In Vitro İnsan Sindirim Simülasyonunun Türkiye Cistus Türlerinden Sulu Ekstraktların Fenolik İçerikleri ve Biyolojik Aktiviteleri Üzerine Etkisi Bölüm 2

Lütfen iletişime geçinoscar.xiao@wecistanche.comdaha fazla bilgi için

Sonuç olarak

C.salvifolius'un sulu ekstraktı, diğer türlerin ekstraktlarından daha iyi bir sindirim enzimi inhibitör aktivite sergilemiştir. Ek olarak, tüm sulu ekstraktların IN numuneleri, ND numunelerine kıyasla daha düşük enzim inhibitör aktiviteleri ortaya çıkardı.

2.4.AGEs Engelleyici Aktivite

Tablo 4'te sunulduğu gibi, tüm sulu ekstraktlarda konsantrasyona bağlı AGE inhibitör aktivitesi gözlendi. CCA, CPA ve CSA'nın ND numuneleri, hem 0.5 hem de 1mg/mL konsantrasyonlarında referans bileşik kersetin'den daha iyi inhibitör aktivite sergiledi. Bununla birlikte, ekstraktların IN örnekleri arasında sadece C.saluifolius özütü, kersetin'den daha iyi inhibe edici aktivite göstermiştir. Biyoyararlı sulu ekstrakt numuneleri, sindirilmeyen numunelere kıyasla daha düşük AGE inhibitör aktiviteleri göstermiştir. Sonuçlara göre, C.salvifolius'un sulu ekstraktının ND numunesi en yüksek AGE inhibitör aktiviteye sahipti. Ancak, C.monspeliensis sulu ekstraktının IN numunesi, test edilen konsantrasyonlarda en zayıf AGE inhibisyon potansiyelini sergiledi.

Daha fazla bilgi için lütfen buraya tıklayın

3. Tartışma

Serbest radikaller, bir elektron elde etmek için proteinlere, lipidlere veya DNA'ya saldırabilir ve çeşitli sağlık sorunlarına neden olabilir. Bu nedenle vücudun antioksidan sistemi ile oksidasyon sonucu oluşan serbest radikallerin dengelenmesi esastır. Bu dengenin bozulması durumunda oksidatif stres ortaya çıkmaktadır [29]. Oksidatif stres, kanser, diyabet, kardiyovasküler hastalıklar, Alzheimer hastalığı vb. gibi çeşitli kronik rahatsızlıklara neden olan ana faktörlerden biridir.oksitleyicidoku ve organlara zarar veren bu savunma sistemleri, aşırı alkol tüketimi, sigara, stres, kronik ilaç kullanımı, radyasyon vb. farklı durumlar nedeniyle etkinliğini kaybedebilir [30]. Çeşitli bilimsel raporlar, ikincil bitki metabolitlerinin oksidatif stresin ve zararlı etkilerinin önlenmesinde önemli bir rol oynadığını göstermiştir [13,14,31]Biyoyararlanım bu bileşiklerin biyoaktivitesini etkileyen önemli bir parametre olmasına rağmen, bu çalışmalarda dikkate alınmamıştır. çoğu çalışma. Ancak sekonder metabolitlerin gastrointestinal sistemde farklı pH koşulları, enzimatik aktivite ve vücut sıcaklığından dolayı yapısal dönüşümlere maruz kaldıkları iyi bilinmektedir. Ek olarak, ikincil metabolitlerin kimyasal özellikleri, örneğinmolekülerbitki matriksindeki makromoleküllere ağırlık, polarite ve bağlanma derecesi de biyoyararlanımlarını etkileyen önemli faktörlerdir [13]. Buna göre, bileşiklerin veya metabolitlerinin, bir kez alındıktan sonra kan dolaşımına absorpsiyonu, sistemik fizyolojik etkilerini uygulamak için esastır. In vitro sindirim simülasyon modelleri, maddelerin olası biyoyararlanım özelliklerinin değerlendirilmesi için kanıt sağlayabilir. Herhangi bir fonksiyonel özelliği iddia etmek için insan denemelerinde doğrulama gerekli olsa da, in vitro simülasyon modelleri, genellikle etik olarak tartışılabilir, kaynak yoğun, pahalı ve zaman alıcı olan in vivo çalışmalara veya insan denemelerine alternatif olarak yaygın olarak kullanılmaktadır [32].

