Cistanche Herba Kaynatma Parçalarında ve Cistanche Tubulosa Ekstraktlarında Dört Feniletanol Glikozit Bileşeninin Eşzamanlı Tayini İçin HPLC

Özet: Bu çalışmanın amacı biryüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC)dört feniletanol glikozidin eşzamanlı belirlenmesi için yöntemCistanches Herba kaynatma parçalarıVeCistanche tubulosa özleri. Kromatografik koşullar, asetonitril - 0%1 formik asitten oluşan bir mobil faza sahip bir Inertsil ODS{{0}} kolonu (25{0 mm × 4,6 mm, 5 µm) kullandı Gradyan elüsyonu kullanılarak çözüm. Akış hızı 1.0 mL/dakika olarak ayarlandı, sütun sıcaklığı 30 derecede tutuldu ve tespit dalga boyu, 1{ enjeksiyon hacmiyle 330 nm idi. {27}} µL. Konsantrasyonlarla zirve alanının doğrusallığı, farklı glikozitler için 2,53 ila 201,60 µg/mL arasında değişiyordu ve korelasyon katsayıları (r) 0,9993'ten büyüktü. Tespit (LOD) ve miktar belirleme (LOQ) limitleri sırasıyla 0,2249 ila 1,1004 µg/mL ve 0,3101 ila 0,8161 µg/mL arasındaydı. Yöntem, %3,0'dan düşük RSD değerleriyle iyi bir hassasiyet, kararlılık ve tekrarlanabilirlik gösterdi. Ortalama geri kazanım oranları %97,70 ile %100,95 arasında değişiyordu; bu, numunelerdeki bu bileşenlerin eş zamanlı miktarının belirlenmesinde yöntemin doğruluğunu ve etkinliğini gösteriyor.

Anahtar Kelimeler:Yüksek performanslı sıvı kromatografisi,Cistanches Herba, kaynatma parçaları,Cistanche tubulosa özleri, feniletanol glikozitler, içerik belirleme.

HETIAN DIKENMİKROBİYAL SINIR ODASI

Rou Cong Rong ve Çöl Ginsengi olarak da bilinen Cistanche, Orobanchaceae familyasına ait olup, pullarla kaplı etli sapları nedeniyle geleneksel tıpta kullanılmaktadır. Haloxylon ve Tamarix gibi Chenopodiaceae bitkilerinin köklerini parazitleştirir ve esas olarak Çin'de İç Moğolistan, Qinghai, Sincan ve Ningxia'nın kurak bölgelerinde bulunur. İlk olarak klasik bitkisel metin olan "Shennong Bencao Jing"de birinci sınıf bir bitki olarak listelenmiştir. Cistanche'nin tadı tatlı ve tuzludur, doğası gereği sıcaktır ve böbrek ve kalın bağırsak meridyenleriyle ilişkilidir. Böbrekleri ve yang'ı güçlendirmede, bağırsakları nemlendirmede ve kabızlığı gidermede, karaciğeri korumada, yaşlanmayı önlemede, yorgunlukla mücadelede ve bağışıklığı güçlendirmede faydaları bilinmektedir. Klinik olarak sıklıkla böbrek yang eksikliği, kan eksikliği kabızlığı, kadınlarda kısırlık, diz ve sırt zayıflığı ve hafıza kaybı gibi durumların tedavisinde kullanılır. Cistanche, "Çölün Ginseng'i" ve "değerli bir ilaç" olarak saygıyla anılır.

Bitki, feniletanol glikozitler, iridoid terpenler, alkaloidler, lignanlar ve diğer bileşenleri içerir; ekinakozit ve akteozit, yang'ı, yaşlanmayı önleyici, antioksidan özellikleri ve hafızayı güçlendirmedeki etkileriyle bilinen temsili feniletanol glikozitlerdir. Bu bileşenler Cistanche'nin tıbbi etkilerinin birincil temelini oluşturur ve aynı zamanda Çin Farmakopesi'nin 2020 baskısında kalite değerlendirmesi ve kontrolü için de temel göstergelerdir.

Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılarak Cistanche türlerinde feniletanol glikozit içeriğinin belirlenmesine ilişkin raporlar mevcuttur, ancak bunlar ham Cistanche malzemeleri ve dilimleriyle sınırlıdır. Şu anda Cistanche tubulosa ekstraktı için ulusal standartlar mevcut değildir ve içeriğinin belirlenmesi rapor edilmemiştir. Ön araştırmamız, Sincan'daki Cistanche tubulosa'nın temel olarak dört temsili feniletanol glikozit içerdiğini buldu: ekinekosid, izoakteozit, akteozit ve tubulozit A. Bu çalışma, hem Cistanche kaynatma parçalarında hem de Cistanche tubulosa ekstraktlarında bu dört bileşenin eşzamanlı belirlenmesi için bir HPLC yöntemi oluşturdu. Cistanche kaynatma parçalarının kalitesini daha iyi değerlendirmeyi ve ekstraktları için kalite standartlarının oluşturulmasına yardımcı olmayı amaçlıyor. Rapor aşağıdaki gibidir.

1 Aletler ve Reaktifler

1.1 Araçlar

• LC-20AT yüksek performanslı sıvı kromatografisi, bir diyot dizisi detektörü dahil (Shimadzu, Japonya)

• AB135-S elektronik terazisi (Mettler Toledo, İsviçre)

• KQ-500DE ultrasonik temizleyici (Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.)

• Aike ultra saf su sistemi (Chengdu Tangshi Corning Bilim ve Teknoloji Geliştirme Co., Ltd.)

1.2 Reaktifler

• Pinoresinol diglukosit (Parti numarası S-003-01904003), Isomucronulatol 7-O-glukozit (Parti numarası Y-073-11803024), Mucronulatol 7-O-glukozit (Parti numarası M{)'nin standart maddeleri {6}}) ve Tubuloside A (Parti numarası G-066-11812016), tamamı Beijing Inlay Technology Development Co., Ltd.'den satın alınmış olup saflığı %98'in üzerindedir.

• Kromatografik kalitede asetonitril ve metanol, analitik kalitede formik asit, su ultra saftı.

• Dört parti Cistanches Herba kaynatma parçası (İç Moğolistan'dan S1, S2 kodu; Sincan'dan S3, S4 kodu) tamamı Urumçi'deki dört eczaneden satın alındı.

• Cistanche tubulosa ekstraktlarının (kod S5, enzimle inaktive edilmiş kuru dilim su ekstraksiyonu; kod S6, enzimle inaktive edilmiş kuru dilim alkol ekstraksiyonu; kod S7, enzimle inaktive edilmiş kuru dilim alkol reçineye bağlı ekstraksiyon) tümü Xinjiang Hetian Dichen Pharmaceutical Bioteknoloji Co.'dan satın alınmıştır. ., Ltd.

2 Yöntem ve Sonuçlar

2.1 Kromatografik Koşullar

• Kromatografik sütun: Inertsil ODS{0}} sütunu (250 mm × 4,6 mm, 5 µm)

• Mobil faz: Asetonitril (A) - 0.1% formik asit sulu çözeltisi (B), gradyan elüsyonu ile (0-12 dakika boyunca %17 A'dan %20 A'ya, %20 A'dan %22 A'ya) 12-30 dakikadan fazla, 30-35 dakikadan fazla %22 A ila %17 A)

• Akış hızı: 1.0 mL/dak

• Algılama dalga boyu: 330 nm

• Sütun sıcaklığı: 30 derece

• Enjeksiyon hacmi: 10 µL

  

Hetia Dichen Fiziko-Kimya Laboratuvarı

2.2 Çözelti Hazırlama

• Karışık standart çözelti: Dört standardın her birini doğru şekilde tartın ve ayrı 10 mL'lik ölçülü şişelere aktarın, 1,008, 1,011, 1,012 ve 1,012 konsantrasyonlu tek standart çözeltiler elde etmek için hacmi %50 metanolle tamamlayın Pinoresinol diglukosit, Tubulosid A, Mucronulatol 7-O-glukozid ve Isomucronulatol 7-O-glukozid için sırasıyla mg/L. Her birinden uygun bir miktar ölçün, 10 mL'lik ölçülü bir şişede birleştirin, %50 metanol ile hacme getirin, sırasıyla 201,60, 50,55, 101,20 ve 50,60 µg/mL konsantrasyonlara sahip karışık bir standart çözelti hazırlamak için iyice karıştırın ve filtreleyin 0,45 µm membran filtreden geçirilir.

