Bitki Adjuvanı Olarak Cistanche Deserticola'dan Suyla Ekstrakte Edilebilir Polisakkaritlerin İn Vitro İmmünostimülatör Aktivitesi

Daha fazla bilgi için:ali.ma@wecistanche.com

Ailian Zhang, Xiumei Yang, Quanxiao Li, Yu Yang, Gan Zhao, Bin Wang, Daocheng Wu

1 Sincan Biyolojik Kaynaklar ve Genetik Mühendisliği Ana Laboratuvarı, Yaşam Bilimleri ve Teknolojisi Koleji, Xinjiang Üniversitesi, Urumçi, Xinjiang, Çin,

2 Anahtar Tıbbi Moleküler Viroloji Laboratuvarı, Temel Tıp Bilimleri Okulu, Şanghay Tıp Koleji, Fudan Üniversitesi, Şanghay, Çin,

3 College of LifeScience and Technology, Xi'an Jiaotong Üniversitesi, Xian, Shanxi, Çin

Soyut

Modern aşılarda güvenli ve etkili bir aşı adjuvanı önemlidir. Çeşitli Çincebitkisel polisakkaritlerbağışıklık sistemini aktive edebilir.cistanche çöl çiçeği(CD) geleneksel bir Çin bitkisidir ve yardımcı bir adaydır. İşte doğruladıksu ile özütlenebilen polisakkaritlerCD'nin (WPCD), bağışıklık tepkilerini in vitro ve in vivo modüle edebilir. Doza bağlı bir şekilde, WPCD, MHC'nin ekspresyon seviyelerini yukarı doğru düzenleyerek murin iliğinden türetilen dendritik hücrelerin (BM-DC'ler) olgunlaşmasını ve işlevini önemli ölçüde destekledi. -II, CD86, CD80 ve CD40, allojenik T hücre proliferasyonu ve IL-12ve TNF-'nin toll benzeri reseptör4 (TLR4) yoluyla verimleri, in vitro deneylerle gösterilmiştir. Ek olarak, farelerde immünomodülatör aktivitesi de gözlendi. WPCD, IgG, IgG1 ve IgG2a titrelerini etkili bir şekilde iyileştirdi ve T ve B hücrelerinin proliferasyonunu, CD4 artı T hücrelerinde IFN- ve IL-4 üretimini ve CD8'de IFN- ekspresyon seviyesini önemli ölçüde arttırdı. artı T hücreleri Alum'dan daha iyi. Ayrıca, WPCD, dalaktaki DC'ler üzerindeki CD40 ve CD80'in ekspresyon seviyelerini belirgin şekilde yukarı regüle edebilir ve Treg frekansını aşağı regüle edebilir. Çalışma, Cistanche Deserticola'nın polisakkaritlerinin, TLR4 sinyal yolu yoluyla DC'leri aktive ederek hem hümoral bağışıklığı hem de hücresel bağışıklığı ortaya çıkarmak için güvenli ve etkili bir aşı adjuvanı olduğunu ileri sürmektedir.

Cistanche kök ürünleri için tıklayın

giriiş

Aşılar, hastalıkları kontrol etmek veya önlemek için önemlidir. Yeni üretilen ve mevcut gelişmekte olan aşılar yüksek oranda saflaştırılmış rekombinanttır.antijenlerdaha güvenlidir, ancak saflaştırılmış antijenler tatmin edici birbağışıklık tepkisizayıflatılmış veya inaktive edilmiş patojen preparatları ile karşılaştırıldığında. Adjuvanların yardımıyla aşılar kalıcı indükleyebilir.bağışıklık tepkileri[1,2]. Yeni güçlü adjuvanlar, hem aşı geliştirme hem de insan sağlığı ile geniş ölçüde ilgilenmektedir. Bugüne kadar, çeşitli adjuvanlar tanımlanmış ve kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Bu adjuvanlar, gerekli antijen miktarını azaltmak, normal bağışıklık tepkileri için gereken bağışıklama sayısını en aza indirmek ve daha hızlı, daha geniş ve daha güçlü indükleme dahil olmak üzere aşılara çeşitli avantajlar sağlar.bağışıklık tepkileri[3–5]. Lipopolisakkarit (LPS) ve Freund'un tam adjuvanı (FCA) gibi birçok güçlü adjuvan geliştirilmiş olmasına rağmen, toksisiteleri nedeniyle yaygın olarak uygulanmazlar. Bu nedenle, Alum gibi sadece birkaç adjuvan klinik kullanım için ruhsatlandırılmıştır [6]. Genel olarak, bulaşıcı ve bulaşıcı olmayan hastalıklara karşı daha iyi profilaktik ve terapötik aşıları teşvik etmek için daha etkili ve daha güvenli adjuvanlar geliştirilmelidir.

Güvenlik, adjuvanların geliştirilmesinde dikkate alınması gereken önemli bir faktördür. Çin otsu bileşenleri, güçlü immünostimülanlar olarak hareket edebilen fenolik bileşikler ve polisakaritler gibi besinleri ve önemli aktif bileşikleri içerir [7-9]. Bunlar arasında, geleneksel Çin bitkilerinden elde edilen polisakkaritler, immün sistemi uyarıcı aktiviteleri ve düşük toksisiteleri nedeniyle geniş çapta araştırılmıştır. Örneğin inülin, FCA gibi diğer adjuvanların toksisitesi olmayan bir immün adjuvandır. AdvaxTM delta inülin adjuvanı ayrıca aşıların immünojenisitesini başarılı bir şekilde arttırmıştır [10,11]. Çince'de Huangqi ve Latince'de Radix Astragali olarak da bilinen Astragalus, dünya çapında yaygın olarak dağıtılmaktadır. Polisakkarit, immünomodülatör aktiviteden sorumlu ana aktif bileşenlerinden biridir. Deneysel çalışmalar, Astragalus polisakaritinin hem in vitro hem de in vivo olarak güçlü immünomodülatör etkilere sahip olduğunu göstermiştir [12, 13]. Aşı adjuvanı olarak lycium barbarum polisakkaritleri de iyi gelişmeler ve uyarıcı etkiler gösterdi [14, 15]. Bu çalışmalar, Çin bitkisel polisakkaritlerinin adjuvan geliştirme için ideal adaylar olduğunu ileri sürdü.

