Gestasyonel Düşük Protein Alımının Embriyonik Böbrek MikroRNA Ekspresyonu Üzerindeki ve Erkek Fetüsün Nefron Progenitör Hücrelerindeki Etkisi
Mar 08, 2022
giriiş
Besin eksikliği, fetal gelişimin çeşitli evrelerinde önemli yollarda sinyal değişiklikleriyle sonuçlanabilir ve bu da yetişkinlikte geri dönüşü olmayan organ ve sistem bozukluklarına neden olabilir [1]. Fetal programlama, gelişim sırasında bir organizmanın yapısı veya işlevi üzerinde uzun vadeli etkilere neden olan herhangi bir hakareti ifade eder [2]. Fetal programlamadaki bozulmalar, düşük doğum ağırlığı, daha az nefron ve artmış kardiyovasküler risk ile sonuçlanır.böbrekyetişkinlikteki bozukluklar [3-6]. Diğer yazarlar ve bizim tarafımızdan yapılan çalışmalar daha düşük doğum ağırlığı, yüzde 28 daha az nefron, azalmışböbrektuz atılımı, kronikböbrek yetmezliğive erişkinlikte standart (NP) protein alımı yavrularına kıyasla gestasyonel düşük protein (LP) alımında arteriyel hipertansiyon [3-7]. Nefrogenez, gen ekspresyonunun, protein sentezinin ve doku yeniden şekillenmesinin sıkı kontrolünü içerir. Çalışmalar, nefron sayılarının üreter tomurcuğu (UB) ve metanefros mezenkim (MM) progenitör hücreleri arasındaki etkileşimler tarafından belirlendiğini göstermiştir [8-10]. MM'den gelen sinyaller, UB tarafından uyarılan büyümeyi ve tübül sisteminin dallanmasını indükler. Sırasıyla, bir mezenkimal başlık (CM) oluşturan MM proliferasyonu ve farklılaşmasına UB uçları aracılık eder [11].
CISTANCH BÖBREK/BÖBREK HASTALIĞINI İYİLEŞTİRECEK
Prenatal stresin fetal gelişim üzerindeki uzun vadeli etkileri ile ilgili epigenetik değişikliklerin rolüne ciddi ilgi vardır [12]. MikroRNA'lar (miRNA'lar), yaklaşık 22 nükleotid uzunluğunda, kodlanmayan küçük RNA'lardır ve hedef gen ekspresyonunun transkripsiyon sonrası düzenlenmesinde önemli bir rol oynarlar [13-16]. miRNA'lar, sitoplazmada mRNA translasyonunu veya stabilitesini düzenleyerek transkripsiyon sonrası gen ekspresyonunu kontrol eder [17, 18]. Fonksiyonel çalışmalar, miRNA'ların gelişim sırasında ve hücre fizyolojisinde kritik biyolojik süreçlerde yer aldığını göstermektedir [13, 16]. Çeşitli patolojilerde ekspresyonlarında değişiklikler gözlenmiştir [16, 19]. Böylece, miRNA'ların karakterizasyonu, gen regülasyonu ve hücresel proliferasyon, farklılaşma ve apoptozun anlaşılmasına ve aşağıdakiler dahil olmak üzere patofizyoloji bozukluklarının açıklanmasına yardımcı olmuştur.böbrekbozukluklar [20–22]. Araştırmalar, sırasındaböbrekontogeny miRNA'lar nefron gelişimi için vazgeçilmezdir [23-26]. Ayrıca, MM progenitör hücrelerde bazı miR NA'ların yetersiz ekspresyonu, hücre proliferasyonunu azaltarak erken farklılaşmaya neden olur ve sonuç olarak nefron sayısını azaltır [27, 28]. Bu fenomen, progenitör hücrelerde artmış apoptoz ve yüksek Bim ekspresyonu ile karakterize edilir [27]. Böylece miRNA'lar, bu metanefrik birincil hücrelerin apoptoz ve proliferasyonu arasındaki dengeyi modüle eder [29].
Bilinmeyen epigenetik değişikliklerin ve miRNA ekspresyon profilinin aşağıdakilerle ilişkili olduğunu varsaydık.böbrekMaternal protein kısıtlı yavrularda gelişim bozuklukları. Bu nedenle, fetüste miRNA paternlerini ve öngörülen gen ekspresyonunu değerlendirmeyi amaçladık.böbrek17 günlük gestasyonel (17-DG) protein kısıtlı erkek yavruda moleküler yolakları ve ilgili bozuklukları tanımlamak içinböbreksırasında hücre çoğalması ve farklılaşmasıböbrekgelişim.
