İşte Başlığın Daha Kısa Bir Versiyonu: Cistanche Tubulosa'daki Altı Bileşenin Yakın Kızılötesi Spektroskopisi İle Eşzamanlı Tayini

1. giriiş

Cistanche (Hoffmg. Et Link), Orobanchaceae bitki familyasının çok yıllık fanerogamik bir cinsidir. Cistanche cinsine ait türlerin çoğu Çin'de bin yıldır tıbbi bitki olarak kullanılmaktadır; üstün bir tonik olarak üne sahip; ve "Çöllerin Ginseng'i" olarak bilinir. Cistanche tubulosa, çok yıllık bir bitki olan Tamarix chinensis'in köklerinin zorunlu bir parazitidir. Çin Farmakopesi'nde orijinal kaynak olarak belgelenmiştir.Cistanches Herba(Çince adı: Roucongrong) 2005 baskısından. Cistanche türleri üzerinde modern farmakolojik araştırmalar 1980'lerde başlatılmıştır. Farmakolojik araştırmalar, Cistanche bitkilerinin ekstraktlarının, böbrek yetmezliğini ve yaşlılık kabızlığını iyileştirmek, öğrenme ve ezberleme yeteneğini geliştirmek, Alzheimer hastalığını önlemek, bağışıklığı arttırmak, yaşlanmayı geciktirmek, yorgunluğu gidermek vb. gibi geniş bir aktivite yelpazesine sahip olduğunu göstermiştir. Son otuz yılda, Cistanche bitkilerinin köklerinin faydalı etkilerinin maddi temelini aydınlatmak için kapsamlı ve sistematik farmakolojik çalışmalar fitokimyasal araştırmalarla birleştirilmiştir. Bu araştırmalar, feniletanoid glikozitlerin (PhG'ler), Cistanche bitkilerinde böbrek yetmezliği, iktidarsızlık, yaşlanma karşıtı ve anti-Alzheimer hastalığının tedavisinde anahtar rol oynayan ana etkili bileşenler olduğunu göstermektedir. Çin Farmakopesinde iki PhG içeriğinin (ekinacoside ve verbascoside) bulunması zorunluydu. Bu arada Cistanche bitkilerindeki mannitol, sükroz, glikoz ve fruktoz gibi karbonhidratlar müshil işlevine ve kandaki karbonhidrat kümelerine sahiptir.Cistanche bitkilerikabızlık tedavisinde kullanılmıştır.

TESTOSTERON PHGS'Yİ ARTIRMAK İÇİN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA %75 ECH %30 ACT %12

C.tubulosa'nın yabani kaynakları esas olarak Çin'in güney Sincan Özerk Bölgesi'ndeki Taklamakan Çölü'nü çevreleyen bölgede dağılmıştır. Geleneksel Çin ilaçları (TCM'ler) olarak kullanılan diğer birçok türe benzer şekilde, C.tubulosa büyük bir ekonomik değere sahiptir ve aşırı toplanma nedeniyle yabani yaşam ortamında nesli neredeyse tükenmiştir. C. tubulosa'nın yetiştirilmesi, Cistanches Herba için hammadde tedarikini sağlamak ve yabani bitki kaynaklarını korumak amacıyla 1990'lı yıllarda Çin'de başladı. 2017 yılı itibarıyla Sincan'ın Hotan Eyaleti'nde yaklaşık 13 bin hektarlık C. tubulosa ekili alanı bulunmaktadır. C. tubulosa'nın kalitesinin artırılmasının yanı sıra ekimi genişletmek için ekim teknolojisindeki ilerlemelere ihtiyaç duyulmaktadır.