Cistanche Deserticola YC Ma(CD, Çince'de "Rou Cong Rong") değerli bir geleneksel Çin bitkisidir ve üstün tonik etkileri nedeniyle yaygın olarak "Çöllerin Ginseng'i" olarak kabul edilir. Sincan'da kurak veya yarı kurak bölgelerde dağıtılır. Çin'de kurutulmuş etli sapı yüzlerce yıldır tonik bir gıda olarak kullanılmaktadır [16, 17]. Uzun yıllar boyunca, haşlanmış CD, aşırı zorlanmanın neden olduğu bozukluğu tedavi etmek için tonik bir gıda olarak kullanılmıştır, bu da oral uygulama için güvenli olduğunu düşündürmektedir. Bu bitki, geniş tıbbi işlevleri nedeniyle yaygın olarak ilgilenmektedir. Son zamanlardaki fitokimyasal ve farmakolojik çalışmalar, polisakkaritlerin biyolojik olarak aktif ana bileşenler olduğunu ve immünomodülatör aktivite, antioksidan etki ve anti-inflamatuar etkiler dahil olmak üzere çeşitli biyolojik etkilere sahip olduğunu göstermiştir [18-21]. Bununla birlikte, Xinjiang'daki C. Deserticola'dan su ile özütlenebilen polisakkaritlerin bağışıklık geliştirme aktivitesi nadiren rapor edilmiştir.

DC'lerin, immün yanıtları başlatmak ve doğuştan gelen ve adaptif hücreleri modüle etmek için gerekli sinyalleri sağlayan önemli antijen sunan hücreler (APC'ler) olduğu iyi bilinmektedir. DC'ler tarafından antijen alımını iyileştiren bazı adjuvanlar, yardımcı uyarıcı veya MHC moleküllerini artırabilir ve bağışıklığı artırabilir. DC'lerin olgunlaşması başladığında, daha fazla ortak uyarıcı molekül ve sitokin üretilir ve DC'ler farklı fenotipler gösterir [22, 23].

Bu çalışmada, ilk olarak WPCD'nin in vivo olarak TLR4 sinyal yolu aracılığıyla DC'lerin aktivasyonunu teşvik edip edemeyeceğinden yararlandık. DC'ler doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık tepkileri arasındaki bağlantı olduğundan, WPCD tarafından uyarılan DC'lerin aktivasyonunun adaptif bağışıklığın sonucunu etkileyeceğini varsaydık. IgG, IgG1 ve IgG2a alt sınıfı titreleri, T- ve B- proliferasyonu ve sitokin üretimi dahil olmak üzere WPCD ile tedavi edilen farelerde ovalbümine (OVA) spesifik bağışıklık tepkisini inceledik. WPCD tedavisinin bu farelerin dalağındaki DC'lerin ve Treg hücrelerinin aktivitesini artırıp artırmayacağını araştırdık. Bulgularımız, C. Deserticola'dan elde edilen doğal polisakkaritlerin potansiyel immünomodülatör aktivitesini kanıtladı ve uygulama kapsamını genişletti.

Malzemeler ve yöntemler

Hayvanlar

Sekiz ila on haftalık C57BL/6, BALB/c veya ICR dişi fareleri, Xinjiang Tıp Üniversitesi'nin Birinci Hastanesinden (Urumqi, Xinjiang, Çin) satın alındı. Fareler, Sincan Hayvan Sağlığı ve Refahı için Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesinin (ACUC) yönergelerine göre patojen içermeyen koşullar altında barındırıldı. Hayvan deney prosedürleri, Sincan Üniversitesi AUCC tarafından onaylandı.

Sulu ekstraktların ekstraksiyonu

C. Deserticola, Çin'in Xinjiang Eyaletinde bulunan bir bitkidir. Ham polisakarit, su ekstraksiyonu ve etanol çökeltmesi yoluyla elde edildi. Kısaca, 100 g kurutulmuş C. Deserticola toz haline getirildi ve ardından süzüldü. Toz, oda sıcaklığında tekrar tekrar petrol eteri ile geri akıtıldı ve daha sonra renkli bileşenleri ve lipidleri uzaklaştırmak için susuz etanol ile 1 saat geri akıtıldı. Kalıntılar kaynar su ile üç kez ekstrakte edildi ve ekstraktlar bir araya toplandı, 4000 rpm'de 10 dakika santrifüjlendi ve 4 saat boyunca 60°C'de geri akıtıldı. Ham polisakkaritleri çökeltmek için çözeltiye dört kat hacimde yüzde 95 etanol ilave edildi. Ham polisakaritler, damıtılmış suda yeniden çözündürüldü ve proteinleri çıkarmak için Savage reaktifi ile işlendi. Ekstraktlar PBS içinde çözüldü ve 0.22-um filtre ile sterilize edildi. Son olarak, WPCD'nin toplam şeker içeriği, fenol-sülfürik asit analizi ile belirtildiği gibi yüzde 59.58 idi [24].