Cistanche bağışıklığı iyileştirebilir

Birçok araştırmacı, Cistus türlerinin farklı organlarından hazırlanan ekstraktların antioksidan potansiyelini de araştırmıştır. Literatür taramasına göre, bu, bir in vitro sindirim simülasyon modeli kullanılarak fenolik maddelerin biyoyararlanımı ve antioksidan aktivite üzerindeki etkilerine ilişkin Cistus türleri üzerinde yapılan ilk çalışmadır. Karas et al. [33], polifenolik bileşenlerin yüzde 10'unun bitki matriksinde sindirilmediğini ve yüzde 90'ının mide veya bağırsak fazında sindirime maruz kaldığını (sırasıyla yaklaşık yüzde 48 ve yüzde 52) öne sürdüler. Daha önce bahsedildiği gibi, sulu ekstraktlardaki tüm fenolik miktarlar, in vitro insan sindirim simülasyon prosedüründen olumsuz etkilenmiştir. Böylece tüm ekstraktların biyoyararlı örneklerinin fenolik içeriklerinde önemli kayıplar tespit edildi. Ayrıca, IN numunelerinin toplam proantosiyanidin konsantrasyonları, tüm sulu ekstraktlarda tespit limitinin altındaydı. Çeşitli çalışmalar da sindirim prosedürünün bitki ekstraktlarındaki fenolik bileşikler ve dolayısıyla ilgili biyoaktiviteler üzerindeki olumsuz etkisini ortaya çıkarmıştır. Örneğin, Salvia virgata Jacq'ın toplam fenolik içeriğini bildirdik. önceki çalışmamızda sindirim prosedüründen de olumsuz etkilenmiştir. Ek olarak, ekstraktın ana metabolitlerinin miktarları, yani rutin ve rosmarinik asit, düşme eğilimindeydi [13]. Buna karşılık, birkaç çalışma çelişkili sonuçlar bildirmiştir. Celeb ve ark. [34], Hypericum perfoliatum L'den elde edilen metanolik ekstraktın biyoyararlı örneklerinde toplam fenolik asit, flavonoid ve fenolik miktarların artışını gözlemlediler. Aslında, ana metabolitler, quercitrin, klorojenik ve gallik asit, 100'ün üzerinde biyoerişilebilirlik oranlarına sahipti. yüzde . Bu çalışmalar, sindirim prosedürünün etkilerinin bitki materyallerine göre değişebileceğini göstermiştir. Bu farklılıkları açıklığa kavuşturmak için sindirim sisteminin fenolik maddeler üzerindeki etki mekanizmasını dikkate almak esastır. Serra et al. [35] fenolik bileşiklerin esas olarak bitki matrisindeki glikozitler, polimerler ve ester formlarında bulunduğunu ve absorpsiyondan önce sindirim sisteminde hidrolize edildiğini öne sürdüler. Gastrointestinal sistemdeki fenolik bileşiklerin yapısal dönüşümlerini çeşitli faktörler etkileyebilir. Örneğin, proantosiyanidinler veya prosiyanidinler gibi daha yüksek moleküler ağırlığa sahip bileşiklerin bağırsakta emilmeden önce hidrolize edilmesi gerekir. Bitki matriksinin yapısı da fenoliklerin biyoyararlılığında önemli bir faktördür; fenolik bileşikler, lifler, proteinler ve lipid molekülleri gibi bitki matrisindeki makromoleküllere bağlanabilir. Bu nedenle, yalnızca matristen serbest bırakılan fenolik bileşenler, gastrointestinal sistemden emilebilir hale gelebilir. Ayrıca, bağırsak mikrobiyotasının farklı pH değerleri ve enzimatik etkileri fenolik bileşiklerin kimyasal yapısındaki dönüşümü etkileyen diğer önemli faktörler arasındadır [36]. Bu veriler ışığında, benzer deneysel çalışmalardan elde edilen farklı sonuçların, sindirim sisteminin karmaşıklığından ve bitki matrisinin bileşiminden kaynaklanabileceğini varsayabiliriz. Tablo 3'te sunulduğu gibi, Cistus özütlerinin biyolojik olarak kullanılabilir örnekleri, düşük fenolik içerikleri nedeniyle sindirilmeyen ve mide sonrası emsallerine göre daha zayıf bir antioksidan aktivite sergilemiştir.

Ayrıca, her iki C. saluifolius özütü, diğer türlerle karşılaştırıldığında DPPH, CUPRAC, FRAP ve TOAC tahlillerinde daha iyi antioksidan aktivite sergilemiştir. Ayrıca, her iki C.paroiflorus özütü, diğer türlerin özütlerinden daha yüksek DMPD radikal süpürme aktivitesi göstermiştir. Tablo 1'de belirtildiği gibi, C. salviifolius'un toplam fenolik, flavonoid ve fenolik asit içeriği diğer örneklere göre daha yüksekti. Bu nedenle, C. saloiifolius ekstraktlarının daha yüksek antioksidan potansiyeli, fenolik içerikleri ile ilişkili olabilir.

Ayrıca, antioksidan potansiyellerindeki azalma, karbonhidratla ilgili enzimler üzerindeki inhibitör aktiviteler ve biyolojik olarak kullanılabilir örneklerin AGE'leri, markör flavonoid glikozitlerdeki düşüşle ilişkili olabilir. Bununla birlikte, Cistus ekstreleri, Şekil 1'de gösterildiği gibi, diğer fenolik maddeleri de içeriyordu. Bu nedenle, sindirimin biyolojik aktivite üzerindeki etkisini izlemek için ekstrelerin ayrıntılı bir kromatografik analizi gereklidir.

