İletişim: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com

Chien-Liang Chao , Hsin-Wen Huang , Hui-Chi Huang , Hsin-Fan Chao , Shuen-Wen Yu , Muh-Hwan Su , Chao-Jih Wang ve Hang-Ching Lin

Soyut

Cistanche tübüloza sulu ekstrakt(CTE), Çin'de bunama tedavisi için botanik reçeteli ilaç olarak zaten kullanılmaktadır. Önceki çalışmalarımız, CTE'nin feniletanoid glikozitlerinin (Cistanche tübüloza sulu ekstrakt), amiloid peptit (A) agregasyonunu ve birikimini inhibe ederek anti-Alzheimer hastalığı (AD) aktivitesine sahiptir. Ancak, tüm analiz sonuçları feniletanoid glikozitlerin biyoyararlanımının son derece düşük olduğunu gösterdiğinden, son çalışmalar feniletanoid glikozitlerin bağırsak bakterileri tarafından metabolize edilebileceğini düşündü. Bu çalışmada, demir şelasyonunun A agregasyonu ve biriktirme inhibisyonu mekanizmasında nasıl önemli bir rol oynadığını gösteriyoruz.feniletanoid glikozitlerCTE'nin(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt). Ek olarak, feniletanoid glikozitlerin (1-3) beyne ulaşabileceğini de kanıtladık. aktif CTE(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)bileşen ve eylem mekanizması teyidi, gelecekte ürün kalite kontrolü ve biyoyararlanım çalışmaları için çok yardımcı olacaktır. Aynı zamanda, kimyasal parmak izi ve farmakokinetik araştırmalar için bitkilerde, gıdalarda, kanda ve dokularda feniletanoid glikozitlerin (1-3) belirlenmesinde faydalı yeni bir analiz yöntemi sunuyoruz.

Anahtar Kelimeler: Cistanche tubulosa; feniletanoid glikozitler; Alzheimer hastalığı; demir şelasyonu

Cistanche tübüloza

1. Giriş

Demans en sık görülen kronik yaşlanma hastalıklarından biridir. 2015 yılında Dünya Alzheimer Raporu, yaklaşık 46,8 milyon demanstan muzdarip olduğunu tahmin ediyor ve bu sayının 2030'da 74,7 milyon ve 2050'de 131,5 milyon olması bekleniyor [1]. Küresel demans nüfusu yıldan yıla artacak ve gelecekte kontrolden çıkacaktır. Demans tedavisi için küresel sağlık harcamaları 2010 yılında yaklaşık 604 milyar ABD dolarıydı ve bu miktarın 2030'da 1000 milyar olması bekleniyor [2]. Demans hastalarının kaza sonucu ölüm riski daha yüksektir [3] ve bu nedenle daha fazla tıbbi bakım gerektirir. Bu, demans hastası ailesel bakıcılar için ağır bir yüktür. Demansın bakıcılar, aile ve toplum üzerindeki etkisi büyük fiziksel, psikolojik, yaşamsal ve ekonomik stres yaratabilir. Demansın iki ana formu vardır, Alzheimer hastalığı (AH) ve vasküler demans [4,5]. AD en yaygın demanstır ve geri dönüşü olmayan ve ilerleyici bir nörodejeneratif bozukluktur [4-6]. AD, 2015 yılında Amerika Birleşik Devletleri'nde altıncı önde gelen ölüm nedeniydi [6].

Son çalışmalar, amiloid peptit (A) (plaklar) ve protein tau (yumaklar) agregasyonunun neden olduğu nöron toksisitesinin AD patogenezi ile yakından ilişkili olduğunu desteklemektedir. A ve protein tau'nun beyinde birikmesi nöron hasarına ve hafıza kaybına neden olabilir [7]. Çözünmeyen A oligomerleri hücre dışı plaklarda toplanır ve sinaptik fonksiyon bozukluğuna, nöron toksisitesine ve hücre ölümüne yol açtığı bildirilmiştir [8]. Ne yazık ki, şimdiye kadar A ve protein tau'yu temizlemek veya A'nın oluşumunu veya oligomerizasyonunu engellemek ve geri dönüşü olmayan nöron hasarını askıya almak veya iyileştirmek için mevcut etkili bir tedavi yoktur. Asetilkolinesteraz inhibitörleri olan galantamin ve donepezil gibi mevcut terapötik ajanlar, nörotransmiter seviyesini yükselterek hafıza kaybını yalnızca geçici olarak iyileştirebilir. 2012'de, büyük AD hasta klinik çalışmalarında hiçbir aday ilaç A etkisini azaltamadı [9]. Bu nedenle, Alzheimer hastalığının prevalansını bastırmak için yeni bir tedavi için araştırmalara acilen ihtiyaç vardır. Metal iyonları, yakın zamanda A agregasyonu ile yakından ilişkili kilit bir faktör olarak kabul edildi [10]. Potansiyel kurşun bileşikleri olarak kabul edilen metal şelatörler, anti-AD yaklaşımı için tamamen yeni bir strateji sağlar [9,11-15].