DC'lerin üretimi

BM-DC'ler, daha önce açıklanan yönteme göre hafif modifikasyonlarla [25] üretildi. C57BL/6 farelerinden alınan kemik iliği DC'leri, yüzde 10 fetal buzağı serumu (Hyclone) ile takviye edilmiş RPMI-1640 tam ortam (Gibco) ile yıkandı. Toplanan hücreler, 50 uM -merkaptoetanol (Sigma, St Louis, MO) ve 20 ng/mL murin GM-CSF (Peprotech, Rocky Hill, NY) ile RPMI-1640 ortamında yeniden süspanse edildi ve 37°C'de inkübe edildi. C yüzde 5 CO2 atmosferinde. Kültür ortamının yarısı, 1-2 günde bir GM-CSF içeren taze bir ortam ile değiştirildi. 6. Günde hücreler toplandı, farklı dozlarda WPCD, LPS (100 ng/mL) (Sigma, St Louis, MO) ile 24 saat işleme tabi tutuldu ve ardından akış sitometrisi ile değerlendirildi.

DC'lerin olgunlaşmasının ve in vitro T hücre aktivasyonunun tespiti

WPCD'nin BM-DC'ler üzerindeki in vitro olgunlaşma etkisi, FAC'ler tarafından fenotipik analiz sonuçlarına göre değerlendirildi. 7. Günde, C57BL/6'dan gelen BM-DC'ler GM-CSF varlığında indüklendi ve ardından farklı WPCD konsantrasyonları (0.01, 0) ile işlendi.{{11 }}2, 0.05, 0.1 ve 0.2 mg/mL) 12 saat boyunca üç kopya halinde. Pozitif kontrol olarak LPS (100 ng/mL) kullanıldı. BM-DC'ler PBS içinde yıkandıktan ve spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için Fc Block (BD Biosciences, CA) kullanıldıktan sonra hücreler, uygun FITC-, PE- veya APC-konjuge CD40, CD11c, CD{ kullanılarak PBS'de boyandı. {24}}, CD80 ve MHC-II antikorları (BD) 20 dakika 37˚C'de. Boyalı hücreler FAC Calibur (BD) tarafından tespit edildi. Veri analizi FlowJo yazılımı (Tree Star) ile yapılmıştır.

In vitro DCS olgunlaşma deneyinde, üreticinin talimatlarına göre sitokin tahlil kitleri (Boster, Wuhan, Çin) kullanılarak IL-12 ve TNF-'yi analiz etmek için hücre kültürü süpernatanları da toplandı. 450 nm'de absorbans, bir ELISA plaka okuyucusu (Bio-Rad, ABD) ile ölçüldü. Örneklerdeki sitokin miktarları, regresyon doğrusal yöntemine göre rekombinant sitokinlerin standart eğrileri ile hesaplandı.

Allojenik uyarıcı aktivitelerini test etmek için, MTT (Sigma, St Louis, MO) tahlili ile önceki metoda [26] göre karışık lenfosit reaksiyonu (MLR) deneyi yapıldı. Kısaca, uyarıcı hücreler olarak kullanılan C57BL/6 farelerinden alınan BM-DC'ler, 7. Günde RPMI-1640 ortamı artı GM-CSF içinde geri kazanıldı ve 12 saat boyunca 37°C'de çeşitli WPCD konsantrasyonları ile işlendi. Hücreler, 24-kuyu plakasına kaplamadan önce RPMI-1640 ortamında yıkandı ve yeniden süspanse edildi. Yanıt veren hücreler olarak tekli pllenosit süspansiyonu, BALB/c farelerinden izole edildi. BM-DC'ler splenositlerle 1:5 ve 1:10 oranlarına göre karıştırıldı. Hücreler, üç kopya halinde üç gün boyunca yüzde 5 CO2 atmosferinde 37°C'de kültürlendi. Pozitif kontrol olarak LPS tedavisi kullanıldı. Kültürler daha sonra son 4-saatlik ekim için 20 μL MTT ile eklenmiştir. T hücre proliferasyon analizi için ölçüm dalga boyundaki (490 nm) ve referans dalga boyundaki (650 nm) absorbanslar ölçüldü. Tüm numuneler bir arka plan kontrolüne karşı ölçüldü.

TLR4 inhibitörü ile in vitro tedavi

BM-DC'ler 1 saat süreyle 5 μM TAK-242 (TLR4, Medchemexpress Inc.USA inhibitörü) ile ön işleme tabi tutuldu ve ardından 12 saat boyunca çeşitli WPCD konsantrasyonları (100 ve 200 ug/mL) ile birlikte kültürlendi Golgi Stop'un varlığında veya yokluğunda üç kopya halinde. Pozitif kontrolde LPS eklendi. Hücreler ve süpernatanlar, sırasıyla CD86ve CD40 yüzey belirteçlerini analiz etmek için FAC'ler ve sitokinler TNF-a ve IL-12'yi analiz etmek için ELISA ile tespit edildi.

bağışıklama protokolü

Akut toksisite testi. Bu çalışmadaki oral akut toksisite testinde 40 sağlıklı yetişkin ICR faresi kullanıldı. ICR fareleri, dozlamadan önce aç bırakıldı (gece boyunca yiyecek ama su değil). WPCD, 7 gün boyunca her bir hayvana sırasıyla 0, 50, 500 veya 5000 mg/kg vücut ağırlığı dozlarında oral olarak uygulandı. Salinle tedavi edilen ve alum ile tedavi edilen fareler kontrol grubuna dahil edildi. Hayvanlar, birbirini izleyen 14 gün içinde günlük olarak gözlendi. Farelerin ayrı ayrı mortalite ve klinik belirtileri kaydettiği gözlemlendi. Ayrıca deney boyunca vücut ağırlıkları ile yiyecek ve su tüketimleri ölçülmüştür. 14. Günde, dalak veya timus indeksi (dalak veya timus ağırlığı/vücut ağırlığı) x 10 olarak hesaplandı.