Bitki ekstraktlarının sindirim enzimleri üzerindeki inhibitör potansiyeli, sentetik inhibitörlerin güvenlik endişesi nedeniyle son zamanlarda daha fazla dikkat çekmiştir. Bu nedenle, bitki ekstraktlarının inhibitör etkisi çeşitli çalışmalarda belirlenmiştir ve bu etki genellikle flavonoidler, fenolik asitler, proantosiyanidinler vb. fenolik maddelerle ilişkilendirilmiştir. Sun ve ark. [37] polifenolik bileşiklerin inhibitör etkilerini hidrofobik kuvvetler ve kovalent olmayan bağlar yardımıyla yukarıda bahsedilen enzimlere bağlanarak sergilediklerini öne sürmüşlerdir. Bu nedenle polifenollerin -amilaz ve -glukosidaz enzim aktivitesinin inhibisyonu, moleküler yapıları ile ilgilidir. Bu etkileşim mekanizması, inhibisyon kinetiği, moleküler docking floresan söndürme, vb. gibi farklı teknikler kullanılarak çalışılmış olsa da, henüz kesin bir sonuca varılamamıştır [38]. Bununla birlikte, çok sayıda çalışma, bitki ekstraktlarının sindirim enzimi inhibisyonlarının doğrudan fenolik içerikleri ile ilişkili olduğunu bildirmiştir. Cistus türlerinin enzim inhibitör aktiviteleri üzerine benzer çalışmalar daha önce de rapor edilmiştir. Sayah et al. [39], C. monspeliensis ve C. saluifolius'tan elde edilen yüzde 80 metanolik ve sulu ekstrelerin -amilaz ve a-glukosidaz inhibitör aktivitelerini araştırdı. Sonuçları bu çalışma ile uyumluydu ve C. salvijfolius sulu ekstraktının daha yüksek -glukosidaz （IC50 ug/mL∶0.95±0.14） ve o gösterdiğini ortaya koydu. -amilaz（IC50 ug/mL∶217.1±0.15）önleyici aktivite, C.monspeliensis sulu ekstraktından sırasıyla （IC50 ug/mL∶14.58±1.26） ve （ICsn ug/mL:886.10±0.10). Her iki sulu ekstrenin bu enzimler üzerindeki inhibitör oranları, referans bileşik akarbozdan (ICso ug/mL:18.01±2.00) daha yüksekti. fenolik ve flavonoid miktarları. C. salvijfolius sulu ekstraktının (sırasıyla 408.43±1.09mg GAE ve 140.00±1.15 RE) hem toplam fenolik hem de toplam flavonoid içerikleri, C.monspeliensis sulu ekstraktından (261.76 ±1.9mg GAE ve 140.00±1.15 RE) daha yüksekti. 78.00±1.15 RE sırasıyla). Orhan et al. [40] ayrıca C.laurifolius'un yapraklarından elde edilen yüzde 80 sulu ve etanolik özütlerin sindirim enzimi inhibe edici potansiyellerini araştırdı. Elde ettikleri sonuçlara göre, yüzde 80 etanolik özüt (yüzde 71,7 ± 0,6) 1 mg/mL konsantrasyonda sulu özüt (yüzde 39,3 ± 2,2) ile karşılaştırıldığında güçlü bir -amilaz önleyici aktivite sergiledi. Fenolik bileşiklerin, özellikle flavonoidlerin, beta hücre apoptozunu önleyerek ve anti-diyabetik aktiviteyi destekleyerek insülin salgısını doğrudan etkilediğini öne sürdüler. Bizim sonuçlarımızla bağlantılı olan bu hipotez, C. salviifolius'un sulu ekstraktlarının ND örneğinin en yüksek toplam flavonoid ve fenolik içeriği ve en büyük o-amilaz ve o-glukosidaz inhibitör aktivitelerini uyguladığını gösterir. Tablo 4'te verildiği gibi, C. salviifolius'un sulu özütü, diğer özütlere göre sindirim enzimleri üzerinde daha iyi inhibitör aktiviteler sergilemiştir.

Ek olarak, sulu ekstraktların IN örnekleri, ND örneklerinden daha düşük fenolik ve flavonoid miktarları içeriyordu ve bu nedenle mevcut çalışmada daha düşük enzim inhibitör aktiviteleri ortaya çıkardı. Ekstraktların fenolik içerikleri sindirim prosedüründen olumsuz etkilenirken, yine de önemli sindirim enzimi inhibe edici aktivite sergilediler. Çeşitli çalışmalarda, flavonoid glikozitler, güçlü asitlerle bitki ekstraktlarının ana metabolitleri olarak rapor edilmiştir.a-amilazve -glukozidaz inhibitör potansiyelleri [41-43]Fenolik bileşiklerin sindirim enzimleri üzerindeki inhibitör mekanizması henüz ortaya çıkarılmamışken, flavonoidler, fenolik asitler, proantosiyanidinler gibi bazı fenolik bileşenler üzerinde yapı-aktivite ilişkisi çalışmaları yapılmıştır. ve tanenler Flavonoidlerle ilgili yapı-aktivite ilişkisi çalışmaları, C-halkasının C2=C3 çift bağının, bu tür bileşiklerin sindirim enzimi inhibisyon potansiyelini arttırdığını göstermiştir. Bu bağ elektron yoğunluğunu yükselttiği için flavonoid ve enzim arasındaki etkileşimin gücü artar [44]. Ek olarak, C-5 ve C-7 üzerindeki hidroksil grupları, flavonoidlerin o-amilaz inhibitör potansiyelini kolaylaştırır. Ayrıca flavonoid iskeletinin hidroksilasyonunun a-amilazlarını olumlu yönde etkilediği ve-glukozidaz enzimiengelleyici potansiyeller[45]. Daha önce belirtildiği gibi, bu çalışmadaki tüm işaretleyici flavonoidler, yukarıda açıklanan bu yapısal gereksinimleri taşıyan flavonol glikozitlerdir. Bununla birlikte, in vitro sindirim prosedüründen sonra, sulu ekstraktların biyoyararlı örneklerinde ilgili aktiviteleri önemli ölçüde azaldı.

