Kodlama Sonrası Tekrarlayan Transkraniyal Manyetik Stimülasyon Kullanılarak Geliştirilmiş Nesne Tanıma Belleği Bölüm 1

soyut

Arka plan: Beyin stimülasyonunun hafızada yer alan kanonik yolları ve proteinleri etkilediği bilinmektedir. Bununla birlikte, beyin stimülasyonunun hafızayı iyileştirme yeteneği konusunda çelişkili sonuçlar vardır; bu, stimülasyonun zamanlamasındaki değişikliklere bağlı olabilir.

Beyin uyarımı ile hafıza arasında yakın bir bağlantı vardır. Beyin stimülasyonu, beyin nöronlarının aktivitesini destekleyebilir, böylece hafızayı ve bilişsel yeteneği geliştirebilir.

Birincisi, beyin uyarımı nöronlar arasındaki bağlantıyı güçlendirebilir. Beynin uyarılmasıyla nöronlar arasındaki iletişim ve bağlantı daha sık ve verimli hale gelecektir. Bu bağlantılar daha istikrarlı ve gerçek hale gelecek, beyni daha esnek, yaratıcı ve düşünceli hale getirecek. Bu avantajlar size öğrenmede ve yaşamda avantaj sağlayacaktır.

İkincisi, beyin uyarımı daha güçlü hafıza sağlayabilir. Sık beyin uyarımı beynin canlılığını ve sağlığını artırabilir, böylece hafızayı geliştirebilir. Beyin sağlığı ile hafıza ve bilişsel faaliyetler arasında hayati bir ilişki vardır. Beyin stimülasyonu beynin iyileşmesine, büyümesine ve onarılmasına yardımcı olacaktır. Bu sayede bilgiyi öğrenmemiz ya da hayattan anlamlı bilgiler almamız daha kolay olacak ve bunları beyinde daha iyi saklayıp hatırlatabileceğiz.

Ayrıca beyin uyarımı yeni bilgilerin öğrenilmesini ve uygulanmasını da teşvik edebilir. Hayatta nasıl başa çıkacağımızı bilemediğimiz çeşitli sorunlarla sürekli karşılaşırız. Beynimizi sık sık uyararak bu karmaşık bilgiyi daha hızlı ve daha doğru anlayabilir, yavaş yavaş ona uyum sağlayabilir, onu işlemenin yollarını bulabilir ve onunla daha iyi başa çıkabiliriz, böylece olaylarla uğraşırken daha kolay oluruz.

Kısacası beyin uyarımı yoluyla daha esnek, yaratıcı ve düşünceli olabiliriz. Ayrıca hayattaki sorun ve zorluklarla daha özgüvenle yüzleşeceğiz. Beyin stimülasyonu bilişsel yeteneğimizi geliştirmenin, öğrenmeyi güçlendirmenin ve hafızayı geliştirmenin iyi bir yoludur. Beyin egzersizi planımıza sadık kalalım, olumlu bir tutum sergileyelim, pozitif olalım, daha iyi kişisel gelişim peşinde koşalım ve ideallerimizi gerçekleştirelim. Belleği geliştirmemiz gerektiği görülebilir ve Cistanche hafızayı önemli ölçüde geliştirebilir çünkü Cistanche aynı zamanda hafıza ve öğrenme için çok önemli olan asetilkolin ve büyüme faktörlerinin seviyelerini arttırmak gibi nörotransmiterlerin dengesini de düzenleyebilir. Ayrıca Cistanche kan akışını iyileştirebilir ve oksijen dağıtımını destekleyebilir, bu da beynin yeterli beslenme ve enerji almasını sağlayarak beyin canlılığını ve dayanıklılığını artırır.

Çalışma belleğini geliştirmek için Bil'e tıklayın

Hipotez: Bir öğrenme görevinin ardından ve geri alma işleminden önceki süre içinde verilen tekrarlayan transkraniyal manyetik stimülasyonun (rTMS) hafızayı iyileştirmeye yardımcı olabileceğini varsaydık. Yöntemler: rTMS bobinini sabitlemek için erkek B6129SF2/J farelerine (n=32) kranyal eklenti yerleştirdik. farelerin serbestçe hareket ederken ön bölgeye tutarlı bir uyarı verilebileceği.

