Hepsidin Aracılı Hipoferremi, Aşılama ve Enfeksiyona Karşı Bağışıklık Tepkilerini Bozuyor Bölüm 2

TARTIŞMA

Demir ve İmmunometabolizma

Hepsidin ile indüklenen hipoferremi, omurgalılarda doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin iyi korunmuş bir bileşenidir.8 Hipoferreminin, lenfosit genişlemesi döneminde meydana gelmesi halinde, daha sonraki uzun vadeli inhibisyon potansiyeline sahip olması durumunda, adaptif bağışıklığın birçok yönünü bozabileceğini gösterdik. Hipoferremi düzeldikten sonra bile T-hücre hafızası. IRP1/2 tarafından kontrol edilen hücresel demir alımının uygun düzenlemesinin T hücresi efektör fonksiyonları için gerekli olduğunu ve TFRC aracılı demir alımının in vivo B ve T hücresi tepkileri için hücre özünde gerekli olduğunu gösteriyoruz.

Transmembran demir ithalatçılarındaki artışlarla birlikte, 24 saat içinde hücre başına ~1 milyon protein kopyası artan, aktive edilmiş T hücreleri tarafından TFRC ifadesindeki dikkate değer artış, hücre dışı kaynaklardan demir elde etme çabalarının önemli ölçüde yoğunlaştığını gösterir. Oksidatif metabolizma ve DNA sentezi çalışmalarının, T hücrelerinde düşük demir mevcudiyeti ile inhibe edilen iki demire bağlı süreç olduğunu göstermiş olmamıza rağmen, epigenetik yeniden programlama ve hipoksi algılama dahil olmak üzere T hücresi biyolojisinde önemli olan diğer birçok hücresel yol da demir gerektirir ve araştırılması gerekir.

Ayrıca, azalmış CD25 ekspresyonu ve IL-2'yi algılayamama, demir eksikliğinde gözlenen efektör/bellek CD8 T hücrelerinin kalitesinin düşmesine katkıda bulunabilir.27 Aktive edilmiş lenfositlerin hızlandırılmış metabolik aktivitesi, demir mevcudiyetine özellikle duyarlı olduğundan, fizyolojik demir konsantrasyonlarındaki değişiklikler, bağışıklık tepkilerini güçlü bir şekilde etkiler. Bu nedenle demir, immünometabolizma kavramlarıyla ilgili bir besin maddesi olarak kabul edilebilir.28

Bağışıklık, vücudun dış dünyadan gelen çeşitli zararlı faktörlere karşı savunma yeteneğini ifade eder. İyi bağışıklığın insan vücudu üzerinde aşağıdakiler de dahil olmak üzere büyük bir etkisi vardır: 1. hastalık direnci: Bağışıklık, patojenleri tanımlayabilir ve ortadan kaldırabilir ve insan vücudunun hastalıklara yakalanmasını önleyebilir. 2. İyileşmeyi teşvik edin: İnsan vücuduna patojenler bulaştıysa, bağışıklık hastalığın iyileşmesini hızlandırabilir ve fiziksel iyileşmeyi teşvik edebilir. 3. Yaşlanma karşıtı: Zayıf bağışıklık fonksiyonu vücudun yaşlanmasına neden olur ve iyi bağışıklık vücudun yaşlanmasını geciktirebilir. 4. Kanseri önleyin: İyi bir bağışıklık sistemi kanser hücrelerini yok edebilir ve kanseri önleyebilir. 5. Kardiyovasküler sağlığı koruyun: İyi bir bağışıklık, kardiyovasküler hastalıkların oluşumunu azaltabilir.

Bu yüzden günlük hayatta bağışıklığımızı güçlendirmemiz gerekiyor. Çalışmalar, Cistanche'nin bağışıklığı iyileştirebileceğini bulmuştur. Cistanche ayrıca vücuttaki serbest radikallerin atılmasına, hücrelerde oksidatif hasarın azaltılmasına ve dolayısıyla bağışıklığın dolaylı olarak iyileştirilmesine yardımcı olabilecek Flavonoidler, C vitamini vb. gibi bazı antioksidan maddeler içerir. Cistanche'nin çeşitli besin bileşenleri ve aktif maddeleri sinerjistik olarak hareket edebilir, vücudun bağışıklığını geliştirebilir ve insan sağlığının geliştirilmesinde olumlu bir role sahip olabilir.

Cistanche'nin sağlığa faydalarına tıklayın

Hepsidin, Hipoferremi ve Viral Enfeksiyonlar

Hepsidin kontrollü demir yeniden dağılımı, farelerde bazı bakteriyel enfeksiyonlara ve sıtmaya karşı koruma sağlar.29,30 İnsanlarda, deneysel norovirüs, tifo ve sıtma enfeksiyonlarından31-33 sonra ve HIV'de vireminin ilk ortaya çıkışı sırasında, insanlarda artmış hepsidin ve hipoferremi meydana gelir{ {5}}enfekte kan donörleri.34 İnflamatuar hipoferremi, demiri konakçılarından alması gereken tek hücreli organizmaların neden olduğu enfeksiyonlar bağlamında faydalı olabilse de, viral enfeksiyonlar bağlamında düşük serum demirinin koruyucu olduğuna dair kanıt yoktur. Aslında, influenza virüsü ile yaptığımız deneylerde, hepsidin kaynaklı hipoferremi uygulamak, bozulmuş bir adaptif bağışıklık tepkisi, viral kalıcılık ve ciddi akciğer hastalığı ile sonuçlanmıştır; bu, düşük serum demirinin bazen enfeksiyona yardımcı olmayan bir yanıt olabileceğini düşündürmektedir.

Son raporlar, yoğun bakım ünitesine (YBÜ) kabul edilen koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19) hastalarında hipoferreminin mevcut olduğunu göstermektedir.35 Düşük serum demiri, lenfopeni ile ilişkilidir ve aşırı derecede düşük serum demiri (~3 mmol/L) ), muhtemelen pulmoner hasara ikincil olarak ciddi solunum hipoksemisi olan COVID-19 hastalarını tanımladı. Bu hipoferremi, sepsis hastaları da dahil olmak üzere önceden bildirilen COVID-19 YBÜ hastalarının kohortlarından daha derindir36,37, bu da aşırı hipoferreminin ciddi COVID-19 hastalığının belirli bir özelliği olabileceğini gösterir. IL-6, hepsidin ifadesini yönlendirir ve yüksek IL-6 ve nispeten düşük tip I ve tip III IFN'nin dengesiz inflamatuar yanıtı, ciddi COVID-19 ve kötü sonuçlarla ilişkilidir.38,39 IL -6-güdümlü ve hepsidin aracılı hipoferremi, antiviral adaptif bağışıklık tepkisini bozarak enfeksiyonun ciddiyetine katkıda bulunabilir. IL-6R'yi hedefleyen Tocilizumab, COVID-19 için bir terapötik olarak araştırılmaktadır ve hipoferremiyi önleyebilir. COVID{19} hastalarında serum demirinin izlenmesi, hastalığın ciddiyetini ve tedavilerin etkilerini değerlendirmede yararlı olabilir.

Demir Ticareti—Uyarlanabilir Bağışıklık ve Aşılamanın Sonuçları

Enfeksiyon bağlamında demirin rolüne ilişkin önceki tanımlamalar, patojenin, konakçının savunduğu konakçı demiri ele geçirme girişimlerini açıklayarak evrimsel bir silahlanma yarışına yol açar.40 konakçı, demiri tutarak istilacı patojenlerin virülansını azaltmaya çalışır, ancak bunu yaparken aynı anda demiri adaptif bağışıklık tepkilerinden de alıkoyar.

Bu değiş tokuşun sonucu, neden olan enfeksiyonun doğasına, inflamatuar yanıtın büyüklüğüne ve tipine ve konağın altta yatan demir durumuna bağlı olacaktır. Küresel olarak, hipoferremi, beslenme demir eksikliğinin yaygın olduğu ve aynı zamanda hepsidini artıran enfeksiyon ve iltihaplanma yükünün olduğu popülasyonlarda yaygındır; bu kombinasyon, muhtemelen yüz milyonlarca kişiyi etkiler.4,10 Yanıtları etkilemenin yanı sıra doğrudan enfeksiyon, hipoferremi aşılamaya verilen yanıtları bozarak bulaşıcı yük üzerinde dolaylı etkilere sahip olabilir. Bazı aşıların etkinliği ve immünojenitesi, demir eksikliğinin endemik olduğu popülasyonlarda yetersizdir41 ve bu tür popülasyonlarda, aşı ile önlenebilir enfeksiyonlardan kaynaklanan çocukluk ölümleri kabul edilemeyecek kadar yüksek olmaya devam etmektedir.42 Burada, demirlerin aşılamaya verilen tepkileri artırdığını bir domuz yavrusu modelinde gösteriyoruz. doğal olarak meydana gelen demir eksikliği bağlamında.

Son zamanlarda, Kenyalı bebeklerin retrospektif bir analizinde, aneminin bazı aşılara verilen hümoral yanıtların bozulmasıyla ilişkili olduğunu ve demir takviyesinin kızamık aşısına verilen hümoral yanıtı artırabileceğini gösterdik.43 Bununla birlikte, demir bazı enfeksiyonların riskini artırabilir ve olumsuz etkilere neden olabilir. bağırsak mikrobiyotasını etkiler.4 Sonuç olarak, aşılar sırasında verilen hedeflenen besinsel demirin, çocuklar ve yaşlılar da dahil olmak üzere demir eksikliği olan popülasyonlarda bağışıklamaların etkinliğini artırıp artırmadığını belirlemek için ısmarlama denemelere ihtiyaç vardır.