Genel olarak, bitki ekstraktlarının AGE'ler üzerindeki inhibitör potansiyeli, fenolik içerikleri, antioksidan potansiyelleri, metal şelatlama yetenekleri, protein etkileşimleri ve AGE reseptör bloke etme aktiviteleri gibi çeşitli faktörlerle ilişkilidir[13]. Tablo 4'te sunulduğu gibi, in vitro sindirim prosedürü ekstrelerin fenolik içeriğini olumsuz etkilediğinden, sulu ekstrelerin biyoyararlı numuneleri ND numunelerine kıyasla daha düşük AGE inhibitör aktiviteleri sergilemiştir. Mevcut çalışma sonuçlarına göre, C.salvifolius'un sulu ekstraktının ND numunesi, toplam fenolik ve flavonoid içeriğinin yanı sıra en yüksek AGE inhibitör aktiviteye sahipti. Karşılaştırıldığında, C.monspeliensis'in sulu ekstraktının IN numunesi, en düşük toplam flavonoid ve fenolik içeriğine atfedilebilecek en zayıf AGE inhibisyon potansiyelini göstermiştir. Flavonoidler bitki ekstraktlarında, meyvelerde, sebzelerde ve içeceklerde yaygın bir dağılıma sahip olduğundan, flavonoidlerin AGE oluşumları üzerindeki inhibisyon potansiyeli üzerine birçok çalışma yoğunlaşmıştır. Bu çalışmada belirteç fenolikler olarak atanan aynı flavonoidler, diğer çalışmalarda da belirteç bileşikleri olarak rapor edilmiştir[46-48].

Sindirim enzimi inhibisyonuna benzer şekilde, flavonoidlerin AGE inhibitör aktiviteleri, C2=C3 çift bağı ve A ve C halkalarının hidroksilasyonu ile uyarıldı. Bununla birlikte, flavonoid iskelete şeker bağlanması, inhibitör aktivitenin azalmasına yol açar [49]. Öte yandan Cervantes-Lauren ve ark. [50] glikozitlerin flavonunun-3-diğer flavonoid glikozitlerden daha büyük bir AGE inhibisyon potansiyeline sahip olduğunu öne sürdü. Bu hipotez, biyoyararlı örneklerde azalmış AGE inhibisyonunun bir açıklaması olabilir. Örneğin, C.monspeliensis'in sulu ekstraktının biyolojik olarak kullanılabilir örneklerinde quercitrin ve hiperosid tespit edilmemiştir, bu da C.monspeliensis'in IN numunelerinin diğer türlerden ekstraktlara kıyasla daha düşük aktivitesinin nedenidir. C. saloifolius'un sulu ekstraktında quercitrin saptanmamasına rağmen, yüksek AGE inhibisyon aktivitesinin nedeni önemli ölçüde daha yüksek miktarlarda hiperosid ve salidrosit olabilir. Genel olarak, numunelerin işaretleyici flavonoid içerikleri ile bunların AGE'ler üzerindeki inhibitör potansiyelleri arasında pozitif bir korelasyon gözlendi.

4. Gereç ve Yöntemler

4.1.Kimyasallar

Deneylerde kullanılan tüm referanslar, enzimler ve kimyasallar Sigma Chemical Co.'dan (St. Louis, MO, ABD) satın alındı. Deneylerde analitik dereceli malzemeler kullanılmıştır.

4.2.Bitki Örnekleri

C.creticus ve C.saloifolius'un havadan parçaları 2018 Nisan ayının son haftasında Yeditepe Üniversitesi (Kayısdağı, İstanbul) yerleşkesinden toplanmıştır. C.mon-speliensis ve C.paroiflorus'un havadan parçaları Alaçatı Kutlu Aktaş yakınlarında toplanmıştır. Balaji, Çeşme, İzmir 2018 Mayıs ayının ikinci haftasında. C. laurifolius'un havadan parçaları Konya, Kemer-Doğanhisar yolundan 2018 Haziran ayının ilk haftasında toplanmıştır. Prof. Dr. Erdem Yeşilada bitki materyallerini doğrulamıştır. C.creticus (YEF18013), C.lauri-folios (YEF18017), C.monspeliensis(YEF18015), C.paroifforus(YEF18016) ve C.salvifolus (YEF18014) için fiş örnekleri Farmakognozi Bölümü Herbaryumunda saklandı, Eczacılık Fakültesi, Yeditepe Üniversitesi, İstanbul, Türkiye.

4.3.Çıkarma Prosedürü

Geleneksel tıpta bir hazırlama tekniği olarak yaygın olarak kullanıldığı için sulu ekstraksiyon seçilmiştir. Kabaca havayla kurutulmuş ve toz haline getirilmiş hava kısımlarıcistanchetürler (100 g) sıcak damıtılmış su (80 derece ,1.5 L) ile bir çalkalama cihazı kullanılarak 15 dakika boyunca ekstrakte edildi. Daha sonra sulu özler bir filtre kağıdından süzüldü ve düşük basınç altında kuruyana kadar buharlaştırıldı. Liyofilizasyon prosedürü tamamlandıktan sonra, ekstraktlar daha fazla işlem için distile suda çözülmüştür (sindirilmemiş numune: ND) (ekstrelerin verimi: C.creticus için yüzde 13.04, C.laurifolius için yüzde 15.7, C.monspeliensis için yüzde 12,8 ,C.parviflorus için yüzde 14.94, C.salvifolius için yüzde 14.74).

