Cistanche Herba Sulu Ekstraktında Ekinakozidin HPLC Tayini

Soyut: Amaç: Cistanche Deserticola'nın su ekstraktında Echinacoside'nin belirlenmesi için bir HPLC yöntemi kurulmuştur. Yöntemler: Ekinakozid HPLC ile belirlendi. Ayırma, asetonitril (A) ve %0,4 fosforik asit çözeltisinden (B) oluşan bir mobil faza sahip bir Inertsil ODSSP C18 kolonu üzerinde gradyan elüsyon yoluyla gerçekleştirildi. Tespit dalga boyu 333 nm'ye ayarlandı ve kolon sıcaklığı 30 dereceydi. Akış hızı 1,0 mL·dak-1 ve enjeksiyon hacmi 10 μL idi. Bulgular: Ekinekozidin 44.93977-539.2764 ug ·m konsantrasyon aralığındaki doğrusal ilişkisi iyiydi(r=0.9998). Geri kazanımlar %94,59-%105,31 (RSD= 2.93%,n=9) idi. Cistanche bitkisinin su ekstraktlarındaki ekinakozit içeriği 15.527,7.347,12.267 mg·g-1 olarak bulunmuştur.

Sonuç: Tekrarlanabilirliği iyi olan yerleşik HPLC yöntemi doğru, basit ve uygulanabilirdir. Cistanche Deserticola'nın su ekstraktında ekinakozidin belirlenmesi için uygundur.

Anahtar Kelimeler: HPLC; Cistanche Deserticola'nın su ekstraktı; Ekinekozid; içeriğin belirlenmesi

Cistanche Deserticola, geleneksel Çin tıbbında klinik uygulamada yaygın olarak kullanılan bir toniktir ve "çöl ginsengi" olarak bilinir. Çin Farmakopesi'nin 2015 baskısında yer alan Cistanche Deserticola, Orobaceae bitkisi Cistanche Deserticola YC Ma veya Cistanche tubulosa (Schenk) Wright'ın kurutulmuş, pullu, etli sapıdır. Sıcak bir yapıya, tatlı ve tuzlu bir tada sahip olup böbrek ve kalın bağırsak meridyenlerine aittir. Böbrek yangını tonlayıcı, öz ve kandan faydalanma, bağırsakları nemlendirme ve kabızlığı giderme etkileri vardır.

Çöl ginsengi

"Shennong Materia Medica Classic", "ortayı besleyebileceğini, beş iç organı besleyebileceğini, yin'i güçlendirip özü besleyebileceğini" belirtiyor. Cistanche Deserticola esas olarak feniletanoid glikozitler, iridoidler ve glikozitler, lignanlar ve glikozitler, polisakkaritler, esterler ve alkaloitler içerir. Feniletanol glikozitler, Cistanche Deserticola'nın ana aktif bileşenleridir; bunların arasında ekinezya ve havuz kenarı, Çin Farmakopesinde Cistanche Deserticola'nın tanımlanması ve içerik belirlenmesi için gösterge bileşenleridir.

Feniletanol glikozit, Cistanche Deserticola'nın ana aktif bileşenidir.

Farmakolojik çalışmalar [4], Cistanche Deserticola'nın bağırsakları nemlendirmek ve kabızlığı gidermek, karaciğeri korumak, osteoporoza direnmek, antioksidan, yaşlanma karşıtı ve yorgunluğu önleyici gibi çeşitli farmakolojik etkilere sahip olduğunu göstermektedir. Cistanche Deserticola'nın sulu ekstraktı, sıçanlarda osteoblastların kemik morfogenetik protein 2 genlerini, yumurtalıkları alınmış farelerin serumunda tartarata dirençli asit fosfataz ve osteokalsinin yanı sıra kemik iliğinde Smad1 ve Smad5 genlerini ve dönüştürücü büyüme faktörlerini destekleyebilir- - - - . vb. ifadelerinin anti-osteoporoz etkisi vardır [5-6]. Ekinosid, osteoblastların çoğalmasını destekleyebilir ve kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin in vitro olarak osteoblastlara farklılaşmasını destekleyebilir [7-9].

