyimlerle nasıl değiştirildiğinin daha iyi anlaşılmasına yol açabilir.

İşitsel kortekste tanımlanan öğrenme kaynaklı transkriptomik profiller, uyarlanabilir işitsel işlemeyi destekleyen veya bozan yeni biyolojik süreç modellerini doğrulayabilir, genişletebilir veya bunlara yol açabilir. İşitsel hafızanın sağlamlaştırılması muhtemelen işitsel korteks içindeki hücresel fonksiyonları etkileyen gen ekspresyonundaki deneyime bağlı değişikliklerin bir ürünüdür ve bu da sesle uyarılan nörofizyolojik tepkilerde sesle uyarılan davranışları değiştiren kalıcı değişiklikleri teşvik eder.

Öğrenmenin neden olduğu transkriptleri tanımlamak için, anatomik olarak tanımlanmış işitsel korteks (Bregma -3.10 mm, Interaural 6.90 mm; Paxinos & Watson, 2007) örnekleri üzerinde RNA dizilimi (RNAseq) kullanılarak ifade profili oluşturma analizi gerçekleştirildi. ) su kısıtlaması olan yetişkin sıçanlardan, bar press için eğitilmiş, su ödülleri için saf tonlara kadar. Hedef saf ton frekansına (5,0 kHz; 65 dB SPL) verilen yanıtlar ödülle sonuçlanırken, hedef olmayana (11,5 kHz; 65 dB SPL) verilen yanıtlar ödüllendirilmedi ve bir sonraki denemeye kadar süreyi uzatan bir mola süresi başlattı.

Bu iki tonlu ayrım görevi (2TD) algısal olarak zor değildir; akustik frekanslar bir oktavın üzerindedir ve kemirgenler tarafından kolaylıkla ayırt edilebilir (Talwar & Gerstein, 1998). Daha doğrusu, davranışsal zorluk ilişkiseldi: 2TD performansı, hangi tonun ödülle ilişkili olduğu (ödülsüzlüğe karşı) hafıza gerektirir. Eğitimli fareler (N=8), art arda üç günlük 45-dakikalık 2TD eğitim seansından sonra feda edildi ve bir grup ses konusunda deneyimsiz fareyle (N=4) ​​karşılaştırıldı. Bu, hayvanların hâlâ 2TD görevini edindiği, eğitimin başlarındaki bir zaman noktasıdır. Erken görev edinimi, haftalar süren eğitim boyunca davranışta gözlemlenen 2TD performansındaki daha sonraki artışlara zemin hazırlayan ilk öğrenmenin neden olduğu transkripsiyon olaylarını yakalamak için hedeflendi.

Örneğin, ortalama performans şansın üzerindeydi, ancak 3 gün sonra yalnızca %66±7,81, uzun süreli eğitimden sonra ise %90'dan büyük veya eşitti (Shang, Bylipudi, &Bieszczad, 2019). Başarılı sese özgü ilişkisel hafızayla ilgili genlerin ekspresyonunu tanımlama fırsatından yararlanmak için, öğrenme ve hafıza oluşumunda aktiviteye bağlı gen ekspresyonunun epigenetik düzenlemesini hedefleyen bir HDAC inhibitöründen yararlandık (McQuown ve diğerleri, 2011; Kwapis, et. diğerleri, 2017; Malvaez ve diğerleri, 2012). Daha da önemlisi, on yıllık bir çalışma, HDAC inhibisyonunun sesle uyarılmış işitsel kortikal tepkilerde (araca göre) öğrenmenin neden olduğu nörofizyolojik plastisiteyi kolaylaştırabildiğini ve işitsel ayırt edici davranışları geliştirebildiğini göstermiştir (Bieszczad ve diğerleri, 2015; Phan ve diğerleri, 2017; Shang, Bylipudi, &Bieszczad, 2019; Rotondo & Bieszczad, 2020; Rotondo & Bieszczad 2021a; 2021b) insanlık dışı olanlar dahil (Gervain, vd., 2013).

Eğitilen hayvanların yarısına HDAC inhibitörü RGFP966 (N=4; 10 mg/kg, ApexBio, cat#A8803; sub. cu. enjeksiyon) uygulandı. diğer yarısı ise aynı şekilde eğitilmiş ancak araç solüsyonu uygulanmış (N=4; eşleşen hacim, sub. cu. enjeksiyon; Şekil 1a). Beyin toplama sırasında gruplar arasında 2TD performansı açısından herhangi bir fark yoktu (RGFP966: %61±5,0 vs. Araç: %71±7,0; t(5,9166)=-1,21, p=0,272 ; Welch'in t-testi). Beyinler derhal toplandı ve HDAC inhibitörünün veya aracın seans sonrası enjeksiyonundan bir saat sonra, işitme korteksindeki inhibitörün en yüksek konsantrasyonuyla tutarlı bir zaman noktasında aniden donduruldu (Bieszczad ve ark., 2015).