4.4.In Vitro İnsan Sindirimi Simülasyon Yöntemi

İnsan sindirim simülasyon modeli, daha önce Celeb ve diğerleri tarafından ayrıntılı olarak açıklanan yöntem takip edilerek Cistus örneklerine in vitro olarak uygulandı.[34] İlk olarak, simüle edilmiş bir mide sıvısı çözeltisi elde etmek için 500 mL distile su içinde 1g NaCl ve 1.6g pepsin çözündürüldü. (SGF). Daha sonra SGF çözeltisinin pH'ı HCl(5 M) ile 2'ye ayarlandı; bu çözeltinin 17.5 mL'si 2.5 mL bitki örnekleri ile karıştırıldı ve bu karışım 37 derecede çalkalayıcı su banyosunda 2 saat bekletildi. sindirim sisteminin peristaltik hareketlerini taklit eder. 2 saat sonra numuneler enzimatik reaksiyonları inaktive etmek için bir buz banyosuna konuldu; numunelerin 2 mL'si daha sonraki deneyler için "post-gastrik" (P) numune olarak ayrıldı. Uygun miktarda NaHC03(1 M, pH7) yüklü bir selülozik diyaliz zarı, soğuk numune çözeltilerine yerleştirildi; böylece gastrointestinal absorpsiyon taklit edilmiştir. Daha sonra 4.5 mL safra asidi/pankreatin solüsyonu solüsyonlarla birleştirildi ve karışım 2 saat daha 37 derecede inkübe edildi. Son olarak, diyaliz zarının içindeki sıvı "biyoyararlı" numune (IN) olarak elde edildi. İşlem bittikten sonra, tüm numuneler daha sonraki deneyler için -20 derecede korunmuştur. 4.5. Fenolik Profilin In Vitro Tahmini

4.5.1.Toplam Fenolik İçerik Analizi

Numunelerin toplam fenolik içeriğinin spektrofotometrik tayini, daha önce Barak ve diğerleri [32] tarafından detaylandırılan yönteme göre bir 96-kuyu plakası şablonunda gerçekleştirildi. 20 μL taze hazırlanmış numune ve referans solüsyonları. Daha sonra karışıma 100 µL Folin-Ciocalteu reaktifi eklendi. Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakikalık bir inkübasyon periyodundan sonra absorbans 690 nm'de ölçülmüştür. Gallik asit, bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için farklı konsantrasyonlarda bir referans çözelti olarak kullanıldı ve toplam fenolik içerikler, gallik asit eşdeğerleri (GAE) olarak ifade edildi.

4.5.2.Toplam Flavonoid İçerik Analizi

Numunelerin toplam flavonoid içeriğinin spektrofotometrik tayini, bir 96-kuyulu plaka şablonunda Bardakçı ve diğerleri tarafından daha önce açıklanan metoda göre yönetildi.[51];150 uL yüzde 75 etanol,10 uL alüminyum klorür ve 10 uL İM sodyum asetat trihidrat, 50 uL numune ve referans çözeltileri ile ayrı ayrı birleştirildi. Daha sonra bu karışımlar karanlık oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edildi. İnkübasyon periyodundan sonra absorbans 405 nm'de hesaplandı.kuersetinbir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için farklı konsantrasyonlarda bir referans çözelti olarak kullanıldı ve toplam flavonoid içerikleri, kuersetin eşdeğerleri (QE) olarak temsil edildi. 4.5.3.Toplam Fenolik Asit İçeriği Testi

Numunelerin toplam fenolik asit içeriği, daha önce Barak ve arkadaşları tarafından bildirilen prosedür izlenerek spektrofotometrik olarak ölçülmüştür. [52]. İlk olarak, Arnow reaktifini elde etmek için uygun miktarlarda sodyum nitrit ve sodyum molibdat damıtılmış suda çözündürüldü. Daha sonra 1 ml numune ayrı ayrı 1 mL Arnow reaktifi, 1 mL 0.1 M HCl ve 1 mL 1M NaOH ile birleştirildi. Daha sonra karışımın hacmi distile su ile 10 mL'ye ayarlandı ve hemen 490 nm'de absorbans okundu. Kalibrasyon eğrisi elde etmek için farklı konsantrasyonlarda referans solüsyon olarak kafeik asit kullanıldı ve toplam fenolik asit içeriği kafeik asit eşdeğerleri (CAE) olarak verildi.

4.5.4.Toplam Proantosiyanidin İçeriği Testi

Numunelerin toplam proantosiyanidin içeriğinin spektrofotometrik tayini, bir 96-kuyulu plaka şablonunda Barak ve ark.'nın yöntemi izlenerek gerçekleştirildi. [1]Kısacası örnek çözeltilerin 25 uL'si sırasıyla 150 uL yüzde 4 vanilin ve 75 uL HCl çözeltileri (yüzde 32) ile karıştırıldı. Karanlık oda sıcaklığında 15 dakikalık inkübasyon süresinden sonra absorbans 492 nm'ye ayarlandı. Bir kalibrasyon eğrisi elde etmek için farklı konsantrasyonlarda bir referans solüsyon olarak kateşin hidrat kullanıldı. Kontrol solüsyonu olarak metanol kullanıldı. Örneklerin toplam proantosiyanidin içeriği, kateşin eşdeğerleri (CE) olarak belirtildi.