Cistanche Deserticola'nın ana kimyasal bileşeni olan Echinoside

Natural Cistanche Echinacoside ürünlerini incelemek için buraya tıklayın

【Daha fazlasını isteyin】 E-posta: xue122522@foxmail.com /WhatsAppp: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Son yıllarda, Cistanche Deserticola'nın alkol ekstraktında ve bileşik preparatlarında ekinakozit ve polisit içeriğinin belirlenmesine ilişkin birçok rapor bulunmaktadır [10-12], ancak Cistanche Deserticola'nın su ekstraktındaki indikatör bileşenlerin içeriğinin belirlenmesine ilişkin çok az rapor bulunmaktadır. Bu çalışmada, Cistanche Deserticola'nın su ekstraktındaki ekinakozit içeriğini belirlemek için yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanıldı.

1. Malzeme

1.1 Cihaz

LC-20AT yüksek performanslı sıvı kromatografisi, SPD-20A dedektör, SIL-20A otomatik örnekleyici, CTO-10ASvp kolon sıcaklık kutusu, LCsolution sıvı kromatografi iş istasyonu, Shimadzu Corporation of Japan; MES125P-OCE-DU Elektronik Analitik Terazi, Sartorius, Almanya; SHZ-D (III) sirkülasyonlu su çok amaçlı vakum pompası, Henan Yuhua Instrument Co., Ltd.

1.2RC2BSO25 döner buharlaştırıcı soğutma sirkülasyon sistemi, RV10DS96 döner buharlaştırıcı, IKA, Almanya; DK-S26 Elektrikli Termostatik Su Banyosu, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd; UPR serisi ultra saf su makinesi, Sichuan Youpu Ultra Pure Technology Co., Ltd.

1.2 Tıbbi Malzemeler ve Reaktifler

Guangzhou Lingnan Geleneksel Çin Tıbbı Slices Co., Ltd.'den satın alınan Et Rong tıbbi malzemesi, parti numarası: 18010011806001, 181001. Guangzhou Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Üçüncü Bağlı Hastanesinin Baş Çin Bitki Uzmanı Tu Xingming tarafından tanımlanan Leobaceae bitkisi Cistanche Deserticola'nın kurutulmuş, pullu, etli sapları, Üçüncü Bağlı Hastanenin İlaç Denetleme Odasında saklanmaktadır. Guangzhou Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi'nden; Ekinosit referans maddesi, içerik %89,7, Çin Gıda ve İlaç Kontrolü Kontrolü Enstitüsü, parti numarası: 111670-201706; Asetonitril kromatografik olarak saftır (Merck, Almanya); Metanol ve fosforik asit analitik olarak saftır (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); Su ultra saf sudur.

2. Yöntemler ve Sonuçlar

2.1 Cistanche Deserticola'dan Su Ekstraktının Hazırlanması

Cistanche tozunu alın, 10 kat daha fazla damıtılmış su ekleyin, ısıtın ve her seferinde 1 saat boyunca iki kez ekstraksiyon yapmak için geri akışa alın. Süzün, süzüntüyü birleştirin ve süzüntüyü 0,100 g · mL-1 ham ilaç içeriğine kadar yoğunlaştırmak için döner bir buharlaştırıcı kullanın. Bekleme için 4 derecede saklayın. 2.2 Kromatografik koşullar ve sistem uygunluğu Kromatografik kolon: InertsilODS SPC18 kolon (150mm × 4,6mm,5 μ m); Mobil faz: asetonitril (A) %- 0.4 fosforik asit çözeltisi (B), gradyan elüsyonu: 0~5 dakika, %17 A; 5~25 dakika, %20 A; 25~30 dakika, %17A; Algılama dalga boyu: 333nm; Sütun sıcaklığı: 30 derece; Akış hızı: 1,0 mL · dk-1; Enjeksiyon hacmi: 10 μ L. Bu kromatografik koşul altında, ekinezya pikleri ile bitişik bileşenler arasındaki çözünürlük 1,5'tan büyüktür ve ekinezya pikleri için teorik sütun sayısı 4000'den az olmamalıdır. Kromatogram Şekil 1'de gösterilmiştir.

Şekil 1 Ekinekozit(A)'nın HPLC kromatogramları ve Cistanche otunun(B) su ekstraktı

2.3 Çözeltinin hazırlanması

2.3.1 Referans çözümü

Uygun miktarda Ekinesetin referans maddesini tartın, doğru bir şekilde tartın, 10 mL'lik ölçülü bir şişeye yerleştirin, çözünmesi için metanol ekleyin ve bekleme için 4 derecede saklanan referans solüsyonunun mililitre μ G'si başına 898.794 Ekinesetin içermesini sağlayın.