• Örnek çözelti: Yaklaşık 1.0 g Cistanches Herba kaynatma parçası tozu (4 numaralı elekten geçirilir) doğru şekilde tartılır ve 1{{10}}0 mL'lik amber renkli balon jojeye aktarılır . Tam olarak 50 mL %50 metanol ekleyin, tartın, 40 dakika süreyle 250 W güç ve 35 kHz frekansla ultrasonik olarak ekstrakte edin, soğutun, yeniden tartın ve kayıp kütleyi %50 metanolle tamamlayın. İyice karıştırın, süzün ve süzüntüyü toplayın. Cistanches Herba örnek çözeltisini elde etmek için 0,45 μm'lik membran filtreden geçin. Benzer şekilde, yaklaşık 0,2 g ekstrakt tozu kullanarak Cistanche tubulosa ekstraktı numune çözeltisini hazırlayın.

1. Ekinakozit 2. Tubulosid A 3. Akteozit 4. İzoakteozit A. Karışık referans solüsyonu B. Cistanches Herba kaynatma parçalarının test solüsyonu C. Cistanche Tubulosa ekstraktının test solüsyonu

2.3 Metodolojik İnceleme

Sistem Uygunluk Testi: Bölüm 2.2'deki üç çözeltinin uygun hacimleri, bölüm 2.1'de belirtilen kromatografik koşullar altında örneklendi ve kromatogramlar kaydedildi. Sonuçlar, ekinekosid piki için teorik plaka sayısının 3000'den az olmaması gerektiğini, ayırma derecelerinin 1,5'tan büyük olması gerektiğini ve bu durumun iyi bir temel ayırmayı işaret ettiğini gösterdi. Ayrıntılar için Şekil 1'e bakın.

Doğrusallık Değerlendirmesi: Bölüm 2.2'deki karma referans çözümünün hassas hacimleri (0.5, 1.0, 2.5, 5.0 ve 10.0 mL) ) 10 mL'lik ölçülü şişelere aktarıldı, %50 metanol ile hacme getirildi, iyice karıştırıldı ve bir dizi karışık referans çözeltisi oluşturmak için kullanıldı. Bu çözeltilerden tam olarak 10 µL'si bölüm 2.1'deki kromatografik koşullar altında enjekte edildi. Tepe alanları kaydedildi ve bileşenlerin konsantrasyonları (X, µg/mL) bağımsız değişken ve tepe alanları (Y) bağımlı değişken olarak kullanılarak doğrusal regresyon gerçekleştirildi. Regresyon denklemleri ve doğrusallık aralığı Tablo 1'de bulunabilir.

Saptama ve Kantitasyon Sınırları: Bölüm 2.2'deki karışık referans çözeltisinin hassas hacimleri alınmış, uygun şekilde seyreltilmiş ve bölüm 2.1'deki kromatografik koşullar altında analiz edilmiştir. Tespit ve nicelik limitleri olarak sırasıyla 3:1 ve 10:1 sinyal-gürültü oranlarına karşılık gelen konsantrasyonlar kullanıldı. Sonuçlar Tablo 1'de sunulmaktadır.

Hassasiyet Testi: Bölüm 2.2'deki karışık referans çözeltisinin uygun bir hacmi, bölüm 2.1'deki kromatografik koşullar altında arka arkaya altı kez analiz edildi. Ekinekosid, tubulozid A, akteozid ve izoakteozidin pik alanlarına ilişkin RSD değerleri sırasıyla %1,31, %0,91, %1,58 ve %0,58'dir (n {{12} }), cihazın hassasiyetinin iyi olduğunu gösterir.

