Yüksek Çözünürlüklü Tandem Kütle Spektrometresi, Tip 2 Diabetes Mellitus Hastalarının Erken Diyabetik Böbrek Hastalığında Özel Bir Gangliosid Modelini Tanımlıyor Ⅱ

2.2. HCD MS/MS ile Makroalbuminüri ile İlişkili Polisialile Türlerin Detaylı Yapısal Analizi

HR-MS taraması, makroalbuminürik hastaların gangliosidlerinin yüksek genel sialik asit içeriği ile karakterize olduğunu gösterdi. A3 örneğinde yüksek kütle doğruluğu ile GQ1 sınıfından en az dört pentasialo gangliotetraoz tanımlandı. Yalnızca A3'ün tarama kütle spektrumunda tespit edilen m/z 812,7{{10}}68'deki iyon, kütle hesaplamasına göre üçlü protonu giderilmiş ve sodyasyona uğramış GQ1(d18:1/18)'e atanmıştır. :0). Makroalbüminüri ile ilişkili bu türün yapısal olarak ayrıntılı bir şekilde karakterize edilmesi için, iyonu m/z 812.7068'de izole ettik ve negatif iyon modunda HR'de HCD MS/MS'ye gönderdik. Bu tandem MS deneyinin hedefleri şunlardı: (i) oligosakarit zincir yapısının araştırılması; (ii) tüm GQ1 moleküllerinin kütlesi dikkate alınarak varsayılan seramid bileşiminin doğrulanması; (iii) oligosakarit omurgası boyunca Neu5Ac monosakaritlerinin lokalizasyonu üzerine spesifik verilerin toplanması, idrarda mevcut olabilecek en yaygın beş GQ1(d18:1/18:0) yapısından (Şekil 3) izomer ayrımına yol açar. makroalbüminürik hastalar.

m/z 812.7068'de tespit edilen [M-4H+Na]3− öncü iyonunun, 30-80 eV aralığında değişken çarpışma enerjisi altında iki dakika boyunca elde edilen TIC'nin birleştirilmesiyle oluşturulan parçalanma spektrumu gösterilmektedir. Şekil 4'te.

Şekil 3. GQ1(d18:1/18:0)'nin en yaygın beş izomeri: (A) GQ1a(d18:1/18:{{10}}) izomeri; (B) GQ1b(d18:1/18:{{20}}) izomer; (C) GQ1c(d18:1/18:0)izomer; (D) GQ1d(d18:1/18:0) izomeri; (E) GQ1e(d18:1/18:0) izomeri.

Wecistanche Destek Hizmeti-Çin'deki en büyük cistanche ihracatçısı:

E-posta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Daha Fazla Özellik İçin Alışveriş Yapın Detaylar:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

BÖBREK ENFEKSİYONLARINA YÖNELİK %25 EKİNAKOSİT VE %9 AKTEOSİT İÇEREN DOĞAL ORGANİK SİSTANŞ EKSTRATINI ALMAK İÇİN TIKLAYINIZ

MS/MS verileri, seramidin (d18:1/18:0) bileşimini m/z 564,8704'te Y0 ve m/z 726,5845'te Y1 ile doğrular. Glc-Cer dizisine ve aynı zamanda C18:0 yağ asidine karşılık gelen m/z 325.1828'deki dahili bölünme iyonu S'ye karşılık gelir (Şekil 5). Benzer şekilde molekülün genel sialilasyon durumu da belgelenmiştir. Bu nedenle, m/z 290.0868'de tespit edilen B1 iyonu ve m/z 312.0686'da sodyasyonlu karşılığı, m/z 581.1807 ve m/z 603.1626'da tespit edilen uzak elemanla birlikte bir Neu5Ac tortusunun ana iyondan ayrılmasına karşılık gelir. , Neu5Ac-Neu5Ac bağlantısının oluşumunu doğrulayın.

Şekil 5. m/z 812.7068'deki [M-4H++Na+ ] 3− öncüsü tarafından deneyimlenen HCD MS/MS ile parçalanma şeması ve GQ1d yapısal izomeri için tanısal iyon dizisi.