Buradaki bulgular, işitsel korteks içindeki ilişkisel öğrenmenin transkriptomik profilini tanımlayan ilk bulgulardır. İki tonlu ayrımcılık görevinde öğrenme, yüzlerce genin transkripsiyon seviyelerinde değişikliklere neden oldu (sessiz olanlarla karşılaştırıldığında) (Şekil 1b). Hiyerarşik bir kümeleme algoritması, genlerin benzersiz bir şekilde yukarı veya aşağı regüle edildiğini gösterdi; bu, işitsel öğrenmenin neden olduğu karmaşık bir kortikal gen ekspresyon olayları ağını ortaya çıkardı (Şekil 2a).

Zenginleştirme analizleri (iPathwayGuideTM; Etki Analizi yöntemi), kolinerjik sinapsı (diferansiyel olarak eksprese edilen genler (DEG) / tüm genler (ALL): 22/101; p=0.004, Bonferronik düzeltme) üst biyolojik yol olarak tanımladı (Tablo 1) . Bu sonuç, nörofizyolojik esneklik ve ilgili işitsel davranış için işitsel korteksteki kolinerjik sinyallemenin yeterliliğini vurgulayan 1990'lardan bu yana yapılan araştırmalarla tutarlıdır (Froemke ve Martins, 2011; Weinberger, 2003; Bakin ve Weinberger, 1996; Kilgard ve Merzenich, 1998). HDAC inhibisyonu altında öğrenmeyle indüklenen transkript seviyeleri ya aynı yönde güçlendirildi (benzersiz gen transkript seviyelerinde daha fazla artış veya daha fazla azalma yoluyla) (Şekil 2b) veya tek başına öğrenmeye kıyasla körleştirildi (Şekil 2c). Bu koşullar altında en önemli biyolojik yollardan biri, sinirsel aktivasyon için hayati öneme sahip efektörleri içeren Nöroaktif ligand-reseptör etkileşimiydi (DEG/ALL: 30/194; p=0.016; Tablo 1).

Diğer bir üst yol ise hücre dışı matris reseptörü (ECM-reseptör) etkileşimiydi (DEG/ALL: 14/69; p=0.04; Tablo 1). ECM'nin bileşenleri kortikal esneklik ve hafıza konsolidasyonu için kritik öneme sahiptir (Happel ve diğerleri, 2014; Banerjee, ve diğerleri, 2017; El-Tabbal, ve diğerleri, 2021; Sonntag, ve diğerleri, 2015). Bu yollar, işitsel fonksiyonda kalıcı deneyime bağlı değişiklikleri kolaylaştırabilen kolinerjik sinyallemeye belki de tamamlayıcı olan potansiyel alternatifler sunar (Ji, Gao ve Suga, 2001; Luo ve Yan, 2013; Metherate, 2011). İfadeleri işitsel öğrenmeyle değişen ancak HDAC engellemesiyle daha fazla değişmeyen diğer genler, sese özgü çağrışımsal hafızadan ziyade muhtemelen görevin prosedürel koşullarıyla ilişkiliydi. Örneğin, beyinde su alımının homeostatik düzenlenmesi için önemli olan apelin sinyal yolu belirlendi (DEG/ALL: 20/116; p=0.0005). İki eğitimli sıçan grubu (HDAC inhibisyonu ile veya HDAC inhibisyonu olmadan öğrenen) arasındaki transkript seviyelerinin doğrudan karşılaştırılması, çok az sayıda benzersiz şekilde diferansiyel olarak eksprese edilen gen (DEG'ler) gösterdi.

Yalnızca Adamts13, U6, Rexo4 ve Cabin1'in farklı şekilde ifade edildiği bulunan (p =0.05) en olası DEG'leri (p =0.05) tanımlamak için kayda değer bir şekilde kullanılan bir eşik (Şekil 2d). Bu nedenle, HDAC inhibisyonunun ana etkisi, Sese özgü hafızayı desteklemek için yeni benzersiz genleri işe almak yerine, normal koşullar altında işitsel öğrenmeyle indüklenen genlerin ifadesini modüle eder. Birlikte, bu bulgular, yetişkin hayvanların ses ipuçları arasındaki ilişkisel ilişkileri ayırt etmeyi öğrenmesi sırasında, eğitimin başlarında işitsel kortekste büyük ölçekli transkriptomik değişikliklerin meydana geldiğini göstermektedir. İşitsel fonksiyonu desteklemek için HDAC inhibisyonunun yerleşik nörofizyolojik ve davranışsal raporlarıyla birlikte bu bulgular, ekspresyonu işitsel hafıza oluşumunun başarısını belirleyen genleri ayırt etmek için bir HDAC inhibitörünün kullanılması taktiğini desteklemektedir.