Cistanche tubulosa'nın (Schrenk) R. Wight, Rou Cong Rong'un kurutulmuş sapı, Çin'in Sincan çölünde yaygın olarak hasat edilir. Çin Farmakopesi'nde indekslenen ve binlerce yıldır fiziksel zayıflık, böbrek yetmezliği, kısırlık, unutkanlık, iktidarsızlık ve yaşlılık kabızlığının tedavisinde kullanılan tonik Çin tıbbına ait önemli bir geleneksel Çin tıbbıdır [16,17].Cistanche tubulosa sulu özü(CTE) kapsülleri, Çin'de vasküler demans için botanik bir ilaç olarak onaylanmıştır. Hafif ila orta derecede AD teşhisi konan 18 hastanın klinik çalışmasına göre, CTE(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)kapsüller, hastalara asetilkolinesteraz inhibitörlerine kıyasla daha stabil bir hafıza durumu verdi [18]. Daha önceki çalışmamızda, CTE(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)Alzheimer hastalığı benzeri sıçanlarda Amiloid peptit (A) birikimini azalttı ve hafıza kaybını iyileştirdi [19]. Feniletanoid glikozitler, ekinakozit (1), akteozit (2) ve izo-akteozit (3), CTE'nin ana bileşenleri olarak kabul edilir.(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)[20]. Bileşik 1, 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP) [21], 1-metilin toksisitesine karşı nöroprotektif aktiviteye sahiptir. -4-fenil piridinyum iyonu (MPP artı ) [22] ve 6-Hidroksidopamin (6-OHDA) [23]. Önceki raporumuz, in vitro bir çalışmada 1'in A oligomerizasyonunu ve toksisitesini baskıladığını ve A birikimini inhibe ederek, A ile indüklenen sıçanlarda bozulmuş hafızayı ve bilişsel işlev bozukluğunu iyileştirdiğini gösterdi [24]. Bileşik 2 ve 3, in vitro olarak A bozunmasını arttırdı ve A oligomerizasyonunu azalttı [25]. Bileşik 3, A ile indüklenen sıçanlarda A birikimini azalttı [25]. Bu çalışmalara dayanarak, C. tubulosa, AD'yi tedavi etme potansiyeline sahip olduğunu zaten kanıtlamıştır. CTE(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)anti-A agregasyonu ve birikimi ile yakından ilişkilidir [24,25]. CTE'yi daha iyi anlamak için(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)mekanizma, aktif bileşenin yanı sıra beyin dokusu örneklerindeki içeriği tanımlamak için uygun ve verimli bir yönteme ihtiyacımız var. Çoğu çalışma, bitkilerde veya gıdalarda yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) [26-28] ile ekinakozit, akteosit ve izo-akteositin nicel tayini için tasarlanmıştır, ancak sadece iki çalışma serum veya dokularda tayin için yapılmıştır [29, 30]. Ancak, KTE sonrası beyin dokularında 1-3'ün eş zamanlı analizine ilişkin bir rapor bulunmamaktadır.(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)oral uygulama. Ek olarak, son çalışmalardan CTE'nin olup olmadığı hala belirsizdir.(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)aktif bileşenler veya bunların metabolitleri kan-beyin bariyerini başarıyla geçti ve beyin nöronları üzerinde etkili oldu. Bu nedenle, bu araştırma, CTE'nin altında yatan mekanizmayı açıkça gösteren ikna edici kanıtlarla gelişmiş ve hassas bir yöntem sunmaktadır.(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)A toplama ve biriktirme karşı.