Anahtar Kelimeler:böbrek yetmezliği; böbrek tübüler; böbrek bozuklukları; böbrek gelişimi; böbrek
Malzeme ve metodoloji
Hayvanlar ve diyetlerDeneyler, daha önce ayrıntılı olarak açıklandığı gibi [5, 6], CEMIB/ UNICAMP tarafından sağlanan bir üreme stoğundan elde edilen kardeş çiftli Wistar HanUnib sıçanlarının (250–300 g) aynı yaştaki dişi ve erkek sıçanları üzerinde gerçekleştirilmiştir. , Campinas, SP, Brezilya. Çevre ve barınma, deneysel prosedür sırasında sağlıklarını ve refahlarını yönetmek için doğru koşulları sundu. Üç haftalıkken sütten kesmeden hemen sonra, hayvanlar kontrollü sıcaklık (25˚C) ve aydınlatma koşulları (07:00–19:00h) altında, musluk suyuna ve standart laboratuvar kemirgen yemeğine (Purina Nuvital) ücretsiz erişim ile tutuldu. , Curitiba, PR, Brezilya: Na artı içeriği: 135 ± 3μEq/g; K artı içeriği: 293 ± 5μEq/g), üremeden 12 hafta önce. São Paulo Eyalet Üniversitesi'ndeki (#446-CEUA/UNESP) Hayvan Kullanımına İlişkin Kurumsal Etik Kurulu, deney protokolünü onayladı ve araştırma boyunca Brezilya Hayvan Deneyleri Koleji tarafından belirlenen genel yönergeler izlendi. Vajinal yaymanın sperm gösterdiği gün olarak gebeliğin 1. günü belirlendi. Daha sonra, standart protein içeriği [NP, n=36] (yüzde 17 protein) veya düşük protein içeriği [LP, n=51 ile izokalorik bir kemirgen laboratuvar yemi üzerinde tüm hamilelik boyunca barajlar ad libitum olarak tutuldu. ] (yüzde 6 protein). NP ve LP anne gıda tüketimi günlük olarak belirlendi (daha sonra vücut ağırlığı için normalleştirildi) ve annelerin vücut ağırlığı her iki grupta haftalık olarak kaydedildi. 17 günlük gebelikte (17-DG), annelere ketamin (75mg/kg) ve ksilazin (10mg/kg) ile anestezi uygulandı ve uterus açığa çıkarıldı. Fetüsler çıkarıldı ve hemen dekapitasyon ile ötenazi yapıldı. Fetüsler tartıldı ve cinsiyet ayrımı için kuyruk ve uzuvlar toplandı. Metanefrozlar, Yeni Nesil Dizileme (NGS), RT-qPCR ve immünohistokimya analizleri için toplandı.
CISTANCH BÖBREK/BÖBREK YETMEZLİĞİNİ İYİLEŞTİRECEK
cinsiyet belirlemeBu çalışma yalnızca erkek 17-DG yavrularında gerçekleştirilmiştir ve cinsiyet ayrımı, Sry geleneksel PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) dizi analizi ile belirlenmiştir. DNA, proteinaz K ve Fenol-Kloroform ile enzimatik lizis yoluyla özümlendi. Reaksiyon için, üreticinin döngü koşulları ile Master Mix Colorless—Promega kullanıldı. Integrated DNA Technologies (IDT), aşağıdaki sekansları izleyerek primeri sentezledi: İleri: 5'-TACAGCCTGAGGACATATTA-3'Ters: 5'-GCACTTTAACCCTTCGATTAG-3'.
Toplam RNA ekstraksiyonuRNA, NP (n=4) ve LP (n=4) bütününden özümlendiböbreklerüretici tarafından belirtilen talimatlara göre Trizol reaktifi (Invitrogen) kullanarak. Toplam RNA miktarı, bir nanoVue spektrofotometresi (GE Healthcare, ABD) kullanılarak 260 nm'de absorbans ile belirlendi. RNA Bütünlüğü, Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Almanya) [30] ile bir RNA Bütünlük Numarası—RIN > 8 elde edilerek sağlandı.
miRNA-Seq ve veri analiziSıralama, MiSeq platformunda (Illumina) gerçekleştirildi. Protokol, üreticinin şu adreste bulunan talimatlarını takip etti:Kısaca, dizileme, kitaplık yapımını içerir ve bu, 1 ug toplam RNA kullanıldı. Bu adımda, adaptörler 3 've 5' bağlanır. Adaptörlerin ligasyonundan sonra, cDNA'yı oluşturmak için bir ters transkripsiyon reaksiyonu gerçekleştirildi. Daha sonra, numune tanımlaması için bir dizi indeksi içeren primerleri kullanan standart bir PCR reaksiyonu ile amplifiye edildi - bu cDNA kütüphanesi, miRNA izolasyonu için agaroz jel elektroforezine tabi tutuldu. Nicelemeden sonra, kitaplık konsantrasyonu 10 nM Tris-HCl, pH 8.5 kullanılarak 2 nM'ye normalleştirildi ve transkriptom dizilimi MiSeq Reagent Kit v2 (50 döngü) ile yapıldı.
Veri analizi, Tao Chen, Ph.D. ile işbirliği içinde yapıldı. Genetik ve Moleküler Toksikoloji Bölümünden, Ulusal Toksikolojik Araştırma Merkezi, Jefferson, AR, ABD. miRNA'ların Yeni Nesil Dizilemesinden (NGS) gelen veriler FASTA formatında üretildi ve BaseSpace.com'a (Illumina, ABD) aktarıldı. Veri kalitesi, üretici (Illumina) tarafından geliştirilen temel çağrı CASAVA yazılımı kullanılarak değerlendirildi. Analizler, BaseSpace miRNA Analizi (Torino Üniversitesi, Kanada'dan) ve sıçan genomu için Small RNA (Illumina, ABD) ile farklı miRNA'ların sekans haritalaması ile yapıldı. Diferansiyel olarak ifade edilen miRNA çalışması, Ingenuity Pathway Analysis yazılımı (Ingenuity, ABD) kullanılarak analiz edildi.
