Farelerde Vitreus Boşluğuna Allojeneik Retinal Progenitör Hücrelerin Sıralı Binoküler Transplantasyonuna Bağışıklık Tepkileri

Soyut:

Allojeneik insan retina progenitör hücrelerinin (RPC) intravitreal transplantasyonu, kör edici retinal dejenerasyonun tedavisi için umut vaat ediyor. Önceki çalışmalar, nöral progenitörlerin, tek enjeksiyonları takiben allograftlar olarak iyi tolere edildiğini göstermiştir; ancak allojeneik hücrelerin ardışık olarak verilmesi, greftlerin daha sonra immün reddi ile birlikte konakçı duyarlılığının potansiyel riskini artırır. Mevcut çalışma, fare hayvan modeli kullanılarak allojenik RPC'lerin tekrarlanan intravitreal transplantasyonları ile bir bağışıklık tepkisinin indüklenip indüklenmeyeceğini değerlendirmek üzere tasarlandı. Orijinal olarak C57BL/6 genetik geçmişine sahip donörlerden türetilen fare retinal progenitör hücrelerini (gmRPC'ler), allojenik insan hücre ürünüyle hastaların tekrarlanan tedavisinin ardından neler beklenebileceğine ilişkin güvenlik verileri sağlamak amacıyla BALB/c alıcı farelere enjekte ettik. . GmRPC'lere karşı bağışıklık tepkileri hafifti; T hücreleri, B hücreleri, nötrofiller ve doğal öldürücü hücrelerden oluşuyordu; makrofajlar açıkça baskındı. Tekrarlanan dozlarda gmRPC'lerle tedavi edilen hayvanlarda duyarlılık belirtisi görülmediği gibi, aşılarda immün aracılı tahribat da görülmedi. İmmünsüpresif tedavilerin olmamasına rağmen, allojenik gmRPC greftleri tekrarlanan dozlamanın ardından hayatta kaldı, böylece allojenik RPC'lerin vitreus boşluğuna tekrarlanan enjeksiyonunun retinitis pigmentozalı hastalarda tolere edildiğine dair ön gözlem için destek sağladı.

cistanche bitkisi bağışıklık sistemini güçlendiriyor

Cistanche Enhance Immunity ürünlerini görüntülemek için buraya tıklayın

【Daha fazlasını isteyin】 E-posta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Anahtar Kelimeler: kök hücreler; bağışıklık toleransı; bağışıklık ayrıcalığı; aşı reddi; intravitreal enjeksiyon

1. Giriş

Retinitis pigmentosa (RP), bir genetik çubuk-koni dejenerasyonu sınıfını kapsar ve ilerleyici görme bozukluğu ve sonunda körlükle sonuçlanır. Vakaların büyük çoğunluğu için, görmeyi korumak veya eski haline getirmek için kanıtlanmış herhangi bir terapötik önlem mevcut değildir; ancak karşılanmayan bu tıbbi ihtiyacı karşılamaya yönelik stratejilerden biri kök hücre naklidir. Araştırma grubumuz, ilerlemeyi stabilize etme veya belki de hastalığın seyrini tersine çevirme terapötik hedefiyle RP'ye müdahale etmenin bir yolu olarak kültürlenmiş insan retina progenitör hücrelerinin (RPC) intravitreal enjeksiyonunu araştırdı. RPG'ler doku bağışı yoluyla olgunlaşmamış retinalardan veya daha yakın zamanda pluripotent hücre hatlarından türetilebilir. Hayvan modellerinde yapılan çalışmalar, bu hücrelerin göze enjeksiyon sonrasında fotoreseptörleri dejenerasyondan kurtarabildiğini ve aynı zamanda konakçının gözünde çubuk fotoreseptörlere farklılaşabildiğini göstermiştir. Hayvan çalışmalarından elde edilen, enjekte edilen hRPC'lerin işlevsel, entegre fotoreseptörler haline gelebildiğine ve dolayısıyla ölen hücrelerin doğrudan yerini alarak retinayı potansiyel olarak stabilize edebildiğine dair bazı kanıtlar vardır. Bu nedenle, enjekte edilen hRPC'ler RP'yi hem nörotrofik bir şekilde hem de bir hücre değiştirme mekanizması yoluyla tedavi edebilir. Her iki durumda da, bu hücre temelli yaklaşım, RP'den etkilenen hastaların ve potansiyel olarak diğer retina hastalıklarının tedavisi için rasyonel bir strateji sunmaktadır.

RPC'lerin ve belki de genel olarak nöral progenitörlerin diğer bir olumlu özelliği, özellikle retina gibi immün ayrıcalık sergileyen bir konuma teslim edildiğinde, allograftlar olarak transplantasyonu takiben bu hücrelerin sağladığı göreceli toleranstır [1,2]. Bununla birlikte, rejeneratif tıp alanında yürütülen klinik araştırmalara ilişkin son incelemeler, retinal gen tedavileri [5] gibi gözü hedef alan müdahaleler de dahil olmak üzere inflamasyon ve immün reddiyle ilgili yaygın ve önemli zorlukları [3,4] bildirmeye devam etmektedir: aynı zamanda hücre tedavilerinin tamamı olmasa da bazılarıdır [6]. Yerel bir hücre tipi olmasına rağmen, retina pigment epitel (RPE) hücresi reddedilme sorunlarından muaf değildir [7-9]; bu nedenle alıcıların immün baskılanması şu anda standart uygulamadır [10,11]. Öte yandan, insan RPC'leri allograftlar olarak oldukça iyi tolere ediliyor gibi görünmektedir [6,12-16], ancak bu onların immün baskılamanın gerekli olduğu ksenograftlar olarak kullanımlarını kapsamaz [17]. Allojeneik RPC'lerin gözde sürekli hayatta kalmasının temeli muhtemelen kullanılan hücreler ve alıcı bölge ile ilgili bir takım faktörleri içermektedir [1,8,18,19]. Akış sitometrisini kullanan önceki çalışmalarda, hem beyinden türetilen hem de retinadan türetilen insan nöral progenitörlerinin, sınıf I'i ifade ettiğini, ancak sınıf II'yi, majör histo-uyumluluk (MHC) antijenlerini ifade etmediğini göstermiştik [20,21]. Greft reddinin klasik mekanizması, yabancı MHC sınıf II moleküllerinin CD4+ konakçı lenfositleri tarafından spesifik olmayan tanınmasını içerir [20-25]. Bu şekilde, sınıf II moleküllerin yokluğu, aşılanmış progenitör hücrelerin, bu mekanizmanın aracılık ettiği bağışıklık reddinden kaçmasına izin verebilir. Ancak intravitreal olarak enjekte edilen hRPC'lerin görünen "bağışıklık ayrıcalıklı" durumu mutlaka mutlak değildir. Fare merkezi sinir sistemi (CNS) progenitörleri başlangıçta saptanabilir sınıf I veya sınıf II MHC moleküllerini eksprese etmezken ve allograftlar olarak belirgin immün ayrıcalık sergilerken [1,2,20], bu hücreler belirli koşullar altında immün redde maruz kalabilir. Çalışmalar, MHC antijenlerinin, CNS progenitörlerinin interferon-gamma (IFN) ile uyarılması yoluyla uyarılabileceğini göstermiştir [1,26]. Daha önce aşılanmış bir konağın duyarlı hale getirilmesinin ardından CNS progenitörleri reddedilebilir. Bu nedenle, CNS progenitör hücreleri (RPC'ler dahil), konakçı bağışıklık sistemi tarafından tespit edilen alloantijenleri eksprese eder. Birlikte bu, aşılanmış progenitör hücrelerin immün ayrıcalıklı statüsünün geçici olduğunu ve örneğin yerel mikro ortamda mevcut olan ve RP gibi dejenerasyonların seyri sırasında değişime uğrayabilen sitokinler tarafından modülasyona tabi olduğunu ima eder. Tüm bu nedenlerden dolayı, çoklu intravitreal RPC enjeksiyonlarına karşı bağışıklık tepkisinin tahmin edilmesi zordur ve özel olarak incelenmesi gerekir.