Cistanche tübüloza sulu ekstrakt

2. Sonuçlar

2.1. Üç Ana Bileşiğin İzolasyonu ve Tanımlanması (1-3)

Kurutulmuş C. tubulosa gövdeleri, oda sıcaklığında yüzde 75 EtOH ile özümlendi. Yoğunlaştırılmış yüzde 75 EtOH özütü reçine ve C18 kolon kromatografisine tabi tutularak üç ana bileşik, ekinakozit (1), ateozit (2) ve izo-akteozit (3) elde edildi. Yapıları, NMR (Nükleer Manyetik Rezonans) spektroskopisi ve ESI-MS (Elektrosprey iyonizasyon kütlesi) analizi ve literatür verileriyle [31–33] (Şekil 1, Ek Malzemeler Şekiller S3–S11) karşılaştırılarak aydınlatıldı.

2.2. CTE'den Feniletanoid Glikozitler (1–3) İçerik Testi(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)

Tahlil yöntemi, feniletanoid glikozitler analizi için doğrulandı. Bileşikler 1-3 (5.{3}} mg) doğru bir şekilde tartıldı ve yüzde 50 metanol (40 mL) ile karıştırıldı. Karışımlar 5 dakika sonike edildi. Üç feniletanoid glikozit (1–3) standart solüsyonu, standart stok solüsyonu (100 µg/mL) olarak karıştırıldı. Standart stok solüsyonu, seri hacimlerde yüzde 50 metanol ile seyreltilerek belirtilen solüsyonların sırasıyla beş farklı konsantrasyonunu (5,10, 25, 50 ve 100 ug/mL) hazırlamak için kullanıldı. Feniletanoid glikozitler (1–3) eğrileri, 5-100 µg/mL'den ultra performanslı sıvı kromatografisi (UPLC) kullanılarak oluşturulmuştur ve sırasıyla doğrusaldır (1, r2=0.9999; 2, r{{25} }.9999; 3, r2=0.9998). Gün içi ve günler arası kesinlik [yüzde RSD (göreceli standart sapma) yüzde 0.1 ila 1.8 arasındaydı] ve doğruluk (yüzde 95,6-104.2) UPLC tarafından 1-3 için kabul edilebilirdi. UPLC, CTE'nin 1, 2 ve 3'ünü nicelleştirdi(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)içerikler sırasıyla 254, 38 ve 41 mg/g olacak (Şekil S2)

2.3. UPLC/MS/MS Doğrulaması

Feniletanoid glikozitler (1-3) karıştırıldı ve sıçan beyin dokusu homojenatı ile eklendi ve katı faz ekstraksiyonu ile Ultra performanslı sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi (UPLC/MS/MS) kullanılarak analiz edildi. 1-3'ün alt saptama sınırı (LLOQ) 0,2 ng/mL idi. Feniletanoid glikozitlerin geri kazanımı beyin dokusu homojenatı (10 ng/mL) ile sırasıyla yüzde 1 için yüzde 91,39, 2 için yüzde 89,54 ve 3 için yüzde 96,81'de yükseldi (Şekil 2).