Neu5Ac kalıntılarının iç veya dış Gal'deki en yaygın bağlantı konumu göz önüne alındığında, Şekil 3'te gösterildiği gibi GQ1(d18:1/18:0) için beş olası yapısal aday vardır. m/z 1032.3662, bir çift bağ ve iç çapraz halka bölünmelerinden oluşur ve m/z 936.7894'te Y2 / olarak tespit edilen iyonla birlikte Z4 /Y0/ 2,4A2'ye atanır. 3,5A1, dört Neu5Ac kalıntısının tamamının iç Gal'e bağlanmasını destekler. Diğer yapısal izomerlerin görülme sıklığı tamamen dışlanamasa da, bu iki fragman iyonu, GQ1(d18:1/18:0)'nin izomerine karşılık gelen (D) adayıyla tutarlı yapısal motifin olduğunu göstermektedir. , A3 örneğinde kesinlikle mevcuttur. Şekil 5'teki şema, GQ1d(d18:1/18:0)'a karşılık gelen öncü iyonun yaşadığı parçalanma yolunu gösterir.

Ayrıntılı yapısal analiz için bir sonraki makroalbuminüri ile ilişkili polisialik aday, yalnızca A3 örneğinin m/z 708,3379'daki tarama kütle spektrumunda tespit edilen ve atanan [M-3H+ ] 3− iyonudur. kesin kütle hesaplamasına dayanarak GT1(d18:1/18:0)'e göre. Bu iyon izole edildi ve HCD kullanılarak tandem MS ile parçalanma analizine tabi tutuldu. 30 ila 80 eV arasındaki değişken çarpışma enerjilerinde 2 dakika boyunca elde edilen taramaların toplanmasıyla oluşturulan ürün iyon spektrumu, bu türün kimyasal yapısı ve ana sinyallerin atanması ile birlikte Şekil 6'da sunulmaktadır. Kullanılan MS/MS koşulları altında parçalanma mekanizması, tanısal parça iyonlarıyla birlikte Şekil 7'de gösterilmektedir. Atanan tüm ürün iyonlarının görünürlüğünü arttırmak için Tablo 3, Şekil 6'da sunulan spektrumda tanımlanan sinyallerin listesini tamamlar.

Şekil 6. A3 numunesinde m/z 708,3379'da tespit edilen [M-3H+ ] 3− öncü iyonunun (−) nanoESI HR HCD MS/MS ile yapısal analizi; kütle hesaplamasında GT1(d18:1/18:0)'ye karşılık gelir. Edinme süresi: 2 dakika; 30–80 eV aralığında değişken çarpışma enerjileri. Ek: MS/MS verilerinden çıkarılan GT1b(d18:1/18:0) izomerinin yapısı.

HCD fragmantasyonu, glikozidik bağlar ve çapraz halka bölünmelerinin bir sonucu olarak ortaya çıkan çeşitli dizi iyonlarına yol açtı. Bu iyonlar, GT1 konumsal izomerlerinin tanımlanmasıyla birlikte tüm karbonhidrat dizisinin atanması ve seramid aglikon bileşiminin doğrulanması için oldukça faydalıdır.

d18:1/18:0 tipi seramid, m/z 564.5353'teki Y0 iyonu tarafından ortaya çıkarılır ve m/z 726.5879'daki Y1 aracılığıyla tanımlanan Glc-Cer dizisi tarafından desteklenir. Ayrıca iyon ataması, bir GT1 izoformunun varlığını kanıtlar. NeuAc-GalNAc bileşimine sahip m/z 493.1669'daki iyon, yalnızca GalNAc kalıntısının sialilasyonu ile karakterize edilen GT1'den oluşabilir. Parça iyonlarının geri kalanı, A3 numunesinde GT1b yapısal izomerinin varlığını göstermektedir. GT1b'nin yapısı, molekülün indirgeyici olmayan ucundan kaynaklanan tüm iyonlar tarafından desteklenir, bu iyonlar Y tipi serilerle belgelenir ve bunlardan biri daha düşük bollukta görünen iki Z iyonu eşlik eder (Şekil 6). Bununla birlikte, m/z 888.6405'te oldukça bol miktarda bir iyon olarak tespit edilen Y2/B2, muhtemelen Neu5Ac veya Neu5Ac-Neu5Ac'nin ayrılmasıyla ilgili desialilasyondan sonra GT1a veya GT1b izomerinden kaynaklanan Gal-Glc-Cer dizisi hakkında kanıt sağlar. iç Gal'den veya GT1d gibi ikame edilmemiş bir iç Gal içeren bir izomerden olabilir.