cistanche tubulosa-bağışıklık sistemini iyileştirir

Eğer RPC tedavisinin RP'de klinik olarak başarılı olduğu kanıtlanırsa, bu iki taraflı kör edici hastalıkta her iki gözün de tedavisi için güçlü teşvikler olacaktır. En azından güvenlik nedeniyle, binoküler tedaviler tipik olarak iki enjeksiyon arasında önemli bir gecikme süresi olacak şekilde sırayla gerçekleştirilir. Allojeneik hücrelerin bu sıralı dağıtımının, ilk enjeksiyona yanıt olarak konakçı duyarlılığına yol açabileceği ve potansiyel olarak ikinci enjeksiyona yanıt olarak bağışıklık reddini tetikleyebileceği dikkate alınmalıdır. Bu, her iki gözde de greft kaybına neden olabilir. RP'de hRPC'lerle tek subretinal dozlamayı [27] veya hayvanlarda insan nöral progenitörleriyle tekrar dozlamayı [28,29] inceleyen önceki raporlarda immün baskılama yer alıyordu. Bu nedenle, aşağıdaki çalışma, farklı bir genetik geçmişe sahip, bağışıklık sistemi yetkin bir fare suşunda sıralı allograftlar olarak fare RPC'lerinin translasyonel bir araştırması olarak tasarlanmıştır. İnsan RPC ürünlerini içermemekle birlikte bu çalışma, güvenliği ele alan hayvan verilerini sağlamak amacıyla IND'yi mümkün kılan çalışmaların bir parçası olarak gerçekleştirildi; yani FDA kayıtlı çalışmalarda tekrarlanan RPC allograft tedavileri alan hastalar için immün baskılamanın gerekli olup olmayacağı.

2. Sonuçlar

Allojeneik farelerde iki taraflı RPC enjeksiyonunun immünolojik sonuçlarını incelemek için gmRPC'ler (C57BL/6 genetik arka planı), BALB/c alıcılarının bir gözüne intravitreal olarak enjekte edildi ve 2 hafta sonra diğer göze ikinci bir RPC dozu enjekte edildi. 2-haftalık zaman aralığı, ilk aşının hem doğuştan hem de adaptif bağışıklık tepkilerini tetiklemesine izin verecek yeterli olacak şekilde seçildi. Deney hayvanlarının hiçbiri, doğal fizyolojik bağışıklık tepkilerinin gözlemlenebilmesi için herhangi bir bağışıklık baskılayıcı ilaç tedavisi almadı.

2.1.Klinik Gözlem ve Oftalmik Muayenede Herhangi Bir Anormallik Ortaya Çıkmadı

Deney hayvanlarının ağırlıkları her gmRPC enjeksiyonu sırasında ölçüldü. Tüm deney hayvanları, birinci ve ikinci enjeksiyon arasında genel sağlık durumuyla tutarlı olarak kilo artışı gösterdi. İkinci gmRPC enjeksiyonundan sonra 14. günde ve 28 ± 1. günde sonlandırılan hayvanlar cerrahi mikroskopla incelendi. İncelenen gözlerin çoğunluğunun hem ön hem de arka segmentlerinin "normal sınırlar içinde" (WNL) olduğuna karar verildi. Tedavi edilmeyen, sahte olarak tedavi edilen ve gmRPC ile tedavi edilen gruplarda herhangi bir iltihaplanma belirtisi veya diğer görünür anormallikler yoktu; bu, gmRPC intravitreal enjeksiyonunun, bu yöntemle tespit edilebilecek yasadışı inflamatuar tepkileri veya fiziksel doku hasarını tetiklemediğini gösteriyor. Grefti oluşturan hücre kümeleri, ikinci gmRPC enjeksiyonunu takiben hem 14. günde hem de 28 ± 1. günde vitreusta görülebiliyordu (Şekil 1). Tekrarlanan gmRPC enjeksiyonu, donör hücresinin sürekli hayatta kalmasıyla tutarlı olarak hücre kümelerinin boyutunda gözle görülür değişikliklere neden olmadı. Terminal uç noktasında brüt patoloji de değerlendirildi ve herhangi bir genişlemiş gözbebekleri (tümör oluşumunun göstergesi) veya başka anormallikler kaydedilmedi.

Şekil 1. Cerrahi bir mikroskop (tümü=sol göz, OS) aracılığıyla fundus fotoğrafçılığı yoluyla in vivo olarak görselleştirilen nakledilen gmRPC'ler. (A, B), sahte tedavi gören hayvanlar (sahte/sahte, S/S); (C, D), sahte tedavi görmüş sağ gözü ve ardından gmRPC'ler ile tedavi edilmiş sol gözü olan kontrol hayvanları (sahte/hücre, S/C) ve her iki gözü sırayla gmRPC'ler (hücre/hücre, C/C) ile tedavi edilmiş hayvanlar cerrahi mikroskopla gözlemlendi ve görüntülendi. Üst panel (A, C, E), ikinci enjeksiyondan sonraki 14. günde alınan OS görüntülerini gösterir; alt panel (B, D, F), ikinci enjeksiyondan sonraki 28. günde alınan OS görüntülerini gösterir. Allogreftler, her iki zaman noktasında (14. Gün: (C, D); ve 28. Gün: () hücre enjekte edilen sol gözlerin (S/C, C/C) vitreusunda görülebilen soluk renkli hücre kümeleri (oklar) olarak görüldü. E, F)). Bu şekilde eksenel olarak bakıldığında, ön ve arka segmentlerde greftler dışında belirgin bir iltihaplanma veya ek anormallik görülmedi.

2.2. İmmünofloresan Etiketleme Vitreustaki Bağışıklık Hücrelerini Gösterdi

Oküler kriyoseksiyonlarda beş ana immün hücre tipi (makrofajlar, nötrofiller, doğal öldürücü hücreler, T hücreleri ve B hücreleri) için immünofloresan etiketleme gerçekleştirildi ve gmRPC enjeksiyonunun ardından gözde pozitif immün hücre infiltrasyonu ortaya çıktı (Şekil 2A-F). T hücresi (CD3), B hücresi (CD45R), nötrofil (Ly-6G) ve doğal öldürücü hücreler (CD49b), gmRPC'lerin enjekte edildiği gözlerde sınırlı bir varlık sergilerken, aktive edilmiş makrofajlar (Iba-1) ) intravitreal greftlere yanıt veren ana bağışıklık hücreleriydi. Tedavi edilmemiş ve sahte tedavi görmüş hayvanlardan alınan karşılaştırılabilir dokularda oküler kriyoseksiyonlarda bağışıklık hücreleri görülmedi; bu da görülen bağışıklık hücresi infiltrasyonunun gmRPC greftlerine bir yanıt olduğunu ortaya koydu. Bu gözlemle tutarlı olarak bağışıklık hücreleri, gmRPC greftlerini çevreleyen alanda veya gmRPC kümelerinin içinde bulunuyordu.