TMPRSS6'da mutasyonları olan IRIDA hastalarında yükselmiş hepsidin ve hipoferremi, en azından bazı patojenlere karşı bozulmuş hümoral bağışıklık ile ilişkilendirilebilir. Kalıcı yüksek hepsidin ve hipoferremi, kronik böbrek hastalığı9 gibi bulaşıcı olmayan kronik enflamatuar bozuklukların da özellikleridir ve kanserlerde inflamasyon ve demir eksikliği gözlenir.44 Bu popülasyonlarda ve koşullarda adaptif bağışıklık, hipoferremi nedeniyle tehlikeye girebilir. Demire bağlı bozukluklar için terapötik bir müdahale olarak tasarlanan hepsidin aktivitesinin farmakolojik veya genetik manipülasyonu, nispeten iyi gelişmiştir.45 Bu nedenle, hepsidin zaten potansiyel olarak erişilebilir bir hedeftir ve birçok hastalıkta bağışıklık tepkilerini kontrol etmenin bir yöntemi olarak araştırılabilir. bağlamlar.

Çalışmanın Sınırlamaları

Çalışmamız, demir kısıtlamasının, oksijen tüketimi ve mitokondriyal membran potansiyeli ile değerlendirildiği üzere T hücresi aerobik metabolizmasını bozduğunu bulsa da, daha geniş hipotez içermeyen yaklaşımlar, demir mevcudiyetinin sınırlandırılmasının T hücrelerinin işlevini bozduğu mekanizmanın daha bütünsel bir şekilde değerlendirilmesini sağlayabilir. Hem T hem de B hücre yanıtları, in vivo olarak serum demir eksikliği tarafından bozulur, ancak izole edilmiş B hücrelerinin fizyolojisinin demir eksikliği tarafından nasıl bozulduğunu veya T hücresi farklılaşmasının demir tarafından nasıl etkilendiğini keşfetmedik. Ayrıca, demir eksikliği nedeniyle CD8 T hücre hafızasındaki bozulmanın ne ölçüde CD4 ve B hücre hafızasına kadar uzandığını ve bu gözlemlerin aşılara verilen yanıtları ve enfeksiyona karşı korunmayı nasıl etkileyebileceğini sormadık.

Özet

Hepsidinin neden olduğu hipoferreminin bağışıklamaya yönelik birincil ve hafıza tepkilerini bozduğunu bulduk ve en azından kısmen IRP1/2 ve TFRC tarafından demir aracılı için yoğun bir aktifleştirilmiş T hücreleri talebini ortaya çıkardık. Yüksek hepsidin, patojenlere karşı adaptif bağışıklık yanıtlarını inhibe edebilirken, düşük serum demirine karşı ek demir, bağışıklık tepkilerini iyileştirebilir. Bu sonuçlar, hepsidin tarafından düzenlenen serum demirinin, bağışıklık için önemli ve potansiyel olarak hedeflenebilir bir kontrol noktası olduğunu göstermektedir.

YILDIZ artı YÖNTEMLER

Ayrıntılı yöntemler bu makalenin çevrimiçi sürümünde verilmektedir ve aşağıdakileri içerir:

TEŞEKKÜRLER

Yazarlar hayvancılık için Oxford Üniversitesi Biyomedikal Hizmetler Departmanı personeline, biyokimyasal ölçümlerdeki yardımları için Alireza Morovat'a (Clinical Biochemistry, Oxford University Hospitals NHS Foundation Trust), David Pattinson'a (Jenner Institute, Oxford University) ve Biobest Laboratories personeline teşekkür eder. , Edinburgh, ELISA'larla ilgili yardım için ve Weatherall Institute of Molecular Medicine akış sitometri tesisi ve Cantrell Lab üyeleri, Dundee Üniversitesi, birçok yararlı tartışma için.

Bu çalışma Birleşik Krallık Tıbbi Araştırma Konseyi (MRC İnsan İmmünoloji Birimi HD'ye temel finansman, ödül no. MC_UU_12010/10) ve bir Christopher Welch Bursu ve EMBO Kısa Süreli Bursu tarafından desteklenmiştir. JNFSJ Draper bir Jenner Araştırmacısı, Lister Enstitüsü Araştırma Ödülü Üyesi ve Wellcome Trust Kıdemli Üyesidir (106917/Z/15/Z).

Rekombinant viral aşıların üretimi için Jenner Enstitüsü, Oxford Üniversitesi ve Viral Vector Core Facility'ye teşekkür ederiz. i3S'de yürütülen çalışma, Norte 2020 Portekiz Bölgesel Operasyonel Programı (hibe no. Norte-01-0145- FEDER-000012) tarafından desteklenmiştir; yazarlar ayrıca ulusal altyapı PPBI-Portekiz Biyogörüntüleme Platformu'nun (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122) ​​bir üyesi olan i3S Scientific Platform HEMS'nin desteğini kabul eder. OB, bir Sir Henry Wellcome Bursu (105654/Z/14/Z) tarafından finanse edilmektedir. TKT, Townsend-Jeantet Charitable Trust (hayır kurumu no. 1011770) tarafından finanse edilmiştir. MS ve UG, MRC İnsan İmmünoloji Birimi tarafından desteklendi. SJ Dunachie bir Jenner Araştırmacısıdır ve Birleşik Krallık Sağlık ve Sosyal Bakım Departmanındaki Fleming Fonu tarafından finanse edilmektedir. MDF ve DRC, Harvard Tıp Okulu S. Burt Wolbach Profesörlüğü tarafından desteklenmektedir. SKW, Wellcome Trust Enfeksiyon, İmmünoloji ve Çeviri Tıbbı doktora programı (hibe no. 108869/Z/15/Z) tarafından desteklenmiştir. BG, Deutsche Forschungsgemeinschaft'tan hibe aldı (hibe no. GA2075/3-1 ve GA2075/5-1). MA, Reading Uluslararası Araştırma Öğrenciliği Üniversitesi tarafından finanse edildi. AS şu anda bir NIHR Doktora Araştırma Bursu (NIHR-DRF-2017-10-094) tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma Maria de Sousa ve Vincenzo Cerundolo'ya ithaf edilmiştir.

YAZAR KATKILARI

İş Kavramı ve Tasarımı, JNF, TKT, MA, TLD, AEA, ARMT, BG, MCL ve HD Verilerin Edinimi ve Analizi, JNF, TKT, MA, AS, SKW, MB, NS, KW, BK, GS, DRC, TLD, JML, AEA, JA, PJL, AEP, DA, MT, CN, MS, UG, FRMvdK, ARMT, BG, MDF, MCL ve HD Koleksiyonu, Demir Eksikliği Olan Hastaların Fenotipi ve Genotiplemesi, MDF ve DRC Verilerin Yorumlanması, JNF, NS, TLD, OB, SCA, SJ Dunachie, MZ, FRMvdK, VC, SJ Draper, ARMT, BG, MDF, MCL ve HD Yazma, JNF ve HD

ÇIKAR BEYANI

HD, Kymab'ın danışma kurulunda yer aldı, Pfizer ve La Jolla Pharmaceutical Company'den araştırma fonu aldı ve Pharmacosmos ve Vifor'dan ücret aldı. Diğer yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

REFERANSLAR

1. Phan, AT, Goldrath, AW ve Glass, CK (2017). T hücresi ve makrofaj bağışıklığının metabolik ve epigenetik koordinasyonu. Bağışıklık 46, 714–729.

2. Andreini, C., Putignano, V., Rosato, A. ve Banci, L. (2018). İnsan demir proteomu. Metalomik 10, 1223–1231.

3. Jabara, HH, Boyden, SE, Chou, J., Ramesh, N., Massaad, MJ, Benson, H., Bainter, W., Fraulino, D., Rahimov, F., Sieff, C., et al. (2016). TFRC'de transferrin reseptörü 1'i kodlayan bir yanlış anlamlı mutasyon, kombine immün yetmezliğe neden olur. Nat. Genet. 48, 74–78.

4. Pasricha, SR, Armitage, AE, Prentice, AM ve Drakesmith, H. (2018). Düşük gelirli ülkelerde aneminin azaltılması: enfeksiyonun kontrolü esastır. BMJ 362, k3165.

5. Muckenthaler, MU, Rivella, S., Hentze, MW ve Galy, B. (2017). Demir Metabolizması İçin Kırmızı Halı. Hücre 168, 344–361.

6. Nemeth, E., Tuttle, MS, Powelson, J., Vaughn, MB, Donovan, A., Ward, DM, Ganz, T. ve Kaplan, J. (2004). Hepsidin, ferroportine bağlanarak ve onun içselleştirilmesini sağlayarak hücresel demir akışını düzenler. Bilim 306, 2090–2093.

7. Lim, PJ, Duarte, TL, Arezes, J., GarciaSantos, D., Hamdi, A., Pasricha, SR, Armitage, AE, Mehta, H., Wideman, S., Santos, AG, et al. (2019). Nrf2, Bmp6 ve hepsidin yoluyla hemokromatoz ve talasemide demir homeostazını kontrol eder. Nat. Metab. 1, 519–531.