Fareler daha sonra nesne tanıma testi örnekleme aşamasına tabi tutuldu ve testten sonra +3, +24, +48 saat tedavi uygulandı. Tedavi, 10 dakikalık 10 Hz rTMS stimülasyonundan (TMS, n=10), sahte tedaviden (SHAM, n=11) veya davranış testini yapmayan veya rTMS almayan bir kontrol grubundan (KONTROL n=11) oluşuyordu.

+72'de fareler yeni ve tanıdık nesneyi keşfetme açısından test edildi. Sonuçlar: 72-saatte, yalnızca rTMS alan fareler yeni nesneyi tanıdık nesneye göre daha fazla keşfetti.

Ayrıca sinaptik GluR2'nin teşvik edilmesinin ve perirhinal korteks ile hipokampal CA1'deki sinaptik bağlantıların sürdürülmesinin bu etki için önemli olduğunu gösterdik.

Ayrıca bu değişikliklerin hipokampal nöronlardaki CAMKII ve CREB yollarıyla bağlantılı olduğuna dair kanıt bulduk.

Sonuç: rTMS'nin bilinen biyolojik etkilerini hafıza yollarına bağlayarak, rTMS'nin konsolidasyon ve bakım aşamaları sırasında verildiğinde hafızayı geliştirmede etkili olduğuna dair kanıt sağlıyoruz.

1. Giriş

Non-invaziv beyin stimülasyonunun, hafızada yer alan kanonik yolları ve proteinleri etkilediği bilinmektedir. Bununla birlikte, beyin uyarımının, özellikle de tekrarlayan transkraniyal manyetik uyarımın (rTMS) bellek üzerindeki etkilerini inceleyen mevcut çalışmalar çelişkili sonuçlara sahiptir [1].

Bunun bir nedeni, hafıza oluşumu ve geri çağırma sırasında uyarının farklı zamanlarda hedeflenmesi olabilir [1]. Kanıtlar, kodlama sonrası veya konsolidasyon aşamalarında rTMS'yi hedeflemenin istikrarlı uzun vadeli anılar geliştirmede faydalı olabileceğini göstermektedir [2]e4].

Konsolidasyon, kısa süreli belleği uzun süreli belleğe (LTM) dönüştüren aşamadır. Süreç, yeni bilgiyi artan postsinaptik reseptör yoğunlukları ile stabil sinaptik modifikasyonlara dönüştüren zamana özgü protein sentezine bağlıdır [5,6].

Bu zamana ve bölgeye özgü protein sentezinin önemi, denovo protein sentezini bloke eden çalışmalarda gösterilmiştir. Örneğin, öğrenme olayından 3-saat sonra hipokampusta protein sentezini bloke eden, ancak öğrenme olayından 6-saat sonra bloke etmeyen bir çalışma, sıçanlarda LTM'yi bozdu ancak kısa süreli hafızayı etkilemedi[7].

Bu proteinlerden, yukarı regüle edilen ve bu süreçte önemli olan birkaç önemli sinyal yolu tanımlanmıştır.

Sinapsta LTM için gerekli olan reseptör innervasyonunu ve omurga stabilitesini işaret eden çok sayıda sinyal yolu mevcuttur. Bunlar, uzun vadeli bir güçlenme (LTP) uyaran olayı yoluyla aktive edilir ve genellikle beyinden türetilen nörotrofik faktör (BDNF) gibi nörotrofik faktörlerle güçlendirilir [8].

BDNF, uzun süreli hafıza oluşturmada özellikle önemlidir, çünkü belirli zaman noktalarında BDNF'nin sentezini bloke etmek, aşağıdaki öğrenmenin konsolidasyonunu bloke etmesini sağlar [5].