WPCD immünomodülatör aktivitesinin in vivo tespiti. WPCD'nin immünomodülatör aktiviteye sahip olup olmadığını araştırmak için model antijen olarak ovalbümin (OVA) (Sigma) kullanıldı ve dişi ICR fareleri rastgele 7 gruba ayrıldı (negatif kontrol grubu (0%0,9 NaCl ve WPCD 400 ug) ve pozitif kontrol (OVA ile Şap 200 ug)). Farelere, 2-hafta arayla 20, 100 veya 400 ug doza göre tek başına 10 ug OVA veya OVA ile WPCD ile deri altından iki kez uygulandı. IgG titrelerini, IgG alt sınıflarını, splenosit proliferasyonunu ve sitokini, DC yüzey belirteçlerini ve Treg frekansını saptamak için booster aşılamadan sonra kan örnekleri ve dalak alındı.

OVA'ya özgü antikorların tespiti

OVA'ya özgü IgG titreleri ve alt sınıfları, önceki yönteme göre ELISA ile incelendi [27]. ELISA plakaları (Nunc, Thermo Fisher Scientific) gece boyunca kaplandı ve ardından bloke edildi. Serum numuneleri, IgG titre analizi veya IgG1 ve IgG2a (Southern Biotech, Inc.) tespiti için seri olarak seyreltildi. Plakalar daha sonra HRP-konjuge anti-fare IgG, IgG1 ve IgG2a içeren PBST ile 37°C'de 1 saat süreyle inkübe edildi. Kolorimetrik reaksiyon, tetrametilbenzidin (TMB) ile geliştirildi ve daha sonra 450 nm/655 nm'de absorbanslar ölçüldü ve optik yoğunluk (OD) birimleri olarak ifade edildi.

Splenosit proliferasyonu ve sitokin tespiti

Splenosit proliferasyonu, MTT tahlili ile belirlendi. İlk aşılamadan sonraki 21. Günde, tek bir splenosit süspansiyonu elde edildi. Hücreler, üç kopya halinde 1x106 hücre/kuyu konsantrasyonuna göre96-yuvalı plakalarda RPMI-1640 ortamında kültürlendi. Kültürler OVA (nihai konsantrasyon 10 ug/mL), ConA (son konsantrasyon 5 ug/mL) (Sigma, St Louis, MO) ve LPS (son konsantrasyon 100 ng/mL) ile 48 saat 37°C'de uyarıldı. . Hücreler 48 saat boyunca kültürlendi ve her bir oyuğa 20 μL (5 mg/mL) MTT (Sigma, St Louis, MO) ilave edildi ve 4 saat daha inkübe edildi. Renk gelişimini (Sigma) durdurmak için her bir oyuğa 50 uL DMSO eklendikten sonra, plakalar bir mikrotitre plaka okuyucusu (Bio-Rad, CA, ABD) tarafından 570 nm'de okundu. Splenosit proliferasyonu, uyarılmış bir kuyunun stimüle edilmemiş bir kuyucuğa OD570 nm oranı olan stimülasyon indeksi (SI) olarak ifade edildi.

T hücrelerinde IL-4 ve IFN- verimleri, küçük değişikliklerle [27, 28] yayınlanmış bir protokole göre hücre içi sitokin boyama ile ölçüldü. İlk aşılamadan sonraki 21. Günde tek splenosit süspansiyonu hazırlandı. Kırmızı kan hücresi lizizinden sonra, splenosit (2x106 hücre/mL), 4-h stimülasyon için OVA (10 ug/mL) ile inkübe edildi ve 12 saat inkübasyon için Golgi stop (BD) eklendi, PMA pozitif kontrol. Hücreler toplandı, PBS ile yıkandı, CD4-FITC/CD8-FITC ile boyandı ve üreticinin talimatlarına göre Cyto fix/Cytoperm kiti (BD) ile sabitlendi ve geçirgenleştirildi. Hücre içi sitokin boyaması, uygun konsantrasyonda IL-4-PE veya IFN- -APC antikorları ile 4˚C'de 20 dakika boyunca gerçekleştirildi. Lekeli hücreler FAC'ler tarafından tespit edildi. Veri analizi FlowJo'da yapıldı.

Dalakta DC olgunlaşmasının ve Treg hücrelerinin değerlendirilmesi

Farelerde splenositlerden DC olgunlaşmasının analizi için, CD11c-PE, CD40-FITC ve CD80-APC antikorları ile hücre yüzeyi boyaması yapıldı. İlk aşılamadan sonraki 3. günde, tek splenosit süspansiyonu (1x106 hücre/mL) elde edildi ve hücreler çift boyamaya tabi tutuldu. Floresan yoğunlukları FAC Calibur ile ölçüldü ve ölçülen veriler FlowJo ile analiz edildi.

WPCD'nin CD4 artı CD25 artı Foxp3 artı Treg hücrelerinin frekansını aşağı regüle edip edemediğini gözlemlemek için. İkinci aşılamadan sonra 7. Günde tek splenosit süspansiyonu hazırlandı. Splenosit (2x106 hücre/mL), CD4-APC antikoru ile hücre yüzeyi boyamasına, ardından uygun CD25-FITC ve Foxp3-PE antikorları ile nükleer sitokin boyamasına tabi tutuldu. üreticinin talimatlarına göre fare düzenleyici T-hücre boyama kiti (eBios ciences). CD4 artı CD25 artı Foxp3 artı Treg hücrelerinin frekansı FAC'ler üzerinde test edildi. Veri analizi FlowJo'da yapıldı.

istatistiksel analiz

Çoklu deney grupları arasındaki farklılıkları analiz etmek için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) testleri (Tukey'nin Çoklu Karşılaştırma Testi) yapıldı. Tüm değerler ortalama ±SD olarak ifade edilir. P< 0.05="" is="" believed="" to="" be="" statistically="" significant.="" the="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" prism="" 5.0="">