8. Drakesmith, H. ve Prentice, AM (2012). Hepsidin ve demir-enfeksiyon ekseni. Bilim 338, 768–772.

9. Ganz, T. (2019). Enflamasyon Anemisi. İngilizce J.Med. 381, 1148–1157.

10. Armitage, AE, Agbla, SC, Betts, M., Sise, EA, Jallow, MW, Sambou, E., Darboe, B., Worwui, A., Weinstock, GM, Antonio, M., ve diğerleri. (2019). Hızlı büyüme, Gambiyalı bebeklerde hepsidin baskılanmasının ve azalan ferritinin baskın bir göstergesidir. Hematolojik 104, 1542–1553.

11. Prentice, AM, Bah, A., Jallow, MW, Jallow, AT, Sanyang, S., Sise, EA, Ceesay, K., Danso, E., Armitage, AE, Pasricha, S.-R., et al. (2019). Solunum yolu enfeksiyonları, Afrikalı çocuklarda demir eksikliği anemisine yol açan hepsidin aracılı demir emilimini bloke eder. bilim İlerler 5, eaav9020.

12. Dallman, PR (1987). Demir eksikliği ve bağışıklık tepkisi. Am. J. Clin. Nutr. 46, 329–334.

13. Oppenheimer, SJ (2001). Demir ve bağışıklık ve bulaşıcı hastalık ile ilişkisi. J. Nutr. 131 (2S-2), 616S–633S, tartışma 633S–635S.

14. Wang, Z., Yin, W., Zhu, L., Li, J., Yao, Y., Chen, F., Sun, M., Zhang, J., Shen, N., Song, Y ., ve Chang, X. (2018). Demir, RNA-Bağlayıcı Protein PCBP1-Aracılı Proinflamatuar Sitokin Üretimini Destekleyerek T Yardımcı Hücre Patojenitesini Artırır. Bağışıklık 49, 80–92.e7.

15. Jiang, Y., Li, C., Wu, Q., An, P., Huang, L., Wang, J., Chen, C., Chen, X., Zhang, F., Ma, L ., et al. (2019). Demire bağımlı histon 3 lizin 9 demetilasyonu, B hücresi proliferasyonunu ve hümoral immün yanıtları kontrol eder. Nat. komün. 10, 2935.

16. Preza, GC, Ruchala, P., Pinon, R., Ramos, E., Qiao, B., Peralta, MA, Sharma, S., Waring, A., Ganz, T. ve Nemeth, E. (2011). Minihepsidinler, farelerde hepsidin aktivitesini taklit eden ve aşırı demir yükünün tedavisi için yararlı olabilecek, rasyonel olarak tasarlanmış küçük peptidlerdir. J. Clin. Yatırım. 121, 4880–4888.

17. Howden, AJM, Hukelmann, JL, Brenes, A., Spinelli, L., Sinclair, LV, Lamond, AI ve Cantrell, DA (2019). T hücresi farklılaşması sırasında T hücresi proteomlarının ve çevresel sensörlerin kantitatif analizi. Nat. immünol.20, 1542–1554. 

18. Hentze, MW, Muckenthaler, MU, Galy, B. ve Camaschella, C. (2010). Tangoya iki: memeli demir metabolizmasının düzenlenmesi. Hücre 142, 24–38.

19. Hukelmann, JL, Anderson, KE, Sinclair, LV, Grzes, KM, Murillo, AB, Hawkins, PT, Stephens, LR, Lamond, AI ve Cantrell, DA (2016). Sitotoksik T hücresi proteomu ve kinaz mTOR tarafından şekillendirilmesi. Nat. immünol. 17, 104–112.

20. Knight, ZA, Schmidt, SF, Birsoy, K., Tan, K. ve Friedman, JM (2014). Eritropoez ve anemide mTORC1 için kritik bir rol. eLife 3, e01913.

21. Gerlach, C., Moseman, EA, Loughhead, SM, Alvarez, D., Zwijnenburg, AJ, Waanders, L., Garg, R., de la Torre, JC ve von Andrian, UH (2016). Kemokin Reseptörü CX3CR1, Bağışıklık Sürveyansı ve Homeostazda Farklı Rollere Sahip Üç Antijen Deneyimli CD8 T Hücre Alt Kümesini Tanımlar. Bağışıklık 45, 1270–1284.

22. Hikono, H., Kohlmeier, JE, Takamura, S., Wittmer, ST, Roberts, AD ve Woodland, DL (2007). Merkezi veya efektör bellek fenotipinden ziyade aktivasyon fenotipi, bellek CD8 artı T hücrelerinin hatırlama etkinliğini tahmin eder. J. Uzm. Med. 204, 1625–1636.

23. Rytych, JL, Elmore, MR, Burton, MD, Conrad, MS, Donovan, SM, Dilger, RN ve Johnson, RW (2012). Erken yaştaki demir eksikliği, yenidoğan domuz yavrularında uzamsal bilişi bozar. J. Nutr. 142, 2050–2056.

24. Maes, D., Segales, J., Meyns, T., Sibila, M., Pieters, M. ve Haesebrouck, F. (2008). Domuzlarda Mycoplasma hyopneumoniae enfeksiyonlarının kontrolü. Veteriner. Mikrobiyol. 126, 297–309.

25. Feinberg, KE, Heeney, MM, Campagna, DR, Aydınok, Y., Pearson, HA, Hartman, KR, Mayo, MM, Samuel, SM, Strouse, JJ, Markianos, K., ve diğerleri. (2008). TMPRSS6'daki mutasyonlar demire dirençli demir eksikliği anemisine (IRIDA) neden olur. Nat. Genet. 40, 569–571.

26. Harboe, ZB, Benfield, TL, Valentiner-Branth, P., Hjuler, T., Lambertsen, L., Kaltoft, M., Krogfelt, K., Slotved, HC, Christensen, JJ ve Konradsen, HB ( 2010). İnvaziv pnömokok hastalığında ve 7 yıl boyunca pnömokokal serotiplerde zamansal eğilimler. klinik bulaştırmak. Dis. 50, 329–337.

27. Kalia, V. ve Sarkar, S. (2018). Efektör ve Bellek CD8 T Hücre Farklılaşmasının IL-2—Bir Dengeleme Yasası ile Düzenlenmesi. Ön. immünol. 9, 2987.

28. Lee, YS, Wollam, J. ve Olefsky, JM (2018). İmmünometabolizmanın Bütünleşik Bir Görünümü. Hücre 172, 22–40.

29. Arezes, J., Jung, G., Gabayan, V., Valore, E., Ruchala, P., Gulig, PA, Ganz, T., Nemeth, E. ve Bulut, Y. (2015). Hepsidin kaynaklı hipoferremi, hidrofilik bakteri Vibrio vulnificus'a karşı kritik bir konak savunma mekanizmasıdır. Hücre Konağı Mikrop 17, 47–57.

30. Portekiz, S., Carret, C., Recker, M., Armitage, AE, Gonc¸ alves, LA, Epiphanio, S., Sullivan, D., Roy, C., Newbold, CI, Drakesmith, H. , ve ll OPEN ACCESS 178 Med 2, 164–179, 12 Şubat 2021 Clinical and Translational Article Mota, MM (2011). Sıtmada süperenfeksiyonun konak aracılı düzenlenmesi. Nat. Med. 17, 732–737.

31. Darton, TC, Blohmke, CJ, Giannoulatou, E., Waddington, CS, Jones, C., Sturges, P., Webster, C., Drakesmith, H., Pollard, AJ ve Armitage, AE (2015) . Hızla Artan Hepsidin ve İlişkili Serum Demir Açlığı, İnsanlarda Tifo Enfeksiyonuna Akut Yanıtın Özellikleridir. PLOS Negl. Trop. Dis. 9, e0004029.

32. Spottiswoode, N., Armitage, AE, Williams, AR, Fyfe, AJ, Biswas, S., Hodgson, SH, Llewellyn, D., Choudhary, P., Draper, SJ, Duffy, PE ve Drakesmith, H (2017). Sıtma Sırasında Hepsidin Düzenlemesinde Aktivinlerin Rolü. bulaştırmak. Bağışıklık. 85, e00191-e17.

33. Williams, AM, Ladva, CN, Leon, JS, Lopman, BA, Tangpricha, V., Whitehead, RD, Armitage, AE, Wray, K., Morovat, A., Pasricha, SR, et al. (2019). Bir norovirüs insan mücadelesinden sonra mikrobesin ve inflamasyon serum biyobelirteç konsantrasyonlarındaki değişiklikler. Am. J. Clin. Nutr. 110, 1456–1464.

34. Armitage, AE, Stacey, AR, Giannoulatou, E., Marshall, E., Sturges, P., Chatha, K., Smith, NM, Huang, X., Xu, X., Pasricha, SR, ve diğerleri . (2014). HIV-1, HBV ve HCV enfeksiyonları sırasında belirgin hepsidin ve demir düzenlemesi modelleri. Proc. Natl. Acad. bilim ABD 111, 12187–12192.

35. Shah, A., Frost, JN, Aaron, L., Donovan, K. ve Drakesmith, H.; Ortak çalışanlar (2020). COVID'de sistemik hipoferremi ve hipoksemik solunum yetmezliğinin şiddeti-19. kritik Bakım 24, 320.