Öte yandan, m/z 734.5701'de tespit edilen Y2, GT1b izomeriyle tutarlı bir konfigürasyon olan iç Gal'deki disialo Neu5AcNeu5Ac elemanı lokalizasyonunu doğrular. Distal grubun varlığı aynı zamanda m/z 581.1828'deki B2 iyonu tarafından da kanıtlanmaktadır.

HCD MS/MS'de, desialile edilmiş Gg4Cer sekansına karşılık gelen Y4 ve/veya Y3 iyonları gibi çeşitli sinyaller, kısmi molekül desialilasyonuyla ilişkilidir; ancak bu iyonlar Neu5Ac'nin nötr Gg4 glikan çekirdeğindeki bağlanma bölgelerini gösteremez. Ek olarak, GT1b dahili bölünme B3/B1 iyonuna atanan Gal-GalNAc dizisine karşılık gelen m/z 364.1243'teki sinyal, GT1c izomerine atfedilebilir çünkü bu glikoform, ikame edilmemiş bir terminal Gal-GalNAc disakkarit içerir. Dolayısıyla, GT1b ile ilişkili olan Y2 dışındaki tüm iyonlar, GT1a, GT1, GT1c ve hatta nadiren rapor edilen GT1d gibi diğer Neu5Ac konumsal izomerlerinden ortaya çıkabilir. Öte yandan Y2'nin kendisi, Neu5Ac'yi iç Gal'e bağlı deneme elemanından da çıkaran düşük olasılıklı bir olayın sonucu olabilir.

GT1'in açıklanması dışında glikosidik bağ bölünmeleriyle ilgili MS/MS verilerinin, A3 karışımındaki diğer GT1 izomerlerini açık bir şekilde atayamadığı göz önüne alındığında, GT1b'yi destekleyen olası iç parçalanmayı keşfetmek için halka bölünmesi iyonlarını daha dikkatli bir şekilde analiz ettik. m/z 634,6067'de düşük yoğunluklu üçlü yüklü iyonu fark ettik; bu, terminal siyalik asit kalıntılarından birinde 0,2 tipi çapraz halka bölünmesiyle tutarlıdır; GT1b türü durumunda, 0,2X4 veya 0,2X3 veya her ikisinden birden oluşabilir. GT1b izomeri genellikle GT1'den daha yaygın olduğundan, Şekil 6 ve 7, GT1b'ye özgü iyon atamasını ve parçalanma şemasını göstermektedir.

Gal-GalNAc-Gal zincir simetrisi nedeniyle diğer yapısal izomerlerin tamamen hariç tutulması mümkün değildir. Her ne kadar HCD MS/MS verileri GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) ve GT1b(d18:1/18)'nin varlığını gösterse de: 0) A3 örneğinde diğer GQ1 ve GT1 izomerlerinin olası oluşumu göz ardı edilemez. Ancak bulgularımız üç izomerin -GQ1d(d18:1/18:0), GT1b(d18:1/18:{{30}}) ve GT1 (d18:1) olduğunu gösteriyor /18:0) A3 örneğinde kesinlikle mevcuttur ve makroalbüminürinin moleküler belirteçleri olarak daha fazla incelenebilir.

3. Malzemeler ve Yöntemler

3.1. Konu Kayıt Kriterleri

Yöntemi geliştirmek ve doğrulamak için, Tip 2 DM hastalarından ve sağlıklı kontrollerden oluşan bir tarama grubu kesitsel bir pilot çalışmada değerlendirildi. Nefroloji Polikliniği ve Diyabet ve Metabolik Hastalıklar Polikliniğine başvuran toplam 30 Tip 2 DM hastası 3 gruba ayrıldı.idrar albümini/kreatinin oranı(UACR) şu şekildedir: normoalbüminürisi olan 10 hasta (A1, UACR < 30 mg/g olarak tanımlanır), mikroalbüminürisi olan 10 hasta (A2, UACR 30–300 mg/g) ve makroalbüminürisi olan 10 hasta (A3, UACR > 300 mg/g) G). Bilinen böbrek hastalığı geçmişi olmayan ve DM'si olmayan (%5,6'dan düşük veya eşit HbA1c değeri hariç) rutin kontroller için pratisyen hekimin muayenehanesine giden, yaş ve cinsiyet açısından eşleştirilmiş on sağlıklı kontrol denek (C) de bu çalışmaya kaydedilmiştir. çalışmak