Sonuçlar

WPCD, BM-DC'lerin in vitro olgunlaşmasını ve işlevini destekledi

Adaptif bağışıklık, yardımcı uyarıcı moleküllerin ve sitokinlerin türleri de dahil olmak üzere DC'lerin aktivasyonu ile belirlenir [29, 30]. Başlangıçta, WPCD'nin ortak uyarıcı moleküllerin ekspresyonunu destekleyip desteklemediğini araştırdık. WPCD'nin farklı dozlarına göre, C57BL/6'dan BM-DC'ler uygulandı. Hücrelerdeki CD11c, CD86, CD80, CD40 ve MHC-II'nin ekspresyon seviyeleri analiz edildi (Şekil 1). SSC ve FSC ile kapılı hücreler, farklı WPCD dozları ile tedavinin BM-DC'lerin morfolojisini değiştirmediğini gösterdi (veriler gösterilmemiştir). CD86, CD80 ve CD40'ın ekspresyon seviyeleri, tedavi edilmeyen gruba kıyasla doza bağımlı bir şekilde önemli ölçüde yukarı regüle edildi ve 20 ug/mL WPCD dozu altında platoya ulaştı, ancak fark LPS grubuyla karşılaştırıldığında anlamlı değil (Şekil 1A–1C). MHC-II'nin ekspresyon seviyesi, 50 ug/mL dozu altında maksimum değerine önemli ölçüde artırıldı (Şekil 1D). Hücresel yüzey belirteçlerinin analiz sonuçları, LPS veya WPCD ile tedavi edilen DC'lerin, CD86, CD80, CD40 ve MHC-II ekspresyon seviyelerini önemli ölçüde arttırdığını ve fenotipik olgunlaşmayı desteklediğini gösterdi.

Bazı adjuvanlar, DC'ler üzerindeki yardımcı uyarıcı molekülleri artırabilir veya doğrudan sitokinlerin salgılanmasını indükleyebilir. IL-12 ve TNF-, Th1 bağışıklık tepkisini aktive eden başlıca sitokinlerdir. WPCD tedavisi üzerine BM-DC'lerde sitokin verimlerini analiz ettik. BM–DC'ler 12 saat boyunca farklı WPCD içerikleri ile işlendikten sonra, bir ELISA kiti ile IL-12 ve TNF- içeriklerini saptamak için süpernatan toplandı. WPCD, IL-12 (Şekil 2A) ve TNF- (Şekil 2B) üretimini doza bağlı olarak artırabilir. Sonuçlar, WPCD'nin DC'lerin işlevsel olgunlaşmasını indükleyebileceğini gösterdi.

Bir bağışıklık yanıtında, DC'leri işlevsel olarak etkinleştirmek gerekir. Daha sonra, daha yüksek seviyede allojenik T hücresi proliferasyonu, tamamen olgun DC'ler tarafından indüklendi. Bu nedenle, DC'lerin WPCD'ye fonksiyonel yanıtı MLR ile araştırıldı. LPS'ye benzer şekilde WPCD ile indüklenen DC'lerin allostimülatör kapasitesi, belirtilen oranda doza bağlı bir şekilde çarpıcı biçimde arttırıldı (Şekil 2C ve 2D). Sonuçlar, WPCD'nin antijen sunumunu iyileştirdiğini ve in vitro MLR tarafından optimize edilmiş T hücresi tepkisini gösterdi.

WPCD, DC'lerin TLR4 yolu yoluyla olgunlaşmasını destekledi

WPCD tarafından aktive edilen BM-DC'lerin, LPS'ye (bir TLR4 ligandı) benzer DC yüzey molekülü ifadeleri gösterdiği yukarıdaki sonuçlardan çıkarılabilir. Bu nedenle, BM-DC'lerin TLR4 yolu aracılığıyla WPCD tarafından aktive edildiğini varsaydık. BM-DC'ler TAK-242 (TLR4 inhibitörü) ile ön işleme tabi tutulduktan ve 12 saat boyunca WPCD ve LPS ile birlikte kültürlendikten sonra, CD40, CD86, TNF-a veya IL{{12 ifadesi }} FAC'ler veya ELISA tarafından tespit edildi. Şekil 3A ve 3B'de gösterildiği gibi, TAK-242 tedavisi, LPS veya WPCD tarafından indüklenen CD40 ve CD86'nin önemli ölçüde aşağı regüle edilmiş ifadeleriyle ve IL-12 veya sitokin üretimiyle sonuçlandı. TNF-a da önemli ölçüde azaldı (Şekil 3C ve 3D). Sonuçlar, WPCD'nin TLR4 yolu yoluyla DC olgunlaşmasını aktive edebileceğini gösterdi.

WPCD geliştirilmiş hümoral ve hücresel bağışıklık

Karşılaştırma amacıyla, WPCD'nin OVA ile immünize edilmiş farelerde hümoral immün yanıtın ortaya çıkarılması üzerindeki etkilerini değerlendirdik. Aşılamadan önce ve ilk aşılamadan sonraki 14, 21, 35 ve 49. günlerde, ELISA ile IgG titresi ve IgG alt sınıfları serumunu saptamak için kan alındı. OVA'ya IgG antikor yanıtı, doza bağlı bir şekilde WPCD uygulamasının (100 ve 400 ug) dozundaki artışla arttı (Şekil 4). Optimal konsantrasyon 100 ug/mL WPCD idi ve 21, 35 ve 49. Günlerde tek başına OVA'ya kıyasla IgG tepkilerini iki kat arttırdı (Şekil 4A). 20 ve 100 ug WPCD uygulamasının altında OVA'ya özgü IgG1 ve IgG2a antikor seviyelerinde önemli artışlar, 35. Günde serumdaki OVA grubuyla karşılaştırıldığında elde edildi (Şekil 4B). Bu arada Alum, aşılanmış farelerde yalnızca OVA'ya özgü IgG ve IgG1 antikorlarının ekspresyon seviyelerini destekledi. Tek başına WPCD, OVA'ya özgü antikorları tetiklemedi. Yukarıdaki sonuçlar açıkça WPCD'nin Alum'dan daha yüksek antikor titreleri ve daha dengeli Th1/Th2 tepkileri ürettiğini gösterdi.