2.4. AD-Benzeri Sıçan Beyin Dokularının Analizi

14 günlük CTE'den sonra(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)oral uygulama (200 mg/kg/gün), AD benzeri sıçan beyin dokuları toplandı ve hipokampus ve striatum olmak üzere iki kısma ayrıldı ve her ikisi de homojenleştirildi [19]. Her bir sıçandan alınan hipokampus ve striatum homojenatları, katı faz ekstraksiyonuna yüklenemeyecek ve aşırı deneysel hatalardan kaçınmak için çok yetersiz olduğundan, dört ayrı sıçandan alınan hipokampus ve striatum homojenatları, UPLC/MS/MS için analiz edilen bir numuneye karıştırıldı. katı faz ekstraksiyon yöntemi (Şekil 3A, B). Feniletanoid glikozitler (1-3) hipokampusta (Şekil 3A) ve striatumda (Şekil 3B) gözlendi. Boş beyin dokularında önemli bir tepe noktası yoktu (Şekil 3C). Hipokampusta ekinakozit içeriği 11.97 ± {{20}}.34 ng/mL, asteosit içeriği 1.25 ± 0.16 ng/mL ve izoakteosit içeriği 1.38 ± 0.08 ng/ idi. ml. Stripatumda ekinakozit içeriği 22.60 ± 1.69 ng/mL, asteosit içeriği 2.03 ± 0.61 ng/mL ve izoakteosit içeriği 4.90 ± 0.64 ng/mL idi. Şekil 4'te gösterildiği gibi, CTE(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)hipokampus ve striatumdaki 1-3'lük anlamlı saptanabilir miktarlara göre kan-beyin bariyerinden geçecektir. 1'in içeriği CTE'de 2 ve 3'ten çok daha yüksektir(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)UPLC analizi ile (Şekil S2). Bu nedenle, oral CTE'den sonra beyin dokusunda 1'in en yüksek olduğunu gözlemlemek mantıklıdır.(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)yönetim. Moleküller 2019, 24, x ARKADAŞ DEĞERLENDİRMESİ İÇİN 4 12 2.4. 14 günlük CTE'den Sonra AD-Benzeri Sıçan Beyin Dokularının Analizi(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)oral uygulama (200 mg/kg/gün), AD benzeri sıçan beyin dokuları toplandı ve hipokampus ve striatum olmak üzere iki kısma ayrıldı ve her ikisi de homojenleştirildi [19]. Her bir sıçandan alınan hipokampus ve striatum homojenatları, katı faz ekstraksiyonuna yüklenemeyecek ve aşırı deneysel hatalardan kaçınmak için çok yetersiz olduğundan, dört ayrı sıçandan alınan hipokampus ve striatum homojenatları, UPLC/MS/MS için analiz edilen bir numuneye karıştırıldı. katı faz ekstraksiyon yöntemi (Şekil 3A, B). Feniletanoid glikozitler (1-3) hipokampusta (Şekil 3A) ve striatumda (Şekil 3B) gözlendi. Boş beyin dokularında önemli bir tepe noktası yoktu (Şekil 3C). Hipokampusta ekinakozit içeriği 11.97 ± {{20}}.34 ng/mL, asteosit içeriği 1.25 ± 0.16 ng/mL ve izoakteosit içeriği 1.38 ± 0.08 ng/ idi. ml. Stripatumda ekinakozit içeriği 22.60 ± 1.69 ng/mL, asteosit içeriği 2.03 ± 0.61 ng/mL ve izoakteosit içeriği 4.90 ± 0.64 ng/mL idi. Şekil 4'te gösterildiği gibi, CTE(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)hipokampus ve striatumdaki 1-3'lük anlamlı saptanabilir miktarlara göre kan-beyin bariyerinden geçecektir. 1'in içeriği CTE'de 2 ve 3'ten çok daha yüksektir(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)UPLC analizi ile. Bu nedenle, oral CTE'den sonra beyin dokusunda 1'in en yüksek olduğunu gözlemlemek mantıklıdır.(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)yönetici.

2.5. Feniletanoid Glikozitler (1–3) Metal Şelatlama Aktivitesi

Literatürde, serbest bileşiklerin ve bunların metal komplekslerinin tayini HPLC [34,35] kullanılarak yapılmıştır. Bu çalışmada şelasyon aktivitesinin ölçüsü UPLC ile analiz edilmiştir. Her bir feniletanoid glikozitin (1-3) 50 µg/mL solüsyonları, 10 µg/mL bakır (Cu), kalsiyum (Ca), magnezyum (Mg), çinko (Zn), demir (Fe) veya sırasıyla sıçan serumu. Her bir metal solüsyonu veya serumu içeren her bileşik, UPLC ile analiz edildi. Feniletanoid glikozitler (1-3), demir ve serum ile metal şelatlama aktivitesi sergiledi (Şekil 5, Ek Malzemeler Şekil S1). Moleküller 2019, 24, x Akran İncelemesi İÇİN CTE'den sonra AD benzeri sıçanlardan alınan 12 numuneden 5'i(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)oral uygulama (200 mg/kg, po) [1 (tR= 4.19 dk), 2 (tR= 5.13 dk) ve 3 (tR= 5.68 dk)] . (c) Boş beyin dokusu. Şekil 4. Feniletanoid glikozitler (1-3), UPLC/MS/MS kullanılarak sıçan beyin dokularında [19] saptanabilirdi. Temsil edilen veriler, her grup için ortalama ± SD, n=3. 2.5. Feniletanoid Glikozitler (1-3) Metal Şelatlama Aktivitesi. Literatürde, serbest bileşiklerin ve bunların metal komplekslerinin tayini HPLC [34,35] kullanılarak yapılmıştır. Bu çalışmada şelasyon aktivitesinin ölçüsü UPLC ile analiz edilmiştir. Her bir feniletanoid glikozitin (1-3) 50 ug/mL solüsyonu, 10 ug/mL bakır (Cu), kalsiyum (Ca), magnezyum (Mg), çinko (Zn), demir (Fe) veya sırasıyla sıçan serumu. Her bir metal solüsyonu veya serumu içeren her bileşik, UPLC ile analiz edildi. Feniletanoid glikozitler (1–3)