Cistanche Deserticola'nın Echinoside'ı

2.3.2 Test çözümü

2,0 mL Cistanche Deserticola sulu ekstraktını doğru bir şekilde ölçün, bir su banyosunda buharlaştırın, metanolde çözün, 10 mL'lik bir ölçülü şişede sabit bir hacme getirin ve . 0.22 μm mikro gözenekli membran filtrasyonunu iyice çalkalayın.

2.4 Doğrusal bir ilişkinin incelenmesi

2.3.1'deki referans çözeltisinin 0,25, 0,50, 1,00, 2,00, 2,50 ve 3,00 mL'sini doğru bir şekilde ölçün ve bunları 5 mL'lik bir ölçülü şişeye yerleştirin, sabit hacme metanol ekleyin ve 44,9397, 89,8794, 179,7588 gradyan konsantrasyonları elde etmek için iyice çalkalayın, 359.5176, 449.3970 ve 539.2764 μ G · mL-1 referans çözeltisi, 0,22 μ M Mikro gözenekli membran filtrasyonu. Belirlemeyi 2.2'deki kromatografik koşullara göre gerçekleştirin ve pik alanını kaydedin. Referans maddenin kütle konsantrasyonu absis (X, μ G · mL-1) olarak kullanıldığında, tepe alanı ordinattır (Y) ve doğrusal regresyon denklemi elde edilir: Y=13185.0X-32273.0, r=0.9998. Sonuçlar ekinezyanın 44,9397 ila 539,2764 μ arasında değiştiğini gösterdi. g · mL-1 konsantrasyon aralığındaki doğrusal ilişki iyidir.

2.5 Hassasiyet testi

539.2764 μG · mL-1 referans solüsyonunu alın, numuneyi 2.2'deki kromatografik koşullara göre sürekli olarak 6 kez enjekte edin ve pik alanını kaydedin. Sonuçlar: Ekinezyanın pik alanının RSD'si %1,81 idi, bu da cihazın iyi bir hassasiyetine işaret ediyordu.

2.6 Stabilite testi

2,0 mL Cistanche Deserticola sulu ekstraktını doğru bir şekilde ölçün, bir su banyosunda kuruyana kadar buharlaştırın, metanolde çözün, 10 mL'lik bir ölçülü şişede sabit bir hacme getirin, iyice çalkalayın, 0,22 μ Mikro gözenekli bir membranla filtreleyin, 2,2'deki kromatografik koşullara göre 0, 2, 4, 8, 12 ve 24 saatte tespit için numuneler enjekte edin ve pik alanını kaydedin. Sonuçlar: Ekinezyanın pik alanının RSD'si %1,16 idi; bu, test solüsyonunun 24 saat içinde iyi bir stabiliteye sahip olduğunu gösterir.

2.7 Tekrarlanabilirlik testi

Cistanche Deserticola'nın 6 porsiyon 2,0 mL sulu ekstraktını doğru bir şekilde ölçün, 2.3.2'de açıklanan yönteme göre paralel olarak 6 porsiyon test çözeltisi hazırlayın, 2.2'de açıklanan kromatografik koşullara göre belirleme için numuneleri enjekte edin ve pik alanını kaydedin. Sonuçlar: Ekinezyanın kütle konsantrasyonunun RSD'si %1,28 idi; bu, yöntemin iyi bir tekrarlanabilirliğe sahip olduğunu gösterir.

Cistanche Deserticola deneyi

2.8 Numune Ekleme Geri Kazanım Testi

9 porsiyon 1,0 mL Cistanche Deserticola sulu ekstraktını doğru bir şekilde ölçün, 0,8, 1,0 ve 1,2 mL referans solüsyonu (101,552 mg · mL - 1) ekleyin, bir su banyosunda buharlaştırın, metanolde çözün ve mL'lik bir ölçülü şişede hacmine getirin; İyice çalkalayın, yüksek, orta ve düşük konsantrasyonlu test çözeltisi hazırlamak için m mikro gözenekli filtre membranlı 0,22 μ filtre. Her bir konsantrasyondan 3 parça paralel olarak hazırlayın, 2.2'deki kromatografik koşullara göre ölçün, pik alanını kaydedin ve numune ekleme geri kazanımını hesaplayın. Sonuçlar Tablo 1'de gösterilmektedir.

