Herba Cistanche Ekstraktı, Ayrılan Proteinlerin Olası İndüksiyonu İle Sıçan Kalplerinde Mitokondriyal Glutatyon Durumunu ve Solunumu Geliştirir

giriiş

Daha önce iskemik olan miyokardın reperfüzyonu, artan reaktif oksijen türleri (ROS) üretimi, Ca2 ve Ca dahil olmak üzere bir dizi mitokondriyal değişikliğe neden olur.2+aşırı yük ve adenozin trifosfat (ATP) üretiminde azalma, bunların tümü nekroz ve/veya apoptoz aracılı hücre ölümüne yol açabilir (Redegeld ve diğerleri, 1992; Lemasters ve diğerleri, 1998). Mitokondri kararda çok önemli bir rol oynadığındanBir iskemi/reperfüzyon (I/R) uyarısını takiben kardiyomiyositlerin kaderini belirlemek için, miyokardiyal I/R hasarına karşı koruma, bu nedenle mitokondriyal yapısal ve fonksiyonel bütünlüğün korunmasına yönelik olmalıdır. İ/R uyarısından sonra mitokondriyal enerji metabolizmasının sürdürülmesi özellikle önemlidir çünkü kalp kasılma fonksiyonu neredeyse tamamen mitokondri tarafından üretilen ATP'ye bağlıdır. Canlı olan ancak kasılmayan kardiyomiyositlerin çok az faydası vardır.

BAĞIŞIKLIĞI GELİŞTİRMEK İÇİN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Herba Cistanche, kurutulmuş bitkinin tamamıCistanche DeserticolaYC Ma (Orobanchaceae), çoğunlukla kuzey ve kuzeydoğu Çin'in çöl bölgelerinde yetişen parazit bir bitkidir. Çin tıbbında "Yang'ı canlandırıcı" bir bitki olarak sınıflandırılan Herba Cistanche, böbrek yetmezliği, kadınlarda kısırlık ve yaşlı hastalarda bağırsak kuruluğundan kaynaklanan kabızlık için reçete edilmektedir (Chen, 1998). Laboratuvarımızda yapılan önceki çalışmalar, bir metanolünHerba Cistanche özümiyokardiyal ATP üretim kapasitesini arttırır (Leung ve Ko, 2008) ve sıçanlarda miyokardiyal I/R hasarına karşı korur (Leung, 2006). ATP üretim kapasitesinin uyarılması, mitokondriyal elektron taşınmasındaki artışla paralellik gösterirken (Leung & Ko, 2008), Herba Cistanche tedavisinin sağladığı I/R hasarına karşı kardiyo koruma, miyokardiyal ATP tükenmesinde bir azalma ile ilişkilendirildi (Leung, 2006). Bu çalışmada Herba Cistanche'nin kardiyoprotektif etkisinde mitokondrinin rolünü tanımlamak için Herba Cistanche tedavisinin sıçan kalplerinde mitokondriyal glutatyon durumu, Ca2+ içeriği, membran potansiyeli ve solunum hızı üzerindeki etkisini araştırdık. .

Malzemeler ve yöntemler

Bitkisel malzeme

Herba Cistanche, yerel (Hong Kong merkezli) bir bitki satıcısından (Lee Hoong Kee) satın alındı. Bitkinin kimliği tedarikçi tarafından doğrulandı ve bir kupon örneği (HKUST00301) Hong Kong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi (HKUST) Biyokimya Bölümü'ne bırakıldı. Bitkinin metanol ekstraksiyonu, böyle bir ekstraktın mitokondriyal ATP üretimini arttırdığını ve sıçan kalplerinde I/R hasarına karşı koruduğunu gösteren önceki çalışmalara dayanarak gerçekleştirilmiştir (Leung, 2006; Leung & Ko, 2008). Kısaca, Herba Cistanche (400 g) küçük parçalar halinde kesildi ve daha önce açıklandığı gibi (Leung & Ko, 2008) 2 saat boyunca 60 derecede 300 mL metanol içerisinde geri akış altında ısıtılarak ekstrakte edildi. Prosedür iki kez tekrarlandı. Havuzlanan ekstrakt, solventin indirgenmiş basınç altında buharlaştırılmasıyla kurutuldu; ham bitki miktarına göre verim %42 (ağırlık/ağırlık) idi. Ekstrakt kullanılıncaya kadar 4 derecede saklandı. Her ne kadar Çin bitkileri geleneksel olarak ağızdan tüketim için suyla ekstrakte edilse de, daha önceki çalışmamızda numunelerin işlenmesinde ve saklanmasında kolaylık sağlamak için metanol kullanılmıştı (Yim & Ko, 2002) ve metanol ekstraksiyonunun her açıdan tatmin edici olduğunu gördük.