36. Lan, P., Pan, KH, Wang, SJ, Shi, QC, Yu, YX, Fu, Y., Chen, Y., Jiang, Y., Hua, XT, Zhou, JC ve Yu, YS (2018). Yüksek Serum Demir Düzeyi Sepsisli Hastalarda Artan Mortalite ile İlişkilidir. bilim 8, 11072.

37. Tacke, F., Nuraldeen, R., Koch, A., Strathmann, K., Hutschenreuter, G., Trautwein, C. ve Strnad, P. (2016). Demir Parametreleri Kritik Hastaların Prognozunu Belirler. kritik Bakım Med. 44, 1049–1058.

38. Blanco-Melo, D., Nilsson-Payant, BE, Liu, WC, Uhl, S., Hoagland, D., Møller, R., Jordan, TX, Oishi, K., Panis, M., Sachs, D., et al. (2020). SARS-CoV'ye Dengesiz Konak Tepkisi-2 COVID Gelişimini Artırıyor-19. Hücre 181, 1036–1045.e9.

39. Cao, X. (2020). COVID-19: İmmünopatoloji ve bunun terapi üzerindeki etkileri. Nat. Rev. Immunol. 20, 269–270.

40. Berber, MF ve Elde, NC (2014). Transferrinin hızlı gelişimi sayesinde bakteriyel demir korsanlığından kaçış. Bilim 346, 1362–1366.

41. Olotu, A., Fegan, G., Wambua, J., Nyangweso, G., Leach, A., Lievens, M., Kaslow, DC, Njuguna, P., Marsh, K. ve Bejon, P (2016). Genç Afrikalı Çocuklarda RTS, S/AS01 Sıtma Aşısının Yedi Yıllık Etkinliği. İngilizce J.Med. 374, 2519–2529.

42. Greenwood, B. (2014). Aşının küresel sağlığa katkısı: geçmiş, bugün ve gelecek. Philos. Trans. R. Soc. Londra. B Bil. bilim 369, 20130433.

43. Stoffel, NU, Uyoga, MA, Mutuku, FM, Frost, JN, Mwasi, E., Paganini, D., van der Klis, FRM, Malhotra, IJ, LaBeaud, AD, Ricci, C., et al. (2020). Aşılama Sırasında Demir Eksikliği Anemisi, Aşı Yanıtında Azalmayı Öngörüyor ve Aşılama Sırasında Demir Takviyesi Humoral Aşı Yanıtını Artırıyor: Kenyalı Bebeklerde Bir Doğum Kohort Çalışması ve Randomize Deneme Takip Çalışması. Ön. immünol. 11, 1313.

44. Lopez, A., Cacoub, P., Macdougall, IC ve Peyrin-Biroulet, L. (2016). Demir eksikliği anemisi. Lancet 387, 907–916.

45. Katsarou, A. ve Pantopoulos, K. (2018). Hepsidin Tedavileri. Eczacılık (Basel) 11, 127.

46. ​​Schulman, JL ve Kilbourne, ED (1969). İnfluenza virüsünün hemaglutinin ve nöraminidaz antijenlerinin yapısındaki bağımsız varyasyon: Hong Kong-68 virüsünün hemaglutinin antijeninin ayırt edici özelliği. Proc. Natl. Acad. bilim ABD 63, 326–333.

47. Powell, TJ, Silk, JD, Sharps, J., Fodor, E., ve Townsend, AR (2012). Heterotipik bağışıklığın indüklenmesi için bir aşı olarak sözde tiplenmiş influenza A virüsü. J. Virol. 86, 13397– 13406.

48. Wang, C., Hart, M., Chui, C., Ajuogu, A., Brian, IJ, de Cassan, SC, et al. (2016). Germinal merkez B hücresi ve T foliküler yardımcı hücre yanıtları, viral vektör ve protein içinde adjuvan aşılara. J. Immunol. 197, 1242–1251.

49. Galy, B., Ferring, D. ve Hentze, MW (2005). Kemirgen Demir Düzenleyici Protein (IRP)-1 ve -2 genlerinin koşullu alellerinin üretimi. Tekvin 43, 181–188.

50. Badea, TC, Wang, Y. ve Nathans, J. (2003). Farede hücre morfolojisini ve klonal ilişkileri görselleştirmek için invazif olmayan bir genetik/farmakolojik strateji. J. Neurosci. 23, 2314–2322.

51. Heeney, MM, Guo, D., De Falco, L., Campagna, DR, Olbina, G., Kao, PP, Schmitz-Abe, K., Rahimov, F., Gutschow, P., Westerman, K ., et al. (2018). Normalleştirici hepsidin, kronik demir eksikliği olan hastalarda TMPRSS6 mutasyon durumunu tahmin eder. Kan 132, 448–452.

52. Naik, SH, Proietto, AI, Wilson, NS, Dakic, A., Schnorrer, P., Fuchsberger, M., Lahoud, MH, O'Keeffe, M., Shao, QX, Chen, WF, et al. . (2005). Son teknoloji: Fms benzeri tirozin kinaz 3 ligand kemik iliği kültürlerinde splenik CD8 plus ve CD8- dendritik hücre eşdeğerlerinin oluşturulması. J. Immunol. 174, 6592–6597.

53. Xiao, B., Deng, X., Zhou, W. ve Tan, EK (2016). MitoTracker Kullanarak Mitofajinin Akış Sitometrisine Dayalı Değerlendirmesi. Ön. Hücre. Nörobilim. 10, 76.

54. Armitage, AE, Lim, PJ, Frost, JN, Pasricha, SR, Soilleux, EJ, Evans, E., Morovat, A., Santos, A., Diaz, R., Biggs, D., ve diğ. (2016). Demir Düzenleyici Hormon Hepsidin'in Uyarılmış Bozulması Akut Enflamatuvar Hipoferemiyi Önler. J. Doğuştan Bağışıklık. 8, 517–528.

55. Buchweitz, JP, Karmaus, PW, Harkema, JR, Williams, KJ ve Kaminski, NE (2007). C57BL/6 farelerinde Delta9-tetrahidrokanabinol tarafından influenza A/PR/8/34'e hava yolu yanıtlarının modülasyonu. J. Pharmacol. Tecrübe. orada. 323, 675–683.

56. Efstratiou, A. ve Maple, PAC (1994). Difteri Laboratuvar Teşhisi (Dünya Sağlık Örgütü Avrupa Bölge Ofisi).

57. Hefele, L., Syphan, S., Xayavong, D., Homsana, A., Kleine, D., Chanthavilay, P., Nouanthong, P., Xaydalasouk, K., Phathammavong, O., Billamay, S ., et al. (2019). Lao Demokratik Halk Cumhuriyeti'nde Difteri-TetanozBoğmaca Tüm Hücre-Hepatit B-Haemophilus influenzae Tip B ile Rutin Aşılamanın Ardından Sağlık Sisteminin Farklı Düzeylerinde Seroproteksiyon. klinik bulaştırmak. Dis. 69, 2136–2144.

58. Dünya Sağlık Örgütü (2005). Pnömokokal konjuge aşıların üretimi ve kontrolü için öneriler. Dünya Sağlık Organı. teknoloji Temsilci Ser. 927, 64–98.

59. Chen, RT, Markowitz, LE, Albrecht, P., Stewart, JA, Mofenson, LM, Preblud, SR ve Orenstein, WA (1990). Kızamık antikoru: koruyucu titrelerin yeniden değerlendirilmesi. J. Bulaş. Dis. 162, 1036–1042.

YILDIZ artı YÖNTEMLER

ANAHTAR KAYNAKLAR TABLOSU

KAYNAK KULLANILABİLİRLİK

Kurşun İletişim

Kaynaklar ve reaktiflerle ilgili daha fazla bilgi ve talepler, Baş İletişim Sorumlusu Hal Drakesmith'e (alexander.drakesmith@ imm.ox.ac.UK) yönlendirilmelidir ve bu kişi tarafından karşılanacaktır.

Malzeme Bulunabilirliği

Bu proje yeni benzersiz reaktifler üretmedi.

Veri ve Kod Kullanılabilirliği

Bu proje herhangi bir yeni kod veya yeni veri seti oluşturmadı.

DENEYSEL MODEL VE ​​KONU DETAYLARI Fareler

Aksi belirtilmedikçe, hayvan prosedürleri Birleşik Krallık İçişleri Bakanlığı projesinin yetkisi ve Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986'nın kişisel lisansları altında gerçekleştirildi ve Oxford Üniversitesi etik inceleme komitesi tarafından onaylandı. Fareler ayrı ayrı havalandırılan kafeslere yerleştirildi ve 188 ppm demir içeren standart bir diyet (SDS Dietex Services, diyet 801161) veya ışınlanmış düşük demir diyeti (2 ppm Fe, TD.99397, Teklad Envigo) veya ışınlanmış ayarlanmış demir diyeti ile ad libitum ile beslendi. (düşük demir diyeti kontrolü, 200ppm Fe, TD.07801, Teklad Envigo). Fareler, artan CO2 konsantrasyonlarında ötenazi edildi.