Şekil 2. Tedavi grubuna göre sızmış bağışıklık hücrelerinin immüno-etiketlenmesi. (A) kontrol bölümlerinin (yalnızca ikincil antikor), (B) anti-Iba-1 (aktive edilmiş makrofaj ve mikroglia işaretçisi), (C) anti-Ly-6G (nötrofil işaretçisi) immünofloresan görüntüleri, (D) anti-CD49b (doğal öldürücü hücre işaretçisi), (E) antikorlar anti-CD3 (T hücresi işaretçisi) ve (F) anti-CD45R (B hücresi işaretçisi) şekilde gösterilmektedir. Mevcut sınırlı kırmızı sinyaller, lökosit belirteçleri için pozitif antikor etiketlemesini, yeşil sinyaller gmRPC greftlerini ve mavi sinyaller DAPI nükleer etiketlemesini gösterir. Sarı, sinyallerin spesifik olmayan bir şekilde örtüşmesidir ve en çok otofloresans sergileyen fotoreseptör dış segmentlerinde belirgindir. Tedavi grupları: tedavi edilmemiş (UT), her iki göz de tedavi edilmemiş; S/S, her iki göze de araçla (sıralı olarak) sahte tedavi uygulandı; S/C, sağ göze araç enjekte edildi, ardından sol göze 50,000 gmRPC enjekte edildi ve; C/C, her iki göze Bölüm 4'teki programa göre 50,000 gmRPC (sırayla) enjekte edildi

Gözdeki her bağışıklık hücresinin en yüksek sayıları hücre tipine göre değişiyordu (Şekil 3A-E). Buna karşılık, iki yönlü ANOVA, tek gmRPC enjeksiyonu alan hayvanları (sahte/hücreler) iki taraflı enjeksiyon alan hayvanlarla (hücreler/hücreler) karşılaştırırken bağışıklık hücresi infiltrasyonunda hiçbir fark ortaya çıkarmadı. Bu, makrofajların (anti-Iba-1 boyaması) (Şekil 3A), nötrofillerin (anti-Ly-6G boyaması) (Şekil 3B), doğal öldürücü hücrelerin (CD49b boyaması) infiltrasyonu için geçerliydi ( Şekil 3C), T hücreleri (CD3 boyama) (Şekil 3D) ve B hücreleri (CD45R boyama) (Şekil 3E).

2.3. ELISPOT Antijen Geri Çağırma Yanıtlarını Göstermedi

ELISPOT, antijene spesifik IFN üreten T hücresi aktivasyonunu test etmenin bir yoludur. Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA) tedavisi, T hücresi reseptör yolunu aktive etmek ve daha sonra T hücresi aktivasyonuna neden olmak için ikinci haberci DAG'yi taklit eden pozitif bir kontroldü. Şekil 4A-D'de, PMA ile tedavi edilen gruplar, yalnızca yanıt veren hücrelerin (yani, CLN'lerden lenfositler, dalaklardan splenositler) bulunduğu kontrol gruplarına kıyasla çok daha yüksek IFN nokta sayıları gösterdi. Yanıt veren hücreler C57BL/6 splenositlerle (B6 SPL) birlikte kültürlendiğinde, 14. gün numuneleri tek başına yanıt veren hücrelerle karşılaştırılabilir düzeydeydi; yalnızca biraz daha yüksek IFN nokta sayımları vardı, bu da T hücresi aktivasyonunun olmadığını gösteriyordu (Şekil 4A, B).

Şekil 3. gmRPC transplantasyonunun ardından immün hücre infiltrasyonunun ölçülmesi. Sızmış bağışıklık hücreleri, her deney koşulu için gmRPC enjeksiyonunu takiben görüntüleme alanı içinde kırmızı floresan sinyaller olarak görselleştirildi, ImageJ kullanılarak sayıldı ve çubuk grafiklerde çizildi. Iba-1 (aktif makrofaj ve mikroglia işaretçisi) (A), anti-Ly-6G (nötrofil işaretçisi) (B), anti-CD49b (doğal öldürücü hücre işaretçisi) (C), antikorlardan elde edilen veriler anti-CD3 (T hücreleri işaretleyicisi) (D) ve anti CD45R (B hücreleri işaretleyicisi) (E) şekilde gösterilmiştir. Sahte/hücre ve hücre/hücre grupları arasındaki anlamlılığı test etmek için iki yönlü ANOVA testleri kullanıldı; p değerleri şöyleydi: (A) p < {{10}}.4492, (B) p < 0.9376, (C) p < 0.119{{18 }}, (D) p < 0,6411 ve (E) p < 0,7201 (hiçbiri anlamlı değildi).

Bu tahlil kullanılarak allojenik donör hücreleri test edilirken, intraperitoneal olarak gmRPC'ler (IP grubu) enjekte edilen hayvanlardan gelen yanıt veren hücrelerde antijen hatırlama yanıtları yoktu çünkü numuneler, hiç maruz kalmayan sahte hayvanlarla karşılaştırıldığında IFN nokta sayımlarına göre daha fazla T hücresi aktivasyonu göstermedi. gmRPC'lere (sahte/sahte). GmRPC'lerin intravitreal olarak bir kez (sahte/hücre) veya tekrar tekrar (hücre/hücre) enjekte edildiği hayvanlarda da herhangi bir antijen hatırlama tepkisi görülmedi. Bir durumda, gmRPC dozajının tekrarlanmasına verilen yanıtlar daha sessiz görünüyordu (Şekil 4B). Birlikte, bu sonuçlar gmRPC'lerin çok düşük antijenite sergilediğini gösterdi. C57BL/6 splenositlerinin gmRPC'lerin genetik geçmişiyle eşleştiğini unutmayın. Beklenmedik bir şekilde alternatif uyarıcı hücreler, gmRPC'ler, negatif kontrol gruplarına kıyasla tüm deney gruplarında IFN nokta sayısını artırdı (Şekil 4A-D). Potansiyel bir açıklama, bu tahlilde yüksek bir arka plana neden olan gmRPC'ler olabilir. Önemli olarak, tedavi edilmemiş, sahte olarak tedavi edilmiş, tek gmRPC enjeksiyonu ve tekrarlanan gmRPC enjeksiyonu grupları arasında hiçbir fark yoktu; bu da yine antijen hatırlama yanıtlarının yokluğunu gösterdi.

Şekil 4. gmRPC transplantasyonunun ardından ELISPOT ölçümü. ELISPOT analizleri aşağıdaki gruplar halinde belirlendi: kontrol, tek başına yanıt veren hücreler (deney hayvanlarının servikal lenf düğümlerinden (CLN'ler) veya dalaklarından (SPL) izole edilmiş T hücrelerini içeren lenfositler veya splenositler; PMA, forbol ile tedavi edilen yanıt veren hücreler {{1} }miristat 13-asetat (PMA) ve Ca iyonofor; B6 SPL, C57BL/6 hayvanlarından izole edilen splenositlerle karıştırılmış yanıt veren hücreler; gmRPC'ler, gmRPC'lerle karıştırılmış aynı yanıt veren hücreler. (A), Yanıt veren hücreler splenositlerdi. İkinci gmRPC enjeksiyonundan sonra 14. günde kurban edilen deney hayvanlarından. (B) Yanıt veren hücreler, ikinci gmRPC enjeksiyonundan sonra 14. günde kurban edilen deney hayvanlarının CLN'lerindeki lenfositlerdi. (C) Yanıt veren hücreler ikinci gmRPC enjeksiyonundan sonra 29. günde kurban edilen deney hayvanlarının splenositleriydi.(D) Yanıt veren hücreler, ikinci gmRPC enjeksiyonundan sonra 29. günde kurban edilen deney hayvanlarının CLN'lerinden gelen lenfositlerdi. Sahte/hücre ve hücre/hücre grupları arasındaki anlamlılığı (*) test etmek için iki yönlü ANOVA testleri kullanıldı; p değerleri şöyleydi: (A) p < 0.5332, (B) p < 0.0001 (anlamlı), (C) p < 0,0207 ( anlamlı) ve (D) p < 0,3355.