C.tubulosa'yı yetiştirmenin temel amacı, bu etkili bileşenler açısından zengin olan Cistanches Herba'yı üretmektir. Ancak etkili bileşenlerin içeriğiCistanches HerbaPhG'ler ve oligosakkaritler gibi, üretim sırasında birçok faktörden önemli ölçüde etkilenebilir. C. tubulosa'nın kalitesini gerçek zamanlı olarak tespit eden bir sistem araştırılmalıdır. Bu nedenle, çok sayıda numunenin kısa sürede analiz edilmesi ihtiyacını karşılamak için yüksek verimli bir yöntemin geliştirilmesi gerekmektedir. Geleneksel olarak, C. tubulosa'daki PhG'ler ve karbonhidratlar gibi birincil etkili bileşenlerin belirlenmesi genellikle yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılarak gerçekleştiriliyordu. Doğru ve güvenilir olmasına rağmen veri toplama ve işlemesi zaman alıcı ve zahmetlidir. Ek olarak, genellikle HPLC analizlerinin toz haline getirilmesini, ekstraksiyonunu ve filtrelenmesini içeren numune hazırlama için de çok fazla zaman ve çaba gerekir. Bu nedenle, nispeten büyük miktarda veri elde etmek için net bir prensibe ve kullanımı kolay bir araca ihtiyaç vardır. Neyse ki yakın kızılötesi spektroskopi (NIRS), hızlı ve tahribatsız olduğundan tarım ürünlerini, gıdaları, tıbbi numuneleri ve farmasötik ürünleri değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu nedenle, NIRS, TCM'lerin etkili ölçümlerine yönelik gereklilikleri tam olarak karşılayabilir ve şaşırtıcı olmayan bir şekilde, NIRS, TCM'lerdeki bileşiklerin niteliksel tanımlanması ve miktarının belirlenmesi için uygulanmıştır.

Bu çalışmada altı etkili bileşenin içeriği,ekinakozit, verbaskosit, mannitol, sakaroz, glikoz ve fruktoz2013-2015 yıllarında Sincan'ın Hotan Eyaletinden toplanan 116 grup C. tubulosa örneğinde ilk olarak HPLC ile belirlendi. Daha sonra bu altı bileşenin kalibrasyon modelleri kısmi en küçük kareler regresyon (PLSR) yöntemiyle oluşturulmuştur. Bu modeller daha sonra kalibrasyon setlerindeki korelasyon katsayıları ve tahmin hataları ile doğrulandı. Sonuçlar, geliştirilen yöntemin C. tubulosa'nın kantitatif analizi için güvenilir bir yöntem olarak kullanılabileceğini gösterdi.

2. Sonuçlar

2.1. HPLC Analizi

içeriğiekinekozit ve verbaskozit116 örneğin tümü için literatürde iyi tanımlanmış bir HPLC-UV yöntemiyle ve dört karbonhidrat (mannitol, sakaroz, glikoz ve fruktoz) literatürde iyi tanımlanmış bir HPLC-ELSD yöntemiyle belirlendi. Numune hazırlama ve belirleme yöntemleri Bölüm 3.1 ve 3.3'te açıklanmıştır. Şekil 1, karma standartların karakteristik kromatogramlarını göstermektedir. Altı etkili bileşenin tamamının taban çizgisine göre ayrıldığı ve bu nedenle ölçülebildiği görülebilir. HPLC yöntemi numune testinden önce doğrulandı. HPLC yönteminin ana sonuçları Tablo 1'de listelenmiştir. Sonuçlar, ekinekosid belirleme yönteminin olumlu bir doğrusal ilişkisini (r=0.9998) ve geri kazanımını (%98,5) göstermektedir; beşiyle aynı sonuç bileşenler. Bu nedenle altı etkili bileşenin içeriği doğru bir şekilde belirlenebilir. Belirlenen tüm içerik aralıkları Tablo 1'de özetlenmiştir.