WT C57BL/6JOlaHsd fareleri, Envigo'dan sipariş edildi. WT B6. SJL-Ptprca Pepcb/ BoyJ (konjenik C57BL/6 CD45.1 eksprese eden fareler) Oxford Üniversitesi'nde kendi bünyesinde yetiştirildi. WT fareleri, transgeniklerle karşılaştırmalar yapılmadan önce kurum içinde en az 2- hafta boyunca standart bir 188 ppm demir diyetinde tutuldu. Homojen bir C57BL/6 arka planı üzerindeki TfrcY20H/Y20H fareleri, Raif Geha, Boston Çocuk Hastanesi, Harvard Tıp Okulu'ndan nazik bir hediyeydi.3 OT-I CD45.1: Transgenik C57BL/ 6.Tg(TcraTcrb)1100Mjb (OT-I) fareler BL6 konjenik soy B6 ile melezlendi. Şirket içi SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ, Mike Bogetofte Barnkob ve Vincenzo Cerundolo'nun (MRC HIU) nazik bir bağışıydı. OT-II CD45.1/CD45.2 heterozigot fareler.

Transgenik B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J (OT-II) fareleri, Oliver Bannard'ın bir hediyesiydi ve aslen The Jackson Laboratory, Bar Harbor ME'dendi ve konjenik homozigot B6 ile çaprazlandı. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ (CD45.1), Tg(TcrbaTcrb)425Cbn transgeni için heterozigot fareler, Pepc ve Pepb allelleri: OT-II CD45.1/ CD45.2 heterozigot üretmek için.

Bireysel deneylerde tüm farelerin cinsiyetleri ve yaşları eşleştirildi ({2}} hafta içinde). İn vivo aşılama deneyleri için fareler, 6-9 haftalıkken kullanıldı, deney başlatıldığında tüm fareler 6-12 haftalıktı. Her deneyde, fareler rastgele olarak tedavi gruplarına ayrıldı, öyle ki her kafeste eşit sayıda fare her tedaviyi aldı. Diyet deneyleri için fareler, deneyin başında rastgele diyet gruplarına ayrıldı.

Koşullu IRP fonksiyonu kaybı olan T hücreleri, floxed Irp1 (Aco1) ve Irp2 (Ireb2) alelleri49 taşıyan fare soylarının tamoksifen ile indüklenebilir bir CRE rekombinaz (CreERT2) sekansı taşıyan bir knock-in suşu ile çaprazlanmasıyla elde edilen hayvanlardan elde edildi. locus.50 Aco1flox/flox, Ireb2flox/flox, Rosa26 plus / plus (CRE negatif, IRP1/2flox/flox Cre –ve olarak adlandırılır) ve Aco1flox/flox,Ireb2flox/flox, Rosa26 plus /CreERT2 yavru arkadaşları (CRE pozitif, IRP1/ olarak adlandırılır) 2flox/flox Cre plus ve) homojen bir C57BL/6 zemini üzerindeydi. DKFZ'de fareler üzerinde gerçekleştirilen üreme ve prosedürler, kurumsal yönergelere göre yapıldı. Fareler, Anahtar Kaynaklar Tablosundaki Aco1 ve Ireb2 primer dizileri kullanılarak genotiplendirildi.

Enjekte edilen maddeler

Minihepsidin: Uygun bir mini-hepsidin PR7329 kütlesi (da-TH-Dpa-bhProRCR-bhPhe-Ahx-Ida(Hekzadesilamin)-NH2) yüzde 80 etanol içinde çözüldü ve sonra 60 mg Purebright SL220/ Sunbright DSPE ile karıştırıldı{13 }}CN (NOF). Kontrol solüsyonu, etanol içinde çözülmüş Purebright SL220 idi. Etanol, 5°C'ye ısıtılmış bir vakum odası kullanılarak buharlaştırıldı. Nihai jel, 24 saate kadar 4°C'de saklandı ve 1 mM'lik bir mHep konsantrasyonu verecek şekilde uygun bir su hacminde yeniden çözündürüldü: 100 mL su içinde 100 nMol mini-hepsidin, fare başına doz başına enjekte edildi.

Ferrik amonyum sitrat (FAC) (F5879 Sigma Aldrich), PBS içinde 3 mg/ml içinde çözüldü. Farelere intraperitoneal olarak 100 mL enjekte edildi. Demir dekstran (Sigma, D8517), PBS içinde 20 mg/ml'ye ayarlandı ve farelere intraperitoneal olarak 100 mL enjekte edildi.

aşılar

Modifiye vaccinia virüsü Ankara, Ovalbumin'i ifade ediyor: MVA-OVA, Oxford Üniversitesi Jenner Enstitüsü Viral Vector Core Facility'den nazik bir hediyeydi. Virüs, PBS içinde 10^7 plak oluşturucu birim (PFU)/mL'ye seyreltildi ve 100 mL, farelerin böğrüne deri altından enjekte edildi.

Ovalbumin'i ifade eden adenovirüs insan serotipi 5: AdHu5-OVA, Oxford Üniversitesi Jenner Enstitüsü Viral Vector Core Facility'den nazik bir hediyeydi. Virüs, PBS içinde 10^10 viral partikül (VP)/mL'ye seyreltildi ve 100 mL, farelerin böğrüne deri altından enjekte edildi.

Birincil OVA protein bağışıklaştırmaları için fareler 200ug (OT-I veya OT-II yanıtları için) veya 800ug (endojen yanıtlar) OVA (sonunda Ovalbumin vac-pov, Invivogen), 25ug MPLA (vac-mpla, Invivogen) ve 1 ug alfa-galaktosilseramid (GS Besra, University of Birmingham, UK veya KRN7000 Enzo Life Sciences'tan hediye). Sekonder OVA protein bağışıklaştırmaları için fareler, yan kısımda deri altından 200 ug OVA ve 25 ug MPLA aldı.

Evlat edinen transferler

OT-I CD8 veya OT-II CD4 T hücrelerinin tepkisini içeren deneyler için, alyuvarla parçalanmış dalak süspansiyonları elde edildi ve OT-I CD8 T hücrelerinin veya OT-II CD4 T hücrelerinin frekansı, akış sitometrisi ile değerlendirildi. Bütün dalak süspansiyonunun konsantrasyonu 50,000 OT-I CD8 T hücre/ml veya 500,000 OT-II CD4 T hücre/ml olarak ayarlandı ve PBS içinde 100 ul hücre süspansiyonu iv enjekte edildi

Karışık kemik iliği kimeraları

Karışık kemik iliği kimerizm deneyleri için yüzde 60 TfrcY20H/Y20H CD45.2 (veya WT CD45.2) kemik iliği karışımı, TfrcY20H/Y20H hücrelerinin kapasitesini test etmek için yüzde 40 CD45.1 kemik iliği ile birleştirildi vahşi tip hücrelere göre bağışıklık tepkilerini sulandırmak ve bunlara katkıda bulunmak. Alınan 8 haftalık erkek CD45.2 alıcıları, 300 saniye boyunca 4,5 Gy ile ölümcül şekilde ışınlandı, ardından 3-saat dinlenme ve ardından 300 saniye boyunca 4,5 Gy doz uygulandı. Fareler, akış sitometrisi ile sulandırmayı analiz etmek için 9-haftalık dinlenme periferik kanı alındıktan sonra belirtilen farelerden 2 milyon toplam kemik iliği hücresi aldı. Bakteriyel enfeksiyonu önlemek için alıcı farelere içme sularında antibiyotik verildi (0.16mg/mL Enrofloxacin (Baytril), Bayer Corporation).

Grip virüsü enfeksiyonu

İnfluenza virüsü (A/X-31 (H3N2) A/Aichi/2/1968)46, MDCK-SIAT1 hücrelerinde çoğaltıldı ve daha önce açıklandığı gibi hemaglütinasyon deneyleri ve TCID50 ile miktarı belirlendi.47

Farelere aerosol haline getirilmiş izofluran ile anestezi uygulandı ve burun içinden 0.08 hemaglutinasyon birimi (HAU) influenza virüsü X-31 ile enfekte edildi. Virüs süspansiyonu, virüsün solunması için burun delikleri üzerine damla damla pipetlendi.

Enfekte farelerin serumundaki grip-spesifik antikor titreleri, MDCK-SIAT1 hücrelerinin bir H3N2 (X31) GFP ifade eden psödotiplenmiş haberci virüsü (S-FLU) ile açıklandığı gibi47 küçük değişikliklerle enfeksiyonunun in vitro mikronötralizasyon deneyleriyle ölçüldü. Kısaca, toplanan fare serumları 56°C'de 30 dakika süreyle ısıyla inaktive edildi. Sera dilüsyonları (dilüsyon 1:40'tan başlayarak), 3e4 gösterge MDCK-SIAT1 hücresi eklenmeden önce 37°C'de 2 saat H3N2 (X31) S-FLU ile inkübe edildi. Plakalar gece boyunca 37°C'de inkübe edildi. Plakalar daha sonra yıkandı ve yüzde 10 formalin içinde sabitlendi. GFP ekspresyonu, bir Clariostar plaka okuyucusunda ölçüldü ve virüs enfeksiyonunda yüzde 50'lik bir azalmayla sonuçlanan (GFP sinyalinde yüzde 50'lik bir azalma ile belirlendi) serumun seyreltilmesi, nötralize edici titre (EC50) olarak rapor edildi.

Domuz yavrusu çalışması

Domuz yavrusu barındırma ve deneysel prosedürlerin tümü, Reading Üniversitesi Süt Ürünleri Araştırma Merkezi'nde (CEDAR), yerel etik yönergelere göre gerçekleştirildi. Tüm deneyler, Reading Animal Welfare and Ethical Review Body (AWERB) tarafından onaylandı ve Birleşik Krallık İçişleri Bakanlığı Lisansı altında yapıldı.