miRNA ifade doğrulamasıHer grupta miRNA için farklı yavrulardan dört erkek yavru kullanıldı (miR{{0}}p, -144-3p, -298-5p, let-7a{{ 4}}p, -181a-5p, -181c-3p ve -199a-5p) ifade analizi. Kısaca, 450 ng RNA, üreticinin yönergelerine göre TaqMan1 Mikro RNA Ters Transkripsiyon Kiti kullanılarak ön amplifikasyon olmadan ters kopyalandı. Tamamlayıcı DNA (cDNA), üreticinin talimatlarına göre StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied BiosystemsTM) üzerinde TaqMan1 Universal PCR Master Mix, No AmpErase1 UNG (2x) ile TaqMan MicroRNA Assays (Life Technologies, ABD) kullanılarak amplifiye edildi. Veri analizi, karşılaştırmalı niceleme yöntemi (Pfaffl, 2001) kullanılarak değerlendirilen nispi gen ekspresyonu kullanılarak yapıldı. Stabilite analizine dayalı olarak, referans gen olarak U6 snRNA ve U87 scaRNA kullanıldı. Tüm göreceli nicelemeler, ΔΔCT yöntemi kullanılarak DataAssist yazılımı v 3.0 kullanılarak değerlendirildi. miRNA verileri, MIQE yönergeleri [31] izlenerek oluşturulmuştur.
CISTANCH BÖBREK/BÖBREK FONKSİYONUNU İYİLEŞTİRECEK
Tahmin edilen hedef genlerin RT-qPCR'sicDNA sentezi için Yüksek Kapasiteli cDNA ters transkripsiyon kiti (Life Technologies, ABD) kullanıldı. Bax, Bim, Kaspaz-3, Kollajen 1, GDNF, PCNA, TGF -1, Bcl-2, Bcl-6, c-Myc, c için RT-qPCR reaksiyonları -ret, cyclin A, Map2k2, PRDM1, Six-2, Ki-67, MTOR, -catenin, ZEB1, ZEB2, NOTCH1 ve IGF1 geni, SYBR Green Master Mix (Life Technologies, ABD) tarafından yapıldı. ) IDT1 Integrated DNA Technologies tarafından sağlanır (Tablo 1). Reaksiyonlar, 2 μL cDNA (1:30 seyreltilmiş), 10μL SYBER Green Master Mix (Life Technologies, ABD) ve her spesifik primerden 4 μL (5 nM) kullanılarak toplam 20 μL hacimde yapıldı. Amplifikasyon ve saptama StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied BiosystemsTM) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ct değerleri, referans gen olarak GAPDH ile normalize edilen yavru metanefroz verileriyle ΔΔCt yöntemi kullanılarak bağıl ekspresyon değerlerine dönüştürüldü [32].
immünohistokimya,Fetüs (grup başına n {{0}}) çıkarıldı ve hemen yüzde 4 paraformaldehit (0.1M fosfat, pH 7.4) içinde sabitlendi. Materyaller dehidre edildi, diafanize edildi ve paraplasta dahil edildi ve bloklar 5-μm kalınlıkta bölümlere ayrıldı. Histolojik kesitler deparafinize edildi ve immünofloresan ve immünoperoksidaz için işlendi. bölümler vardı
bloke edici bir solüsyonla (PBS içinde yüzde 8 cenin sığır serumu, yüzde 2.5 sığır albümini ve yüzde 2 yağsız süt tozu) inkübe edildi. Daha sonra, buzdolabında gece boyunca yüzde 1 yağsız süt içeren PBS içinde seyreltilmiş birincil antikor (anti-Altı-2) ile ayarlayın. PBS ile yıkandıktan sonra kesitler, oda sıcaklığında 2 saat boyunca yüzde 1 süt içeren aynı tamponda seyreltilmiş Alexa 488 floroforuna konjuge edilmiş spesifik bir ikincil antikor ile inkübe edildi. PBS ile art arda yıkamalardan sonra, slaytlar, Vectashield floresan montaj ortamı (Vector Laboratories, Inc. Burlingame) kullanılarak lamellerle monte edildi. Örnekteki floresan, lazer konfokal mikroskopi ile tespit edildi. Görüntüler Focus Imagecorder Plus sistemi kullanılarak elde edildi. c-Myc, Ki-67, Bcl-2, TGF -1, - catenin, ZEB1, ZEB2, Caspase 3 cleaved, siklin A ve WT1 proteinleri için immünohistokimya yapıldı. Slaytlar hidratlandı ve 5 dakika PBS pH 7.2'de yıkandıktan sonra, düdüklü tencerede 25 dakika sitrat tampon pH 60 ile antijenik geri kazanım yapıldı. Slaytlar PBS içinde yıkandı. Daha sonra hidrojen peroksit ve metanol ile endojen peroksidaz blokajı karanlıkta 10 dakika boyunca gerçekleştirildi. Kesitler PBS'de tekrar yıkandı. Spesifik olmayan bağlanmanın bloke edilmesi daha sonra takip edildi ve slaytlar bir bloke etme solüsyonu (PBS içinde yüzde 5 yağsız süt tozu) ile 1 saat inkübe edildi. Kesitler, buzdolabında gece boyunca yüzde 1 BSA ile seyreltilmiş birincil antikor (Tablo 2) ile inkübe edildi. PBS ile yıkandıktan sonra kesitler 2 saat oda sıcaklığında spesifik sekonder antikora maruz bırakıldı. Slaytlar PBS ile yıkandı. Dilimler, DAB (3,3'-diaminobenzidin tetrahidroklorür, Sigma-Aldrich CO1, ABD) ile ortaya çıkarıldı. Akan suda art arda yıkandıktan sonra, slaytlar hematoksilen ile zıt boyandı, kurutuldu ve Entellan1 kullanılarak bir lamel ile monte edildi. Görüntüler fotomikroskop (Olympus BX51) veya National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell'den bir Axio Observer Z.1 mikroskobu (Carl Zeiss AG, Almanya) üzerinde bir Zeiss LSM 780-NLO konfokal kullanılarak elde edildi. Campinas Eyalet Üniversitesi'nde Biyoloji (INFABIC).