Hayvan bakımı ve ilaç tedavisi

Yetişkin dişi Sprague-Dawley sıçanları (8-10 haftalık; 200-230 g), yaklaşık 22 derecede 12 saatlik karanlık/aydınlık döngüsüne sahip, nem kontrollü bir odada barındırıldı ve yiyecek ve suya ad libitum izin verildi. Hayvanlar, her grupta beş hayvan olacak şekilde rastgele farklı gruplara atandı. Fareler aldıHerba Cistanche özüart arda 3 gün boyunca intragastrik olarak ({{0}},2 g/mL suda) 0,5g/kg veya 1,0 g/kg'da. Kontrol (tedavi edilmeyen) hayvanlara yalnızca su verildi. Son dozlamadan yirmi dört saat sonra, biyokimyasal analiz için anestezi altındaki hayvanlardan kalp ventriküler dokusu elde edildi. Tüm deney protokolleri, HKUST Araştırma Uygulama Komitesi tarafından onaylandı.

Mitokondriyal fraksiyonların hazırlanması

Kıyılmış kalp ventriküler dokuları (~{{{0}}.6g), buz soğukluğunda sakkaroz tamponunun [0.32M sukroz, 1 mM etilen diamin tetraasetik asit] 10-kat (a/h) fazlalığında homojenleştirildi (EDTA), 50 mM Tris/HCl; pH 7,4] Teflon cam homojenleştirici kullanılarak, 4000 rpm'de, 25-30 vuruşla. Mitokondriyal peletler, 800 x g'de 4 derecede 30 dakika boyunca santrifüjleme yoluyla doku homojenatlarından hazırlandı ve saflık, daha önce açıklandığı gibi sırasıyla süpernatan ve pelet içindeki süksinat dehidrojenaz ve laktat dehidrojenazın göreceli spesifik aktivitelerinin ölçülmesiyle belirlendi (Evans, 1992). Mitokondriyal peletler 1 mL homojenleştirme tamponu içerisinde süspanse edildi.

Mitokondriyal indirgenmiş glutatyon ve oksitlenmiş glutatyon seviyelerinin ölçümü

Mitokondriyal indirgenmiş glutatyon (GSH) seviyeleri, Griffith'ten (198{{17}) değiştirilmiş bir protokolde 5,59-ditiyobis(2- nitrobenzoik asit) (DTNB) ve glutatyon redüktaz (GR) kullanılarak enzimatik olarak belirlendi. }). Mitokondriyal fraksiyonun bir kısmı (210 µL), 90 µL %10 (h/h) 5-sülfosalisilik asit (SSA) ile karıştırıldı ve Karışım 600xg'de 10 dakika santrifüj edildi. Oksitlenmiş glutatyon (GSSG) seviyelerini ölçmek için, 100 uL miktarlarda SSA süpernatanları, mikrofüj tüplerinde 10 uL %20 (a/h) 2-vinilpiridin ve 10 uL %60 (h/h) trietanolamin ile karıştırıldı. Her tüpün oda sıcaklığında en az 1 saat beklemesine izin verildi. Fosfat tamponu (0,1 M, 5 mM Na2 EDTA ile; pH 7,5) içerisinde 0,63 mM DTNB ve 0,053 mM NADPH (indirgenmiş nikotinamid adenin dinükleotit fosfat) içeren bir reaksiyon karışımı, 2 dakika boyunca 30 derecede önceden inkübe edildi. Bir SSA numunesi süpernatanından (toplam glutatyon) veya bir GSSG numunesinden bir kısım (30 uL), bir 96-kuyucuklu mikrotitre plakasının bir oyuğuna ve 0,525U/ içeren 180 uL önceden ısıtılmış reaksiyon karışımına ilave edildi. Daha sonra mL GR eklendi. 412 nm'deki absorbans değişiklikleri 5 dakika boyunca spektrofotometrik olarak izlendi. GSH ve GSSG konsantrasyonları, standartlar olarak GSH ve GSSG [%3 (a/h) SSA içinde çözünmüş] kullanılarak kalibrasyon eğrilerinden tahmin edildi ve nmol/mg protein olarak ifade edildi. GSH seviyeleri, toplam GSH'den GSSG miktarının iki katının çıkarılmasıyla tahmin edildi.