2.2. NIRS Analizi

Şekil 2, C. tubulosa örneklerinin NIR spektrumlarını (4000–10,000 cm−1 ) göstermektedir. Tüm numunelerde 4000 cm−1 ila 7500 cm−1 arasında önemli absorpsiyon zirveleri ortaya çıkarken, 7500 cm−1 ila 10.000 cm−1 arasında hafif dalgalanmalar görüldü. NIR spektrumlarının taban çizgisi kayması, numunenin parçacık boyutu ve rengi gibi faktörlerden kolayca etkilenmesi nedeniyle meydana geldi (Şekil 2A). Gereksiz bilgilerin etkisini bir dereceye kadar azaltmak için spektrumların matematiksel ön işlemleri kullanıldı. Matematiksel ön işlemler birinci türetmeyi (1. türetme), ikinci türetmeyi (2. türetme), standart normal çeşitliliği (SNV) ve çarpımsal dağılım düzeltmesini (MSC) içeriyordu. Şekil 2B, C. tubulosa'nın NIR spektrumunun 2. derivasyonunu göstermektedir ve 4000–4500 cm−1, 5000–5500 cm−1 ve 7000–7500 cm−1 olmak üzere üç bölgede meydana gelen önemli farklılıklar gözlemlenmektedir.

2.3. Kantitatif Kalibrasyon Modellerinin Oluşturulması

Kısmi en küçük kareler regresyonu (PLSR) klasik bir modelleme yöntemidir ve sonuçların yüksek kalitesi nedeniyle niceliksel modellerde yaygın olarak uygulanmaktadır. PLSR'nin avantajları arasında iyi tahmin yeteneği ve göreceli basitliği yer alır. PLSR aynı zamanda TCM'lerin kantitatif kalibrasyon modellerinin oluşturulmasında da yaygın olarak uygulanmıştır [25]. Ön işleme tabi tutulmuş NIR spektrumlarına dayanarak, C. tubulosa'daki altı etkili bileşen için bir NIR kantitatif analiz modeli, HPLC analiz verilerinin gerçek değerler olduğu PLSR yöntemi kullanılarak oluşturulmuştur. 116 numune 3:1 oranında rastgele kalibrasyon ve doğrulama setlerine bölündü. Kalibrasyon için en uygun koşullar düşük RMSEC ve yüksek korelasyon katsayısına göre seçilmiştir.

CİNSEL FONKSİYONU GELİŞTİREN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3.1. Kalibrasyon Modelleri İçin Dalga Bandının Seçimi

Uygun bir dalga bandının seçimi, kalibrasyon modelinin oluşturulmasında önemli bir adımdı. Bu çalışmada, 4000–7500 cm−1 (TQ analist yazılımı tarafından önerilir) ve 4000–10,000 cm−1 NIR aralığı spektrumları karşılaştırıldı. Tablo 2'den 4000 cm−1 ile 7500 cm−1 aralığında bu aralığın kalibrasyon için uygun olmadığı görülmüştür. Dolayısıyla bu çalışmada altı kimyasal bileşenin spektral aralıklarının tümü aşağıdaki aralıktan seçilmiştir: RMSEC performansları ve korelasyon katsayısı karşılaştırılarak 4000 ila 10.000 cm−1.

2.3.2. Kalibrasyon Modelleri İçin Optimum Faktör Sayısının Seçimi

PLSR, faktörlerin hesaplanmasıyla spektrum verilerinin boyutluluğunu azaltarak verilerdeki maksimum değişkenlik miktarını açıklar. "Yetersiz uyum" sorunu, sınırlı sayıda faktörden kaynaklanan yetersiz bilgi nedeniyle ortaya çıktı; ancak modelde ortaya konulan optimum değerlerden daha büyük faktörlerin seçilmesi "aşırı uyum" sorununu beraberinde getirecektir. Ya "yetersiz uyum" ya da "aşırı uyum" yerleşik modellerin tahmin gücünü azaltacaktır [22]. Şekil 3, altı bileşiğin tümü için RMSECV ile faktörler arasındaki ilişkiyi göstermektedir. Bu nedenle RMSECV'nin en düşük değerlerine karşılık gelen faktörleri seçtik. Kalibrasyon modelleri için optimum faktör seçimi Tablo 3'te listelenmiştir.