Morfoloji ölçümüparafin 5 μmböbrekkesitler, bir fotomikroskoptan (Olympus BX51) CellSens Dimension yazılımı kullanılarak analiz edildi. buböbrekdilimlere erişilerek nefrojenik alan, CM ve UB proteini ve hücre sayısı, yaş uyumlu NP yavruları (n {{4 }}) farklı annelerden. Analiz edilen her metanefrosun tüm CM ve UB'sini (farklı annelerden 4NP ve 4LP) ölçtük ve istatistiksel analiz t-testi ile yapıldı ve değerler ortalama ± SD olarak ifade edildi. p�0.05 anlamlı kabul edildi. İstatistiksel analiz ve şekil oluşturma için GraphPad Prism v01 Software, Inc., ABD kullanıldı.
istatistiksel analizT-testi kullanıldı ve değerler ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edildi. P�0.05 anlamlı kabul edildi. İstatistiksel analiz ve şekil oluşturma için GraphPad Prisma v. 01 yazılımı (GraphPad Software, Inc., ABD) kullanıldı.
Sonuçlar
miRNA-Seq ile miRNA'ların ifadesiMaternal düşük protein ile ilişkili mikroRNA değişikliklerini anlamakböbrekprogramlama, global bir miRNA profilleme analizinin ifadesini gerçekleştirdik. Sırasıyla 19 ve 25 miRNA'nın yukarı veya aşağı regüle edildiği 44 düzensiz miRNA (p � 0.05) tanımlandı (Tablo 3). En çok ifade edilen miRNA'lar ve işlevleri, yolları ve ağları, Ingenuity Yazılımı kullanılarak tanımlandı (Tablo 4).
miRNA ifadesinin doğrulanmasıLP grubunun hayvanlarında, Let-7a-5p, miR-181a-5p, miR-181c-3p yukarı regüle edildi, miR-127-3p, miR-144-3p ve miR-199a-5p, NP hayvanlarına göre aşağı regüle edildi. Sonuçlar, her iki grubu karşılaştırarak miR-298 ifadesinde herhangi bir farklılık göstermez (Şekil 1). Tablo 5, RT-qPCR doğrulama verileriyle dizileme yapan miRNA'larla elde edilen değerleri ortaya koydu. NP yavrularına göre LP'de önemli miRNA ekspresyon farkı gözlemlenmesine rağmen, valide edilmiş miRNA'ların kat değişimi (FC) her iki tekniğe benzerdi.
miRNA-gen hedefleri
LP'de Six-2, Bcl-2, PRDM1, siklin A, PCNA, GDNF, Collagen 1, Caspase 3 ve Bim gibi farklı miRNA'nın öngörülen hedeflerinin ekspresyon genleri, NP'den önemli ölçüde farklı değildi. fetüs. Ancak Bax, TGF -1 Bcl-6, c-ret, Map2k2, Ki-67, mTOR, -catenin, ZEB1, ZEB2 ve IGF1 gen ekspresyonu {{15'te yukarı doğru düzenlenmiştir. }}DG LP grubu ile yaş uyumlu kontrollerin karşılaştırılması. Tersine, c-Myc ve NOTHC1, maternal protein kısıtlı yavrularda aşağı regüle edildi (Şekil 2).
Fetus vücut kütlesi ve metanefroz morfometrisi17-DG LP vücut kütlesi, aynı yaştaki NP yavrularından farklı değildi. Bununla birlikte, LP'nin metanefros mezenşimi, NP grubuna göre yüzde 7,6 küçülme alanı ve korteks kalınlığında yüzde 29 azalma gösterdi (Şekil 3).immünohistokimyaBu çalışmada, LP fetüsü, NP yavrularına kıyasla Altı-2 başlık floresansında önemli bir azalma (yaklaşık yüzde 69) gösterdi (Şekil 4).