CİNSEL FONKSİYONU GELİŞTİREN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Mitokondriyal Ca2+ içeriğinin ölçümü

Mitokondriyal Ca{{0}} içeriği, Victor2 Çoklu Etiket Sayacı kullanılarak Ca2+-duyarlı bir floresan probu, Fluo-5N AM ester (Molecular Probes, Eugene, OR) kullanılarak ölçülmüştür. (Model 1420; PerkinElmer, Turku, Finlandiya), Menze ve ark. (2005). Ca2+ ayrışma sabitleri (Kd değerleri), 1–1000 µM konsantrasyon aralığında geçerli bir Ca2+ kalibrasyon kiti kullanılarak belirlendi; Kit üreticisinin verilerine göre tahmini Kd değerleri yüksek güvenilirlikle 90–100 µM idi. Mitokondriyal fraksiyonun bir kısmı (25uL) (0,5mg protein/mL nihai konsantrasyon), 25 uL inkübasyon tamponu (100mM KCl ve 30mM MOPS [3-(N-morfolino)propansülfonik asit] ile karıştırıldı; 96-iyice siyah bir mikrotitre plakasında pH7,2}. Karışım 25 derecede 15 dakika inkübe edildi; Daha sonra 25 uL dijitonin (50 ug/mL) ve 25 uL Fluo-5N AM ester (%0,005 (a/h) Pluronic F-127 içinde 1 uM) ilave edildi. Dijitonin, membran geçirgenliğini kolaylaştırarak, floresan boyanın mitokondriyal girişine aracılık etti. Digitonin varlığında sıçan kalp mitokondriyal preparatlarındaki Fluo-5N seviyelerinin 20-kat arttığını bulduk. Reaksiyon karışımları 25 derecede 30 dakika süreyle inkübe edildi ve floresans okumaları, 488 nm'lik bir uyarılma dalga boyunda ve 532 nm'lik bir emisyon dalga boyunda ölçüldü. Mitokondriyal Ca2+ içerikleri bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak tahmin edildi ve µmol/mg protein olarak ifade edildi.

Mitokondriyal membran potansiyelinin ölçümü

Membran potansiyeli (ΔΨm), Bonavita ve ark.'nınkinden değiştirilmiş bir yöntemle değerlendirildi. (2003), bir floresan boya kullanarak, lipofilik katyonik prob 5,596,69- tetrakloro-1,193,39-tetraetilbenzimidazolilkarbosiyanin iyodür, yaygın olarak JC-1 olarak adlandırılır. Mitokondriyal fraksiyonların alikotları (50 uL) (1 mg protein/mL'ye ayarlanmış), 50 uL substrat çözeltisi (6 mM piruvat ve 6 mM malat içeren), 25 uL önceden işlenmiş adenozin difosfat (ADP) (30 mM) çözeltisi ile 37 derecede inkübe edildi, ve karanlıkta 25 µL 3 µM JC-1. ΔΨm değerleri, Victor2 MultiLabel Counter kullanılarak 535 nm'de (FL1) floresans 580 nm'de (FL2) ölçülerek elde edildi. JC-1 mitokondride kümeler oluşturur, bu da yüksek FL2 floresans değerlerine neden olur ve normal mitokondriyal potansiyele işaret eder. ΔΨm kaybı, FL2 floresansında bir azalmaya (JC-1 daha az düzeyde toplanır) ve buna eşlik eden FL1 floresansında (JC-1 monomerlerinden) bir artışa yol açar. Veriler FL1/FL2 floresans değerlerinin oranları olarak ifade edildi. Testi doğrulamak için bir ΔΨm-çöktürücü ajan olan karbonil siyanür m-klorofenilhidrazon (CCCP) kullanıldı.

Mitokondriyal solunumun ölçümü

Mitokondriyal solunum hızı, Clark tipi oksijen elektrotuyla (Sarasota, FL, ABD) donatılmış bir Hansatech Oxygraph-Plus cihazı kullanılarak 37 derecede ölçüldü. Mitokondriyal fraksiyonlar (0.6mg protein/mL), 125mM KCl, 20mM MOPS, 10mM Tris, 0.5mM etilen glikol tetraasetik asit (EGTA) ve 2mM KH2P04 içeren solunum tamponunda süspanse edildi; PH'ı 7.2. 37 derecede 2 dakika inkübasyonun ardından her numuneye 50 µL substrat solüsyonu (5 mM piruvat ve 5 mM malat) verildi. Solunum oranları, 1 mM ADP varlığında (Durum 3) ve tüm ADP'nin ATP'ye fosforilasyonundan sonra (Durum 4) ölçüldü. Durum 3: Durum 4 solunum hızlarının oranı, solunum ve fosforilasyon arasındaki bağlantının sıkılığını gösteren solunum kontrol indeksidir (Javadov ve diğerleri, 2005; Kuwabara ve diğerleri, 1997). Substrat çözeltisinin eklenmesinden önce, Durum 1 solunum hızı, Durum 2 solunumunun başlangıcına kadar ölçülmüş ve Durum 2 solunum hızı, ADP eklenmeden önce tahmin edilmiştir.