Demir eksikliğinin aşılamaya verilen tepkiler üzerindeki etkisini değerlendirmek için, 6 yavrudan 18 büyük beyaz F1 hibrit domuz yavrusu, 1 günlükken cinsiyetleri eşleştirilmiş 2 tedavi grubu arasında eşit olarak dağıtıldı. Tedaviler şunlardı: grup 1: sığır bazlı bebek maması sütüne benzer, demir içermeyen kontrol, beslenen domuz sütü ikamesi (SMR); grup 2: demir takviyeli beslenen (150mg/kg BW) SMR, bu grubun yarısı ayrıca 1 günlükken kas içi (IM) demir enjeksiyonu (200mg Fe) aldı (Şekil S6). CEDAR'a gelmeden önce domuz yavrularına aşı, antibiyotik veya standart hayvancılık IM demir enjeksiyonları yapılmadı. Başlangıçta domuz yavruları, kaselerden içmeyi öğrenmek için 2 gruba (ağızdan demir ve ağızdan demir takviyesi yapılmayan) yerleştirildi ve 2 günlük olduklarında ayrı ayrı barındırıldılar.

Deneme boyunca domuz yavruları, talaş ve saman üzerinde 30°C'de barındırıldı ve 12 saatlik aydınlık ve karanlık döngüsü altında ısı lambaları sağlandı ve taze içme suyuna ücretsiz erişimleri sağlandı. Domuz yavruları başlangıçta her 4 saatte bir (günde 5 besleme) yüzde 10 SMR konsantrasyonuyla (demir ilaveli veya takviyesiz) beslendi ve bu, 4. günde yüzde 15'e ve son olarak yüzde 20'ye (4 besleme/gün, standart konsantrasyon) çıkarıldı. ovma riskini azaltmak için. Haftada iki kez yapılan ağırlık ölçümlerinin ardından, deneme boyunca 150 mg/kg vücut ağırlığı elde etmek için SRM ve demir sülfat (oral demir takviyesi) miktarı buna göre artırıldı. Tüm domuz yavrularına 2 haftalıkken Mycoplasma hyopneumoniae'ye (2ml, Suwaxyn MH-One, Zoetis Ltd, Leatherhead, UK) karşı bir IM aşısı yapıldı ve 2 haftada (aşılama öncesi) EDTA olmayan vakutainerler kullanılarak venepunktur yoluyla kan örnekleri toplandı. 3 ve 4 haftalık (aşı sonrası). Kan, 80°C'de saklanan serumu elde etmek için santrifüjlenmeden önce 3-4 saat süreyle hemen buzdolabında tutuldu. 28. günde, domuz yavruları aşırı dozda pentobarbital sodyum BP yüzde 20 (Dolethal, Vetoquinol Ltd, Northamptonshire, BK) tarafından öldürüldü.

IRIDA hastaları

IRIDA ve kontrol hastalarının toplanması, genotiplenmesi ve hematolojik fenotiplenmesi daha önce tarif edilmiştir.51

Hücre kültürü

Tüm hücreler 37°C'de, yüzde 20 O2 ve yüzde 5 CO2'de kültürlendi. medya. R1'i tamamlayın0. Yüzde 10 FCS (sigma), glutamin (2mM), penisilin (100U/ml), streptomisin (0.1mg/ml) ve Beta-merkaptoetanol (55mM) içeren RPMI. Demirle modifiye edilmiş kültür ortamı. Demir içermeyen Pannexin NTS serum ikamesi (P04-95080; Pan Biotech) sipariş edildi. Demir içermeyen Pannexin NTS serum ikamesi, demir içermeyen eksiksiz hale getirmek için glutamin (2mM), penisilin (100U/ml), streptomisin (0.1mg/ml) ve Beta-merkaptoetanol (55mM) ile birlikte RPMI'ye yüzde 10 v/v oranında eklendi orta. Demir içermeyen tam ortamın demir içeriğini değiştirmek için, belirtilen konsantrasyonda holo transferrin (T0665 Sigma Aldrich) eklendi. Apotransferrin (T1147 Sigma Aldrich), ortamın toplam transferrin konsantrasyonunu 1.2 mg/ml'de tutmak için demir içermeyen tam ortama da ilave edildi.

CD8 T hücreleri. Tek hücreli süspansiyonlar, 40 mm'lik bir hücre süzgeci aracılığıyla mekanik ayırma yoluyla servikal, inguinal, aksiller ve brakiyal lenf düğümlerinden yapılmıştır. Proliferasyon analiz edildiğinde, lenf düğümü süspansiyonları, 500 mL PBS içinde 5mM Invitrogen Cell Trace Violet (C34557) ile yeniden süspanse edildi ve 12ml tam ortam ile söndürülmeden, yıkanmadan ve T hücresi izolasyonuna geçmeden önce 37°C'de 8 dakika boyandı. CD8 T hücreleri, Stem Cell Technologies CD8 T hücre izolasyon kiti (19853, Stem Cell Technologies) ve Easy Plate Magnet kullanılarak WT C57BL/6, TfrcY20H/Y20H, OT-I CD45.1 lenf düğümlerinden ve IRP1'den izole edildi. Üreticinin talimatlarına göre Miltenyi Biotech negatif CD8 T hücre izolasyon kitini (130-104-075, Miltenyi Biotech) kullanan /2flox/flox Cre -/ artı ve fareler.

Düz tabanlı doku kültürüyle işlenmiş plakalar, 2 saat 37°C'de 5 mg/ml anti-fare CD3 (145-2C11) ile kaplandı ve ardından PBS ile yıkandı. CD8 T hücreleri, 100U/ml fare IL-2 nihai konsantrasyonu ve 1 mg/ml anti-fare CD28 (37.51) içeren tam bir ortam içinde kaplanmıştır. TfrcY20H/Y20H, WT C57BL/6 hücreleri veya IRP1/2flox/flox Cre -/ plus ve içeren kültürler, tam bir R10 ortamında gerçekleştirildi. Azaltılmış demir konsantrasyonunun C57BL6/ veya OT-1 CD45.1 farelerinden alınan WT T hücreleri üzerindeki etkisini inceleyen kültürler, demir içermeyen tam ortamda gerçekleştirildi. CD8 T hücreleri, proliferasyon analizi için aktivasyondan 72 saat sonra analiz için 500,000/ml'lik bir nihai konsantrasyonda veya aktivasyon analizi için aktivasyondan 24 saat sonra analiz için 700,000/ml'lik bir nihai konsantrasyonda kaplandı.

IRP1/2flox/flox Cre -/ plus kültürü için ve hücreler, 100 nM'de 4-hidroksitamoksifen (4-OHT) (H6278, Sigma/Merck) veya karşılaştırılabilir hacimde saf etanol ile işlendi çözünür anti-CD28, IL-2 ve plakaya bağlı anti-CD3'ün aktivasyon karışımı ile eşzamanlı. Hücre proliferasyonu analiz edildiğinde, 24 saatlik kültürden sonra hücreler toplandı, döndürüldü ve {{19}'ı çıkarmak için 100U/ml fare IL-2 ve 1 mg/ml anti-fare CD28 içeren taze ortamda yeniden süspanse edildi }OHT veya EtOH ve anti-fare CD3 ile kaplanmış oyuklarda tekrar kaplandı. Hücreler, 48 saat daha kültürlendi ve proliferasyon, akış sitometrisi ile değerlendirildi.

Demir kurtarma deneyleri için, kültürün başlangıcından itibaren belirtilen konsantrasyonda demir sülfat (FeSO4) (F8633, Sigma Aldrich) veya ferrik amonyum sitrat (FAC) (F5879, Sigma Aldrich) eklendi ve çantada tekrar dolduruldu. 4-OHT/EtOH çıkarıldığında 24 saat sonra IRP1/2flox/flox Cre -/ artı beş deney.

BMDC'ler, küçük değişikliklerle tarif edildiği gibi52 kültürlendi. Kısaca, C57BL/6 farelerinden alınan kırmızı hücreli parçalanmış kemik iliği hücreleri, 100 ng/ml FLT3L (550702, Biolegend) içeren tam R10 ortamında 1 milyon hücre/ml'de yeniden süspanse edildi ve kullanımdan önce 7 gün süreyle kültürlendi.

YÖNTEM DETAYLARI

Akış sitometrisi

Lenf düğümlerinin veya dalağın tek hücreli süspansiyonları, 40 mm'lik bir hücre süzgeci aracılığıyla mekanik ayrışma yoluyla yapıldı. Kırmızı hücreler, Tris amonyum klorür (ACT) kullanılarak dalak süspansiyonlarında parçalanmıştır.

Lenfositleri akciğerden izole etmek için, akciğerler makasla kıyılmış ve 4 ml sindirim ortamında 3{5} dakika sindirilmiştir: RPMI, 40U/ml DNaz I (Sigma-Aldrich, katalog numarası: D5025) ve 0.4 mg/ ml Kollajenaz IV (Sigma-Aldrich, katalog numarası: C5138). Tek hücreli süspansiyonlar, bir 70-hücre süzgecinden geçirilerek yapıldı. Hücreler peletlendi ve kırmızı hücreler, ACT Kırmızı hücre lizis tamponu ile parçalandı. Daha sonra akciğer süspansiyonunda lenfositleri zenginleştirmek için yüzde 40 /yüzde 80 Percoll (GE Healthcare 17-0891-02) katman izolasyonu kullanıldı. Zenginleştirilmiş lenfositler daha sonra yıkandı ve akış boyamadan önce sayıldı.