Çalışmaya dahil edilen tüm hastalarda minimum 5-yıllık DM süresi, en az 2 yıl boyunca stabil böbrek fonksiyonu ve iyi kan basıncı kontrolü vardı (<130/80 mmHg), negative urinary sediment, and a negative urine culture. The exclusion criteria were represented by other causes of proteinuria (other glomerular diseases, neoplasia, or autoimmune diseases), hematuria, poor control of DM (HbA1c > 10%), liver diseases, and pregnant or lactating women. The patients had no indication for böbrek biyopsisi(hematüri ve diğer proteinüri nedenlerinin olmaması, GFR'de hızlı bir düşüş olmaması).

3.2. Etik Beyanı

Çalışma Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak yürütüldü ve protokol, Kurumun Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylandı (İnsan Araştırmaları Kurulu - "Victor Babes" Tıp ve Eczacılık Üniversitesi Timisoara, Nr. 15/12.09.2016). ;İlçe Acil Hastanesi, No.100/23.11.2016). Tüm hastalar ve kontroller bilgilendirilmiş onam formunu imzalayarak çalışmaya katılmayı kabul etti.

3.3. Laboratuvar Değerlendirmeleri

30 Tip 2 DM hastasının idrar gangliozidi, kesitsel bir pilot çalışmada 10 sağlıklı kontrolle karşılaştırmalı bir analizle araştırıldı. Biyokimyasal parametreler serum üre ve kreatinin, 24 saatlik proteinüri, UACR, idrar sedimenti ve idrar kültürünü içeriyordu. Tüm hastalarda idrar yolu enfeksiyonları negatifti. Doğal gangliosid karışımlarının bileşimi, 24 saatlik toplanan idrar örneklerinden tespit edildi. Hasta ve kontrollerin idrar örnekleri kısa süreliğine -20 ◦C'de saklandı ve testten önce çözüldü.CKDdeğerlendirme için KDIGO kılavuzuna göre tanımlandı vekronik böbrek hastalığının yönetimi. eGFR aşağıdaki formül kullanılarak hesaplandı:kronik böbrek hastalığıepidemiyoloji işbirliği denklem formülü (CKD-EPI kreatinin 2009 denklemi) [16].

3.4. Gangliosid Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Gangliosid ekstraksiyonu, Svennerholm ve Fredman [17] tarafından geliştirilen ve Vukeli'c ve ark. tarafından modifiye edilen yöntemi takip etti. [18]. Daha önce bu protokolü gangliosidlerin vücut sıvılarından çıkarılması ve saflaştırılması için uyarladık ve bunu beyin omurilik sıvısı (BOS) gangliosidlerine uyguladık. Yöntem, kütle spektrometresi ile BOS gangliozidlerinin profillenmesi ve parçalanma analizi ile ilgili önceki çalışmamızda ayrıntılı olarak açıklanmıştır [19]. Kısaca, lipitler, 1:2:0.75 C/M/W toplam hacim oranına kadar kloroform (C)/metanol (M)/su (W) karışımı kullanılarak iki kez ekstre edildi; "W" karşılık gelir idrara; bu nedenle karışım 4 mL C, 8 mL M ve 3 mL idrar örneği içeriyordu. Analitik dereceli kloroform ve metanol, Merck'ten (Darmstadt, Almanya) satın alındı ​​ve daha fazla saflaştırılmadan kullanıldı. Fazların tamamen ayrılmasından sonra, [19]'da anlatılan prosedürler takip edilerek, polar glikosfingolipitleri içeren üst faz toplandı.

Toplanan ham gangliosidlerin saflaştırılması birkaç aşamada gerçekleştirildi [19]: çökelmiş protein-tuz komplekslerinin çıkarılması, ardından santrifüjleme, bir Sephadex G-25 kolonu (Sigma-Aldrich, Burlington, MA, ABD) üzerinde jel filtrasyonu ) düşük moleküler ağırlıklı kirletici maddeleri uzaklaştırmak için ve son olarak suya karşı 4 ◦C'de gece boyunca diyaliz. Gangliositler tüm idrar kısımlarından aynı koşullar altında ekstre edildi ve A1 (normoalbuminüri), A2 (mikroalbuminüri), A3 (makroalbuminüri) ve C (kontrol) karışımları elde edildi.