istatistiksel analiz

Veriler, çoklu grup karşılaştırmaları için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile analiz edildi. P değerleri < 0.05 olduğunda iki grup arasındaki anlamlı farkları belirlemek için en az anlamlı fark (LSD) değerleri kullanıldı.

CİNSEL FONKSİYONU GELİŞTİREN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Sonuçlar

Şekil 1 ve 2'de gösterildiği gibi metanolle işlemHerba Cistanche özü({{0}}.5 veya 1.0g/kg/day×3), GSH düzeylerinde doza bağlı artışlar (%11-30) ve azalmalarla kanıtlandığı gibi, sıçan kalplerinde mitokondriyal glutatyon durumunu önemli ölçüde arttırdı. GSSG seviyeleri (%31).

Herba Cistanche tedavisi, kontrollerle karşılaştırıldığında sıçan kalplerinde mitokondriyal Ca2+ düzeylerini doza bağlı olarak azalttı; baskılama 1.0 g/kg'lık bir dozda %41'di (Şekil 3).

FL1/FL2 oranındaki azalma (%14-16) ile kanıtlandığı gibi, Herba Cistanche tedavisi mitokondriyal ΔΨm'yi arttırdı. CCCP (100 μM), FL1/FL2 oranındaki artışın gösterdiği gibi ΔΨm çökmesine neden oldu (Şekil 4).

Herba Cistanche tedavisikontrollere kıyasla test hayvanlarında önemli ölçüde daha yüksek Durum 3 solunum oranı (%84) ile kanıtlandığı gibi mitokondriyal solunumun arttığı görüldü (Tablo 1). Durum 2 ve Durum 4 solunum seviyeleri sırasıyla %47 ve %80 oranında arttı, ancak Durum 4 solunumunun uyarılması, ayrılmayan protein 2/3'ün bir inhibitörü olan 1 mM guanozin-5'-difosfat tarafından tamamen bastırıldı. Herba Cistanche tedavisi, Durum 3/Durum 4 solunum oranları oranıyla tahmin edildiği gibi solunum kontrol indeksini etkilemedi.

Tartışma

Herba Cistanche ile tedavi edilen sıçan kalplerinden izole edilen mitokondri, artan GSH seviyeleri ve azalan GSSG seviyeleri ile gösterildiği gibi, gelişmiş glutatyon durumu gösterdi. Mitokondriyal glutatyon redoks durumunun korunması, I/R hasarına karşı kardiyokoruma açısından kritik öneme sahiptir (Chiu ve Ko, 2003). Sitosolik Ca2+ içeriği, miyokardiyal iskemi sırasında, iç membran Ca2+ uniporter'ı tarafından alım yoluyla artar (Ataka ve diğerleri, 1992; Grover ve diğerleri, 1990), mitokondriyal Ca{{6}'ya yol açar. } birikim. Sonuçlarımız Herba Cistanche ekstresi ile tedavinin mitokondriyal glutatyon redoks durumunu arttırdığını ve mitokondriyal Ca2+ seviyesini düşürdüğünü, bunun da miyokardiyal I/R hasarına karşı koruma sağlayabileceğini göstermektedir (Leung, 2006). 1,0 g/kg gibi daha yüksek bir dozda Herba Cistanche tedavisinin GSSG ve Ca{11}} düzeylerini daha da azaltamaması, glutatyon redoks potansiyelini ve kalsiyum durumunu etkileyen, kendi kendini sınırlayan bir düzenleyici mekanizmanın varlığıyla ilişkili olabilir mitokondride.