3. Tartışma 

Retinal dejeneratif hastalıkların tedavisinde bir araç olarak kök hücre teknolojisine büyük ilgi olmuştur ve grubumuz, RP'de allojenik hRPC'lerin kullanımını araştırmaktadır. İntravitreal enjeksiyon yoluyla birden fazla doz allojenik insan RPC ürünü uygulandığında olası bağışıklık sonuçlarını ele alan verileri toplamak için, C57BL/6 arka planından gmRPC'leri greft olarak ve BALB/c farelerini konakçı olarak kullanarak mevcut hayvan çalışmasını gerçekleştirdik. Bu farklı genetik geçmişler, allojenik hRPC'lerle sıralı tedaviyi modellemek ve insanlarda test edilmeden önce ön güvenlik verileri sağlamak için kullanıldı.

Yanıtları tam olarak değerlendirmek için, konakçı hayvanlara herhangi bir bağışıklık baskılayıcı tedavi uygulanmadı. Tek bir gmRPC enjeksiyonuyla oluşturulan bağışıklık tepkilerini, açıklanan enjeksiyon programına göre sıralı iki taraflı dozlamayla karşılaştırdık. Oftalmik muayeneler, 1 doz gmRPC veya 2 doz gmRPC alan hayvan grupları arasında inflamasyonu veya başka herhangi bir kayda değer farkı ortaya çıkarmadı; bu, alıcıların ilk gmRPC tedavileri tarafından duyarlılaştırılmadığını veya duyarlılığın hafif olduğunu düşündürdü. İmmünetiketleme sonuçları, T hücreleri (CD3), B hücreleri (CD45R), makrofajlar (Iba-1), nötrofiller (Ly-6G) ve doğal öldürücü hücreler (Ly-6G) olmak üzere beş bağışıklık hücresi tipinin tamamının incelendiğini ortaya çıkardı. CD49b) göze sızmış ve nakil sonrası RPC greftlerini hedef almıştır. Bununla birlikte, bu sızma nispeten ılımlıydı ve diğer hücre tipleri tespit edilebilse de ağırlıklı olarak Iba-1 pozitif makrofajlardan oluşuyordu. Çok sınırlı sayıda T hücresi, B hücresi, nötrofil ve doğal öldürücü hücre mevcuttu. İlginç bir şekilde, makrofajların varlığına rağmen her iki durumda da greft kaybı olmadan tek ve tekrarlı RPC greftleriyle gösterilen hayatta kalma eşdeğerdi. Genel olarak bu, immün baskılama kullanılmasa bile, genetik olarak farklı RPC'lere karşı hem doğuştan hem de edinilmiş bağışıklık tepkilerinin orta derecede olduğunu göstermektedir. Ayrıca ELISPOT tahlil sonuçları, gmRPC ile tedavi edilen gruplarda hiçbir antijen hatırlama tepkisi göstermedi; bu, T hücrelerinin C57BL/6 farelerinden gmRPC greftlerinin reddedilmesinde önemli bir rol oynamadığı iddiasıyla tutarlıdır. Yine, gmRPC greftlerinde makrofaj infiltrasyonu gözlendi, ancak bu, klasik immün reddi ile ilişkili tipte önemli greft tahribatı ile ilişkili değildi [22-24].

erkekler için cistanche faydaları-bağışıklık sistemini güçlendirir

Bu gözlemler birlikte, diğer dokularda görülen, yaygın olarak tanınan T ve B hücresi aracılı allojenik transplant reddi mekanizmalarından açıkça farklı olan bir durumu ortaya koymaktadır. Bu duruma birçok faktör katkıda bulunabilir. Bir tarafta, vitreus'un kornea ve retina ile bu tür özellikleri ne ölçüde paylaştığı daha az çalışılmış ve belki de daha tartışmalı olsa da, gözün "bağışıklık ayrıcalıklı" bir bölge olduğu kavramı vardır. Öte yandan, RPC'lerin kendileri, daha sık çalışılan hücre tipleriyle karşılaştırıldığında allograftlar olarak azalmış immünojenite sergiliyor gibi görünmektedir. Daha önce gösterdiğimiz gibi, murin RPC'leri, MHC sınıf I ve sınıf II antijenlerinin temel ekspresyonundan yoksundur, ancak bunlar sitokin uyarımı yoluyla indüklenebilir. MHC ekspresyonunun bu yokluğu, transplantasyon sonrasında bu hücrelerin hayatta kalmasına katkıda bulunabilir. Bununla birlikte, aşılarda bağışıklık hücrelerinin varlığı, bu ortamda aşı toleransının pasif olmadığı ve aktif bir bağışıklık düzenleyici fenomenin sonucu olduğu kavramını desteklemektedir. Burada, aynı türden immün hücre infiltrasyonunun tek enjeksiyonlardan sonra zaten mevcut olduğu ve tekrarlanan dozlama ile daha da kötüleşmediği vurgulanmalıdır; dolayısıyla, özellikle makrofajlar tarafından olmak üzere greftlerin immün hücre infiltrasyonunun daha önceki bir sonucun sonucu olmadığı yönündeki sonuçumuzun altı çizilmelidir. konak duyarlılığı. Bu deneyin parametreleri dahilinde, tekrar dozlamanın genel greft yaşayabilirliğini azaltmadığı görüldü; bu, terapötik bağlamlarda sürekli etkililik olasılığı ile tutarlıydı. Farklı enjeksiyon aralıkları gibi alternatif parametreler, bağışıklık hücresi aktivitesini klinik uygulamayla alakalı olacak ölçüde artırabilir veya azaltabilir. Makrofaj baskınlığı da dahil olmak üzere sızıntıların hücresel bileşenlerinin insanlar için de geçerli olup olmayacağı belirsizdir. Ayrıca, bu allograftların hayatta kalması, sağlıklı bir kan-retina bariyerine sahip normal bir retinaya bağlı olmayabilir. Burada kullanılan BALB/c alıcıları albinodur ve ışık hasarına karşı hassastır [30]. Ayrıca, sürekli sağkalım, çeşitli retina dejenerasyon modelleriyle yapılan önceki çalışmalarda tekrar tekrar görülmüştür (örneğin, [31]).

Greft hayatta kalma oranıyla karşılaştırıldığında, greft içindeki hücrelerin canlılığı daha karmaşık bir durum ortaya koyuyor. Muhtemelen ani büyüme faktörünün çekilmesi de dahil olmak üzere birçok faktöre bağlı olarak, transplantasyon sonrası hızla meydana gelen CNS progenitör hücrelerinde bilinen bir kayıp vardır. Ayrışmış hücreler göze yerleştikten sonra küre benzeri agregatlar halinde birleşir; bunların merkezleri, belki de damarlanma eksikliği ve besin difüzyonu zorlukları nedeniyle büyüme için optimal olmayan bir mikro ortam sağlıyor gibi görünmektedir. RPC greftleri için makrofajların belirgin tropizmi, greftlerin iç kısmındaki bu cansız hücrelerin varlığına spesifik olmayan bir yanıt olabilir; makrofajlar, hücresel enkaz temizleyicileri olarak görev yapar. Alternatif olarak tamamen yaşayabilir RPC'ler, örneğin kemo-çekici sitokinlerin ekspresyonu yoluyla makrofajları aktif olarak çekebilir, bunun üzerine konakçı hücreler, ikincil olarak canlı olmayan donör hücrelerinden gelen döküntülerle karşılaşır. Daha da önemlisi, bu özel ortamlarda görülen makrofaj infiltrasyonunun derecesi, immün olmayan ayrıcalıklı bölgelerdeki hücresel allogreftlere verilen yanıtların aksine, greft veya konakçı retina için olumsuz sonuçlara sahip görünmüyor [4]. Son olarak, burada rapor edilen sonuçların, fare modeliyle sınırlı olmasına rağmen, insanlarda yapılacak çalışmalara yönelik etkileri olabileceğini belirtmekte fayda var. Farenin aksine, kültürlenmiş insan RPC'lerinin başlangıçta güçlü seviyelerde MHC sınıf I antijenleri ifade ettiğini biliyoruz; bu nedenle karşılaştırmanın geçici olduğu kabul edilir. Bununla birlikte, Çin'deki bir grup tarafından subretinal hRPC greftlerinin klinik testlerinin yanı sıra grubumuz tarafından yapılan intravitreal hRPC transplantasyonunun daha sonra immünsüprese olmayan RP'li hastalarda allograftların sürdürülebilir sağkalımını gösterdiğini not etmek ilginçtir (JC). -01, [32], yayınlanmamış veriler). Burada sunulan çalışmaya benzer şekilde, her iki göze (JC-01 Uzantısı, yayınlanmamış veriler) sıralı enjeksiyonun ardından da durum böyleydi. Ek olarak, JC-02 [33] üzerinde aynı göze ardışık tekrar dozlarının uygulandığı bir takip çalışmasında da greftin hayatta kaldığı görüldü [34]. Birlikte ele alındığında, bu bulgular, nöral progenitör transplantasyonu durumunda, özellikle de göze, immün baskılamanın her zaman gerekli olmadığını göstermektedir; ancak bu olgunun sınırları ve altta yatan düzenleyici mekanizmaların açıklanması gerekmektedir.