Gen hedefli bir yaklaşımla genom çapında dizilimi doğrulamak için biyolojik yollardaki zenginleştirme analizlerinden çeşitli ilgi çekici genler (GOI'ler) seçildi. Örnekler, eğitilmiş ve tedavi edilmiş iki hayvan grubunu aynı erken dönemde kopyalayan ayrı kohortlardan toplandı. kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) kullanılarak gen ekspresyonu analizinde kullanılmak üzere eğitim zaman noktası (yani üçüncü 2TD eğitim oturumundan bir saat sonra). Tekrarlanan kohortlarda 2TD performans farkı yoktu (RGFP9661: %61±5.0 vs. RGFP9662: %67±6.0; t(8.441)=-0.834, p {{20}}.4274 ve Araç1:71±6.0%'ye karşı Araç2: %74±3.0; t(4.0809)=-0.444, p {{ 34}}.6796; Welch'in t-testi).

İlk GOI, öğrenmenin ilk saatlerinde zirveye ulaştığı bilinen ve hafıza oluşumu için kritik olduğu bilinen, iyi çalışılmış, aktiviteye bağlı bir "hemen-erken gen" olan Egr1'di (Duclot ve Kabbaj, 2017). Bu, gen hedefli çalışmada ayrı bir hayvan kohortunda HDAC inhibisyonu ile aynı şekilde güçlendirilmiş ekspresyon artışı doğrulanmış, üst düzeyde öğrenmeyle indüklenen bir gendi (Şekil 3). Aynı şey beyindeki sirkadiyen ritimlerin ve serotoninerjik yolların düzenlenmesinde rol oynayan bir gen olan Per2 için de geçerliydi (Bae, ve diğerleri, 2001; Albrecht, ve diğerleri, 2001; Cuesta ve diğerleri, 2009; Reh, ve diğerleri. ,2020). Per2, diğer beyin bölgelerindeki HDAC modülasyonuyla bağlantılı olan "saat geni" ailesinin bir parçasıdır (Kwapis ve diğerleri, 2018) ve işitsel işlevlerde de rol oynayabilir (Reh ve diğerleri, 2020). Buna karşılık, genom çapında tanımlanan bazı GOI'ler yalnızca kısmen doğrulandı.

Chrna7, nörofizyolojik kanıtlarla tutarlı olarak işitsel öğrenmeyle aşağı regüle edildiği tespit edilen dinamik nikotinik asetilkolin reseptörünün (nAChR) bir alt birimini kodlar (Takesian, ve diğerleri, 2018; Kuchibhotla, ve diğerleri, 2017). Bu nedenle, gen hedefli çalışmanın tüm 2TD ile eğitilmiş hayvanlarda Chrna7 aşağı regülasyonunu doğrulamasını bekledik, ancak aşağı regülasyon yalnızca HDAC inhibisyonu olmadan 2TD'yi öğrenen araçla tedavi edilen hayvanlarda belirgindi. Seçilen ilave GOI'ler, RGFP966'nın seçici HDAC hedefinin diğer beyin bölgelerindeki aşağı yöndeki etkilerini yaymak için gerekli olduğu bildirilen hemen erken genler olan Nr4a yetim nükleer reseptör ailesinden Nr4a1 ve Nr4a2'dendi (McQuown ve diğerleri, 2011; Kwapis, ve diğerleri). ., 2019).

Nr4a ailesi gen ekspresyonundaki göreve bağlı bölgesel farklılıklara ilişkin önceki raporlarla tutarlı olarak (McNulty, ve diğerleri, 2012), işitsel öğrenmeden sonra işitsel kortekste Nr4a1'de yukarı regüle edildi, ancak Nr4a2 değil. Diğer DEG'ler, Htr1a veya Adamts13, muhtemelen özel tasarlanmış gen hedefli problarımız tarafından tespit edilmeyen bilinen transkript varyantlarındaki farklılıklar nedeniyle veya tip I hata nedeniyle veya eğitimli hayvan grupları arasındaki ince davranış farklılıkları nedeniyle gen hedefli çalışma tarafından doğrulanmadı. 2TD performans ölçümlerinde tespit edilemedi. Ayrıca, muhtemelen kolinerjik ve serotonerjik modülasyon üzerindeki etkisi nedeniyle duyusal korteksteki "kritik dönem" benzeri plastisiteyi yeniden açmak için uzun bir işlev geçmişine sahip bir gen olan Lynx1'i de araştırdık (Morishita ve diğerleri, 2010). , 2018). Ancak tespitinde başarısız olan önceki genom çapındaki raporlarla tutarlı olarak (Kalish ve diğerleri, 2020), ne RNAseq veri setimizde ne de gen hedefli bir çalışmada tespit edildi.

Tutarsızlıkların hayvanlar arasındaki gerçek biyolojik veya bireysel değişkenlik ile mi yoksa düşük bolluk veya hücre tipine spesifik eksprese eden transkriptlerle teknik değişkenlik nedeniyle mi açıklanabileceğini belirlemek zor olsa da, bazı GOI'ler için olağanüstü tutarlı sonuçlar rapor ediyoruz. Chrna7, Egr1 ve Per2'nin öğrenme kaynaklı ifadesi gen hedefli ve genom çapındaki yaklaşımlar arasında ve farklı eğitimli hayvan grupları arasında tutarlı olduğundan, bu genlerin kalıcı değişiklikler için en temel oyunculardan biri olabileceği mantıklıdır. işitsel işlev ve hafıza şu anda gelecekteki araştırmalar için birincil öneme sahiptir.