4.6.Serbest Radikal Süpürme Aktivite Testleri 4.6.1.DPPH Radikal Scavenging Aktivite Testi

Numunelerin DPPH radikal süpürme aktivitesi, Celeb ve diğerleri[53] tarafından modifiye edilen yöntem izlenerek bir 96-kuyulu plaka şablonunda belirlendi. İlk başta, 150 uM DPPH solüsyonu taze olarak hazırlandı. Daha sonra 200 μL DPPH solüsyonu 25 μL numune solüsyonu ile karıştırıldı. Daha sonra bu karışım karanlık oda sıcaklığında 50 dakika inkübe edildi. Absorbans 540 nm'de hesaplandı. Bütillenmiş hidroksitoluen (BHT), farklı konsantrasyonlarda referans çözelti olarak kullanıldı. Kontrol solüsyonu olarak metanol kullanıldı. Numunelerin aktivitesi, yüzde 50 aktivite gösteren konsantrasyona karşılık gelen EC50 olarak sunuldu.

4.6.2.DMPD Radikal Süpürme Aktivite Testi

Örneklerin DMPD plus (N,N-dimetil-p-fenilendiamin) radikal süpürme aktivitesi, daha önce İnan ve diğerleri tarafından açıklanan yönteme göre bir 96-kuyulu plaka şablonunda gerçekleştirildi. [13]. İlk olarak, 10{{10}} mM DMPD artı solüsyon, 0.05 M FeCl; 6H2O solüsyonu ve 0.01 M asetat tamponu taze olarak hazırlandı. Daha sonra 1 mL DMPD solüsyonu, 100 mL asetat tamponu ve 0.2 mL FeCl; 6H2O çözeltisi karıştırıldı ve daha sonra 15 µL numune çözeltileri bu karışımdan 210 µL ile birleştirildi. 50 dakika karanlık oda sıcaklığında inkübasyon periyodundan sonra absorbans 492 nm'de ölçüldü. Trolox, bir kalibrasyon eğrisi elde etmek için farklı konsantrasyonlarda referans çözelti olarak kullanıldı. Örnek çözeltilerin konsantrasyonları 1 mg/mL idi. Örneklerin DMPD radikal süpürme aktiviteleri Trolox eşdeğerleri(TE) olarak belirtildi. 4.7.Metal İndirgeme Aktivite Deneyleri

4.7.1.Ferrik İndirgeyici Antioksidan Güç Testi (FRAP)

Numunelerin FRAP aktivitesinin belirlenmesi, daha önce Bardakçı ve diğerleri [54] tarafından bildirilen prosedür izlenerek 96 oyuklu bir plaka şablonunda gerçekleştirildi. Deneyin başlangıcında, asetat tamponu, ferrik-tripiridiltriazin ve FeCl karıştırılarak FRAP reaktifi oluşturuldu; 6H2O çözümleri. Bundan sonra, FRAP reaktifi 30dakika 37 derecelik fırının içine konuldu. Daha sonra 10 uL numune solüsyonu sırasıyla 30 uL distile su ve 260 µL FRAP reaktifi ile birleştirildi. 37 derecede 30 dakika inkübasyon süresinden sonra, absorbans 593 nm'ye ayarlandı. Sonuçları değerlendirmek için farklı molaritelerde demir sülfat (0.25-2 mM) çözeltisi kullanılarak standart bir eğri oluşturuldu. BHT, farklı konsantrasyonlarda referans çözelti olarak kullanıldı. Numunelerin FRAP aktiviteleri 1 g kuru ekstraktta mM FeSO4 olarak sunuldu.

4.7.2.Kuprik İndirgeyici Antioksidan Kapasite Testi (CUPRAC)

Numunelerin CUPRAC aktivitesi, Celeb ve diğerleri tarafından modifiye edilen yöntem izlenerek bir 96-kuyulu plaka şablonunda belirlendi. 【31】; 85 µL CuSO4 （10 mM）, neocuprain ve amonyum asetat çözeltileri ve 51 uL distile su 43 uL numune çözeltilerine ayrı ayrı eklendi. 50 derecede su banyosunda inkübasyon periyodunu (20 dk) takiben 450 nm'de absorbans ölçüldü. Askorbik asit, bir kalibrasyon eğrisi elde etmek için farklı konsantrasyonlarda referans çözelti olarak kullanıldı. Örneklerin CUPRAC aktiviteleri askorbik asit eşdeğerleri (AAE) olarak sunuldu. 4.8. Toplam Antioksidan Aktivite Deneyi (TOAC) Numunelerin toplam antioksidan aktivite tayini, Celeb ve ark. [55]. İlk başta, TOAC çözeltisini elde etmek için belirli bir miktarda sodyum fosfat monobazik, amonyum molibdat tetrahidrat ve sülfürik asit karıştırıldı. Daha sonra 30 μL numune solüsyonuna 300 μL TOAC solüsyonu eklendi. 95 derecede 90 dakika su banyosunda inkübasyon periyodundan sonra absorbans 690 nm'de belirlendi. Askorbik asit, bir kalibrasyon eğrisi elde etmek için farklı konsantrasyonlarda referans çözelti olarak kullanıldı. Numunelerin TOAC aktiviteleri, askorbik asit eşdeğerleri (AAE) olarak temsil edildi. 4.9.Biyoyararlanım İndeksi Tahmini

Biyoyararlanım indeksi (BAvI), İnan ve diğerleri[13] tarafından açıklanan teorik denkleme göre hesaplandı: BAVI=CIN/CND "Biyoyararlanım indeksi" (BAvI), fenoliklerin sayısının oranı olarak tanımlandı. biyoyararlı örnekte (IN) sindirilmemiş örnekte (ND) olana. 4.10. HPTLC ile Marker Flavonoidlerin Kantifikasyonu