2.6. Sıçan Serumunda Ekinakozit (1) Analizi in Vivo

Sıçan serumunda ekinakozid dağılımını anlamak için, ekinakozid (1) oral uygulamadan (100 mg/kg) sonraki ilk zamandan 720 dakikaya kadar serum, ekinakozid uygulamasından ilk andan 720 dakika sonrasına kadar serum toplanmıştır. (1) oral uygulama (100 mg/kg) ve UPLC ile analiz edildi. Şekil 6, sıçan serumunda ekinakozitin zamana karşı konsantrasyon profillerini gösterdi.

3. Tartışma

Demans, özellikle AD, bir Gordian düğümüne yol açan geri dönüşü olmayan yaşlanma ve kronik bir hastalıktır. Bu aşılmaz hastalık, büyük ve artan bir mali yük ile ciddi ekonomik sorunlara yol açmaktadır. Dünya çapında, AD araştırmacıları yeni AD karşıtı ilaçları araştırmak için çok çaba sarf ediyor, ancak 2012'de A'yı hedef alan birkaç büyük klinik çalışmada başarısız oldu [9]. A'yı doğrudan hedefleme dışında, beyindeki metal iyon dengesi, AD oluşumuna yol açan A agregasyonu ve birikimi ile ilgili temel neden olarak kabul edilir [9,10]. Bu nedenle metal iyonları AD'nin patogenezinde önemli bir rol oynar ve metal şelasyon hipotezi önemli bir araştırma yönü haline gelmiştir [9,13-15].