Birlikte ele alındığında bulgular, yetişkin işitsel korteksinde, nörofizyoloji ve davranışta ortaya çıkan işitsel işlevi destekleyebilecek dinamik bir transkripsiyon manzarasını ortaya koymaktadır. Duyusal sistem işlevi üzerindeki epigenetik kontrollerin giderek artan kanıtları göz önüne alındığında (cf, Shang &Bieszczad, 2022), bu konuyu dikkate almak heyecan vericidir. Epigenetik mekanizmaların işitsel kortikal devrelerin deneyime bağlı esnekliği ile stabiliteyi dengelemede nasıl bir rol oynadığı. Örneğin, mevcut genom çapındaki veri seti aynı zamanda arepresif histon deasetilaz, Hdac9'un ifadesinde, HDAC inhibisyonunda bulunmayan, öğrenmenin neden olduğu bir azalmayı da tanımladı.

Azalan HDAC9 ekspresyonunun etkisini, öğrenmenin tetiklediği transkripsiyonu teşvik etmek için HDAC'leri farmakolojik olarak inhibe etmenin etkisine benzetmek cazip gelebilir. Epigenetik düzenleyicilerin bir diğer önemli sınıfı histonlardan ziyade DNA'yı değiştirir. Örnekler, her ikisi de DNA metilasyonunu etkileyen (Bayraktar ve Kreutz, 2018) ve HDAC inhibisyonu altında öğrenmeyle sırasıyla aşağı ve yukarı regüle edildiği tespit edilen Tet1 ve Gadd45b'dir. Ayrıca, HDAC inhibisyonu ile öğrenmeyle indüklenen en üst biyolojik yol olarak bir mikroRNA sınıfı ortaya çıktı (bkz. Tablo 1), bu alanda nöral transkripsiyonel kontrolün temel epigenetik düzenleyicileri olarak ilgi kazandı (Saab ve Mansuy, 2014). Epigenetik oyuncular ile ifade edilen genlerin protein ürünleri arasında daha yüksek düzeyde moleküler etkileşimlerin olması da muhtemeldir. Örneğin, tanımlanan yukarı regüle edilmiş Egr1, aşağı yöndeki genleri aktive etmek için baskılayıcı metilasyon işaretlerini ortadan kaldırmak üzere Tet1'i işe alabilir (Sun ve diğerleri, 2019). Öğrenme sırasında işitsel sistemdeki epigenetik düzenleyiciler arasındaki etkileşimlerin önemini çözümlemek için daha ileri moleküler çalışmalara ihtiyaç duyulacaktır. Üstelik bu rapor, seçilmiş işitsel kortikal genler ve bunların aşağı yönlü efektörleri arasında bağlantı kurmak için acil bir fırsat sunuyor.

Bu genler ve moleküller arasındaki boşluğun sesle uyarılan nörofizyolojik olaylar üzerindeki etkileri arasında köprü kurmak, yetişkin işitme sisteminin davranışı değiştirmek için deneyimle nasıl uyum sağladığını anlamak için çok önemlidir. Aslında, davranışsal işlevlerde uzun vadeli değişiklikler için de novo transkriptlerin çevirisi gereklidir, çünkü hücresel işlevlerde kalıcı değişiklikler üretirler. Örneğin, öğrenmenin tetiklediği transkripsiyonel süreçlerin temel hedef efektörleri, sesi belirleyen devreler içindeki kanalların veya reseptörlerin kullanılabilirliğini değiştirebilir (Metherate, Intskirveli ve Kawai, 2012; Brown ve Kaczmarek, 2011; Henton, Zhao ve Tzounopoulos, 2023). işitsel sistemde uyarılmış eşik, duyarlılık ve alıcı alan mimarisi. Farklı işitsel görevlerin, görevle ilgili ses özelliği veya görev yapısı için öğrenmeyi destekleyecek belirli hücresel işlevlerle ilgili biyolojik yollar için benzersiz gen ağlarını işe alacağını varsaymak mantıklıdır.

Genel olarak bu rapor, öğrenme, yetişkin ve işitsel korteksteki RNAseq veri kümelerini kullanılabilir hale getirmek için bir başlangıç ​​noktası görevi görür (bkz. Veri Havuzu). Yetişkin işitsel korteksindeki moleküler genetik süreçlere odaklanan çalışmaların ciddi eksikliği nedeniyle daha da kötüleşen bilgi açığını daraltma çabası artık memnuniyetle karşılanıyor. Özellikle modern Omics teknolojileri hızlı bir şekilde gelişip geliştiğinden, hassasiyeti teknik olarak okuma derinliğiyle de sınırlı olan (Li & Wang, 2021) toplu RNA dizilemesinin uzay-zamansal sınırlamalarının ötesinde çalışmayı teşvik ediyoruz.