Cistus türlerinden elde edilen sulu ekstraktların tüm simülasyon örneklerinde (ND, PG, IN) salidrosid, hiperosit ve kersitrin konsantrasyonlarının kantitatif tayini, yüksek performanslı ince tabaka kromatografisi (HPTLC) (CAMAG, Muttenz, İsviçre) ile gerçekleştirilmiştir. Güzelmeric ve ark.[16] tarafından valide edilen yöntemi takip ederek. Hiperosid, salidrosid ve kersitrin 25,50 ve 100 ug/mL konsantrasyonlarda hazırlandı ve taze hazırlanmış numune çözeltilerinin konsantrasyonları 10mg/mL'ye ayarlandı. Bu çözeltiler, normal fazlı cam destekli silika jel plakalarına (20 cm × 10 cm, Merck, Darmstadt, Almanya） belirli hacimlerde （1-5 μL standart solüsyonlar ve 5 uL numune solüsyonları） 100 μL şırıngalar kullanılarak applied uygulandı. Hamilton, Bonaduz, İsviçre） Uygulama prosedürü Linomat 5 numune aplikatörü ile gerçekleştirildi.Geliştirme işlemi Automated Development Chamber(ADC 2) ve etil asetat:diklorometan,asetik asit,formik asit:su (10:25:10) ile yapıldı. :10:10:10me) mobil faz olarak seçilmiştir.Daha sonra plakalar, daldırma cihazında (CAMAG) Doğal Ürün Reaktifi (NPR)(1g difenilborik asit 2-aminoetilesterin 200mL etil asetat) ile türetilmiştir.hiperosidve kuersitrin 260 nm'de spektrofotometrik olarak analiz edildi, salidrosid miktarı bir UV tarayıcı ile 330 nm'de ölçüldü. Standartların Rf değerleri hiperozid （≈0.35）, kuersitrin （≈0.45）, tilirosit （≈0.65） olarak belirlendi. Korelasyon katsayıları（r2） ×0.98 olarak bulundu. işaretleyici flavonoidlerin miktar tayini için.

4.11.Diyabetle İlgili Enzimler Üzerindeki İnhibitör Aktivite

4.11.1. -Glukozidaz İnhibitör Aktivitesi

Cistus türlerinin sulu ekstraktlarından elde edilen sindirilmemiş ve biyoyararlı örneklerin glukozidaz inhibitör aktiviteleri, daha önce Balan ve ark. tarafından açıklanan yöntem izlenerek incelenmiştir. [56]. İlk olarak uygun miktarlarda monosodyum fosfat ve disodyum fosfat karıştırılarak 100mM fosfat tamponu (pH7) elde edildi. o--glukosidaz enzimi, a-glukosidaz çözeltisi （0.2U/mL） elde etmek için fosfat tamponu içinde çözündürüldü. Daha sonra 170 uL fosfat tamponu, 20 μL -glukosidaz solüsyonu ve 20 uL numune solüsyonu birleştirildi ve 37 derecelik bir fırında 15 dakika inkübe edildi. Daha sonra karışıma 100 mM potasyum fosfat tamponu (pH7.0) içinde 20 μL 2.5 mM p-nitrofenil- -D-glukopiranozid solüsyonu ilave edildi ve 37°C'de başka bir inkübasyon periyodu gerçekleştirildi. 15 dakika için derece. Daha sonra reaksiyonu sonlandırmak için karışıma 80 µL 0.2 M sodyum karbonat çözeltisi eklendi. Absorbans 405 nm'de ölçüldü. Farklı konsantrasyonlarda kuersetin çözeltisi referans olarak kullanılmıştır. Sonuçlar, Cistus türlerinin sulu ekstraktlarının ND ve IN numunelerinin 1 mg/mL ve 0.5 mg/mL konsantrasyonlarındaki inhibitör aktivite yüzdesi olarak tahmin edildi. 4.11.2. -Amilaz İnhibitör Aktivitesi Cistus türlerinin sulu ekstraktlarından elde edilen sindirilmemiş ve biyoyararlı numunelerin o-amilaz inhibitör aktivitesi, daha önce Balan ve arkadaşları tarafından detaylandırılan prosedür izlenerek belirlendi.[56]. Numunelerin a-amilaz inhibitör aktivitelerinin spektrofotometrik tayini, DNS (3,{42}}dinitrosalisilik asit) reaktifi kullanılarak yapıldı. Yöntemde belirtildiği gibi nişastanın dönüştürülmesinden maltoz oluşmakta ve alkali DNS'nin sarı rengi, nişastadan üretilen maltoz nedeniyle turuncu-kırmızı renge dönüşmektedir. Böylece, sodyum potasyum tartrat çözeltisi (2 M NaOH içinde çözülmüş) ve belirli bir miktarda DNS (distile suda çözülmüş) karışımından 96 mM DNS çözeltisi hazırlanmıştır. Daha sonra 6.7 mM NaCl (u-amilaz enziminin kofaktörü) ile 20 mM sodyum fosfat tamponu 20 derecede (pH:6.9) hazırlandı. a-Amilaz enzimi （1U/mL） ve nişasta（10 mg/mL） bu tampon içinde çözündürüldü. Daha sonra 50 μL sodyum fosfat tamponu ve 10 μL a-amilaz enzim solüsyonu 20 μL numune solüsyonu ile karıştırıldı. Bu karışım 37 derecede 45 dakika inkübe edildi. İnkübasyon süresinden sonra karışıma 20 µL nişasta çözeltisi ilave edildi. 37 derecede 45 dakika süreyle başka bir kuluçka dönemi başlatıldı. Aynı prosedür, "örnek arka planı" adı verilen w-amilaz enzim solüsyonu eklenmeden numunelere uygulandı. Kontrol grubu, numune solüsyonlarının yokluğunda aynı prosedürle çalışıldı. Absorbans 540 nm'de ölçüldü. Akarboz, farklı konsantrasyonlarda referans çözelti olarak kullanıldı. Sonuçlar, Cistus türlerinin sulu ekstraktlarından elde edilen ND ve IN numunelerinin 1 mg/mL ve 0.5 mg/mL konsantrasyonlarında inhibitör aktivite yüzdesi olarak sunuldu. 4.11.3.AGE İnhibitör Aktivitesi Cistus türlerinin sulu ekstraktlarından alınan sindirilmemiş ve biyoyararlı örneklerin AGE inhibitör aktivitesi Starow-icz ve ark. [57]. Herhangi bir işlemden önce 1 mg/mL ve 0,5 mg/mL konsantrasyonlarda ND ve IN numuneleri taze olarak hazırlanmıştır. Daha sonra, 1 mL ND ve IN numune çözeltilerine 1 mL 10 mg/mL konsantrasyonda sığır serum albümini (BSA) çözeltisi ilave edildi. Kontrol numuneleri ND ve IN numune çözeltileri eklenmeden hazırlandı ve boş numuneler 0,5 M glikoz eklenmeden hazırlandı. Daha sonra hazırlanan tüm numuneler, 55 derecede çalkalanan su banyosunda 40 saat süreyle inkübe edildi. İnkübasyon periyodu sona erdikten sonra, floresan yoğunluğunu hesaplamak için 370 nm eksitasyon/440 nm emisyon aralığında Thermo ScientificTM VarioskanTMLUX çok modlu mikroplaka okuyucu kullanıldı. Quercetin, farklı konsantrasyonlarda referans çözelti olarak kullanıldı.