Splenosit proliferasyonu, hücresel bağışıklığın başka bir göstergesidir. ConA, T hücrelerini uyarır ve LPS, B hücresi proliferasyonunu uyarır. İlk aşılamadan sonraki 21. Günde, tek splenosit süspansiyonu elde edildi ve sırasıyla OVA (10 ug/mL), OVA323-339 (10 ug/mL) peptit, ConA (5 ug/mL) ve LPS (5 ug/mL) ile uyarıldı. ug/mL) 48 saat süreyle. Daha sonra MTT yöntemi ile T hücrelerinin proliferasyonu ölçüldü. WPCD, OVA ve WPCD ile bağışıklaştırılan farelerde OVA-antijen, Con A-mitojen ve LPS mitojen ile uyarılan splenosit proliferasyonunu önemli ölçüde destekleyebilir (Şekil 5) ve optimal WPCD konsantrasyonu 100 ug/mL idi. Bu veriler, OVA ile immünize edilmiş farelerde bir aşı adjuvanı olarak WPCD'nin, T-hücrelerinin ve B hücrelerinin aktivasyonunu Alum'dan daha etkili bir şekilde indükleyebileceğini gösterdi.

OVA aşıları ile formüle edilen tüm test edilmiş WCPD adjuvanları, eşit derecede güçlü hümoral ve hücresel bağışıklık üretti (Şekil 4 ve 5). Bu verilere dayanarak, OVA'ya özgü T yardımcı (Th) hücre yanıtı üzerindeki WPCD etkilerini daha fazla değerlendirmek için, Akış sitometrisi ile CD8 plus ve CD4 plus T hücrelerinde sitokin ekspresyonlarını daha da analiz ettik (Şekil 6). İlk aşılamadan sonraki 21. Günde, farelerin tek bir splenositi izole edildi ve daha sonra OVA (10 ug/ mL) ile birlikte kültürlendi. 100 ug OVA/WPCD uygulanan grupta CD4 artı T hücrelerindeki IL-4 verimi, OVA/Şap grubu ve OVA grubundan önemli ölçüde yüksekti ve PMA'dakine benzerdi (Şekil 6A). Ayrıca, CD8 plus ve CD4 plus T hücrelerindeki IFN-verimi, OVA/WPCD (20, 100 ve 400 ug) uygulanan farelerde de önemli ölçüde arttı (Şekil 6B ve 6C). Şap adjuvanı ile karşılaştırıldığında, WPCD, T hücrelerinden IL-4 ve IFN salgılarını indüklemede daha iyi bir kapasite gösterdi.

WPCD, DC'lerin olgunlaşmasını uyardı ve in vivo olarak Treg frekansını azaltır

DCS, birincil bağışıklık tepkilerini başlatmada yer alan en güçlü APC'ler olarak kabul edilmektedir. Bu nedenle, ilk aşılamadan sonraki 3. Günde, WPCD'nin CD40 ve CD80 üzerindeki etkilerini farelerde dalaktaki DC'ler üzerinde de araştırdık (Şekil 7A ve 7B). 100-ug OVA/WPCD grubundaki fareler, DC'ler üzerinde OVA/Şap grubundakilerden önemli ölçüde daha yüksek seviyelerde CD40 ve CD80 üretti. Bu veriler, WPCD'nin DC'leri aktive edebileceğini ve farelerde DC'lerin olgunlaşmasını indükleyebileceğini gösterdi. Treg hücreleri, tolerans ve bağışıklık tepkilerini dengeleyebilir. WPCD'nin bağışıklık tepkisini nasıl modüle ettiğini daha fazla araştırmak için farelerde dalaktaki Treg hücreleri, bir fare düzenleyici T hücresi boyama kiti ile boyandı. İlk aşılamadan sonraki 21. Günde, toplam CD4 artı T hücrelerinde CD25 artı Foxp3 artı Treg hücrelerinin sıklığında azalma gözlemlendi (Şekil 7C). OVA ve OVA/Şap grupları ile karşılaştırıldığında, WPCD grubu önemli ölçüde azaltılmış bir Treg frekansı gösterdi.

Farelerde WPCD'nin güvenlik değerlendirmesi

Oral akut toksisiteyi tahmin etmek için akut toksisite testi gerçekleştirdik. 5000 mg/kg vücut ağırlığı ile oral yoldan uygulanan fareler, hiçbir anormal davranış veya yan etki göstermedi ve toksisite değerlendirme testinde hiçbir ölüm oranı bulunmadı. Farklı WPCD dozları uygulanan farelerin çeşitli grupları arasında vücut ağırlığı artışı, Timus indeksi ve Dalak indeksinde anlamlı bir fark kaydedilmedi ve anlamlı bir fark yoktu (Tablo 1). 14 gün sonra mortalite gözlenmedi. Bu nedenle, WPCD'nin LD50 değeri, vücut ağırlığının kg'ı başına 5000 mg'dan fazlaydı.