İşitsel korteksteki araştırmalar, moleküler genetikte temel moleküler basamakları (Schicknick ve diğerleri, 2008), izin veren IEG profillerini (Mello, Velho ve Pinaud, 2006; de Hoz, ve diğerleri, 2018) tanımlayan bazı ilk adımları atmış olsa da ; Peter, et al., 2011) ve hatta kromatindinamik (Peter, et al., 2021), transkripsiyon dinamiğinin güzel bir şekilde çalışıldığı işitsel çevrede emsaller vardır (Kwan, 2016; Barta, et al., 2018; Li, et al., 2018). diğerleri, 2020; Ebeid ve diğerleri,2017). Tek hücreli RNA dizilimi (RNA-Seq) ve küçük moleküllü floresan yerinde hibridizasyon (smFISH) gibi mevcut moleküler araçlar, deneyime bağlı hücreden hücreye varyasyona ve işitsel kortikal hücreler ve devreler içindeki moleküler etkileşimlere ilişkin içgörü sağlamak için faydalı olacaktır. Toplu RNAseq'in aksine, bu yöntemler, işitsel korteksteki katmana özgü mikro devreler ve lemniskal topografya gibi derin hücresel çeşitliliği ve üst düzey organizasyonu onurlandırır.
Yalnızca yakın zamanda aktif olan işitsel kortikal hücrelerden gelen transkriptleri etiketlemek ve sıralamak için akıllı yaklaşımlar (Cho, Huang ve Gray, 2016), işlevsel olarak en alakalı hücre türleri ve popülasyonlarından işlevsel olarak en alakalı gen setlerini sağlam bir şekilde elde etmek için duyarlılığı yeterince artırabilir. Benzer yaklaşımlar, korteksteki aktiviteye bağlı bölgesel transkriptomik profilleri yakalamak ve farklı dinleme koşulları veya davranışsal talepler altında işitsel sistemin kortikal altı işleviyle kortikalin inanılmaz entegrasyonunu onurlandırmak için subkortikal olarak da kullanılabilir. Yetişkin beyninde işitsel öğrenmenin altında yatan genetik ve moleküler mekanizmalardaki hücresel ve bölgesel ayrımların tam olarak karakterize edilmesi, yaşam boyu belirli işitme ve dinleme yeteneklerini desteklemek için sağlam ve kalıcı fonksiyonel değişikliklere olanak tanıyan bölge seçici ve molekül hedefli hassas terapötiklerin geliştirilmesi için çok önemlidir.

Yöntemler

Denekler: Davranışsal ve moleküler deneylerde toplam 24 yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçanı (varışta 250 – 300 g; Charles RiverLaboratories, Wilmington, MA) kullanıldı. Tüm hayvanlar ayrı ayrı sıcaklık kontrollü (24 °C) bir koloni odasında 12-saatlik aydınlık/karanlık döngüsünde barındırıldı. Deneklerin davranışsal eğitimden önce yiyecek ve suya istedikleri kadar erişimleri vardı. Tüm prosedürler, Rutgers, New Jersey Eyalet Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (IACUC) yönergelerine göre onaylanmış ve yürütülmüştür (Protokol No.:999900026 (KMB)).

Davranış aparatı ve ses uyaranları: Tüm davranış seansları, sesi azaltılmış bir kutu içindeki iki özdeş aletli koşullandırma odasında (H{{0}}TC-NSF; Coulbourn Instruments, Holliston, MA) gerçekleştirildi. Her iki odaya da eşit düzeyde maruz kalmanın sağlanması için günlük eğitim oturumları dengelendi. Her bölme (12" G x 10" D x 12" Y; tel örgü zemini) bir tepki kolu (H21-03R), evin ışığı (H11-01R), bir hoparlör (H{ {8}}R) ve bir su dağıtım sistemi (H14-05R). Eğitim aşamaları sırasında hayvanlar, bir su bardağının (~0,02cc) sunumunu tetikleyen tepki koluna ("barpress") basabilirler. ödül portunda (1,25"G x 1,625" Y). Erken seans sırasında hayvanın bara basma tepkisini şekillendirmek ve su bardağının sunumunu tetiklemek için bir el düğmesi (H21-01) kullanıldı. Çevrimdışı analiz için Graphic State 4 yazılımı (CoulbournInstruments, Holliston MA) kullanılarak davranışsal tepkiler kaydedildi.

Tüm işitsel uyaranlar Tucker-Davis Technologies (TDT, Alachua, FL) ve RPvdsEx yazılımı kullanılarak oluşturuldu ve operant odasının duvara monte hoparlörü aracılığıyla sunuldu. Beyaz gürültü (prosedür eğitimi sırasında; Şekil 1a) 7 veya 9 saniye süreyle sunuldu (75 dB SPL). Saf tonlar (iki tonlu ayrım eğitimi sırasında; Şekil 1a) her zaman 8 saniye (70 dB SPL) süreyle sunuldu. Ses seviyeleri, dijital bir ses ölçer (Larson DavisSoundTrack LxT1) kullanılarak günlük olarak kalibre edildi.