4.12.İstatistiksel Analiz

Tüm deneyler bağımsız olarak üç farklı zamanda gerçekleştirilmiştir. Verilerin parametrik veya parametrik olmayan dağılımını belirlemek için GraphPad Prism yazılım programı (6.1 versiyonu) kullanılmıştır. TPC, TFC, TPAC, TSC, TPACC, FRAP, CUPRAC, TOAC, DPPH ve DMPD tahlillerini değerlendirmek için Tek yönlü ANOVA Tukey'nin Çoklu karşılaştırmalar analiz bölümü kullanıldı. Öte yandan, o-amilaz, -glukosidaz ve AGE inhibisyon deneylerinin sonuçları, iki yönlü ANOVA Sidak'ın çoklu karşılaştırma analizi ile incelenmiştir. Önemli sonuçlar p ile gösterildi<0.05. 5.="">

Bu çalışmada, Türkiye florasında kayıtlı tüm Cistus türlerinin sulu ekstrelerinin fenolik profilleri ve in vitro antioksidan ve antidiyabetik potansiyelleri araştırılmıştır. Geleneksel ilaçlarda kaynatma veya infüzyon yaygın olduğu için, deneysel çalışmalarda aktivite değerlendirmesi için sulu ekstraktların kullanılması özellikle önemlidir. Öte yandan, sulu ekstrakttaki hidrofilik bileşenler, yutulduğunda gastrointestinal sistemde bir dizi metabolik dönüşüme tabi tutulur. Bu nedenle geleneksel formülasyonların doğru aktivite değerlendirmesi için biyoyararlı metabolitlerin aktiviteleri de araştırılmalıdır.

Bu, in vitro insan sindirim simülasyon yönteminin Türkiye Cistus türleri üzerindeki sonuçlarını inceleyen ilk çalışmadır. Ayrıca Türkiye'deki Cistus türlerinin AGE'ler üzerindeki inhibisyon potansiyeli ilk kez bu çalışmada incelenmiştir. Ayrıca salidrosid, hiperosid ve kuersitrin belirteç olarak atanmıştır.flavonoidlerve konsantrasyonlarındaki değişiklikler in vitro sindirim prosedüründe izlendi. Ekstraktların fenolik içerikleri ve antidiyabetik ve antioksidan aktiviteleri gastrointestinal sindirim prosedürlerinden olumsuz etkilenirken, yine de önemli biyoaktivite sergilediler. Sonuçlara göre C.saloifolius özütü fenolik içerik ve antioksidan ve anti-diyabetik aktiviteler açısından en güçlü bitki olarak tespit edilmiştir. Sonuç olarak, Türkiye Cistus türlerinin toprak üstü kısımları zengin fenolik içeriklere ve potansiyel antioksidan ve anti-diyabetik aktivitelere sahiptir. Biyoyararlanımı değerlendirmek için in vitro sindirim simülasyon yöntemi kullanılmış olsa da, organizmada meydana gelen metabolik yolları tam olarak taklit etmeyebilir. Bu nedenle, fenolik bileşiklerin biyoyararlanımını ve bunların rapor edilen farmakolojik etkilere katkısını ayrıntılı olarak değerlendirmek için daha fazla in vivo ve klinik çalışmalara ihtiyaç vardır.

Bu makale Molecules 2021, 26, 5322'den alınmıştır.