3.5. Kütle Spektrometresi için Numune Hazırlama

Saflaştırılmış A1, A2, A3 ve C gangliosid ekstraktları, bir vakum pompasına bağlı bir SpeedVac Concentrator SPD 111 V sisteminde (Savant, Düsseldorf, Almanya) tamamen kuruyana kadar buharlaştırıldı. MS taraması için, her bir kuru ekstrakt, stok solüsyonu oluşturmak üzere saf metanol içerisinde çözüldü ve -20 ◦C'de saklandı. MS analizinden önce, stok çözeltiler bir Sigma 2-16 model santrifüjde (Sartorius AG, Göttingen, Almanya) santrifüjlendi. Orbitrap MS infüzyonu için, saf metanol içinde 5 pmol·μL -1 konsantrasyonuna sahip çalışma örnekleri, stok çözeltiden alikotların seyreltilmesiyle elde edildi. İnfüze edilen çözeltideki gangliosid konsantrasyonu, ortalama 2000 g mol-1 moleküler ağırlığa göre hesaplandı.

3.6. nanoESI ile Orbitrap Kütle Spektrometresi

MS deneyleri, çevrimdışı bir nanoES kaynağı ES 259 ​​(Thermo Fisher, Bremen, Almanya) ile donatılmış bir LTQ Orbitrap Velos Pro™ kütle spektrometresi (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Almanya) üzerinde gerçekleştirildi.

Cihaz, iki farklı türde kütle analizörünü birleştiren ve çok sayıda avantaj sağlayan hibrit bir kütle spektrometresidir: yüksek hassasiyet ve doğruluk, iyi veri kalitesi ve analiz hızı, karmaşık karışımlardaki küçük bileşenlerin tespit potansiyeli, düşük numune tüketimi, ve çapraz incelemenin ve numuneden numuneye aktarımın önlenmesi.

İlk analizör, belirli bir kütle-yük oranına (m/z) sahip bir iyonu izole edebilen ve belirli bir m/z ile iyona kinetik enerjiyi sırayla koyarak etkinleştirebilen çift basınçlı doğrusal dört kutuplu bir iyon tuzağıdır. çarpışmaya bağlı ayrışmaya neden olur. İkinci analizör, iyonları iç elektrotun etrafındaki dairesel yörüngelerde yakalayan, silindirik bir dış elektrot ve namlulu bir iç elektrottan oluşan Orbitrap'tir. Mükemmel çözme gücüne sahiptir ve karmaşık iyonik türlerin çok aşamalı MS (MSn) deneylerinde etkili parçalanma teknikleriyle sıralanması olanağını sunar.

Borosilikat kılcal damarlar (10 cm uzunluğunda), 10 um uç boyutlarına ve 4 mm konik uzunluklara sahip elektrosprey kılcal damarlar üretmek için bir Sutter p-97 mikropipet çekiciyle çekildi. Vericinin arkasına metanol içinde 5 pmol·μL -1 konsantrasyonundaki 10 uL'lik bir çözelti uygulandı ve çözeltinin içine 0,25 mm'lik bir platin tel yerleştirildi. Platin tele ve koniye uygulanan potansiyel değerler, bileşenlerin etkili bir iyonizasyonunu sağlamak için kalıcı olarak ayarlandı. NanoESI süreci enstrümantal parametrelerin şu şekilde ayarlanmasıyla başlatıldı: nanoESI voltajı, 0,80 kV; koni voltajı, 40–60 V; desolvasyon sıcaklığı, 80 ◦C; S-lens RF düzeyi, %60. MS parametrelerinin bu değerleri iyonizasyonu ve sabit bir spreyi arttırdı ve aynı zamanda gangliosid molekülünün oligosakarit çekirdeğine bağlı kararsız Neu5Ac kalıntısının kaynak içi parçalanmasını en aza indirdi.