WPCD'nin farelerin büyümesi üzerinde olumsuz etkileri olup olmadığını test etmek için deri altı aşılamadan önce ve sonra vücut ağırlığı her fare için sırasıyla belirlendi (Tablo 2). Farelerin daha sonraki gözlemlerinde yan etkiler veya anormal davranışlar gözlenmedi. Ayrıca, WPCD verilen farelerin vücut ağırlığı ve salin solüsyonu veya OVA/Şap ile tatbik edilen farelerin vücut ağırlığı önemli bir fark göstermedi. Bu gözlem sonuçları, WPCD uygulamasının güvenli olduğunu gösterdi.

Tartışma

Adjuvanlar, aşılardaki anahtar bileşenlerdir [31]. Genomik ve proteomikteki ilerlemeler nedeniyle, giderek daha fazla rekombinant ve sentetik aşı molekülü tanımlanmaktadır. Bu nedenle, daha fazla adjuvan ve formülasyon gereklidir. Bazı güçlü adjuvanlar genellikle artan toksisite ile ilişkilidir, örneğin FCA. Bu nedenle, sonunda istenen bağışıklık tepkisini sağlayan farklı sinerjik bileşenler içeren güvenli bir formülasyon bulmak gereklidir. Çin bitkilerinden elde edilen polisakkaritler toksik değildir ve önemli bir yan etki göstermez [32,28]. Belirli bir aşı için güvenli bir adjuvan gereklidir.

Cistanche Deserticola önemli bir tonik bitkidir ve Çin'in kuzeybatısındaki kurak topraklarda ve sıcak çöllerde yaygın olarak bulunur. Cistanche Deserticola, immünomodülatör, antioksidatif, antibakteriyel ve antitümör etkileri dahil olmak üzere biyoaktiviteleri nedeniyle geniş çapta endişe duymaktadır [20,21]. Adjuvanların geliştirilmesi için iyi bir aday olan Cistanche Deserticola'nın yapısal karakterizasyonu ve immünolojik aktivitesinde bazı ilerlemeler kaydedilmiştir. WPCD'nin adjuvan etkilerini ve mekanizmasını in vitro ve in vivo olarak deneysel olarak değerlendirdik. WPCD'nin deri altı uygulaması, serum antikorlarını ve lenfosit proliferasyonunu artırarak, sitokinlerin ekspresyonunu artırarak, DC olgunlaşmasını yukarı doğru düzenleyerek ve CD4 artı CD25 artı Foxp3 artı Treg hücrelerinin sıklığını aşağı doğru düzenleyerek hümoral ve hücresel bağışıklık tepkilerini önemli ölçüde destekledi.

DCS, saf T hücrelerini hazırlamak için anahtar APC'lerdir. DC'lerin aktivasyonu adjuvanlar için önemlidir. DCS, özellikle fare iliğinden türetilen DC'ler, adjuvanları ve aşıları değerlendirmek için sıklıkla kullanılır. Akış sitometrisi, bir antijeni çevreleyen hücrelerden yakaladıktan sonra aktive olan hücreleri ayırt edebilir. FCM analizinde, uyarılmış hücrelerin kümelenme derecesi, immünomodülatörlerin güvenliğini değerlendirmenin dolaylı bir göstergesidir [3]. Bu nedenle, in vitro DC'lerde WPCD adjuvan aktivite verileri, hayvan modelleri için değerli bilgiler sağlayabilir. BM-DC modeline dayalı olarak, MHC-II, CD86, CD80 ve CD40'ın ekspresyon seviyeleri, sitokin üretimi ve allojenik T hücre proliferasyonu, optimum WPCD konsantrasyon aralığında tespit edildi. MHC-II, CD86, CD80 ve CD40'ın ekspresyon seviyeleri BM-DC'lerde yukarı regüle edildi ve TNF-a ve IL-12 verimleri doza bağlı bir şekilde arttı. Allojenik T hücre proliferasyonu gözlendi. BM-DC'lerin morfolojisi değişmedi. WPCD adjuvanı, BM-DC aktivasyonunu ve inflamatuar sitokinlerin in vitro salgılanmasını indükleyerek, antijen miktarını ve APC miktarını önemli ölçüde artırabilir ve T hücrelerini, immünomodülatör aktivitenin artmasına katkıda bulunan IFN- salgılaması için uyarabilir.

Çeşitli Çin otsu polisakkaritleri, bağışıklık sistemini aktive etme yeteneğine sahiptir ve DC'lerin TLR4 yolu ile olgunlaşmasını uyararak mükemmel adjuvan yeteneklerine sahiptir [33,28]. Bu nedenle, TLR4'ün WPCD kaynaklı DC'lerin olgunlaşmasının sinyal yoluna katıldığını varsayıyoruz. Beklendiği gibi, TLR4 inhibitör tedavileri, TNF-a ve IL-12'de önemli bir düşüşle sonuçlandı. Ayrıca, TLR4 yolunun inhibisyonu, DC'ler üzerinde CD 40 ve CD80 ekspresyonunu da engelledi ve bu, DC'lerin olgunlaşmasının TLR4'e bağlı olduğunu gösterdi. Bu nedenle, TLR4'ün WPCD kaynaklı DC'lerin olgunlaşmasına katıldığı açıktır.

Adjuvanların ve aşı formülasyonunun optimum dozu birçok deneyde ampirik olarak belirlenir. Farelerde WPCD adjuvanı ve OVA antijenlerinin doz-yanıt ilişkisini araştırmak için, ICR farelerine iki kez deri altından uygulamak için in vitro BM-DC'lerden daha önce bildirilen verilere dayanarak farklı WPCD dozları seçtik. WPCD'nin OVA'ya özgü antikorların verimini önemli ölçüde arttırdığını ve IgG1 ve IgG2a seviyelerinin artmasıyla dengeli bir Th1/Th2immün tepkisini indüklediğini bulduk. Özellikle IgG2a seviyesi, optimum dozda Alum ile tedavi edilenden daha yüksekti. Bu nedenle, WPCD, daha düşük enjeksiyonlarla daha yüksek spesifik antikor seviyeleri ve daha yüksek etkinlik ile sonuçlandı.