4. Malzemeler ve Yöntemler

4.1. Hücre kültürü

Daha önce karakterize edilen gmRPC'ler [31] bu allojenik çalışma için donör hücreler olarak seçilmiştir. Başlangıçta, gmRPC'ler, geliştirilmiş bir yeşil floresan proteini (GFP) eksprese edecek şekilde genetiği değiştirilmiş GFP-transgenik C57BL/6 farelerinden izole edildi. GmRPC'lerde GFP proteininin ekspresyonu, ek etiketlemeye gerek kalmadan enjeksiyonun ardından greftlerin görselleştirilmesine izin vermesi nedeniyle ilgi çekiciydi. Mevcut çalışma için gmRPC'ler, N-2 Takviyesi (1:100, Life Technology, Carlsbad, CA, ABD), Glutamax-1 (1:100, Life Technology) ile desteklenmiş Gelişmiş DMEM/F12'de kültürlendi , Carlsbad, CA, ABD) ve EGF (20 ng/mL, rekombinant, Human, Life Technologies, Carlsbad, CA, ABD) ve 37 ◦C ve %5 CO2'de inkübe edildi. Hücreler, kaplanmamış doku kültürü şişelerinde karışık süspansiyon/gevşek şekilde bağlanmış koloniler halinde tutuldu. Hücreler, bir dakika boyunca PBS içerisinde 1:5 oranında seyreltilmiş ve eklenen trypsin hacminin 10 katı kadar nötralize edilmiş TrypLE Select CTS (Life Technologies, Carlsbad, CA, ABD) ile trypsinizasyon yoluyla pasajlanmıştır. Hücre-tripsin karışımı, oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 140 g'de santrifüjlendi, süpernatan çıkarıldı ve hücre topağı, istenen konsantrasyonda doku kültürü şişelerine ekilmeden önce taze ortamda yeniden süspanse edildi. Hücre konsantrasyonu ve canlılığı, tripan mavisi boyama yoluyla belirlendi; sayımlar Countess (Life Technologies, Carlsbad, CA, ABD) ve hemasitometre ile yapıldı.

İntravitreal enjeksiyonlar için hücre pelleti, BSS PLUS® içerisinde 50K hücre/μL oranında yeniden süspanse edildi. Hücre konsantrasyonu ve canlılığı enjeksiyonlardan önce ve sonra değerlendirildi. Enjekte edilen doz, enjeksiyon başına göz başına 50000 hücreydi. Doz ve araç önceki çalışmalarımıza dayanarak seçildi.

4.2. Deney Hayvanları

Bu çalışmanın amacı, allojenik RPC'lerin tekrarlanan intravitreal enjeksiyonu yoluyla indüklenen potansiyel allojenik bağışıklık tepkilerini araştırmaktı. Alıcı hayvanlar, gmRPC'lerin izole edildiği C57BL/6 farelerinden genetik olarak farklı olan BALB/c fareleriydi. Her bir zaman noktası için tedavi edilen deney grubu başına en az üç hayvanın kullanılmasının, deney süresi boyunca sonuç değişkenleri ve potansiyel hayvan kayıpları açısından gruplar arasındaki istatistiksel anlamlılığın değerlendirilmesine izin vermek için gerekli olduğu kabul edildi. Ayrıca, başarısız hücre enjeksiyon prosedürü veya hayvan kavgası sonucu potansiyel yıpranma gibi deneysel sonucu potansiyel olarak etkileyen birçok ek faktör göz önüne alındığında, istatistiksel analiz için gereken minimum sayıların karşılanmasını sağlamak amacıyla grup başına beş hayvan üzerinde enjeksiyon prosedürleri gerçekleştirildi.

cistanche tubulosa-bağışıklık sistemini iyileştirir

Tablo 1, immünofloresan da dahil olmak üzere histopatoloji değerlendirmelerinin gerçekleştirileceği dört zaman noktasının (4, 7, 14 ve 28 gün) her biri için hazırlanan dört hayvan grubunu göstermektedir. Periton içine 10ˆ6 gmRPC enjekte edilen iki ek hayvan grubu, iki ELISPOT değerlendirme zaman noktasının (14 ve 28 gün) her biri için pozitif kontroller olarak hazırlandı. Tablo 2 her grup için planlanan değerlendirmeleri özetlemektedir.

Tablo 1. Deney grupları.

Tablo 2. Değerlendirme zaman noktaları.

4.3. İntravitreal Enjeksiyon

GmRPC'ler intravitreal enjeksiyon yoluyla uygulandı. Anestezi yapıldıktan sonra, enjekte edilecek hayvanın her iki gözüne Midriasil (%1 Tropikamid oftalmik solüsyon) ve Fenilefrin (%2,5 oftalmik solüsyon) uygulandı. Yeterli midriyazis elde edildiğinde, hayvan manuel olarak zaptedildi ve hayvanın başı, oküler arka segmenti (yani vitreus ve retina) görselleştirmek amacıyla cerrahi mikroskobun optikleri enjekte edilecek gözün oküler eksenini hizalamak için döndürüldü. . Göz, göz kapaklarına basınç uygulanarak manuel olarak nazikçe öne çıkarıldı ve alt nazal kadranda limbusa bitişik sklerayı nazikçe delmek için bir insülin şırıngası üzerindeki 31G iğne kullanıldı. Donör hücrelerini (veya araç kontrolünü) içeren cilalı cam bir mikropipet ucu, doğrudan görüntüleme altında vitreus boşluğuna yapılan kesiden ilerletildi. Lens veya arka segment yapılarının bütünlüğünün bozulmamasına dikkat edildi. Hücreler veya araçlar tek başına 1 mikrolitrelik bir hacimde enjekte edildi. Göz içi basıncının dengelenmesine izin vermek için birkaç dakikalık duraklamanın ardından, pipet ucu doğrudan görüntüleme altında yavaş yavaş gözden çıkarıldı. Yeriyle birlikte herhangi bir göz içi kanama kaydedildi. Enjeksiyonun ardından hayvan, iyileşmesi için emici tarafı yukarı/plastik tarafı aşağı bakacak şekilde yönlendirilmiş yeni tek kullanımlık pedle kaplı temiz bir kafese yerleştirildi. İyileşme, bir ısıtma yastığı kullanılarak kolaylaştırıldı ve hayvanın yürüyebilme yeteneği ile doğrulandı. Uyandıktan sonra hayvan, isteğe bağlı olarak suya erişim sağlanacak şekilde ameliyat sonrası kafese nakledildi. Hayvanlar ameliyat sonrası günlük olarak görsel olarak izlendi. Göz içi enjeksiyona ilişkin minimal veya hiç belirti gözlenmedi.