BDNF, tirozin kinaz reseptörlerine (TrkB) bağlanır ve mitojenle aktifleşen protein kinaz/hücre dışı sinyalle düzenlenen kinaz (ERK) veya fosfolipaz Cg yolları gibi birden fazla sinyal yolunu başlatabilir. Bu sinyal yolları, transkripsiyon düzenleme faktörü siklikAMP'ye duyarlı element bağlayıcı proteinin (CREB) aktive edilmesinde birleşir.

Kalsiyum/kalmodulin bağımlı protein kinaz II (CAMKII) gibi kalsiyumla aktifleşen proteinler de CREB ile aktifleşen gen regülasyonunda rol oynarlar[9e11] ve ayrıca glutamaterjik AMPA reseptörlerinin sinaptik ekspresyonuna doğrudan aracılık edebilir ve sinaptik yapı iskelesini stabilize edebilirler [12e15] .

Bu sinyal yolları birlikte, reseptör ekspresyonunda ve sinapstaki artan aktivasyona aracılık eden translokasyonda bir kayma ile sonuçlanır, böylece sinapsları stabilize etmeye hizmet eder ve uzun süreli LTP'nin korunmasına katkıda bulunur [16]. Önemli olarak, önceki çalışmalar hafıza konsolidasyonunu iyileştirmenin mümkün olduğunu göstermiştir. bu konsolidasyon yollarının deneysel ortamlarda periyodik olarak yeniden etkinleştirilmesi yoluyla sağlanır [17].

Önceki çalışmalar, rTMS'nin beyindeki bu spesifik yolları doğrudan etkileme yeteneğini göstermiştir. İn vivo çalışmalar rTMS'nin beyindeki BDNF düzeylerini arttırdığını göstermiştir [18e20]. Daha doğrudan, in vitro rTMS, CAMKII yolunda baskın bir sinyal molekülü olan nöronlarda Ca2+ artışıyla sonuçlanır [18]. CAMKII ve CREB fosforilasyonunda artış, rTMS'den sonra in vitro olarak da gösterilmiştir [20,21].

rTMS ayrıca sinaptik reseptör ekspresyonunu doğrudan etkileyerek AMPA reseptör yoğunluğunu [22e24] artırır ve AMPA reseptör alt birimleri Glutamat Reseptörü 1 (GluR1) ve Glutamat Reseptörü 2'yi (GluR2) [25,26] düzenler.

Bu nedenle, asrTMS bu yolları etkinleştirir; bu, pekiştirme aşamasında hafızanın iyileştirilmesinde en etkili yöntem olacaktır. Bu çalışma, belleğin pekiştirme ve sürdürme aşamalarının uyarılmasını hedefleyerek, rTMS'nin belleği geliştirmek için kullanımını incelemiştir.

Bir öğrenme görevinin ardından ve geri alma öncesindeki dönemde uygulanan rTMS'nin hafıza performansını artırabileceğini varsaydık. Bu, hafızada yer alan ve aynı zamanda rTMS'den de etkilenen yolların periyodik olarak yeniden etkinleştirilmesinin bir sonucu olabilir.

Belirli bir epizodik LTM'nin hayvan modelini kullanarak, rTMS'nin kodlama ile geri alma arasındaki 72- saat içinde verildiğinde nesne hafızasını iyileştirdiğini, oysa SHAM tedavisi verilen farelerin hafızayı korumadığını gösterdik.

Bu etki, perirhinal korteks ve CA1'deki sinaptik bağlantılarda meydana gelen değişiklikler, CREB ve CAMKII'nin yüksek aktivasyonu ve sinapstaki AMPA reseptör alt birimlerindeki dinamik bir değişim ile desteklenmiştir.

2. Gereç ve yöntemler

2.1. Hayvanlar

Bu çalışma için 2 ila 4 aylık n=33 erkek B6129SF2/J faresi kullandık. Tüm fareler, kuru yem ve suya serbestçe erişilebilen 12-sa aydınlık/12-sa karanlık döngüsü altında yaşadı. Tüm hayvan bakımı ve prosedürleri Hayvan Refahı Yasası'na uygundu ve kurumsal yönergelere uygundu ve VA Palo Alto Hayvan Araştırma Komitesi tarafından onaylandı.