HDAC3'ün davranışsal eğitimi ve farmakolojik inhibisyonu: Bir günlük vivaryuma alıştıktan sonra, sıçanlar en az 3 gün boyunca her gün muameleye tabi tutuldu. Davranış eğitiminin başlamasından önce, sıçanlar, aynı yaştaki kontrol hayvanlarının kısıtlamasız ağırlığının %85'ine ulaşana kadar kısıtlı su içeren bir programa yerleştirildi. Daha sonra su kısıtlamalı sıçanlar, su ödülleri için baskı yapmak üzere ses zayıflatılmış bölmelerin içinde şekillendirildi (Şekil 1a). Barpress şekillendirme ve ardından gelen ses eğitimi, daha önce tanımlandığı gibiydi (Shang, Bylipudi ve Bieszczad, 2019). Kısaca, tüm hayvanlar 5 gün boyunca barpress yapacak şekilde şekillendirildi ve ardından bu aşamada barpress'e ses çıkarmayı öğrenmek için prosedürel bir görevde eğitildi. bir su ödülü elde etmek için geniş bantlı bir Gauss gürültü uyarısıydı (1-12.5 kHz bant geçişli filtrelenmiş beyaz gürültü; 75 dB SPL). Tüm hayvanlar, eğitimin bir sonraki aşamasına geçmeden önce bu sesi ödülle ilişkilendirmeyi başarıyla öğrendi. Prosedürel eğitim, hayvanların görevi yüksek düzeyde performansa kadar ne kadar hızlı öğrenebildikleri konusunda bireysel değişkenlik gösterdi. Bununla birlikte, tüm hayvanlar ortalama 12,67 gün sonra ardışık iki gün boyunca %90'dan büyük veya buna eşit bir performans düzeyine (ortalama=92%85, sem =0,01%) ulaşmayı başardılar ( sd=2.85 gün). Performans %100 kullanılarak hesaplandı.

Eğitimin bir sonraki aşaması, farelerin spektral olarak farklı iki ses frekansını ayırt etmek üzere eğitildiği iki tonlu ayrımcılık (2TD) göreviydi (Şekil 1a). S+ tonuna (5.0 kHz; 70 dB SPL) yapılan barbasmalar su ödülünün sunulmasıyla sonuçlanırken, Taşa yapılan bar basışları (11.5 kHz; 70 dB SPL) bir hata sinyaliyle (yanıp sönen ev) sonuçlandı ışığı) ve bir "mola" (sonraki denemenin başlaması için ilave 6 saniye beklenir). S+ ve S-S denemeleri randomize edildi ve 8 saniye sürdü. Denemeler arası aralıklar (ITI'ler) ortalama 15 saniyeydi (aralık: 5-25 saniye, rastgele). Sessiz bir ITI sırasında yapılan barpressler önemsizdi (mola yok, hata sinyali yok, su ödülü yok). Günlük oturumların süresi 45 dakikaydı. Tüm hayvanlar 2TD görevini art arda toplam üç gün boyunca gerçekleştirdi. Sıçanlar eğitimli bir gözlemci tarafından eşleştirildi ve böylece prosedürel görevi benzer oranlarda elde eden hayvanlara 2TD aşamasında farklı tedavi koşulları atandı. Performansı eşleştirilmiş çiftlere, her birinin hemen ardından ya farmakolojik sınıf I HDAC3 inhibitörü RGFP966 (Abcam Inc., ab144819; 10 mg/kg;sc; N=12) ya da araç çözeltisinin (N=9) sistemik enjeksiyonları yapıldı. 2TD oturumu. 2TD görevinin performansı daha önce açıklandığı gibi hesaplandı: %100 (Shang,Bylipudi ve Bieszczad, 20).

).Doku toplanması ve RNA izolasyonu: 2TD'nin üçüncü seansından sonra hayvanlara üçüncü ve son RGFP966 enjeksiyonunu aldıktan bir saat sonra, beyinler hızlı bir şekilde parçalara ayrıldı ve kuru buz üzerine yerleştirilmiş bir 2-metilbütan kabında şokla donduruldu. Flaşla dondurulmuş beyinler daha sonra gelecekteki işlemlere kadar -80˚C'de saklandı. Beyinleri kriyoseksiyona hazırlamak için, beyinler optimum kesme sıcaklığı bileşiği (OCT) ile kaplandı ve beyin dokusunun kesim için -20˚ C'ye ulaşmasını sağlamak amacıyla -20˚ C'de 12-24 saat süreyle saklandı. OCT ile kaplanan beyinler daha sonra 250 um kalınlığında bir kriyostatta (Leica CM 3050S) yatay olarak dilimlenecektir. 1 mm'lik yuvarlak doku mikro zımbası kullanılarak, her yarıküreden 2 mm3 işitsel kortikal doku (beyin bölgesi başına toplam 4 mm3 olacak şekilde tek bir örnek halinde birleştirilir) RNA ekstraksiyonu için örneklendi. İşitsel korteks konumu, Paxinos ve Watson'ın Stereotaksik Koordinatlardaki Fare Beyni (6. baskı) referans olarak kullanılarak tanımlanmıştır (yaklaşık olarak A/P=-3,6 ila -5,8 mm, M/L {{20} } ±6,4 mm D/V=-4,2 ila -5,8 mm; ve hipokampüsün bir yer işareti olarak kullanılması

Her numuneden toplam RNA, üreticinin protokolü kullanılarak PureLinkTM RNA Mini Kiti (ThermoFisher) kullanılarak izole edildi. RNA örnekleri daha sonra RNA Clean andConcentratorTM -25 Kiti (Zymo Research) ile saflaştırıldı.