İşlemden sonra hayvanlarda, ameliyat edilen gözlerin ovulması, tüylerin kabarması veya sürekli uyuşukluk gözlemlendi; bunların hepsi acil ötenazi gerekçesiydi. Kavga sırasında yaralanan iki hayvan telef oldu. Diğer tüm hayvanlar planlanan uç noktalarda sonlandırıldı. Ötenazi CO2 inhalasyonu yoluyla gerçekleştirildi.

4.4. Oftalmik Muayene

A Leica Ultimate Red Reflex Surgical Microscope was used for ophthalmic examination and photography of experimental mice. Sedation was performed with a Ketamine Hydrochloride/Xylazine Hydrochloride mixture (50–100 mg/mL Ketamine, 5–10 mg/mL Xylazine) administered by intraperitoneal injection. After sedation, topical mydriatics (Tropicamide, Phenylephrine) were applied to the eye(s) to be imaged in 5 min intervals until adequate mydriasis was achieved, as determined via pupil diameter (>2,5 mm) ve ışık uyarımına yanıt. Göz kırpma kaybının telafisi olarak, kornea kurumasını önlemek amacıyla her iki göze gerektiği kadar topikal olarak hipromelloz (Gonak) solüsyonu uygulandı. Görüntüleme prosedürü için, anestezi altındaki hayvanlar bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirildi ve sternal yaslanma pozisyonuna yerleştirildi. İşlemin sonunda, intraperitoneal enjeksiyon yoluyla Atipamezole (0.1–1 mg/kg) uygulanarak anestezinin kısmen tersine çevrilmesi sağlandı.

4.5. Histopatoloji

İki ardışık greft (her gözde bir tane) alan hayvanlardaki bağışıklık tepkileri, ikinci göze enjeksiyonu takiben 4. günde, 7. günde, 14. günde ve 28 ± 1. günde her iki gözün histopatolojisi yoluyla değerlendirildi. Tablo 1'e göre tedavi edilen fareler, Tablo 2'de belirtilen programa göre sonlandırıldı. Hayvanlara, karbondioksit inhalasyonu kullanılarak ötenazi uygulandı. Deney hayvanları üzerinde fosfat tamponlu salinde (PBS) %2 paraformaldehit (PFA) ile kardiyak perfüzyonlar gerçekleştirildi. Daha sonra tüm gözbebekleri toplandı ve 4 ◦C'de 48 saat boyunca %2 PFA/PBS içinde bekletildi. Sabit gözbebekleri, gömülmeden önce bir sükroz gradyanı (PBS'de %10 sakaroz, oda sıcaklığında 1 saat, PBS'de %20 sükroz, oda sıcaklığında 1 saat ve PBS'de 4 °C'de gece boyunca %30 sükroz) ile işlendi. Kriyoseksiyon için OCT ortamı. Retinal mikroanatomiyi görselleştirmek ve enjekte edilen donör hücrelerin yerini belirlemek için gözlerin kriyoseksiyonları (10 µm) Harrison hematoksilen ve eozin (H&E) ile boyandı.

gmRPC ile tedavi edilen gruplar için, kriyoseksiyonlar, GFP+ (donör) hücreleri için immünofloresan kullanılarak değerlendirildi. Gözlerde bulunan spesifik bağışıklık hücresi tiplerinin tanımlanması, aşağıdakiler için spesifik birincil antikorlarla etiketleme yoluyla gerçekleştirildi: CD3 (T lenfosit işaretçisi) [35], CD45R (B lenfosit işaretçisi) [36], Iba-1 (aktive edilmiş makrofaj ve mikroglia işaretçisi) [37], Ly-6G (nötrofil işaretçisi) [38] ve CD49b (doğal öldürücü hücre işaretçisi) [39]. Kriyoseksiyonlar PBS içinde üç kez oda sıcaklığında yıkandı ve PBS (NGS; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, ABD) içinde 0.03% Triton X-100 ve %10 normal keçi serumu ile bloke edildi. Oda sıcaklığında 1 saat. Sıçan anti-fare CD3 (1:100 seyreltme, BD Biosciences, San Jose, CA, ABD), sıçan anti-fare CD45R (1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, ABD), tavşan anti-fare Iba{{ 26}} (1:400 seyreltme, Wako Chemicals, Richmond, VA, ABD), sıçan anti-fare Ly-6G (1:100 seyreltme, BD Biosciences, San Jose, CA, ABD) ve sıçan anti-fare -fare CD49b (1:100 seyreltme, BD Biosciences, San Jose, CA, ABD) numunelere uygulandı ve gece boyunca 4 derecede inkübe edildi. Numuneler oda sıcaklığında 3 kez PBS içerisinde tekrar yıkandı. Alexa-Fluor-konjuge ikincil antikorlar (keçi anti-sıçan Alexa-Flour-568 ve keçi anti-tavşan Alexa-Flour-568, Life Technologies, Carlsbad, CA, ABD) numunelere 1 saat boyunca uygulandı oda sıcaklığında. Daha sonra tüm numuneler oda sıcaklığında üç kez daha PBS içerisinde yıkandı. Lameller DAPI Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, ABD) kullanılarak monte edildi ve slaytlar gece boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakıldı.

4.6. ELISPOT ve MLR Testleri

RPC'ye özgü hafıza T hücreleri, ilk greft yerleştirmeden 2 ve 4 hafta sonra bir enzim bağlantılı immünosorbent nokta (ELISPOT) tahlili yoluyla izlendi. Deney grupları, her zaman noktası için Tablo 1 ve 2'de gösterildiği gibi kuruldu. ELISPOT tahlili, spesifik bir antikor kaplı mikroplaka üzerinde salgılanan proteinleri yakalar ve T hücresi IFN salgısını tespit ederek hafıza T hücresi aktivasyonunu belirlemek için kullanılabilir. Deneysel okuma, mikroplaka üzerindeki IFN noktalarının sayısıdır. Mevcut IFN noktalarının sayısı, aktive edilen T hücrelerinin sayısının göstergesidir. Alloreaktif T hücrelerinin sıklığı, 96-kuyulu Multiscreen-IP plakaları (Millipore, Burlington, MA, ABD) üzerinde 48 saatlik bir karışık lökosit reaksiyonu (MLR) gerçekleştirilerek değerlendirildi. Yanıt veren hücreler, deney hayvanlarının servikal lenf düğümlerinden (CLN'ler) ve dalaklarından saflaştırılmış T hücrelerini içeren lenfositler/splenositlerdi ve uyarıcı hücreler, orijinal olarak C57BL/6 farelerinden türetilen gmRPC'lerdi. ELISPOT tahlilleri standart protokole göre gerçekleştirildi. 96-kuyu Multiscreen-IP plakaları, steril koşullar altında kuyucuk başına 15 µL %35 etanol ile önceden ıslatıldı. Plakalar, PBS (2 ug/mL) içinde seyreltilmiş 100 uL IFN yakalama antikorunun (klon AN-18, eBioscience, San Diego, CA, ABD) plakalara uygulanmasından önce üç kez steril PBS ile yıkandı. Plakalar, MLR tahlillerinin plakalar üzerinde gerçekleştirilmesinden önce gece boyunca 4 derecede inkübe edildi. Yakalama antikoru kaplı plakalar üç kez PBS ile yıkandı ve ardından RPMI1640 ile 37 ◦C'de 2 saat süreyle bloke edildi.