2.3.3. Kalibrasyon Modelleri için Spektral Ön İşlemin Seçimi

Kalibrasyon modelleri için bir diğer kritik etkili faktör, saçılma ve taban çizgisi kaymasının etkisini azaltmayı, sinyal-gürültü oranlarını arttırmayı ve düzensiz değişimleri ortadan kaldırmayı amaçlayan spektral ön arıtmadır. Radyasyon saçılımının etkisini ortadan kaldırmak için çarpımsal saçılma düzeltmesi (MSC) ve standart normal değişken (SNV) yöntemleri kullanıldı. Taban çizgisi kaymasının etkilerini çözmek için 1. ve 2. türev spektrumları karşılaştırıldı ve 2. türev seçildi. Arzu edilen etkiyi elde etmek için, gürültü artışını önlemek amacıyla türetmeden önce spektrumları Savitzky-Golay (SG) filtre algoritmasıyla yumuşattık. Tablo 3'te spektral ön işleme ilişkin bilgiler ve kalibrasyon modelleri için sonuçları gösterilmektedir.

2.4. Kurulan Modellerin Değerlendirilmesi

İyi bir NIRS kalibrasyon modelinin düşük RMSEC ve RMSEP değerlerinin yanı sıra yüksek korelasyon katsayısına (r) ve RMSEC ile RMSEP arasındaki küçük farklara sahip olması gerekir. Seçilen altı bileşiğin kalibrasyon modelleri yukarıda belirtilen prosedürlere göre oluşturulmuştur (Tablo 3). Ekinakozit kalibrasyon seti için RMSEC ve r değerleri sırasıyla 27,6 ve 0,9808 idi. Diğer kimyasal bileşik modellerinin performans parametreleri Tablo 3'te listelenmiştir; buradan oluşturulan modellerin tatmin edici tahmin sonuçları ortaya çıkardığı ve C. tubulosa'nın hızlı kantitatif analizi için kullanılabileceği sonucuna varabiliriz. Kalibrasyon modellerini daha açıklayıcı ve görsel olarak gözlemlenebilir hale getirmek için altı kimyasal bileşiğin dağılım grafikleri Şekil 4'te gösterilmektedir. Şekil 4'te gösterildiği gibi, tahmin edilen ve ölçülen değerler arasında küçük farklılıklar meydana geldi çünkü çoğu nokta, y=x denklemiyle regresif eğri etrafında dağıtılmıştı. Bu nedenle Şekil 4'te mükemmel tahmin performansları gözlendi.

3. Malzemeler ve Yöntemler

3.1. Numune Hazırlama

2013'ten 2015'e kadar Xinjiang özerk bölgesindeki Hotan Eyaletinden yüz on altı C. tubulosa örneği toplandı. Tüm örnekler yetiştirildi, ancak farklı büyüme aşamalarında toplandılar. Numunelerin taze ağırlıkları 20 gr ile 1000 gr arasında değişmektedir. Güneşte kurutulduktan sonra kurutulan numuneler ezildi ve 60-gözenekli bir elekten elendi.

3.2. NIR Spektroskopik Veri Toplama

Numunelerin NIR spektrumları, 4000–10,000 cm−1 spektral bölge üzerinde 8 cm−1 aralıklarla Antaris MXFT-NIR Sistemi (Thermo Scientific, Madison, WI, ABD) ile donatılmış olarak toplandı. elde taşınan fiber optik yansıma adaptörü. Her spektrum 64 taramanın ortalaması alınarak elde edildi. Numunelerin aynı sıcaklıkta analiz edildiğinden emin olmak için NIR spektrum taramasından önce tüm numunelerin oda sıcaklığına (25 ◦C) dengelenmesine izin verildi. Laboratuvardaki nem ortam seviyesinde tutuldu.

BÖBREK FONKSİYONUNUN GELİŞTİRİLMESİ İÇİN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3. HPLC Veri Toplama

3.3.1. Ekstraksiyon Hazırlığı

Bir gram C. tubulosa tozu, 30 dakika boyunca ultrasonikasyon (500 W, 40 KHz) ile konik bir şişede 50 mL %50 metanol ile ekstre edildi. Ekstrakt 4◦C'de saklandı. Ekstraktın süpernatanı, HPLC analizi için bir numune elde etmek üzere filtrelendi.