Six-2 immünoperoksidaz analizi, NP yavrularına kıyasla kapak alanına göre yüzde 28 oranında azaltılmış Six{3}} artı hücrelerle ilişkili olan LP CM'de hücre sayısının azaldığını (yüzde 14) gösterdi (Şekil 4). Mevcut çalışma aynı zamanda LP yavrularına göre LP'de c-Myc CM ve UB immün boyanmış hücrelerde (yüzde 14'ten az) önemli bir azalma gösterdi (Şekil 4). Ek olarak, CM'deki Ki-67 etiketli alan yüzdesi LP'de NP fetusa kıyasla yüzde 48 daha az iken, Bcl-2 ve bölünmüş kaspaz-3 immünoreaktivitesi her iki gruptan farklı değildi (Şekiller). 5 ve 6). Mevcut çalışma aynı zamanda LP yavrularına göre LP'de c-Myc CM ve UB immün boyanmış hücrelerde (yüzde 14'ten az) önemli bir azalma gösterdi (Şekil 4). Ek olarak, CM'deki Ki-67 etiketli alanın yüzdesi LP'de NP fetusa kıyasla yüzde 48 daha az iken, Bcl-2 ve bölünmüş kaspaz-3 immünoreaktivitesi her iki gruptan farklı değildi (Şekiller). 5 ve 6). Öte yandan, LP'de, CM ve UB-katenin etiketli alanlar, NP yavrularında mevcut olana kıyasla sırasıyla yüzde 154 ve yüzde 85 arttı (Şekil 7). Aynı zamanda, mTOR immünreaktivite dağılımı da LP CM (yüzde 139) ve UB'de (yüzde 104) NP fetüsünden önemli ölçüde daha geniş bir alanı işgal etti (Şekil 7). LP yavrularında, UBS hücre boyamasındaki TGF -1 artarken (yaklaşık yüzde 30), CM'de immün boyanmış hücreler NP grubuyla ilgili olarak farklı değildi (Şekil 8). CM çekirdek hücrelerinde bulunan ZEB1 metanefros lekeli, LP fetüsüne kıyasla LP'de yüzde 30 arttı (Şekil 8). Aynı zamanda, ZEB2 immünofloresansı, tüm metanefroz yapılarında mevcut olmasına rağmen, her iki deney grubunda da benzerdi (Şekil 8). Mevcut çalışma, miRNA ve mRNA ekspresyonunu ve proteinleri dikkate alarak
Tartışma
Nefrogenezin hücresel ve moleküler mekanizmaları hakkında bilgi artmıştır [33-37]. Bununla birlikte, birçok düzenleyici faktör ve buna dahil olan sinyal yollarıböbrekontogenez belirsizliğini koruyor [38]. miRNA'lar, gen ekspresyonunun düzenlenmesinde çok önemli bir rol oynar.böbrekgeliştirme [25, 39–41]. Bildiğimiz kadarıyla, maternal LP alımı 17-DG erkek mezenkim hücrelerinde miRNA ve mRNA ekspresyon analizleri yapılmamıştır. Erken nefrogenezin önlenmesinde rol oynayan ve daha az sayıda nefron ile sonuçlanan yeni bir moleküler mekanizma öneriyoruz. NGS'yi miRNA ifadesini değerlendirmek için kullandık ve NP metanefrozlarına kıyasla 17-DG LP'de 19 miRNA'nın yukarı ve 25'inin aşağı regüle olduğunu bulduk. Düzenlenmemiş ilk 10 miRNA arasında, çoğalma, farklılaşma ve hücresel apoptoz ile ilgili biyolojik hedeflere sahip 7 miRNA seçtik. Hem miRNA-Seq hem de TaqMan veri analizi, kontrol NP yaş uyumlu hayvanlara göre LP hayvanlarında miRNA ifadesinde tutarlı ve spesifik değişiklikler ortaya çıkardı.
miR-181 ailesi, yüksek düzeyde korunmuş dört üyeden oluşur: miR-181a, miR-181b, miR-181c ve miR-181d [ 42]. Neoplastik hücrelerde, miR-181a, bir tümör baskılayıcı olarak görev yapar, hücresel proliferasyonu ve göçü inhibe eder ve hücresel apoptozu indükler [43]. Bu çalışma, yaş uyumlu NP yavrularına göre 17-DG LP'de miR-181a-5p ifadesinin arttığını ortaya koydu. Kaspaz mRNA ekspresyonu değişmemiş olsa da, LP'deki Bax/ Bcl-2 mRNA oranındaki iki kat artış, NP yavrularına kıyasla CM'de artmış apoptoz olduğunu düşündürür, bu da apoptozun transkripsiyon sonrası düzenlendiğini gösterir. Çalışmalar, BCL ailesinin mitokondriden sitokrom salınımını desteklediğini ve ardından Casp3 aktivasyonunu inhibe ederek hücresel apoptozu inhibe ettiğini göstermiştir [44]. Li ve ark. aşırı eksprese edilen miR-181a'nın azalmış Bcl-2 protein seviyesi ile ilişkili olduğunu ortaya çıkarmak için bir akut akciğer hasarı modeli kullandı; tersine, miR-181a inhibisyonu Bcl-2 seviyelerini arttırdı [45]. Bu çalışma, miR-181c'nin Six-2 ekspresyonunu ve hücre proliferasyonunu negatif olarak düzenlediğini gösteren Lv ve ark.'nın sonuçlarını doğruladı.böbrekLP 17-DG yavrularında [25] geliştirme.