2.2. Bobin desteği ameliyatı

Farelerin her biri, uyanık hayvanların tutarlı rTMS uyarımına izin veren bir bobin desteğinin takılması için ameliyat edildi. Cerrahi prosedürle ilgili ayrıntılar Poh ve ark., 2018'de bulunabilir[27].

Kısaca hayvanlara %3'lük izofluran ile anestezi uygulandı ve bir burun konisi ile %2e3'te tutuldu. Bölgenin tıraşlanıp sterilite açısından temizlenmesinin ardından neşter bıçağıyla yaklaşık 10 mm uzunluğunda sagittal bir kesi yapıldı.

Periosteum nazikçe kazındı ve bregma'ya siyanoakrilat ile önceden hazırlanmış bir bobin desteği takıldı ve diş çimentosu ile güçlendirildi. Yara daha sonra sarmal desteğinin çevresine dikildi.

2.3. Davranış ve stimülasyon prosedürleri

Davranış ve stimülasyon prosedürlerine genel bir bakış için bkz. 1a. Bobin destek ameliyatından beş gün sonra iyileşme sonrasında fareler, üç gün boyunca ayrı bir stimülasyon kafesine ve bobin prosedürlerine alıştırıldı.

Bobin alışkanlığının son gününde fareler, 10- dakika boyunca Açık Alan Testine (OFT) tabi tutuldu; bu aynı zamanda Nesne Tanıma Testi (ORT) için alışkanlık görevi gördü. Ertesi gün fareler, 10 dakika boyunca aynı nesnelerden ikisiyle ORT Örnekleme aşamasına maruz bırakıldı. Nesneler benzer büyüklükte ancak farklı renk ve şekillerdeydi. Bu nesneler kare şeklinde bir test alanının karşılıklı köşelerine yerleştirildi.

Üç saat sonra fareler rastgele iki tedavi grubuna ayrıldı: 10-dakikalık 10 Hz rTMS aktif uyarımı alan TMS ve uyarım sırasında bobinin kapatılması dışında aynı şekilde tedavi edilen SHAM.

Hem TMS hem de SHAM fareleri alışma sonrasında24- ve 48-saat sonra yeniden tedavi edildi. Son günde (alışmadan 72-saat sonra) fareler, bir tanıdık nesne ve bir yeni nesneyle 10-dakika boyunca ORT Test aşamasına maruz bırakıldı.

Yeni nesnenin keşfinin tanıdık nesneden daha büyük olup olmadığını belirlemek için ayrımcılık indeksini (((yeni nesne keşfi)-(tanıdık nesne keşfi))/((yeni nesne keşfi)+(tanıdık nesne keşfi)) hesapladık. Hem önceki çalışmalar [28] hem de pilot veriler (gösterilmemiştir) normal koşullar altında farelerin bu zaman noktasında ORT hafızasını korumadığını gösterdiğinden 72-h'yi seçtik.

Hem nesne türleri hem de yeni nesnenin konumu gruplar arasında dengelendi. Alışkanlık, numune alma ve sonda oturumu için, denemelerden önce farelere deney odasına alışmaları için her zaman 30 dakika verildi ve nesneler ve alan, her fareden sonra %70 etanol ile temizlendi.

Yalnızca davranışsal görevin etkilerini araştırmak için ayrıca, ORT yapmayanlar dışında SHAM fareleriyle aynı şekilde tedavi edilen bir grubu da dahil ettik.

Bunun yerine, hiçbir nesne olmadan bir örnekleme ve araştırma oturumuna tabi tutuldular. TMS grubundaki bir fare, örnekleme oturumunda her iki nesnenin toplam 20-s keşfi için gereken eşiğe ulaşamadı ve bu nedenle çalışmadan çıkarıldı. Bu fare daha sonraki biyokimyasal analizin dışında tutuldu.