Stabilite Testi: Test örneği çözeltileri hazırlandı ve bölüm 2.1'deki koşullar altında analiz edilmeden önce 0, 2, 4, 6, 8, 12 ve 24 saat boyunca oda sıcaklığında bırakıldı. Ekinakozit, tübülozit A, akteozit ve izoakteosidin pik alanlarına ilişkin RSD değerleri sırasıyla %1,84, %2,18, %1,05 ve %1,55 (n=7) olup, test çözeltilerinin oda sıcaklığında stabil olduğunu gösterir. 24 saate kadar sıcaklık.

Tekrarlanabilirlik Testi: Bir numune (ID: S2) doğru şekilde tartıldı ve altı parçaya bölündü. Her kısım, bölüm 2.2'deki yönteme göre bir test numunesi çözeltisi olarak hazırlandı ve bölüm 2.1'deki kromatografik koşullar altında analiz edildi. Ekinakozit, tübülozit A, akteozit ve izoakteozidin ortalama içerikleri sırasıyla %0%0.779, 0.0%20, %0.155 ve %0.074'tür. %1,21, %3,12, %2,65 ve %2,96 (n=6) RSD değerleriyle, yöntemin iyi tekrarlanabilirliğini gösterir.

Geri Kazanım Testi: Bilinen miktarda numune (ID: S2) alındı ​​ve dokuz parçaya bölündü. Her porsiyona, bölüm 2.2'deki yönteme göre hazırlanan bireysel referans çözeltilerinin düşük, orta veya yüksek konsantrasyonları eklendi ve bölüm 2.1'deki kromatografik koşullar altında analiz edildi. Zirve alanları kaydedildi ve iyileşme oranları hesaplandı. Sonuçlar Tablo 2'de gösterilmektedir.

Hetian DiChen HPLC Laboratuvarı

2.4 Örnek İçeriğin Belirlenmesi

Her bir numune partisinin uygun hacimleri, bölüm 2.2'deki yönteme göre test çözeltileri olarak hazırlandı, ardından bölüm 2.1'deki kromatografik koşullar altında analiz edildi. Her numune üç kopya halinde test edildi, zirve alanları kaydedildi ve numunelerin içeriği hesaplandı. Sonuçlar Tablo 3'te gösterilmektedir.

3 Tartışma

Bu çalışmada, bir diyot dizisi detektörü kullanılmış ve karışık referans çözeltilerinin ve test örneği çözeltilerinin taramaları 200 ila 450 nm dalga boyu aralığında gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar, ekinakozit ve akteozidin 330 nm'de, tübülozit A'nın 331 nm'de ve izoakteozidin 327 nm'de maksimum emilim sergilediğini gösterdi. Ek olarak, ekinekozit ve akteozit için 330 nm'lik bir tespit dalga boyunu belirten Çin Farmakopesi'nin 2020 baskısına atıfta bulunularak, birçok bileşenin önemli kromatografik zirvelere ve 330 nm'de yüksek yanıt değerlerine sahip olduğu gözlemlendi ve bu da 330 nm'nin seçilmesine yol açtı. son ölçüm dalga boyu.

Cistanches Herba kaynatma parçalarının içerik belirleme sonuçlarından, hem Cistanche tubulosa hem de çöl Cistanche'de en yüksek içeriğe ekinakozidin sahip olduğu, bunu akteozidin takip ettiği, tubulosid A ve izoakteosidin ise nispeten daha düşük içeriğe sahip olduğu bulunmuştur. Dört feniletanol glikozit bileşeninin içeriğinde önemli bir değişkenlik vardı ve bu değişkenlik aynı yerden veya farklı yerlerden gelen farklı partiler arasında da belirgindi. Bu farklılık, bitkilerde kimyasal bileşenlerin birikimini etkileyen coğrafi çevre, sıcaklık, iklim ve hammaddelerin hasat süreçleri gibi faktörlere bağlanabilir. Farklı kaynaklardan elde edilen Cistanche'nin kimyasal bileşenleri benzer olmakla birlikte, bu bileşenlerin konsantrasyonları farklılık göstererek etkilerinin farklı olmasına neden olur. Bu nedenle daha iyi klinik sonuçlar elde etmek için hammaddelerin etkinliklerine göre seçilmesi uygundur.