Tahlil plakalarının her biri aşağıdaki kontrolleri içeriyordu: hücre içermeyen kuyucuklar, stimülasyonsuz hücreleri içeren kuyucuklar ve forbol {{0}}miristat 13-asetat (PMA) tedavisine tabi hücreleri içeren kuyucuklar ve pozitif kontroller olarak Ca iyonoforu. PMA tedavisi, T hücresi reseptör yolunu aktive etmek ve Ca iyonoforunun kalsiyum iyonlarının hücrelere girişini kolaylaştırmasıyla T hücresi aktivasyonuna neden olmak için ikinci haberci DAG'ı taklit ederek pozitif bir kontrol görevi görür. Plakalar, renk reaksiyonundan önce 37 ◦C'de 36 saat süreyle inkübe edildi. Plakalar, {{10}}.0%1 Tween 20 içeren PBS ile altı kez yıkandı ve ardından 100 µL saptama antikoru (klon R64A2, eBioscience, San Diego, CA, ABD), seyreltildi Her kuyucuğa PBS (0.5 µg/mL) uygulandı. Plakalar 37 ◦C'de 2 saat daha inkübe edildi. Plakalar tekrar PBS içindeki %0.01 Tween 20 ile yıkandı. Kuyu başına 100 uL Streptavidin-AP (1:1000 seyreltme, Invitrogen) uygulandı ve plakalar, oda sıcaklığında 45 dakika süreyle inkübe edildi. Tüm plakalar üç kez tekrar PBS içindeki %0.01 Tween 20 ve tek başına PBS ile üç kez daha yıkandı. Son olarak renklendirme için her kuyucuğa 100 µL BCIP/NBT (Sigma Aldrich, Münih, Almanya) eklendi. Tüm plakalar, veri analizinden önce musluk suyuyla kapsamlı bir şekilde yıkandı ve kurutuldu.

cistanche tubulosa-bağışıklık sistemini iyileştirir

5. Sonuçlar

Bu çalışma, allojenik RPC'lerin vitreus boşluğuna sıralı binoküler greftlerinin farede klasik immün reddi tetiklemediğini göstermektedir. Bu allojenik histolojik çalışmaların insan RPC klinik ürünüyle gerçekleştirilemeyeceği kabul edilse de veriler, retinitli hastaların incelendiği bir klinik güvenlik çalışmasının (jCyte, JC-01E, yayınlanmamış veriler) sonuçlarıyla tutarlı görünmektedir. Pigmentosa'ya immünosüpresif tedaviler olmaksızın eş zamanlı olmayan iki taraflı enjeksiyonlar uygulandı. İki çalışmayı doğrudan karşılaştırmak zor olsa da her ikisinin de genel sonuçlarının allograft sağkalımı açısından benzerlik göstermesi dikkat çekicidir.

Referanslar

1. Hori, J.; Ng, TF; Şatos, M.; Klassen, H.; Streilein, JW; Young, MJ Nöral progenitör hücreler immünojeniteden yoksundur ve allograftlar olarak yıkıma karşı direnç gösterirler. Kök Hücreler 2003, 21, 405–416. [CrossRef] [PubMed]

2. Klassen, H.; Schwartz, PH; Ziaeian, B.; Nethercott, H.; Genç, MJ; Bragadottir, R.; Tullis, GE; Warfvinge, K.; Narfstrom, K. Gelişmekte olan kedi beyninden izole edilen sinir öncüleri, distrofik kedinin retinasına transplantasyonun ardından retinal entegrasyon göstermektedir. Veteriner. Oftalmol. 2007, 10, 245–253. [CrossRef] [PubMed]

3. Salado-Manzano, C.; Perpina, U.; Straccia, M.; Molina-Ruiz, FJ; Cozzi, E.; Rosser, AE; Canals, JM Nörodejeneratif Hastalıklarda İmmünolojik Yanıt Hücre Tedavisinde Bir Darboğaz mı? Ön. Hücre Nörobilimi. 2020, 14, 250. [CrossRef]

4. Petrus-Reurer, S.; Romano, M.; Howlett, S.; Jones, JL; Lombardi, G.; Saeb-Parsy, K. Rejeneratif hücresel tedaviler için immünolojik hususlar ve zorluklar. İletişim Biyol. 2021, 4, 798. [CrossRef]

5. Bucher, K.; Rodriguez-Bocanegra, E.; Dauletbekov, D.; Fischer, MD İlişkili olmayan viral vektörler kullanılarak retinal gen terapisine verilen bağışıklık tepkileri - Tedavi başarısı ve güvenliği için çıkarımlar. Prog. Retin. Göz Arş. 2021, 83, 100915. [CrossRef]

6. Singh, MS; Park, SS; Albini, TA; Canto-Soler, MV; Klassen, H.; MacLaren, RE; Takahashi, M.; Nagiel, A.; Schwartz, SD; Bharti, K. Retinal kök hücre nakli: Güvenliği ve potansiyeli dengelemek. Prog. Retin. Göz Arş. 2020, 75, 100779. [CrossRef]

7. Kamao, H.; Mandai, M.; Okamoto, S.; Sakai, N.; Suga, A.; Sugita, S.; Kiryu, J.; Takahashi, M. Klinik uygulamayı amaçlayan insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı retina pigment epitel hücre tabakalarının karakterizasyonu. Kök Hücre Rep. 2014, 2, 205–218. [ÇaprazRef]

8. Sugita, S.; Kamao, H.; Iwasaki, Y.; Okamoto, S.; Hashiguchi, T.; Iseki, K.; Hayashi, N.; Mandai, M.; Takahashi, M. İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetilen retina pigment epitel hücreleri tarafından T hücresi aktivasyonunun inhibisyonu. Araştır. Oftalmol. Vis. Bilim. 2015, 56, 1051–1062. [ÇaprazRef]

9. McGill, TJ; Stoddard, J.; Renner, LM; Messaoudi, I.; Bharti, K.; Mitalipov, S.; Lauer, A.; Wilson, DJ; Neuringer, M. İnsan Olmayan Primatlarda Subretinal Boşluğa Transplantasyonun Ardından Allogeneik iPSC'den Türetilmiş RPE Hücre Grefti Arızası. Araştır. Oftalmol. Vis. Bilim. 2018, 59, 1374–1383. [ÇaprazRef]

10. Sugita, S.; Mandai, M.; Kamao, H.; Takahashi, M. RPE hücre naklinin immünolojik yönleri. Prog. Retin. Göz Arş. 2021, 84, 100950. [CrossRef]

11. Nair, DSR; Thomas, BB Retinanın Dejeneratif Hastalıkları için Kök Hücre Bazlı Tedavi Stratejileri. Curr. Kök Hücre Arş. Orada. 2022, 17, 214–225. [CrossRef] [PubMed]

12. Martinez Velazquez, Los Angeles; Ballios, BG Kalıtsal Retina Hastalığına Yönelik Yeni Nesil Moleküler ve Hücresel Terapötikler. Uluslararası J. Mol. Bilim. 2021, 22, 11542. [CrossRef]

13. Liu, Y.; Chen, SJ; Li, SY; Qu, LH; Meng, XH; Wang, Y.; Xu, HW; Liang, ZQ; Yin, ZQ Retinitis pigmentosa hastalarında insan retina progenitör hücre naklinin uzun vadeli güvenliği. Kök Hücre Arş. Orada. 2017, 8, 209. [CrossRef] [PubMed]

14. Wang, Y.; Tang, Z.; Gu, P. Retina dejenerasyonu için kök/progenitör hücre bazlı transplantasyon: Klinik çalışmaların gözden geçirilmesi. Hücre Ölümü Dis. 2020, 11, 793. [CrossRef] [PubMed]

15. Almanca, OL; Vallese-Maurizi, H.; Soto, TB; Rotstein, NP; Politi, LE Retina kök hücreleri, umutlar ve engeller. Dünya J. Kök Hücreler 2021, 13, 1446–1479. [ÇaprazRef]

16. Karamalı, F.; Behtaj, S.; Babaei-Abraki, S.; Hadady, H.; Atefi, A.; Savoj, S.; Soroushzadeh, S.; Najafian, S.; Nasr Esfahani, MH; Klassen, H. Fotoreseptör dejenerasyonu için potansiyel terapötik stratejiler: Görmeyi geri kazanmanın yolu. J. Tercüme. Med. 2022, 20, 572. [CrossRef]