Tüm kütle spektrumları (MS ve tandem MS), HR modunda, negatif iyon modu tespitinde ve 200–2000 m/z aralığında elde edildi. MS taramaları çözünürlük 60.000'e ayarlanarak elde edildi. Kütle spektrometresi LTQ Tune Plus v2.7 (Thermo Scientific, Bremen, Almanya) tarafından çalıştırıldı ve kontrol edildi ve MS veri toplama ve işleme, Xcalibur 3.0.63 yazılımı (Thermo Scientific, Bremen, Almanya) kullanılarak sağlandı.

MS/MS deneyleri, çarpışma gazı olarak 50 psi'lik bir basınçta helyum 5.0 saflığı kullanılarak çarpışma hücresinde CID tarafından LTQ'da gerçekleştirildi. MS/MS taramaları, 20,000'ye ayarlanmış bir çözünürlükle elde edildi. İyon seçimi ve parçalanması manuel olarak gerçekleştirildi. Öncü iyonlar, 1 m/z birimlik bir izolasyon genişliği içerisinde seçildi ve parça iyonlarının kapsamını arttırmak için 30-80 eV aralığında değişken çarpışma enerjileri kullanılarak HCD ile parçalandı.

Birikmiş taramaların birleştirilmesiyle elde edilen TIC'ler ve kütle spektrumları, spektrumların çıkarılmasının yanı sıra yumuşatılmasına ve çıkarılmasına olanak tanıyan Xcalibur 2.1 yazılımı (Thermo Scientific, Waltham, MA, ABD) kullanılarak işlendi.

Deneylerden önce m/z ölçeği, Thermo Scientific'ten (Waltham, MA, ABD) ticari olarak Pierce® ESI Negatif İyon Çözümü olarak bilinen özel referans kullanılarak harici olarak kalibre edildi. Negatif iyon modunda bu standart, hem MS hem de tandem MS deneylerinde taranan m/z aralığının adil iyonik kapsamına sahip bir spektrum sağladı.

Negatif iyon modunda nanoESI MS ve MS/MS koşullarının optimizasyonu, karşılaştırma ve veri değerlendirmesi için ticari olarak temin edilebilen aşağıdaki standart gangliosid fraksiyonları ölçüldü: GM1 (sığır beyni); GD1a, GD1b, GT1b ve GQ1b (domuz beyni); ve Avanti Polar Lipids'den (Birmingham, AL, ABD) GM3 ve GD3 (sığır sütü) ve ayrıca ticari olarak Cronassial karışımı olarak bilinen sığır beyninden elde edilen tüm gangliosid ekstraktı, Abano Terme'den (Padua, İtalya).

3.7. Gangliosidlerin Kısaltması

Gangliosid ataması için, 1980'de Svenner-holm [20] tarafından tanıtılan kısaltma sistemi, IUPAC-IUB Biyokimyasal Adlandırma Komisyonu'nun 1998'deki önerileriyle birlikte [21] aşağıdaki şekilde uygulandı:

LacCer-Gal 4Glc 1Cer; GM3-II3 - -Neu5Ac-LacCer; GD3-II3 - -(Neu5Ac)2-LacCer; GT3-II3 - -(Neu5Ac)3-LacCer; GM2-II3 - -Neu5Ac-Gg3Cer; GD2-II3 - -(Neu5Ac)2-Gg3Cer; GM1a veya GM1-II3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GM1b-IV3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GalNAc-GM1b-IV3 - -Neu5Ac-Gg5Cer; GD1a-IV3 - -Neu5Ac, II3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GD1b-II3 - -(Neu5Ac)2- Gg4Cer; GT1b-IV3 - -Neu5Ac, II3 - -(Neu5Ac)2-Gg4Cer; GQ1b-IV3 - -(Neu5Ac)2, II3 - - (Neu5Ac)2-Gg4Cer; nLM1 veya 30 -nLM1-IV3 - -Neu5Ac-nLc4Cer; LM1 veya 30 -isoLM1-IV3 - - Neu5Ac-Lc4Cer; nLD1-disialo-nLc4Cer.