2.9 Örnek içeriğinin belirlenmesi

Cistanche Deserticola'dan 3 porsiyon 2,0 mL su ekstraktını doğru bir şekilde ölçün, bir su banyosunda kuruyana kadar buharlaştırın, metanolde çözün, 10 mL'lik balon jojede sabit bir hacme getirin, iyice çalkalayın, 0,22 μ Mikro gözenekli bir membranla filtreleyin, 2.2'deki kromatografik koşullara göre ölçün, pik alanını kaydedin ve ekinezya içeriğini hesaplayın. Sonuçlar Tablo 2'de gösterilmektedir.

Tablo 1: Ekinekozidin geri kazanım testlerinin sonuçları

Tablo 2 Cistanche bitkisinin su ekstraktındaki ekinakozit içerik belirleme sonuçları

3. Tartışma

3.1 Test ürününün hazırlanma yöntemi

Cistanche Deserticola'nın sulu ekstraktı, test edilecek bileşenlerle belirli bir etkileşime neden olan fenil etanol glikozitler ve polisakkaritler gibi çeşitli kimyasal bileşenler içerir. Bu çalışma, %50 metanol ve metanol olmak üzere iki farklı solvent konsantrasyonunu araştırdı. Sonuçlar, solvent olarak %50 metanol kullanılan test ürününün kromatogramındaki piklerin ayırma etkisinin ekinezya ve bitişik bileşenler arasında zayıf olduğunu gösterdi. Çözücü olarak metanol kullanıldığında, ekinezya glikozit zirvesinin çözünürlüğü iyidir ve diğer safsızlık zirvelerinden herhangi bir müdahale olmaz. Bu nedenle test çözeltisi için çözücü olarak metanol seçildi. Çözücü olarak metanol kullanılarak Cistanche Deserticola'nın su ekstraktı bir su banyosunda kuruyana kadar buharlaştırıldı. İki tedavi yöntemi kullanıldı: metanol çözünmesi, sabit hacimde çalkalama ve metanol ultrasonik (10 dakika) çözündürülmesi. Sonuçlar iki yöntem arasında anlamlı bir fark olmadığını gösterdi. Bu yöntem, metanolün çözündürülmesi ve sabit hacimde çalkalamanın basit işlemi nedeniyle test çözeltisini hazırlamak için seçildi.

Çin otu cistanche

3.2 Mobil faz seçimi

Bu çalışmada Çin Farmakopesi'nde (Cilt I) (2015) Cistanche Deserticola'nın içerik tespiti için kullanılan mobil faza (metanol-%0,1 formik asit) atıfta bulunulmuştur. Sonuçlar, ekinezya glikozit zirvesinin genişlediğini ve mobil fazın zayıf elüsyon yeteneğiyle ilişkili olabilecek bir öncü fenomenin bulunduğunu gösterdi; İlgili literatüre bakıldığında [12-13], mobil faz olarak asetonitril-%0,5 asetik asit kullanılmış, ancak ekinezyanın tepe şekli zayıftı ve kuyruklanma olgusu mevcuttu. Mobil fazın pH değeri dikkate alınarak son olarak mobil faz olarak asetonitril-%0,4 fosforik asit kullanıldı. Sonuç olarak, ekinezya zirvelerinin teorik plaka sayısı 4000'den fazlaydı ve ekinezya ile komşu bileşen zirveleri arasındaki çözünürlük 1,5'tan büyüktü. Tepe şekli, safsızlık tepe noktalarının müdahalesi olmadan simetrikti ve taban çizgisi stabildi. Bu nedenle bu çalışmada ekinezya içeriğinin belirlenmesinde kromatografik mobil faz olarak asetonitril-%0,4 - 0.4% fosforik asit kullanıldı. Bu çalışmada Cistanche Deserticola sulu ekstraktındaki Ekinezyanın belirlenmesi için HPLC yöntemi kullanılmıştır.

Cistanche özü tozu

Yöntem basit, doğru ve tekrarlanabilirdir. Cistanche Deserticola sulu ekstraktında ekinezyanın belirlenmesi için uygundur ve Cistanche Deserticola sulu ekstraktı için kalite kontrol yöntemi olarak kullanılabilir. Bu çalışma yalnızca Cistanche Deserticola'nın su ekstraktındaki ekinezya içeriğini belirledi. Gelecekte, çeşitli faktörlerin ekinezya içeriği üzerindeki etkisini araştırmak için Cistanche Deserticola'nın bileşik kaynatmasındaki ekinezya içeriğinin belirlenmesi ve Cistanche Deserticola içeren kaynatmanın kalite kontrolü için bir referans sağlanması planlanmaktadır.