Yeni aşılar, antikorları, T yardımcı (Th) hücrelerini ve sitotoksik T lenfositlerini (CTL'ler) içeren güçlü hücresel tepkilerin indüklenmesini gerektirir. Terapötik aşı, daha güçlü T-hücre yanıtlarını indüklemeyi amaçlar. İdeal adjuvan, aşının gücünü arttırır ve toksik etkilere neden olmadan hücre aracılı bağışıklığı destekler [34]. Bağışıklanmış fare modellerindeki gözlemler arasında, WPCD, Alum ile karşılaştırıldığında OVA'ya özgü ve spesifik olmayan splenosit proliferasyonunda bir artışa yol açtı. Bazı adjuvanlar sitokinleri ve bağışıklık sistemini yukarı regüle eder. Örneğin saponinler, normalde sadece antikorları indükleyen bir antijene karşı hücre aracılı bağışıklık tepkilerini uyarabilir. Farelerde bağışıklık düzeylerini dolaylı olarak değerlendirmek için göstergeler olarak IL-4 ve IFN-'yi seçtik. WPCD, Alum'dan daha fazla IL-4 ve IFN- salgısını indükleyebilir. Böylece, WPCD aşılamasının bir sonucu olarak güçlü yardımcı T-hücre yanıtları ve sitokin salgıları gözlemlendi, bu da WPCD'nin lenfositleri Th1-tipi sitokini ve Th2-tipi sitokini salgılamak için daha verimli bir şekilde uyarabileceğini düşündürdü. Şap.

Antijen sunumunu etkileyen adjuvanlar, karmaşık immün süreçleri etkileyebilir. Treg hücreleri Th1 ve Th2 yanıtlarını modüle edebilir [35]. Uygun bir WPCD dozu, CD80 ve CD40'ın ekspresyon seviyelerini artırarak ve erken immün yanıtta OVA antijen sunumu kapasitesini güçlendirerek farelerde DC'lerin olgunlaşmasını destekleyebilir. DCS aktivasyonunun ve Treg frekansının deneysel sonuçları, WPCD'nin DC'lerin olgunlaşmasını indüklediğini ve farelerde dalakta Treg frekansını azalttığını gösterdi. Bu sonuçlar, WPCD'nin, antijen sunan hücreleri hedefleyerek ve T hücresine özgü aktivasyonu teşvik ederek OVA aşılarının etkinliğini arttırdığını kanıtladı.

Adjuvanların geliştirilmesinde, ilgili enfeksiyona karşı uygun immün yanıtı seçici olarak indüklemek zordur. Uygun adjuvan, insanlar veya hayvanlar için düşük yan etkilere ve toksisiteye sahip olmalıdır. Bu nedenle, ani ve uzun vadeli yan etkiler de dahil olmak üzere WPCD güvenliği dikkate alınmalıdır. Bu çalışmada, 110 gün boyunca WPCD'nin akut toksisitesini ve WPCD'nin farelerin büyüme performansı üzerindeki olumsuz etkisini araştırdık. WPCD'nin akut toksisitesinin sonuçları, vücut ağırlığı, timus indeksi veya Dalak indeksinin önemli bir fark göstermediğini gösterdi. WPCD'nin LD50 değeri, vücut ağırlığının kg'ı başına 5000 mg'dan fazlaydı. Farelerin deneysel sonraki gözlemi boyunca, farelerde hiçbir yan etki veya anormal davranış bulunmadı. Bu sonuçlar WPCD'nin güvenli olduğunu gösterdi.

Sonuç olarak, bu çalışmada, Xinjiang'dan C. Deserticola'dan ekstrakte edilen ham bir polisakkarit olan WPCD, adjuvanların bazı özelliklerini sergiledi. Örneğin WPCD, DC'leri aktive ederek, antikor yanıtlarını artırarak, sitokin üretimini geliştirerek hem Th1 hem de Th2 yanıtlarını güçlendirdi. Ayrıca, DC'lerin olgunlaşmasını ve işlevini in vitro TLR4 yolu yoluyla analiz ederek WPCD etkinliğinin mekanizmasını araştırdık. Yalnızca WPCD ile tedavi edilen farelerde belirgin bir yan etki gözlenmedi. Bu nedenle, WPCD, hücresel ve hümoral bağışıklık tepkilerinde daha yüksek bağışıklık uyarıcı aktiviteye sahipti. Adjuvanlar, birkaç bileşiğin bir karışımıdır. Birkaç ham özütün bir karışımı, tek bir bitki özünden daha fazla faydalı etkiye sahip olabilir. WPCD özlerini sistematik olarak araştırmak, etkinliklerini ve güvenliğini test etmek ve etkilerinin mekanizmalarını aydınlatmak gereklidir.

Destek Bilgisi

S1 Dosyası. GELİŞ Kontrol Listesi. (DOCX)

Teşekkür

Deneylerde iyi fikirler sağladıkları için Bing Wang ve Daocheng Wu'ya özel teşekkürler.

Yazar Katkıları

Kavramsallaştırma: Ailian Zhang, Bin Wang, Daocheng Wu.

Veri küratörlüğü: Xiumei Yang, Yu Yang. Resmi analiz: Ailian Zhang, Quanxiao Li.

Finansman alımı: Ailian Zhang.Proje yönetimi: Ailian Zhang.

Kaynaklar: Ailian Zhang, Gan Zhao.Yazı – orijinal taslak: Ailian Zhang.

Yazma – inceleme ve düzenleme: Ailian Zhang, Daocheng Wu.