3.8. MS Veri Yorumlama

Bugüne kadar gangliosid taramasının ve tandem kütle spektrumlarının yorumlanmasına yardımcı olacak özel bir bilgisayar yazılımı, veri tabanı veya diğer BT hizmetleri mevcut olmadığından, bu çalışmada tespit edilen moleküler iyonlar, tam kütle hesaplaması ile gangliosid türlerine atanmıştır. Bu tip glikosfingolipid ve bilinen biyosentez yolları hakkında daha önce edindiğimiz bilgilerin bir kısmı. MS ve MS/MS verilerinin yorumlanmasında ve kütle hesaplamalarında, bugüne kadar gelişmiş MS yaklaşımlarını kullanarak çeşitli insan dokularında ve sıvılarında tanımladığımız ve karakterize ettiğimiz geniş gangliosid moleküler ve parça iyon envanteri bize yardımcı oldu. Bu yapılar daha önce yayınlanmış çalışmalarımıza dahil edilen orijinal veritabanlarımızı temsil etmektedir [12,19,22–31]. Bu çalışmada bildirilen yeni türler şu anda mevcut olan gangliosid kayıtlarımızı tamamlamaktadır.

HCD MS/MS içinde oluşturulan oligosakarit omurga dizisi iyonlarının atanması, genel kabul görmüş terminolojiyi takip etti [24,25].

4. Sonuçlar

Bu çalışmada, normo, mikro ve makroalbüminürik hastaların yanı sıra sağlıklı kontrollerden alınan idrar ekstraktlarının aynı çözelti altında karşılaştırmalı bir analizi ile DKD'de gangliosidin belirlenmesi için HR MS ve tandem MS'ye dayalı bir yaklaşım geliştirdik. ve araçsal koşullar. Çalışmamızın nihai amacı, DKD'de kontrollere karşı ve hastalığın farklı evrelerinde ifade edilen renal gangliosidlerin bileşiminde ve yapısında meydana gelen değişiklikleri belirlemekti.

Bu amaç için optimize edilmiş MS platformunun sağladığı yüksek hassasiyet, tekrarlanabilirlik, çözünürlük ve kütle doğruluğu, ifade edilen türlerin sialilasyon derecesinin, DKD'nin bir işaretleyicisini temsil eden, hastalığın ilerlemesinde önemli bir rol oynadığını tespit etmemizi sağladı. Tip 2 DM hastalarının normoalbuminüri aşamasında bile. Ek olarak Cer'in bileşiminde gözlemlenen değişiklikler, glikan yapısının yanı sıra lipit kısmının da DKD aşamaları için moleküler bir parmak izi olarak kabul edilebileceğini göstermektedir.

Araştırmanın daha ileri aşamasında, olası bir biyobelirteç rolü olan türlerin yapısal analizi için HCD'nin MS/MS'i kullanıldı. A3 örneğinde, kütle hesaplamasına göre GQ1(d18:1/18:0) ve GT1(d18:1/18:{{1)'ye karşılık geldiği bulunan moleküler iyonlar 0}}) sırasıyla izole edildi ve cihazın çarpışma hücresinde parçalanmaya tabi tutuldu. Bu deneylerin amacı molekülün ayrıntılı yapısal konfigürasyonu hakkında bilgi toplamaktı. Optimize edilmiş sıralama koşulları, özellikle çarpışma enerjisi aralığı ve çarpışma gaz basıncı, glikozidik bağların spesifik bölünmelerini tetikledi ve bu, tandem kütle spektrumlarında ilgili sinyaller olarak tespit edilen fragman iyonlarının oluşumuyla sonuçlandı. Gangliosid molekülünün karbonhidrat zincirindeki Neu5Ac kısımlarının lokalizasyonuyla ilgili belirli izomerler için çeşitli iyonların tanısal olduğu bulunmuştur. Bu yapısal olarak bilgilendirici dizi iyonlarına dayanarak, GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) ve GT1b(d18:1/18)'nin şunu keşfettik: 0) izomerleri A3 numunesinde mevcuttur ve makroalbuminüri ile ilişkilidir.

Elde edilen sonuçlar, idrarda tespit edilen gangliosidlerin karmaşıklığı arasındaki nedensellik ilişkisini kanıtlamak için daha büyük gruplar üzerinde yürütülen boylamsal çalışmalarda bazı hipotezlerin daha fazla doğrulanmasını gerektirir.DKD hastalarıve Tip 2 DM'nin seyrinde normoalbuminüri aşamasında bile çok erken böbrek tutulumu. Bununla birlikte, mevcut bulguların, gangliosidlerin sialilasyonu, O-asetilasyonu ve O-fukosilasyonunun ve ayrıca bunların O-GalNAc ve CH3COO− tarafından modifikasyonlarının hastalığın ilerlemesinde oynadığı rolün araştırılmasına yönelik bir araştırma yönü açtığını düşünüyoruz. Bu sonuçların bir diğer yararlı yönü, gelişmiş kütle spektrometresi kullanılarak gangliosid profiline dayalı olarak erken DKD tanısına yönelik prosedürlerin olası geliştirilmesidir.