Murin periferal kan lökositlerinin analizi için, bir BD mikro eğitici EDTA tüpüne kuyruk kanaması yoluyla toplanan 100 ml tam kan, 1 ml ACT Kırmızı Hücre lizis tamponu ile karıştırıldı ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edildi. Kan solüsyonu 400 g'de 5 dakika döndürüldü, süpernatan çıkarıldı ve lökosit topağı, akış sitometrik boyama için yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarıldı.

Aktivasyondan sonra uygun zaman noktalarında doku hücresi süspansiyonları veya in vitro aktive edilmiş hücreler, kuyucuklu bir 96-dipli plakaya aktarıldı, döndürüldü ve 200 mL PBS ile yıkandı. Hücreler, karanlıkta 4°C'de 20 dakika boyunca 40 mL PBS içinde uygun konsantrasyonlarda FC reseptör bloğu, florofor-konjüge edilmiş antikorlar ve sabitlenebilir bir canlı ölü boya ile boyandı. Hücreler yıkandı ve doğrudan bir Invitrogen Attune veya BD LSR Fortessa üzerinde çalıştırıldı. Bazı deneyler için hücreler, yıkanmadan ve analiz için yeniden süspanse edilmeden önce karanlıkta 4°C'de 100ul yüzde 4 paraformaldehit içinde 10 dakika sabitlendi veya hücre içi antijenleri lekelemek için saponin bazlı perma tamponunda yeniden süspanse edildi.

NIH tetramer tesisinden reaktifler kullanılarak tetramer boyama, antikor boyamadan önce oda sıcaklığında 3{2} dakika FACs tamponunda (yüzde 2 FCS ve yüzde 0.04 Sodyum Azid içeren PBS) gerçekleştirildi.

Mitokondriyal analiz için hücreler yıkandı ve Mitotracker Green (M7514, Thermofisher Scientific) ve Mitotracker Deep Red (M22426, Thermofisher Scientific) ile 100 nM'de tam ortamda (serum demir eksikliği özetleyen kültürler için demir eksikliği olan ortam veya TfrcY20H/ için R10) ile boyandı. Y20H kültürleri) üreticinin talimatlarına göre 37°C'de 30 dakika. MTDR boyamasının, yayınlanmış literatürle tutarlı olarak Karbonil siyanür-p-triflorometoksifenilhidrazon (FCCP) ile mitokondriyal membran potansiyelinin farmakolojik bozulmasına duyarlı olduğunu bulduk.53 MTDR'nin MTG'ye oranı, mitokondri hacmi için normalize edilmiş membran potansiyelini belirtmek için hesaplandı .

Hücre içi sitokinlerin saptanması için splenositler, 0.1 mg/ml SIINFEKL (OVA 257-264)( OVA'ya özgü yanıtlar için Vac-sin Invivogen) peptidi, Vaccinia'ya özgü yanıtlar için 0,5 mg/ml B8R peptidi (AS-64688, Anaspec) veya 1ug/ml OVA (323-339), (Va- is, Invivogen) OT-II sitokin üretimini indüklemek için. 30 dakika sonra 5 mg/ml Brefeldin A eklendi ve hücreler, akış sitometrisi için yüzey/hücre içi boyamadan önce 4 saat daha kültürlendi.

ICS tarafından MVA'ya özgü CD4 tepkilerinin saptanması için, 7. gün BMDC, 50ng/ml FLT3L ile bir kuyucuklu plakanın oyuk başına 0,3 milyon hücreyle kaplandı. BMDC'ler ya uyarılmadan bırakıldı, 0.5 mM CpG (ODN 1826) (Tlrl-1826, Invivogen) ile spesifik olarak uyarılmadı veya gece boyunca MOI of 1 MVA-OVA ile enfekte edildi. Ertesi gün hücreler yıkandı ve bağışıklaştırılmamış veya MVA ile aşılanmış farelerden alınan 2 milyon splenosit eklendi. 30 dakika sonra Brefeldin A, 5 mg/ml'lik bir nihai konsantrasyona ilave edildi ve hücreler, akış sitometrisi için yüzey/hücre içi boyamadan önce 4 saat daha kültürlendi. Sitokin salgılayan CD4 T hücreleri, CD154 artı sitokin artı olarak tanımlandı (saf farelerden alınan CpG atımlı DC'ler veya CD4'ler üzerindeki uyarılmamış CD4 ile karşılaştırıldığında).

Kullanılan antikorlar için Anahtar Kaynaklar Tablosuna bakın.

Anahtar popülasyonlar için örnek geçitleme şemaları, Ek Yöntemler Şekil 1-6'da gösterilmektedir. CD8 artı CD44 artı Tetramer artı CD8 T hücreleri (Ek Yöntemler Şekil 1A) ve mini hepsidinin tetramer-pozitif CD8'ler üzerindeki etkisi (Ek Yöntemler Şekil 1B). B220 artı IgD- CD95 artı germinal merkez B hücreleri (Ek Yöntemler Şekil 2A) ve mini hepsidinin germinal merkez B hücreleri üzerindeki etkisi (Ek Yöntemler Şekil 2B). CD4 artı CD44 artı CXCR5 artı PD-1 artı T foliküler yardımcı hücreler (Ek Yöntemler Şekil 3A) ve mini hepsidinin T foliküler yardımcı hücreler üzerindeki etkisi (Ek Yöntemler Şekil 3B). CD138 artı IgD- plazma hücreleri (Ek Yöntemler Şekil 4A) ve mini hepsidinin plazma üzerindeki etkisi (Ek Yöntemler Şekil 4B). CD8 artı CD45.1 artı OT-I CD8'leri (Ek Yöntemler Şekil 5A) ve mini hepsidinin OT-I efektör hücreleri üzerindeki etkisi (Ek Yöntemler Şekil 5B). OT-I IFN-gama, TNF-alfa veya IL-2 üreten CD8 T hücrelerinin ICS tarafından kaplanması (Ek Yöntemler Şekil 6A) ve mini hepsidinin sitokin üreten CD8 T hücreleri üzerindeki etkisi (Ek Yöntemler Şekil 6B).

Kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) ile gen ekspresyonu analizi

Karaciğer eksplantlarından veya akciğer loblarından RNA ekstrakte edildi, daha sonra RNA'ya (AM7020 Thermofisher Scientific) ve RNeasy plus kitiyle (QIAGEN, 74136) hızlı dondurulmuş hücre peletlerine toplandı ve Applied'de kantitatif PCR için cDNA'ya (Life Technologies, 4387406) ters kopyalandı Anahtar Kaynaklar Tablosunda listelenen TaqMan tahlillerini kullanan Biosystems 6500 Fast Real-Time PCR sistem makinesi. üreticinin protokollerine göre. Gen ifadesi 2^([endojen kontrol geninin CT'si] – [ilgili genin CT'si]) olarak sunulur. Hprt, karaciğer ve akciğer qRT-PCR için endojen bir kontrol geni kullanmıştır. CT, T hücresi aktivasyonu sırasında değişmediğinden, CD8 T hücre kültürleri için bir kontrol geni olarak B2m kullanıldı.

Doku ve serum demir ölçümleri

Dokular 100C'de 3 saat kurutuldu ve doku parçasının kuru kütlesi ölçüldü. Doku parçaları, 65°C'de 20 saat boyunca yüzde 10 trikloroasetik asit/yüzde 30 hidroklorik asit içinde sindirildi. Hem olmayan demir içeriği, asitle sindirilmiş dokunun, yüzde 0,1 (ağırlık/hacim) batofenantrolindisülfonik asit (Sigma, 146617) ve yüzde 0,8 tiyoglikolik asit (Sigma, 88652) içeren kromojen reaktif ile 535 nm'de absorpsiyon ölçülerek ve karşılaştırılarak reaksiyonuyla belirlendi. açıklandığı gibi standart bir ferrik amonyum sitrat eğrisine.54

Murin örneklerinin serum analizi için kardiyak ponksiyon yoluyla elde edilen 400 ml'ye kadar kan bir BD mikro eğitici SST tüpüne (Beckton Dickinson) yerleştirildi. Serum döndürülerek elde edilen pıhtılaşmış kan numunesi 8,000 g'de 5 dakika döndürüldü ve 80°C'de saklandı. Serum demiri, Abbott Architect c16000 otomatik analiz cihazı (Abbott Laboratories) ve İngiltere'deki Oxford John Radcliffe Hastanesi'ndeki MULTIGENT Demir Kiti kullanılarak belirlendi.

Domuz yavrusu çalışmasının analizi

Domuz serum demiri, OUHNHS Klinik Biyokimya Departmanında bir Abbott Architect c16000 otomatik analiz cihazında (Abbott Laboratories) otomatik bir tahlil kullanılarak ölçüldü. Serum numuneleri, üreticinin Biobest Laboratories Ltd, Edinburgh'daki talimatlarına göre ticari bir monoklonal bloke edici ELISA (M. hyopneumoniae saptama kiti, Thermo Scientific Oxoid, UK, K004311) kullanılarak M. hyopneumoniae antikorları için test edildi; numune optik yoğunluk (OD) sonuçları, tampon kontrol oyuklarının ortalama OD'si kullanılarak düzeltildi. Nötralize edici antikorların (izotipin agnostiği) serum titreleri, tanımlanan anti-M'nin bağlanmasından türetilen sinyal bloke etme yüzdesi olarak hesaplandı. hyopneumoniae HRP konjuge antikoru teste dahil edilmiştir. Sonuçlar, 14. güne (bağışıklama günü) göre 28. günde (bağışıklamadan 14 gün sonra) blok yüzdesinde gelişme olarak rapor edildi ve kalıtsal anne antikorunun üzerindeki antikor yanıtlarındaki gelişmeyi saptadı.=yüzde blokunda iyileştirme (28. günde yüzde blok) – (14. günde yüzde blok).