Mitokondri, elektron taşınması yoluyla iç zar boyunca elektrokimyasal bir proton gradyanı üretir. Bu gradyan, ATP sentazı tarafından ADP'yi ATP'ye fosforile etmek için kullanılır. Kültürlenmiş kardiyomiyositlerin yaralanmasından sonra hipoksi/reoksijenasyonda olduğu gibi mitokondriyal membran potansiyelinin azalması (Chiu ve diğerleri, 2008), ATP üretiminde bir azalmaya neden olur. Miyokardiyal mitokondriyal membran potansiyelini artırabilen Herba Cistanche tedavisinin özellikle iskemik reperfüzyon sonrası ATP oluşumunu arttırması muhtemeldir. Yine kendi kendini sınırlayan bir düzenleyici mekanizmanın varlığı, Herba Cistanche tedavisinin mitokondriyal membran potansiyeli üzerindeki etkilerinin neden doza bağlı olmadığını açıklayabilir.

Herba Cistanche tedavisi, oksijen tüketimiyle değerlendirildiği üzere sıçan kalp mitokondrisinde Durum 3 solunum hızını büyük ölçüde artırdı. Bu bulgu, mitokondriyal ATP üretim kapasitesinin in vitro ve situ ölçümlerinden elde edilen sonuçlarla tutarlıdır (Leung & Ko, 2008). Şaşırtıcı bir şekilde, Herba Cistanche tedavisi miyokardiyal ATP'nin kararlı durum seviyesini azaltsa da (veriler gösterilmemiştir), tedavi mitokondriyal ATP oluşumunu arttırdı. Bağlantısız solunumun katılımı bu farklı gözlemleri açıklayabilir. Eşleşmemiş oksidatif fosforilasyon, protonlar mitokondri iç zarı boyunca mitokondri matriksine geri hareket ettirildiğinde meydana gelir, böylece elektron taşıma zinciri tarafından oluşturulan zar potansiyeli dağılır. Bu, ATP oluşumunu yönlendiren proton hareket kuvvetinin azalmasıyla sonuçlanır (Garvey, 2003). Sonuç olarak, mitokondrideki Ca2+ konsantrasyonu ve ROS üretimi önemli ölçüde zayıflar (Teshima ve diğerleri, 2003). Bu öneri, Herba Cistanche ile tedavi edilen kalplerde mitokondriyal Ca2+ düzeylerinde azalma olduğunu gösteren mevcut çalışmanın sonuçlarıyla tutarlıdır. Eşleşmemiş solunum ile ilgili olarak, ayrılmamış proteinlerin (UCP'ler) sentezi Herba Cistanche tedavisi ile indüklenebilir. UCP'lerin oksidatif fosforilasyonu ayırdığı ve transgenik fare kalplerinde UCP1 ekspresyonunun I/R kaynaklı miyokardiyal hasara karşı korunduğu bilinmektedir (Hoerter ve diğerleri, 2004). UCP'lerin ayrılma etkisi, purin nükleotid difosfatlar ve trifosfatlar (ADP, ATP, guanozin difosfat (GDP) ve GTP gibi) tarafından inhibe edildi (Echtay ve diğerleri, 2002). Bu çalışmada, ADP (substrat olarak) varlığında membran potansiyeli ve solunum hızı gibi mitokondriyal parametreler ölçüldü; UCP'lerin ayrılma etkisi bu nedenle engellendi. Bununla birlikte, ADP yokluğunda mitokondriyal Durum 4 solunum hızı ölçüldüğünde, bu oran, Herba Cistanche ile tedavi edilen kalplerden hazırlanan mitokondrilerde, tedavi edilmeyen kontrollerin kalplerine göre daha yüksekti. Durum 4 solunum hızı, protonlar F1 F0 -ATPaz içermeyen bir mekanizma yoluyla mitokondriyal matrise geri sızdığında mitokondri tarafından oksijen tüketimini yansıtır (Garvey, 2003). UCP'lerin Devlet 4 solunumunda Herba Cistanche'nin neden olduğu artışa olası katılımı, bu artışın GSYİH tarafından bastırıldığı bulgusu ile desteklenmektedir (Bento ve diğerleri, 2007).

Sonuç olarak, Herba Cistanche ile tedavi, mitokondriyal glutatyon durumunu iyileştirebilir, mitokondriyal Ca2+ seviyesini azaltabilir ve sıçan kalplerinde mitokondriyal membran potansiyelini ve solunum hızını artırabilir. Mitokondriyal glutatyon durumunun ve fonksiyonel yeteneğin arttırılması ve UCP'lerin varsayılan indüksiyonu, glutatyonun sağladığı kardiyokoruma ile ilişkili olabilir.Herba Cistanche tedavisiI/R yaralanmasından sonra.

DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA BİTKİ CISTANCHE ÖZÜ PHGS75% ECH 30% ACT 12%