Xiang et al. artan miR-144 ifadesinin baskıladığını gösterdiböbrekkarsinom proliferasyonu, daha kısa bir G2/M fazı ile sonuçlanır. Ayrıca, Xiang ve ark. miR-144'nin aşırı ekspresyonunun mTOR geni ve protein ekspresyonunu inhibe ettiğini ortaya çıkardı [46]. Nijland et al. mTOR sinyallemesindeki bir artışın, anneleri besin kısıtlamasına tabi tutulan embriyolarda nefron sayısını belirlemek için çok önemli olduğunu göstermiştir [47]. Rapamisin kompleksi 1'in (mTORC1) memeli hedefi, embriyo gelişimi için esastır; bununla birlikte, bu kompleksin fizyolojik koşullar ve çevresel stres altında büyüme ve otofaji arasındaki dengeyi nasıl düzenlediği bilinmemektedir [48]. Bu nedenle, mTOR sinyali, gebelik sırasında LP alımına maruz kalan hayvanlarda hücresel yanıtlarda yer alabilir; otofajinin algılanması, başlatılması ve sonlandırılmasında; ve hücre içi besin mevcudiyetine yanıt olarak [46]. Varsayımsal olarak, şiddetli protein kısıtlaması sırasında miR-144-3p'nin azaltılmış ifadesi, {{'deki nefron kaybını telafi etmek için CM hücrelerinde ve UB'de sırasıyla yaklaşık yüzde 139 ve yüzde 104 olmak üzere artan mTOR ifadesi ile ilişkilendirilebilir. 11}}DG LP'nin çocuğu Chen ve ark. miR-127, Bcl-6 [49] yoluyla hücre yaşlanmasının yeni bir düzenleyicisi olarak tanımladı. Pan et al. miR-127 yetersiz ekspresyonunun karaciğer hücrelerinde artan hücre proliferasyonu ile ilişkili olduğunu bildirdi [50]. Bu çalışma, protein kısıtlı hayvanların CM'sinde hücre proliferasyonunda bir azalma ve Ki-67 için pozitif olarak etiketlenen hücrelerde önemli bir azalma olduğunu gösterdi. Ayrıca, Menendez-Castro ve ark.'nın sonuçlarıyla uyumlu olarak nefrojenik alanda azalma ve LP soyunda proliferasyon gözlendi. yüzde 8.4 protein kısıtlı soyda [51, 52]. Bu nedenle, 17-DG LP başlığındaki miR-127-3p ifadesinin azalmasıyla birlikte artan Ki-67 ve Bcl-6 mRNA ifadesi, korumak için karşı düzenleyici mekanizmalarla ilişkilendirilebilir. çoğalma.
Güneş et al. miR-199a-5p'nin aşırı ekspresyonunun, hücre döngüsünü kontrol etmenin yanı sıra kistik hücre proliferasyonunu azalttığını ve apoptozu indüklediğini gösterdi [53]. Bu çalışmada, 17-DG LP'de miR-199a-5p ekspresyonu azalır, hücresel çoğalma belirteci olan Ki-67 ve Map2k2'nin artan transkripsiyonuna eşlik eder. LP 17-DG metanefrozlarında Ki-67 reaktivitesinin azalmasıyla ilişkilidir. Bu nedenle, gestasyonel yetersiz beslenme, transkripsiyon sonrası bir mekanizma yoluyla farklılaşmayı teşvik eder. Özellikle, sonuçlarımız, embriyonik kök hücre farklılaşması sırasında kök hücre pluripotensini koruyan bir EMT indükleyicisi olan çinko parmak E kutusu bağlayıcı homeobox 1'in (ZEB1) baskılayıcı bir rolünü ortaya koymaktadır. -katenin'in nükleer ZEB1 transkripsiyonunu aktive ederek ZEB1 ekspresyonu ile sonuçlandığı bilinmektedir [34]. En iyi çalışılmış yollardan biri olan TGF sinyal yolu, embriyonik gelişim sırasında EMT'yi indükleyebilir. Embriyonik gelişim için birkaç TGF benzeri ligand gereklidir. Bununla birlikte, EMT üzerindeki TGF aracılı etkilerin tümü ZEB1/2'ye bağlı değildir, nakavt hücreler mezenkimal genler fibronektin ve N-kadherin ekspresyonunu indükleyebilir. Bununla birlikte, E-cadherin artık aşağı regüle edilmez ve aktin lifleri de oluşur [54]. Karner et al. sırasında bildirdiböbrekgeliştirme, Wnt9b/ -catenin
Hem UB hem de CM'de ifade edilen sinyal yolu, hem nefron progenitör hücre yenilenmesi hem de farklılaşması için gereklidir ve embriyogenez sırasında nefronların oluşumu için esastır [55]. Evrimsel olarak korunan Wnt9b/ -katenin yolu, çok hücreli organizmalarda organ, doku geliştirme ve yaralanma onarımında kritik bir rol oynar. Bir çalışma, c-Myc'nin -katenin'in transkripsiyonel bir hedefi olduğunu, proliferasyonunu ve farklılaşmasını düzenlediğini göstermiştir.böbrektübüler epitel [56]. -katenin'in gen ve protein düzeyinde ekspresyonu, çalışılan dönemlerde arttı.böbrek17-DG LP fetüsündeki gelişme. Pan et al. Myc'in nefron progenitör hücrelerinin yenilenmesini teşvik etmek için -katenin ile işbirliği yaptığını bildirdi [10]. Burada, yaş uyumlu NP yavrularıyla karşılaştırıldığında, LP daha düşük c-Myc ifadesi gösterdi. Bu nedenle, bu hayvanlar çoğalma ve hayatta kalma için gerekli olan daha düşük yenilenebilir hücre rezervine sahip olabilir ve LP modelinde daha az sayıda nefron yansıtabilir. Dahası,