Murin anti-OVA IgG titreleri

İmmünize edilmiş farelerden alınan OVA proteinine karşı antikor titreleri, ELISA ile belirlendi. Kısaca, plakalar gece boyunca OVA proteini (InvivoGen Endofit, 50 ml/oyuk, 10 mg/ml) ile kaplandı. Test serumlarının dilüsyonları (üç kopya halinde) plakaya eklendi. Plakalar 6 kez PBS-T (PBS, yüzde 0.05 Tween) ile yıkandı. OVA bağlayıcı IgG'yi saptamak için, bir alkalin-fosfataz-konjuge keçi anti-fare IgG'sini (Sigma Aldrich A-3562) bağlayan keçi anti-fare sekonder Ab'si, ardından ilave yıkama. pNPP substratı eklendikten sonra OD405, bir ELx800 plaka okuyucu (Bio-Tek) kullanılarak ölçüldü. OD'nin ilk olarak arka plan artı 3 SD'nin altında olduğu seyreltme, uç nokta titresi olarak AU cinsinden kaydedildi.

IRIDA hastalarında insan serum antikor ölçümleri

Kızamık, Kabakulak, Kızamıkçık, Suçiçeği, Ptx, FHA, PRN, Dtxd, Ttx, Hib ve Streptococcus pneumonia serotipleri 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C'ye karşı antikor konsantrasyonları (IgG), Mutant TMPRSS6 alelleri ve demir eksikliği olmayan vahşi tip TMPRSS6 kontrolleri olan IRIDA hastalarından alınan serumlardaki 19A, 19F, 23F Ulusal Halk Sağlığı ve Çevre Enstitüsü, Bilthoven, Hollanda'da ölçülmüştür. Hiçbir durumda, TMPRSS6 hastalarında ortalama antikor konsantrasyonu önemli ölçüde yüksek değildi.

histoloji

Hava yolu iltihabını değerlendirmek için, akciğer numuneleri fosfat tamponunda yüzde 4 paraformaldehit ile sabitlendi ve i3S, Portekiz'deki HEMS çekirdek tesisinde parafine gömüldü. Ksilen ile deparafinizasyon ve bir derece alkolden geçirilerek hidrasyondan sonra 3 mm kalınlığındaki kesitler hematoksilen-eozin ile boyandı. Pulmoner inflamasyon için histopatoloji skorları aşağıdaki gibi değiştirilmiş kriterler55 kullanılarak atanmıştır: 0, normal, inflamasyon yok; 1, minimal, nadir enflamasyon odakları; 2, perivasküler/peribronşiyolar bölmede hafif, enflamatuar hücre infiltratı, alveoler uzantı yok veya çok az; 3, perivasküler/peribronşiyolar boşlukta orta derecede enflamatuar hücre infiltratı ve alveoler parankime orta derecede yayılma; ve 4, perivasküler/peribronşiyolar boşluğa şiddetli, inflamatuar hücre infiltratı ve alveolar parankimde bulunan daha büyük inflamatuar odaklar.

Nötrofilik infiltrasyon, polimorfonükleer lökosit (PMN) kanıtı olmaksızın 0 olarak sınıflandırıldı; 1, dağılmış PMN'nin varlığı; 2, fokal kümelenme ile sık PMN; 3, multifokal toplama ile sık PMN. Nötrofil infiltrasyonu, Centro Hospitalar de Sa˜ o Joa˜o, Portekiz'deki Anatomik Patoloji Servisinde gerçekleştirilen kloroasetat esteraz (Leder) boyası ile ayrıca değerlendirildi. Orcein boyaması (IPATIMUP Diagnostics, Portekiz'de gerçekleştirildi) alveolar septanın elastik liflerini değerlendirmek ve inflamatuar infiltratın varlığıyla ilişkili alveoler akciğer yapısındaki değişiklik derecesini değerlendirmek için kullanıldı. Kesitler, eğitimli bir patolog da dahil olmak üzere iki araştırmacı tarafından, tedavi grupları hakkında önceden bilgi sahibi olmadan, kör bir şekilde puanlandı. Ortalama puan hesaplandı ve tedavi grupları arasında karşılaştırıldı. Dalak bölümleri benzer şekilde işlendi, ancak standart prosedürler kullanılarak Perls'in ferrik demir için Prusya mavisi reaksiyonu ile boyandı.

Seahorse metabolik akı analizi ile ATP üretim hızı

ATP üretim hızı ve mitokondriyal ve glikolitik metabolizmanın buna göreli katkısı, Agilent Seahorse XF gerçek zamanlı ATP oranı tahlil kiti (103592-100) ve bir Aligent XF96 cihazı kullanılarak üreticinin protokolüne göre hesaplandı. Kısaca CD8 T hücreleri, belirtilen transferrin konsantrasyonuna sahip ortamda 48 saatlik aktivasyondan sonra toplandı, yıkandı ve Seahorse Tahlil Ortamında (1mM piruvat, 2mM L-glutamin ve 10mM Glikoz ile tamponlanmamış RPMI pH 7.40) yeniden süspanse edildi. ve 150,{12}} canlı hücre/göz, bir Poly-D-lizin kaplı XF96 mikroplakasına bölündü. Oksijen tüketim oranları (OCR) ve hücre dışı asitleştirme oranları (ECAR), 1,5 mM Oligomisin ve 0,5 mM Rotenone/Antimycin A'nın art arda eklenmesiyle ölçülmüştür.

Lüminesans ile ATP ölçümü

ATP üretimi, üreticinin talimatlarına göre Cell Titer-Glo (Promega G7570) kullanılarak ölçüldü. Kısaca CD8 T hücreleri, 24 saat boyunca 'hücre kültürü'nde tarif edildiği gibi kültürlendi (ve bu nedenle hücre bölünmesinin başlamasından önce analiz edildi), döndürüldü ve 50 mL ortam içinde yeniden süspanse edildi (demir eksikliği kültürleri için demir içermez, normal RPMI ile TfrcY20H/Y20H kültürleri için yüzde 10 FCS), lüminesans ölçümleri için uygun bir beyaz duvarlı opak 96-kuyulu plakaya aktarıldı ve 50 mL Cell Titer-Glo eklendi. Kuyular karıştırıldı ve ATP içeriğiyle orantılı olarak lüminesans, bir Promega GloMax Luminometre üzerinde ölçüldü.

ÖLÇEKLEME VE İSTATİSTİKSEL ANALİZ

Aynı yaş ve cinsiyetteki farelerle yapılan in vivo deneyler için standart rastgeleleştirme prosedürleri kullanıldı (deneysel ve kontrol fareleri, yavrular arasından rastgele seçildi). Araştırmacılar, deneyler ve değerlendirmeler sırasında tahsisat konusunda kör değildi. Her deney için gereken fare sayısı, yetiştirilmiş hayvanların mevcudiyeti, güç hesaplamaları, aynı fare suşları ile deney yapma önceki deneyimleri ve pilot deneylerden elde edilen verilerden belirlendi. İstatistiksel analizler, Prism sürüm 6 (GraphPad Yazılımı) kullanılarak yapıldı. Spesifik istatistiksel testlerin detayları şekil açıklamalarında verilmiştir.

TMPRSS6 IRIDA hastalarının antikor konsantrasyonları için SPSS (IBM SPSS Statistics, Version 22) ile istatistiksel analizler yaptık. Veriler, Smirnov-Kolmogorov testleri ve histogram çizimlerinin görsel olarak incelenmesi yoluyla normallik açısından kontrol edildi. Normal dağılmayan veriler, istatistiksel analizler için logaritmik olarak dönüştürüldü. Katılımcıların difteri önleyici serum IgG konsantrasyonları R 0$1IU/ml,56 anti-tetanoz IgG > 0,5IU/ml,57 anti-Hib IgG > 1 olduğunda immünolojik yanıtı koruyucu olarak tanımladık. 0mg/ml,57 anti-PCV IgG R 0$35 mg/ml58 ve anti-kızamık IgG R 0$12IU/ml.59.

Boğmacaya karşı IgG için belirlenmiş koruyucu serum konsantrasyonu yoktur.57 Gruplar arası etkiler için, bağımsız numune t-testleri veya bağımsız numune parametrik olmayan testler kullanılmıştır. Grubun (IRIDA'ya karşı kontrol) serum IgG konsantrasyonları üzerindeki etkisini değerlendirmek için bir kovaryans analizi (ANCOVA) yaptık. Grup, sabit bir etki olarak tanımlandı ve sırayla aşı yanıtının bilinen belirleyicilerini ekledik: modellere ortak değişkenler olarak cinsiyet, yaş, Hb ve TSAT. IRIDA ve kontrol grupları arasında serokonversiyonu karşılaştırmak için Pearson Ki-Kare testi ve Fisher's Exact testi yaptık.

For more information:1950477648nn@gmail.com