Özetle bu çalışmada oluşturulan yöntem basit, hızlı, doğru ve etkilidir. Cistanches Herba kaynatma parçalarında ve Cistanche tubulosa ekstraktlarında dört feniletanol glikozit bileşenini aynı anda belirlemek için kullanılabilir. İçerik belirlemenin sonuçları, aynı veya farklı konumlardan farklı partilerin ve farklı ekstraktların kalite seviyelerini yansıtabilir ve ilgili kalite standartlarının oluşturulması için teorik bir temel sağlayabilir.

Sekme. 2 Kurtarma testinin sonuçları (n=9)

Sekme. 3 Örneklerdeki dört feniletanoid glikozidin içerik belirleme sonuçları(%,n=3)

Cistanche'nin Faydaları

Referanslar:

1. 中文 (Çince): 国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)［M］．北京:中国医药科技出版社,2020:{ {1}}.
   英文 (İngilizce): Ulusal Farmakope Komisyonu. Çin Halk Cumhuriyeti Farmakopesi (Cilt 1) [M]. Pekin: Çin Tıp Bilimi ve Teknolojisi Basını, 2020: 140-141.

2. 中文 (Çince): 朱乃亮,徐荣,吴海峰,等. J］. 中国药学杂志,2016,51(13):1116-1119.
   英文 (İngilizce): Zhu Nailiang, Xu Rong, Wu Haifeng, ve diğerleri. Cistanche Deserticola ve Cistanche tubulosa'nın [J] parmak izleri üzerine karşılaştırmalı bir çalışma. Çin Eczacılık Dergisi, 2016, 51(13): 1116-1119.

3. 中文 (Çince): 闫暾,齐海平,李旻辉,等. J］. 包头医学院学报,2019,35(1):120-121.
   英文 (İngilizce): Yan Tun, Qi Haiping, Li Minhui, ve diğerleri. Cistanche Deserticola ve Cistanche tubulosa'nın [J] karşılaştırılması. Baotou Tıp Fakültesi Dergisi, 2019, 35(1): 120-121.

4. 中文 (Çince): 吴波,顾少菊,傅玉梅,等. J］. 中医药学刊,2003,21(4):539-548.
   英文 (İngilizce): Wu Bo, Gu Shaoju, Fu Yumei, ve diğerleri. Cistanche Deserticola ve Cistanche tubulosa'nın [J] müshil ve tonlayıcı böbrek-yang etkileri üzerine çalışma. Çin Tıbbı ve Eczacılığı Dergisi, 2003, 21(4): 539-548.

5. 中文 (Çince):范亚楠,黄玉秋,贾日柱,等. J］. 中华中医药学刊,2017,35(11):2882-2885.
   英文 (İngilizce): Fan Yanan, Huang Yuqiu, Jia Tianzhu, ve diğerleri. Yaşlanan model farelerde Cistanche Deserticola'nın işleme öncesi ve sonrası yaşlanma karşıtı ve bağışıklık fonksiyonu üzerindeki etkileri [J]. Çin Geleneksel Çin Tıbbı ve Eczacılığı Dergisi, 2017, 35(11): 2882-2885.

6. 中文 (Çince): 吴波,付玉梅. J］. 中国药理学通报,2005,21(5):639.
   英文 (İngilizce): Wu Bo, Fu Yumei. Cistanche glikozitlerinin subakut yaşlanan fareler üzerindeki anti-lipid peroksidasyon etkisi üzerine çalışma [J]. Çin Farmakolojik Bülteni, 2005, 21(5): 639.

7. 中文 (Çince):胡余明,胡怡秀,刘秀英,等. J］. 中国预防医学杂志,2007,8(4):370-373.
   英文 (İngilizce): Hu Yuming, Hu Yixiu, Liu Xiuying, ve diğerleri. Normal farelerde Cistanche glikozitlerinin öğrenme ve hafıza fonksiyonu üzerindeki etkisi üzerine çalışma [J]. Çin Önleyici Tıp Dergisi, 2007, 8(4): 370-373.