Referanslar

1. Ghaderian, SB; Beladi-Mousavi, SS Kronik böbrek hastalığında diyabet ve hipertansiyonun rolü.J. Ren. Enj. Önceki2014, 3, 109–110. [Çapraz Referans] [PubMed (İngilizce)] 

2. Johansen, KL; Chertow, GM; Foley, RN; Gilbertson, DT; Herzog, CA; Ishani, A.; Israni, AK; Ku, E.; Tamura, MK; Li, S. ABD Renal Veri Sistemi 2020 Yıllık Veri Raporu: Amerika Birleşik Devletleri'nde Böbrek Hastalığının Epidemiyolojisi.Am. J. Böbrek Dis.2021, 77, A7–A8. [Çapraz Referans] [PubMed (İngilizce)] 

3. Lin, YC; Chang, YH; Yang, SY; Wu, KD; Chu, TS Diyabetik böbrek hastalığının patofizyolojisi ve tedavisinin güncellenmesi.J. Med. Doç.2018, 117, 662–675. [Çapraz Referans] [PubMed] 

4. Vallon, V.; Thomson, SC Diyabetik hastalık modellerinde böbrek fonksiyonu: Diyabetik böbreğin patofizyolojisinde tübüler sistem.Annu. Rev. Physiol.2012, 74, 351–375. [Çapraz Referans] 

5. Milas, Ö.; Gadalean, F.; Vlad, A.; Dumitrascu, V.; Velciov, S.; Gluhovschi, C.; Bob, F.; Popescu, R.; Ursoniu, S.; Jianu, DC; ve ark. Pro-inflamatuar sitokinler, tip 2 diyabet hastalarında diyabetik böbrek hastalığının erken evresinde podosit hasarı ve proksimal tübüler fonksiyon bozukluğu ile ilişkilidir.J. Diab. Karmaşık.2020, 34, 107479. [Çapraz Referans] 

6. Petrica, L.; Ursoniu, S.; Gadalean, F.; Vlad, A.; Gluhovschi, G.; Dumitrascu, V.; Vlad, D.; Gluhovschi, C.; Velciov, S.; Bob, F.; ve ark. İdrar podosit ile ilişkili mRNA seviyeleri, tip 2 diyabetin erken diyabetik nefropatisinde proksimal tübül fonksiyon bozukluğu ile ilişkilidir.Diabetol. Metab. Syndr.2017, 9, 31–43. [Çapraz Referans] 

7. Kwak, DH; Rho, YI; Kwon, OD; Ahan, SH; Şarkı, JH; Çooook YK; Kim, SJ; Choi, BK; Jung, KY Sıçanların streptozosin kaynaklı diyabetik glomerüllerinde gangliosid GM3'ün azalması.Hayat Bilimi2003, 72, 1997–2006. [Çapraz Referans] 

8. Masson, E.; Troncy, L.; Ruggiero, D.; Wiernsperger, N.; Lagarde, M.; El Bawab, S. a-Serisi Gangliosidler, Gelişmiş Glikasyon Son Ürünlerinin Perisit ve Mezangial Hücre Proliferasyonu Üzerindeki Etkilerine Aracılık Ediyor: Retinal ve Renal Mikroanjiyopati için Ortak Bir Aracı mı?Diyabet2005, 54, 220–227. [Çapraz Referans] 

9. Zador, Z.; Deshmukh, GD; Kunkel, R.; Radin, NS; Shayman, JA Streptozosin kaynaklı diyabetin böbrek hipertrofisinde glikosfingolipit birikiminin rolü.J. Clin. Araştır.1993, 91, 797–803. [Çapraz Referans]

10. Ene, CD; Penescu, M.; Anghel, A.; Neagu, M.; Budu, V.; Nicolae, I. Dolaşan Gangliosidlerle Diyabetik Nefropatinin İzlenmesi.J. Immunoass. İmmünokimya.2016, 37, 68–79. [Çapraz Referans]