Gene expression analysis, Gene Ontology (GO) biological process analysis, and gene set enrichment analysis (GSEA): RNA-seq analysis was conducted by the Iowa Institute of Human Genetics (IIHG; Iowa City, IA, USA). Briefly, using 500 ng total RNA (all RIN values >8) sıralama kütüphaneleri, üreticinin tavsiye ettiği protokollere göre Illumina TruSeq® Stranded mRNA Library Prepkit kullanılarak oluşturuldu. Kitaplıklar bir havuzda toplandı ve sıralama, 100 bp çift uçlu SBS kimyası çalıştıran bir Illumina NovaSeq 6000 üzerinde gerçekleştirildi. Okumalar, öncelikle Iowa Üniversitesi'ndeki Argon HPC kaynağında çalışan Harvard Chan Bioinformatics (v.1.2.4) tarafından geliştirilen 'bcbio-nextgen.py' açık kaynaklı bilişim hattıyla işlendi. Bu ardışık düzen, okuma kalitesi kontrolü, okuma hizalaması ve nicelik belirleme için 'en iyi uygulamalar' yaklaşımlarını içerir. 'bcbio-nextgen.py' ardışık düzeni, seçilen genom yapısı olarak 'rn6' anahtarıyla "RNA-seq" modunda çalıştırıldı (dahili olarak Ensembl derlemesine ve gen yapısı 'Rnor_6.0'a referans veriyor). Hizalanan boru hattı, bağlantıya duyarlı, ultra hızlı hisat2 hizalayıcıyı (2.2.1) kullanarak Rnor_6.0 genomuna okur ve eş zamanlı olarak 'somon' (1.4.0) hizalayıcıyı kullanarak transkriptoma niceliksel okumalar yapar. Kalite kontrolü için okunan verileri incelemek amacıyla, at2 BAM hizalama dosyalarını inceleyen bir hesaplama aracı olan Qualimap (2.2.2) kullanıldı. Dizi kalite puanları temel kontrollerden geçti ve dizi çoğaltma oranları kabul edilebilir parametreler dahilindeydi. Tüm numuneler ekzonik bölgelere okuma hizalaması için QC'den geçmiştir. Somondan türetilen transkript miktarları (TPM veya "milyon başına transkript") içe aktarılmış ve Rstudio'da tximport (1.12.3) kullanılarak gen seviyesindeki tahmini sayımlarla özetlenmiştir. DESeq2 vinyetini uygular (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/DESeq2/inst/doc/DESeq2.html).

Tüm örneklerde tahmini sayısı 5'ten az olan genler, önerilen prosedüre göre aşağı yönlü analizden önceden filtrelendi. Tahmini gen düzeyi sayımlarında DESeq2 (v.1.24.0) ile diferansiyel gen ekspresyonu analizi yapıldı. %5 FDR ve X< abs(logFC) < 10 was set as a cutoff for differential expression (DEGs). Heatmaps, line graphs, and volcano plots were generated using clusterProfiler packages in R/Bioconductor. Gene level, pathway, and DEG analyses were generated using iPathwayGuide (Advaita Bioinformatics, https://www.advaitabio.com/ipathwayguide; last accessed November 15, 2022). iPathwayGuide scores pathways using the Impact Analysis method (Draghici et al., 2007); Tarca et al., 2009, Khatri et al., 2007). The underlying pathway topologies, comprised of genes and their directional interactions, are obtained from the KEGG database (Kanehisa et al., 2000; Kanehisa et al., 2010; Kanehisa et al., 2012; Kanehisa et al., 2014).

qRT-PCR ile RNA-seq verilerinin doğrulanması: RNA-seq verileri, farklı sıçan gruplarından ekstre edilen mRNA üzerinde qRT-PCR ile doğrulandı. Başlangıçta her bölgede zenginleştirilmiş bulunan yeni DEG'lerin listesinden beş transkript seçildi. Genlerden üçü, işitsel kortikal fizyolojik ve davranışsal literatüre dayanan hipoteze dayalıydı; diğer üç gen ise, İlaç ve Araç grupları arasında yapılan bir karşılaştırmada gen seviyesinden ve DEG analizlerinden tanımlanan yeni genlerdi. Tüm primer dizileri ya sıçanlarda beyin dokusu üzerine önceki literatürden seçilmiştir (diziler aşağıdaki tabloda verilmiştir) ya da NCBI Primer Blast kullanılarak tasarlanmış ve erime eğrileri ve PCR amplikon ürün dizilimi değerlendirilerek hedef özgüllüğü doğrulanmıştır. qRT-PCR analizleri bir QuantStudio 3'te (Applied Biosystems) SsoAdvancedTMUniversal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) ile gerçekleştirildi. Her numune için 500 ng cDNA, bir iScriptTM cDNA Sentez Kiti (Bio-Rad) kullanılarak çoğaltıldı.