17. Semo, M.; Haamedi, N.; Stevanato, L.; Carter, D.; Brooke, G.; Genç, M.; Coffey, P.; Sinden, J.; Patel, S.; Vugler, A. İnsan Retina Progenitör Hücrelerinin Etkinliği ve Güvenliği. Çeviri Vis. Bilim. Teknoloji. 2016, 5, 6. [CrossRef]

18. Mochizuki, M.; Sugita, S.; Kamoi, K. Gözün immünolojik homeostazisi. Prog. Retin. Göz Arş. 2013, 33, 10–27. [ÇaprazRef]

19. Yamasaki, S.; Sugita, S.; Horiuchi, M.; Masuda, T.; Fujii, S.; Makabe, K.; Kawasaki, A.; Hayashi, T.; Kuwahara, A.; Kishino, A.; ve ark. İnsan ESC ve iPSC'den Türetilmiş Retinaların Düşük İmmünojenite ve İmmünsüpresif Özellikleri. Kök Hücre Temsilcisi 2021, 16, 851–867. [ÇaprazRef]

20. Klassen, H.; Schwartz, MR; Bailey, AH; Multipotent insan ve fare nöral progenitör hücreleri tarafından ifade edilen Young, MJ Yüzey belirteçleri arasında tetraspaninler ve protein olmayan epitoplar bulunur. Nörobilim. Lett. 2001, 312, 180–182. [ÇaprazRef]

21. Klassen, H.; Ziaeian, B.; Kirov, II; Genç, MJ; Schwartz, PH Ölüm sonrası insan dokusundan retina progenitör hücrelerinin izolasyonu ve otolog beyin progenitörleriyle karşılaştırılması. J. Neurosci. Res. 2004, 77, 334–343. [ÇaprazRef]

22. Ingulli, E. Transplantasyonda hücresel red mekanizması. Pediatr. Nefrol. 2010, 25, 61–74. [ÇaprazRef]

23. Issa, F.; Schiopu, A.; Wood, KJ Greft reddi ve transplantasyon toleransında T hücrelerinin rolü. Uzman Rev. Klin. İmmünol. 2010, 6, 155–169. [CrossRef] [PubMed]

24. Nasr, M.; Sigdel, T.; Sarwal, M. Transplant reddi teşhisinde ilerlemeler. Uzman Rev. Mol. Tanı. 2016, 16, 1121–1132. [CrossRef] [PubMed]

25. Klassen, H.; Imfeld, KL; Ray, J.; Genç, MJ; Ölçer, FH; Berman, MA Yetişkin hipokampal progenitör hücrelerin immünolojik özellikleri. Vis. Res. 2003, 43, 947–956. [CrossRef] [PubMed]

26. Weinger, JG; Weist, BM; Plaisted, WC; Klaus, SM; Walsh, CM; Lane, TE MHC uyumsuzluğu, viral kaynaklı bir demiyelinizasyon modelinde omurilik naklini takiben nöral progenitör hücre reddine neden olur. Kök Hücreler 2012, 30, 2584–2595. [CrossRef] [PubMed]

27. ReNeuron, L. İnsanda İlk Faz I/IIa, Açık Etiketli, Retinitis Pigmentosalı (RP) Hastalarda Subretinal Olarak Nakledilen İnsan Retina Progenitör Hücrelerinin (hRPC) Güvenliği ve Tolerabilitesine İlişkin Prospektif Çalışma. Klinik Araştırma# NCT02464436. Çevrimiçi olarak mevcuttur: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02464436 (27 Şubat 2023'te erişildi).

28.Lu, B.; Lin, Y.; Tsai, Y.; Girman, S.; Adamus, G.; Jones, MK; Shelley, B.; Svendsen, CN; Wang, S. Dejenere Retinaya Daha Sonra Yapılan İnsan Nöral Progenitör Nakli, Başlangıçtaki Greftin Hayatta Kalmasını veya Terapötik Etkinliğini Riske Atmaz. Çeviri Vis. Bilim. Teknoloji. 2015, 4, 7. [CrossRef] [PubMed]

29.Jones, MK; Lu, B.; Girman, S.; Wang, S. Retinal dejeneratif hastalıklarda değiştirme ve koruma için hücre bazlı terapötik stratejiler. Prog. Retin. Göz Arş. 2017, 58, 1–27. [CrossRef] [PubMed]

30. Bell, BA; Kaul, C.; Bonilha, VL; Rayborn, ME; Shadrach, K.; Hollyfield, JG BALB/c fare: Standart vivaryum aydınlatmasının yaşlanma sırasında retina patolojisi üzerindeki etkisi. Tecrübe. Göz Arş. 2015, 135, 192–205. [ÇaprazRef]

31. Klassen, HJ; Ng, TF; Kurimoto, Y.; Kirov, I.; Şatos, M.; Coffey, P.; Genç, MJ Multipotent retinal progenitörler gelişimsel belirteçleri eksprese eder, retinal nöronlara farklılaşır ve ışık aracılı davranışı korur. Araştır. Oftalmol. Vis. Bilim. 2004, 45, 4167–4173. [ÇaprazRef]

32. jCyte, Inc. Retinitis Pigmentosa'da İnsan Retinal Progenitör Hücrelerinin (jCell) Tek, İntravitreal Enjeksiyonunun Güvenliği. Klinik Araştırma# NCT02320812. Çevrimiçi olarak mevcuttur: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02320812 (24 Şubat 2023'te erişildi).

33. jCyte, Inc. Retinitis Pigmentosalı Yetişkinlerde İnsan Retinal Progenitör Hücrelerinin İntravitreal Enjeksiyonunun Güvenliği ve Etkinliği. Klinik Araştırma# NCT03073733. Çevrimiçi olarak mevcuttur: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03073733 (24 Şubat 2023'te erişildi).

34. jCyte, Inc. Retinitis Pigmentosalı Yetişkin Deneklerde İnsan Retinal Progenitör Hücrelerinin (hücre) Tekrarlanan İntravitreal Enjeksiyonunun Güvenliği. Klinik Araştırma# NCT04604899. Çevrimiçi olarak mevcuttur: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04604899 (24 Şubat 2023'te erişildi).

35. Oudejans, JJ; van der Valk, P. T hücresi ve NK hücresi neoplazmlarının immünohistokimyasal sınıflandırması. J. Clin. Pathol. 2002, 55, 892. [CrossRef] [PubMed]

36. Tostanoski, LH; Chiu, YC; Gamon, JM; Simon, T.; Andorko, JI; Bromberg, JS; Jewell, CM Yerel Lenf Düğümü Mikro Ortamının Yeniden Programlanması Sistemik ve Antijene Özel Toleransı Artırıyor. Hücre Temsilcisi 2016, 16, 2940–2952. [CrossRef] [PubMed]

37. Jurga, AM; Paleczna, M.; Kuter, KZ Diferansiyel Mikroglia Fenotiplerinin Genel ve Ayırıcı Belirteçlerine Genel Bakış. Ön. Hücre Nörobilimi. 2020, 14, 198. [CrossRef] [PubMed]

38. Li, JC; Zou, XM; Yang, SF; Jin, JQ; Zhu, L.; Li, CJ; Yang, H.; Zhang, AG; Zhao, TQ; Chen, CY Nötrofil hücre dışı tuzakları, mide kanserli hastalarda kanserle ilişkili trombozun gelişimine katkıda bulunur. Dünya J. Gastroenterol. 2022, 28, 3132–3149. [ÇaprazRef]

39. Kee, BL Doğal Öldürücü Hücrelerin Geliştirilmesi ve ILC1. Ansiklopedi İmmünobiol. 2016, 1, 140–148.