Diğer tüm fareler hem örnekleme hem de sonda oturumunda kriterlere ulaştı. Bir fare hariç, deney gruplarındaki son sayılar TMS n=10, SHAM n=11 ve CONTROLn=11 idi.

2.4. Batı lekesi

Sondalama seansından üç saat sonra fareler aşırı dozda ketamin ile öldürüldü ve hipokampus ve frontalkorteks dokuları hızlı bir şekilde kuru buz üzerinde parçalara ayrıldı ve 80°C'de saklandı.

Bu numuneler, 1x Proteaz İnhibitör Kokteyl (Roche) ve 1x Fosfataz İnhibitör Kokteyl (Roche) tabletleri (10 ml'de) içeren 300 mL buz soğukluğunda Syn-Per Synaptic Protein Ekstraksiyon Reaktifi (Thermo Scientific) ile 5 saniye boyunca homojenleştirildi.

Homojenatlar, hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için 1200 g'de 10 dakika boyunca santrifüjlendi. Süpernatan alınmış ve süpernatanın bir kısmı Tam Homojenatın analizi için bölüntülenmiştir. Geriye kalan kısım 4°C'de 20- dakika boyunca 15000 g'de santrifüjlendi.

Sinaptozomlar içeren peletler, Synaptic Homojenat'ı oluşturmak için 1.5 ml/g doku oranında Syn-Per içerisinde yavaşça yeniden süspanse edildi. Numunedeki protein konsantrasyonunu ölçmek için bir nanodamla kullanıldı.

Tam Homojenat ve Sinaptik Homojenat analize kadar 80°C'de saklandı. Hem Tam hem de Sinaptik homojenatlar, buz soğukluğunda PBS içinde 4 mg/ml'ye seyreltildi ve 1:4 Protein Yükleme Tamponu (LiCor) ve 1:4000 merkaptoetanol ile karıştırıldı. Daha sonra 95°C'de 5-bir dakika ısıtıldılar ve Mini PROTEAN TGX Jellere (Bio-Rad) yüklendiler.

100 V'de elektroforez kullanılarak ayırmanın ardından proteinler, nitroselüloz lekeleme membranına (GE Healthcare Lifesciences) aktarıldı. Membranlar SuperSignal WesternBlot Güçlendirici Antijen Ön Muamele Solüsyonunda (Thermo Scientific) yıkandı ve ardından Bloklama Tamponu (Rockland) ve %1 keçi serumu ile 1- saat boyunca bloke edildi.

Blokajın ardından membran, SuperSignal Western Blot Enhancer Primer Antikor Seyreltici (Thermo Scientific) içerisinde seyreltilmiş primer antikorlarla gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edildi.

Kullanılan birincil antikorlar fare monoklonal ERK 1/2 (1:1000, Santa Cruz Biyoteknoloji), tavşan monoklonal fosfo-p44/42 MAPK (pERK 1:1000, Hücre Sinyal Teknolojileri), fare monoklonal CREB (1:500, Hücre Sinyal Teknolojileri), tavşan monoklonaldir fosfo-CREB (S133) (pCREB1:500, Hücre Sinyal Teknolojileri), tavşan monoklonal CAMKIIalfa (1:1000, Hücre Sinyal Teknolojileri), fare monoklonalfosfo-CAMKII (Thr286) (pCAMKII 1:1000, Invitrogen), fare monoklonal GluR1 (1: 750, Santa Cruz Bioteknoloji), tavşan monoklonal fosfo-GluA1 (S845) (pGluR1(845) 1:750, CellSignaling Technologies), tavşan monoklonal fosfo-GluA1 (S831)(pGluR1(831) 1:750, Hücre Sinyal Teknolojileri), fare monoklonal GluR2 (1:750, Invitrogen), tavşan poliklonal fosfo-GluR2(S880) (pGluR2 1:500, Invitrogen), fare monoklonal TrkB (1:500, BD Transduction Laboratories) veya tavşan poliklonal fosfo-TrkB( Tyr816) (pTrkB 1:500, EMD Millipore).