8. 中文 (Çince): 屠鹏飞,姜勇,郭玉海,等. J］. 中国现代中药,2015,17(4):297-301.
   英文 (İngilizce): Tu Pengfei, Jiang Yong, Guo Yuhai, ve diğerleri. Batı çöl bölgelerinde ekolojik uygarlığı teşvik etmek için Cistanche Deserticola ekolojik endüstrisini geliştirmek [J]. Modern Çin Tıbbı, 2015, 17(4): 297-301.

9. 中文 (Çince):覃文婷,宿美凤,雒晓梅,等. 定性分苷类及多糖类成分［J］. 辽宁中医药大学学报,2018,20(7):77-81.
   英文 (İngilizce): Qin Wenting, Su Meifeng, Luo Xiaomei, ve diğerleri. Farklı kökenlerden Cistanche Deserticola'daki feniletanoid glikozitlerin ve polisakkaritlerin kalitatif analizi [J]. Liaoning Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Dergisi, 2018, 20(7): 77-81.

10. 中文 (Çince): 王力伟,曹瑞,房永雨,等. J］. 中药材,2017,40(2):295-300.
    英文 (İngilizce): Wang Liwei, Cao Rui, Fang Yongyu, ve diğerleri. Ultra performanslı sıvı kromatografisi-tandem üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi [J] ile Cistanche Deserticola'daki aktif bileşenlerin belirlenmesi. Çin Tıbbi Malzemeleri Dergisi, 2017, 40(2): 295-300.

11. 中文 (Çince): 初侨,席兴军,杨丽. J］. 食品研究与开发,2015,36(16):49-52.
    英文 (İngilizce): Chu Qiao, Xi Xingjun, Yang Li. Cistanche Deserticola'da [J] ekinakozit ve verbaskosidin flaş ekstraksiyon teknolojisi üzerine çalışma. Gıda Araştırma ve Geliştirme, 2015, 36(16): 49-52.

12. 中文 (Çince): 余逸凡. J］. 化工管理,2019(13):111-112.
    英文 (İngilizce): Yu Yifan. Cistanche'nin [J] kimyasal bileşenleri ve farmakolojik aktiviteleri üzerine araştırma ilerlemesi. Kimyasal Yönetimi, 2019(13): 111-112.

13. 中文 (Çince): 王小新,骆婷婷. 肉苁蓉对小鼠抗疲劳及记忆力的影响［J. 内蒙古中医药,2014,33(22):102–103.
    英文 (İngilizce): Wang Xiaoxin, Luo Tingting. Cistanche Deserticola'nın farelerde yorgunluk önleme ve hafıza üzerindeki etkisi [J]. İç Moğolistan Geleneksel Çin Tıbbı Dergisi, 2014, 33(22): 102-103.

14. 中文 (Çince): 随家宁,李芳婵,郭勇秀,等. 化学成分,药理作用研究进展及其质量标志物预测分析［J］. 辽宁中医药大学学报,2021,23(1):191-196.
    英文 (İngilizce): Sui Jianing, Li Fangchan, Guo Yongxiu, ve diğerleri. Cistanche Deserticola'nın kimyasal bileşenleri ve farmakolojik etkileri üzerine araştırma ilerlemesi ve kalite belirteçlerinin tahmin analizi [J]. Liaoning Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Dergisi, 2021, 23(1): 191-196.

15. 中文 (Çince): 刘涛,殷松娜,栾昕. J］. 中国临床药理学杂志,2019,35(23):3084-3087.
    英文 (İngilizce): Liu Tao, Yin Songna, Luan Xin. Cistanche Deserticola'nın erken yumurtalık yetmezliği olan sıçanlarda bağışıklık faktörleri ve apoptozla ilişkili proteinler üzerindeki etkisi [J]. Çin Klinik Farmakoloji Dergisi, 20