3.3.2. HPLC-UV ile Echinacoside ve Verbascoside'nin Eşzamanlı Tayini

Sıvı kromatografik analiz, iki LC-20ADXR solvent dağıtım ünitesi, bir LC-20AD pompası, bir SIL-20ACXR otomatiğinden oluşan bir Shimadzu UHPLC sistemi (Shimadzu, Kyoto, Japonya) üzerinde gerçekleştirildi. örnekleyici, bir CTO-20AC kolon fırını, bir SPD-M20A DAD dedektörü, DGU-20A3R gaz giderici ve bir CBM-20A kontrol cihazı.

Kromatografik ayırmalar için kullanılan Grace Prevail Karbonhidrat ES kolonu (150 × 2,1 mm, 2,7 mm) 35 °C'de tutuldu. Mobil faz, asetonitril (A) ve 0%1 sulu formik asitten (B) oluşuyordu ve aşağıdaki gradyan programı izlenerek iletildi: 0–7 dakika, %10–20 doğrusal gradyan A; 7–15 dakika, %20 A; ve 15–20 dakika, %20–10 A'lık doğrusal gradyan. Mobil fazın akış hızı 0,4 mL/dak idi. UV izleme 330 nm'de gerçekleştirildi.

3.3.3. HPLC-ELSD ile Mannitol, Sükroz, Glikoz ve Fruktozun Eşzamanlı Tayini

HPLC, bir G1322A gaz giderici, bir G1311A dörtlü pompa, bir G1311A otomatik örnekleyici, bir G1316A kolon sıcaklık kontrol cihazı ve bir G1315B DAD dedektöründen oluşan bir Agilent 1100 serisi LC sistemi (Palo Alto, CA, ABD) üzerinde gerçekleştirildi.

Kromatografik ayırmalar için bir Sigma Prevail Karbonhidrat ES kolonu (4,6 x 250 mm, 5 µm) kullanıldı ve 25 ◦C'lik bir kolon sıcaklığında tutuldu. Mobil faz, asetonitril ve sudan (77:23, h/h) ve 0,7 mL/dakika akış hızında sağlanan izokratik müttefikten oluşmuştur. Atık su, varsayılan parametrelere sahip bir buharlaştırıcı ışık saçılım detektörü (ELSD) kullanılarak izlendi.

3.4. Veri İşleme

Kalibrasyon ve doğrulama setlerinin bölünmesini, spektrumların matematiksel ön işlemlerini, kalibrasyon modellerinin oluşturulmasını ve diğer hesaplamaları gerçekleştirmek için TQ Analyst (versiyon 8.0, Thermo Scientific, Madison, WI, ABD) kullanıldı. . Rakamları oluşturmak için Origin (versiyon 9.1) kullanıldı.

4. Sonuçlar

Bu çalışmada, eş zamanlı analiz için hızlı ve tahribatsız bir yöntem önerdik.ekinakozit, verbaskosit, mannitol, sakaroz, glikoz ve fruktozC. tubulosa'da NIRS tarafından. RMSEC, korelasyon katsayısı, RMSEP ve Rp değerlerinin analizleri, oluşturulan kantitatif NIR modellerinin C. tubulosa'da seçilen altı etkili bileşenin içeriğini doğru bir şekilde tahmin etmek için kullanılabileceğini gösterdi. HPLC ile karşılaştırıldığında, bu çalışmada bildirilen NIRS yöntemi, tatmin edici niceliksel analiz yeteneğini korurken önemli ölçüde iş gücü ve zamandan tasarruf sağlayabilir. Bu nedenle burada bildirilen yöntem, C. tubulosa'nın kalite kontrolünde kullanılma ve dolayısıyla C. tubulosa'ya yönelik yetiştirme ve proses teknolojisinin geliştirilmesine rehberlik etme potansiyeline sahiptir.

CİNSEL FONKSİYONU GELİŞTİREN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%