Wnt/ -katenin ve Notch sinyal yolları, Six-2 ifadesinin düzenlenmesini koordine edebilir ve nefron progenitör hücrelerinde Six-2 ifadesinin aşağı regülasyonunda yer alır. Çalışmalar, Altı-2 ekspresyonu ve CM progenitör hücrelerini farklılaşmamış durumda tutmak için düşük -katenin seviyelerinin gerekli olabileceğini göstermiştir; dahası, yüksek - katenin seviyeleri nefron progenitör hücre kaderini belirler [57, 58]. Bu nedenle, artan -katenin ekspresyonu ile birlikte azalan cMyc ve Notch sinyalinin 17-DG LP yavrularında Six-2 ekspresyonunu yüzde 28 azalttığını ve erken CM hücre farklılaşması ve azalan kök hücre ile ilişkili olduğunu varsayıyoruz. Yetişkinlikte nefron sayısı. Ayrıca, verilerimiz, LP yavru MM hücrelerinde, artan Let-7a-5p ve -katenin ifadesinin ve azaltılmış Notch sinyalinin c-Myc, Six-2 modüle edebileceğini destekleyebilir, ve Ki-67 ifadesi, progenitör hücrelerin kendini yenilemesinde bir azalmaya yol açar. Kalan CM progenitör hücrelerinin tükenmesi, nefron sayısında bir azalmaya ve arteriyel hipertansiyon gelişimine veböbrekyetişkinlikteki bozukluklar (Şekil 10). Boivin ve ark.'nınkiyle uyumlu olarak, sonuçlarımız artan CM-katenin'in UB büyümesini ve nefrogenezi bozduğunu göstermektedir [59]. Çalışmalar, UB büyümesinin önemli bir düzenleyicisi olan büyüme faktörü glial kaynaklı nörotrofik faktörün (GDNF) c-Ret tirozin kinaz reseptörü ve Gfra1 ko-reseptörü aracılığıyla sinyal verdiğini göstermiştir [60, 61]. 17-DG LP yavrularında, önemli bir
c-Ret reseptörü kodlayan mRNA'daki artış teorik olarak UB büyümesinde bir artışa yol açacaktır. Bununla birlikte, bu çalışmada, GDNF ifadesi değişmedi, bu da cRet mRNA'daki bir artışa rağmen UB dallanmasının azaldığını düşündürdü. Daha önce, 14.5 günlük gestasyonel protein kısıtlamasından sonra üreter tomurcuk dallarında yüzde 28,3'lük bir azalma gözlemlemiştik [4], bu, GDNF'de hiçbir değişiklik olmamasına rağmen, MM hücrelerinin Altı-2 etiketlemesinde yüzde 28'lik bir azalma ile ilişkilendirilebilir. transkripsiyon. -katenin muhtemelen c-ret reseptörü ile etkileşime girer ve UB hücresinin çekirdeğine taşınır, epitel hücrelerinde TGF -1 ekspresyonunu destekler, UB dallanmasını inhibe eder ve {{11}'de görüldüğü gibi CM progenitör hücresinin erken farklılaşmasına neden olur. }DG LP yavruları [62– 64]. Bu nedenle GDNF, üreter tomurcuğuna mezenkimal sinyallere aracılık etmede gerekli olmayabilir; bununla birlikte, mekanizma açıklığa kavuşturulmamıştır. Gerçekten de, 17-DG LP yavrularından gelen MM'nin Let-7 miRNA ifadesinde belirgin bir artış gösterdiğini ve bunun da önemli ölçüde bozulmaya neden olduğunu gösterdik.böbrekböylece nefrogenezin gelişimsel zamanlamasında bu genlerin modülatör rolünü doğrular [65].
İlk insülin benzeri büyüme faktörü (IGF) çalışmalarında, IGF-1 ve -2'nin fetal büyümedeki baskın rolleri bol, ancak çoğunlukla dolaylı kanıtlarla aydınlatıldı. IGF'lerin kültürlenmiş fetal hücrelerde ve preimplantasyon embriyolarında proliferasyon ve farklılaşma faktörleri olarak hareket ettiği bulundu. Ayrıca, IGF'lerin kültürlenmiş fetal hücreler ve eksplantlar tarafından in vitro olarak salgılandığı bulunmuştur [66]. IGF dahil olmak üzere büyüme faktörleri, kısmi veya tam epitelyal-mezenkimal geçişe neden olabilir. IGF yollarının aktivasyonu, ZEB1 ekspresyonunu indükleyerek EMT'nin yukarı regülasyonu ile sonuçlanır [67]. Birkaç aday büyüme faktörü dahil olmasına rağmenböbreknefrogenezde yer alıp almadıkları bilinmemektedir. Farklı zamanlarda farklı büyüme faktörlerine ihtiyaç duyulabilir. Bu bağlamda bazı büyüme faktörleri gereksiz olabilir. Embriyonik gelişim sırasında, özel hücre tiplerini ayırt etmek ve üç boyutlu bir yapı oluşturmak için sıralı EMT ve MET turlarına ihtiyaç vardır. Bu çalışmada, mezenkimal-epitelyal interkonvertibilitenin hücre plastisitesini koruduğu bulundu, bu da embriyo için LP koşullarında oldukça indüklenebilir bir sistemin varlığını düşündürdü. Let-7 miRNA ailesinin ifadesi, çeşitli fetal dokularda kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Let-7 