Teşekkür

Yazarlar, davranışsal prosedürler ve analizlerdeki yardımlarından dolayı Dr. Andrea Shang, Sean Tsaur ve Sooraz Bylipudi'ye teşekkür eder; RNA ekstraksiyonu ve numune toplama protokollerindeki yardımlarından dolayı Dr. Mimi L. Phan'a; Dr. Troy A. Roepke, Ali Yasrebi ve Christopher O'Brien'a RNA örneği saflaştırma analizindeki yardımlarından dolayı; ve teknik yardım için Alisa Ray'e teşekkür ederiz. Tüm mevcut ve eski CLEF Lab personeline yardımları ve destekleri için teşekkür ederiz.

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Sağırlık ve İletişim Bozuklukları Enstitüsü [R01-DC014753 - KMB] tarafından desteklenmiştir; Rutgers Üniversitesi Sanat ve Bilim Okulu; lisans araştırmaları için küçük hibe finansmanı sağlayan Rutgers Üniversitesi'ndeki Aresty Vakfı; ve Rutgers Üniversitesi'ndeki Project SUPER programı, lisans araştırmaları için küçük bir hibe fonu ile.

Referanslar:

Alberini, CM ve Kandel, ER (2014). Bellek Konsolidasyonunda Transkripsiyonun Düzenlenmesi. Biyolojide ColdSpring Harbor Perspektifleri, 7(1), a021741.doi:https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021741

Albrecht, U., Zheng, B., Larkin, D., Sun, Z. ve Lee, C. (2001). MPer1 ve mper2 sirkadiyen saatin normal şekilde sıfırlanması için gereklidir. J Biol Ritimleri, 16, 100-104. doi:10.1177/074873001129001791.

Aschauer, D. ve Rumpel, S. (2016). Duyusal Neokorteks ve İlişkisel Bellek. Öğrenme ve Hafızanın Davranışsal Sinir Bilimi, 37, 177-211.doi:https://doi.org/10.1007/7854_2016_453

Bae, K., Jin, X., Maywood, ES, Hastings, MH, Reppert, SM ve Weaver, DR (2001). SCN sirkadiyen saatinde mPer1, mPer2 ve mPer3'ün diferansiyel fonksiyonları. Nöron, 30, 525-536.doi:10.1016/S0896-6273(01)00302-6.

Bakin, JS ve Weinberger, NM (1996). Nukleus bazalis'in uyarılmasıyla serebral kortekste fizyolojik bir hafızanın uyarılması. Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Bilimler Akademisi Bildirileri, 93(20), 11219-11224. yap:https://doi.org/10.1073/pnas.93.20.11219

Banerjee, SB, Gutzeit, VA, Baman, J., Aoued, HS, Doshi, NK, Liu, RC ve Ressler, KJ (2017). Yetişkin duyusal korteksindeki perinöronal ağlar, korku öğrenimi için gereklidir. Nöron, 95(1), 169-179. doi:10.1016/j.neuron.2017.06.007

Barta, CL, Liu, H., Chen, L., Giffen, KP, Li, Y., Kramer, KL, . . . O, DZ (2018). Yetişkin zebra balığı iç kulak kıl hücrelerinin RNA-seq transkriptomikanalizi. Bilimsel Veriler, 5, 180005.doi:https://doi.org/10.1038/sdata.2018.5

Bayraktar, G. ve Kreutz, MR (2018). Yetişkin Beyin ve Nörolojik Bozukluklarda Aktiviteye Bağlı DNA Demetilasyonunun Rolü. Moleküler Sinir Biliminde Sınırlar, 11, 169.doi:10.3389/fnmol.2018.00169

Bieszczad, KM, Bechay, K., Rusche, JR, Jacques, V., Kudugunti, S., Miao, W., . . . Wood, MA (2015). RGFP966 Aracılığıyla Histon Deasetilaz İnhibisyonu, Duyusal Kortikal Plastisite ve Bellek Oluşumunun Özgüllüğü Üzerindeki Frenleri Serbest Bırakır. J Neurosci, 35(38), 13124-13132.doi:https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0914-15.2015

Brown, MR ve Kaczmarek, LK (2011). Potasyum kanalı modülasyonu ve işitsel işleme. İşitme Araştırması, 279(1-2), 32-42. yap:https://doi.org/10.1016/j.heares.2011.03.004

Bychkov, ML, Vasilyeva, NA, Shulepko, MA, Balaban, PM, Kirpichnikov, MP ve Lyukmanova, EN(2018). Lynx1, A 1-42 ve JNK Aktivasyonunun Neden Olduğu Uzun Süreli Güçlenme Blokajını ve Nöromodülatör İfadesinin Azaltılmasını Önler. Acta Naturae, 10(3), 57-61.

Reference:1950477648n@gmail.com