Standart yükleme kontrolü için tavşan poliklonal Cofilin (1:2000, Sigma) kullanıldı. TBS-Tween'de durulamanın ardından membran, keçi anti-tavşan 800 ve keçi anti-fare 680 (1:3000, LiCor) içerisinde oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edildi.

İmmünoblot, Odyssey Clx Kızılötesi görüntüleme sistemi (LiCor) kullanılarak görüntülendi ve bant yoğunluğunun veri analizi, Image Studio (LiCor) kullanılarak yapıldı.

2.5. İmmünohistokimya

Sondalama seansından üç saat sonra, aşırı dozda ketamin ile öldürülen farelere daha sonra transkardiyal olarak 50 ml soğuk 1 M PBS ile perfüze edildi.
Beyinler hemen 4°C'de %4 paraformaldehid solüsyonunda sonradan sabitlendi ve 30 mm'lik kesitlere kriyokesim yapılmadan önce en az 48- saat boyunca PBS içindeki %30 sakkaroza aktarıldı. Serbest yüzen bölümler bloke edildi ve 1 M PBS içindeki %0,1 Triton içindeki %10 keçi eşek serumu ile geçirgenleştirildi, ardından tavşan poliklonal PSD95 (1:300, Thermo Scientific) ve fare monoklonal SV2A (1:300, Thermo Scientific) ile 48- saat süreyle inkübe edildi. Santa Cruz Biyoteknoloji).

Kesitler daha sonra 1- saat süreyle ikincil antikorlar Alexa Fluor keçi anti-tavşan 568 (1:500, Invitrogen) ve Alexa Fluorgoat anti-fare 488 (1:500, Invitrogen) ile inkübe edildi. Dilimler daha sonra nükleer boya DAPI ile yıkandı (1:1000, Sigma), slaytların üzerine monte edilmiş ve Fluoromount (Thermo Scientific) ile kaplanmıştır.

Boyanma, frontal kortekste (FC), dorsal CA1 hipokampusta, entorhinal kortekste (EC) ve perirhinal kortekste (PC) ölçüldü.

Tüm dilim boyunca sinaptik noktaları tanımlamak için bir BZ-X700 Floresan Mikroskobu (Keyence) ile 40x büyütmede Z yığınlı görüntüler çekildi. Toplam PDS95 noktası, SV2A noktası ve ortak lokalize (birbirinin yanında veya üst üste binen iki nokta olarak tanımlanır) her alan için en az dört görüntüden sayıldı ve her fare için alınan sonuçların ortalaması alındı. Kolokalize %'nin miktarının belirlenmesi (örtüşen SV2A ve PSD95)/(toplam SV2A ve PSD95) noktalarının sayılmasıyla tamamlandı.

2.6. İstatistikler

Hesaplanan kalıntıların çarpıklık, basıklık ve Shapiro Wilk değeri incelenerek değerlendirilen tüm veriler normallik varsayımlarını karşıladı ve Levene istatistiği kullanılarak değerlendirilen varyans homojenliğinde herhangi bir ihlal yoktu.

Davranış testleri için, SHAM'ı TMS ile karşılaştırmak amacıyla öğrencilerin t testleri kullanıldı; gruplar içindeki yeni ve tanıdık nesnelerin araştırılması için Tekrarlanan Ölçümler İki Yönlü ANOVA kullanıldı.

İmmünohistokimya ve Western blot verileri, One-WayANOVA kullanılarak anlamlılık açısından test edildi. Tüm post-hoc ikili karşılaştırmalar için, anlamlılığı p < 0.05 olan bir Tukey düzeltmesi kullanıldı.

Varyansın homojenliği ihlal edilmişse, Welch Testi ile anlamlılık belirlendi ve ardından Games-Howell ile post-hoc düzeltildi, bu durumlar sonuçlarda not edildi. Tüm istatistikler SPSS (versiyon 22, IBM) kullanılarak yapıldı ve grafikler GraphPad (versiyon 7, Prism) kullanılarak üretildi.

For more information:1950477648nn@gmail.com