miRNA ekspresyonundaki artış, proliferasyonun azalması ve MM hücre farklılaşmasının erken artışı ve sonuç olarak nefron sayılarının azalması ile ilişkilidir [27, 15, 68-71]. Yüksek Let-7 ekspresyonu, kemirgenlerde serebral embriyogenezin son aşaması sırasında daha yüksek organizmalarda gösterilmiştir [72, 73]. Nagalakshmi et al. Let-7 miRNA ifadesinin UB epitel hücre kaderini öncüden farklılaşmış duruma değiştirdiğini ortaya çıkardı [71]. Buna karşılık, Yermalovich ve ark. bir RNA bağlayıcı protein olan Lin28b'nin aşırı ekspresyonunun, baskılayıcı Let-7 miRNA'ları ile ilişkili olduğunu gösterdi. lin28 ve Let-7, omurgasızlarda ontojenik zamanlamanın bilinen düzenleyicileri olmasına rağmen, bunların memeli organ gelişimindeki rolü anlaşılamamıştır [65]. Bu çalışmada, LP fetüsündeki Let-7a-5p miRNA ekspresyonundaki artış, NP grubuna göre nefrogenezden ödün vererek azalmış CM hücre proliferasyonu ile ilişkilendirilebilir. Bu nedenle, artan Let-7 miRNA'nın neden olduğu CM hücre proliferasyonunun baskılanması ve nefrojenezin erken kesilmesinin, 17-DG LP'de Lin28b'nin geçici olarak azaltılmış ifadesi yoluyla doğrudan veya dolaylı olarak meydana gelebileceğini varsayıyoruz. Bu etki önemli ölçüdeböbrek17-DG LP'deki gelişme, bu genin nefrogenez sırasında gelişim zamanlamasını düzenlediğini doğrular. Bu çalışmada, artan Let-7a-5p miRNA ifadesi, c-Myc ifadesindeki azalma ile örtüşmektedir. Myc, proliferasyon, büyüme, apoptoz ve hücre farklılaşmasında rol oynar.böbrekorganogenez [74–76]. LP 17-DG yavrularında, MM c-Myc gen ekspresyonu azaldı ve CM c-Myc immünoreaktivite alanı, NP yavrularına kıyasla yüzde 14 daha küçüktü. Eşzamanlı olarak, CM hücre sayısındaki yüzde 14'lük bir düşüşün, NP yavrularına göre LP'de yüzde 48 Ki-67 immünoreaktivitesini azalttığı gözlemlendi. Tutarlı bir şekilde, çalışmalar c-Myc'nin UB dallanmasının son fazında ve CM progenitör hücre proliferasyonunu uyarmada önemli bir rol oynadığını göstermiştir [74].
CISTANCH BÖBREK/BÖBREK ENFEKSİYONUNU İYİLEŞTİRECEK
kök hücrelerde azaltılmış seviye, onları farklılaşmamış bir durumda tutar. Ancak bu çalışmada, CM'de Let-7a-5p miRNA'nın güçlü ifadesi, c-Myc ifadesini aşağı regüle etti, böylece LP 17-DG'de progenitör hücre çoğalmasını ve erken hücre farklılaşmasını azalttı. yavru (Şekil 10). üzerine çalışmalarböbreklerc-Myc transgenik farelerin bir deneyi, azalan kök hücre proliferasyonu ile ilişkili c-Myc ve S-ix-2 immünopozitif CM hücrelerinde eşzamanlı bir azalma ortaya çıkardı [74]. Bu çalışma, Altı-2 pozitif hücrede, belirli birböbrek17-DG LP yavrularının CM'sinde NP yavrularına kıyasla nefron sayılarında gözlenen azalma gibi kök hücre işaretçisi. 2009 yılında Fogelgren ve ark. Altı-2 gen ekspresyonunun, azalmış nefron sayıları, hipertansiyon ve kronik ile ilişkili olduğunda fetal ontogenez sırasında azaldığını göstermiştir.böbrek yetmezliği[77]. Bu nedenle, CM progenitör hücrelerinde azaltılmış Six-2 gen ekspresyonu, aşağıdakiler sırasında sinyal kaynaklı farklılaşmanın baskılandığını gösterir.böbrek17-DG LP'nin sonraki neslinde geliştirme. Bununla birlikte, fazlalık dikkatli kullanılmalıdır - nefrogenezdeki ince kusurlar, daha ayrıntılı analizlerle veya farklı koşullar altında ortaya çıkabilir. IGF1 mRNA seviyeleri, metanefrik gelişimin ilk periyodu sırasında en yüksek seviyedeydi, transkriptler MM boyunca tespit edildi, ancak seviyeleri daha fazla gelişme sırasında azaldı. Ancak, sırasındaböbreknefron kolaylaştırıcı büyüme faktörleri (IGF1) ve inhibe edici büyüme faktörleri (TGF -1) arasındaki hassas bir denge olan embriyogenez, UB dallanmasını düzenler.
Çözüm
Birçok yazar nefrogenezi incelemiş olsa da [34, 37, 78], nefron sayılarını belirleyen mekanizmalar hakkında çok az şey bilinmektedir. Bu çalışma, birçok MM progenitör hücre miRNA'sı, mRNA'sı ve proteininin 17-DG LP yavrularında değiştirildiğini, bunun da proliferasyonun azalmasına ve erken hücre farklılaşmasına yol açtığını göstermektedir (Şekil 11). Nefron progenitörünün yenilenmesi ve farklılaşması arasındaki bu hassas denge,böbrekYeterli sayıda nefron elde edilememesi kronik için bir risk faktörü olduğundan gelişmeböbrekdüzensizlik.