Daha önceki çalışmalarımıza göre [18,19,24,25], CTE(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)potansiyel anti-demans aktivitesi gösterdi. İnsan klinik çalışmalarında bile, CTE ile 1 yıllık tedaviden sonra(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)orta dereceli AD hastaları için kapsüller, Alzheimer Hastalığı Değerlendirme Ölçeği-bilişsel alt ölçek (ADAS-cog) skoru tedavi öncesine göre önemli bir bozulma göstermez [18]. CTE(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)AD hastalarının ADAS-cog skorunu sabit tuttu, ancak diğer reçeteli ilaçlar tutmadı. AD tedavisi için ruhsatlandırılmış reçeteli ilaçların tek seçeneği, donepezil ve galantamin gibi kısa vadede AD semptomlarını iyileştiren asetilkolinesteraz inhibitörleridir (AChEI'ler), ancak 1 yıllık tedaviden sonra bozulma meydana gelir [36]. Klinik çalışmalara dayanarak, CTE(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)anti-AD ajan gelişimi için potansiyel bir tedavi olma fırsatına sahiptir. Önceki raporlarımıza dayanarak [24,25], ekinakozit (1), ateozit (2) ve izo-akteozit (3), nöronları A tarafından hasar görmekten koruyacak, in vitro A oligomerizasyonunu azaltacak ve A tarafından indüklenen bilişsel işlev bozukluğunu önemli ölçüde iyileştirecektir. canlılarda. In vitro çalışma 1-3'lük aktif dozların 50 ug/mL'ye kadar olduğunu göstermiştir [24,25]. Ancak önceki çalışmalar, sıçanlarda 1 ve 2'nin oral biyoyararlanımının çok düşük (1 için yüzde 0.83 ve 2 için yüzde 0.12) olduğunu düşündü [29,30]. Bileşik 1, oral ekinezya tableti uygulamasından sonra insan serumunda bile tanımlanamadı [37]. Mevcut çalışmalar, 1-3'ün bağırsak hücrelerinde zayıf membran geçirgenliğine ve absorpsiyona sahip olduğunu [38] ve 1'in çoğunun gastrointestinal kanallarda metabolize olacağını [39] göstermektedir. Sıçan serumundaki Bileşik 2 içeriği, 10 mg/kg asteozid dozu ile 15 dakikalık intravenöz enjeksiyondan sonra sadece yaklaşık 4.5 ug/mL olmuştur [30]. Bununla birlikte, bu çalışma, CTE'den sonra sıçan beyin dokularının hipokampusunda ve striatumunda 1-3'ün tespit edileceğini göstermektedir.(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)oral uygulama (Şekil 3 ve 4). Ek olarak, Şekil 6, sıçan serumundaki bileşik 1 içeriğinin, bileşik 1 oral uygulamadan (100 mg/kg) sonra 15 dakikadan 720 dakikaya yaklaşık 5 kat arttığını gösterdi. CTE'nin feniletanoid glikozitlerini düşündük(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)kan-beyin bariyerini geçecek ve CTE arasında şelasyon eylemi olacaktır.(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)ve metal. Şelasyon, tersinir bir kimyasal reaksiyondur. Demir, serum ve beyindeki temel elementtir [10,40]. Şekil 5, üç feniletanoid glikozitin, demir ve serum ile metal şelatlama aktivitesine sahip olacağını göstermektedir. Demir ve serum, üç feniletanoid glikozitin tepe tutma süresi alanını açıkça değiştirir. Demir şelasyonu, feniletanoid glikozitlerin çok düşük biyoyararlanımının yanlış tanımlanmasına yol açan çok önemli bir neden olabilir. Bu nedenle, üç CTE'nin kan serumu ve beyin analizinde metal şelatlama aktivitesi dikkate alınmalıdır.(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt)gerçek biyoyararlanımı ve farmakokinetiği geri kazanmak için feniletanoid glikozitler. Ek olarak, sonuçlar üç feniletanoid glikozitin (1-3) kan-beyin bariyerinden geçeceğini ve vücut dolaşımı yoluyla beyin dokularına ulaşacağını gösterdi. Bu çalışma, UPLC/MS/MS kullanılarak 1-3 analizi için en hızlı ve hassas bir yöntem geliştirdi ve feniletanoid glikozitlerin (1-3) CTE'nin başlıca biyoaktif bileşenleri olduğunu kanıtlamak için güçlü kanıtlar sağladı.(Cistanche tübüloza sulu ekstrakt).

Cistanche tubulosa özü

4. Malzemeler ve Yöntemler

4.1. Bitki Malzemesi

C. tubulosa'nın gövdeleri, Mayıs 2016'da Çin'in Hangzhou kentinden toplanmıştır. Bitki, Dr. Lin HC Fiş numuneleri (No. 20016CT) tarafından tanımlandı ve Sinphar Tian-LiPharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, Çin'de saklandı.

4.2. İzolasyon ve Arıtma

Kurutulmuş C. tubulosa sapı toz haline getirildi ve ardından beş kez yüzde 75 EtOH ile özü çıkarıldı. Çözücünün düşük basınç altında buharlaştırılmasından sonra, ham özüt, H2O/EtOH gradyan çözücü sistemleri ile Macroporousresin AB-8 kolon kromatografisine tabi tutuldu. yüzde 20 EtOH'den yüzde 100 EtOH'ye kadar. İnce tabaka kromatografisine göre, daha fazla ayırma için dört fraksiyon (Fr.1~Fr.4) toplandı. Fr. 2, mobil faz sistemi olarak yüzde 18 asetonitril kullanılarak bir COSMOSIL® 5C18-AR-II kolonu (250 mm x 20 mm id, 5 um) üzerinde hazırlayıcı yüksek performanslı sıvı kromatografisine (HPLC) tabi tutuldu. Arkadaş hızı 15 mL/dk idi. Üç ana ilgi tepe noktası seçici olarak toplandı. Hedeflenen bileşikleri içeren fraksiyonlar ayrıca kuruyana kadar yoğunlaştırıldı ve sırasıyla 1, 2 ve 3 üretildi.

4.3. Deneysel Analiz

1H ve 13C NMR spektrumları, dahili standart olarak tetrametilsilan (TMS) ile Bruker Avance DRX 500 MHz spektrometreleri (Billerica, MA, ABD) kullanılarak elde edildi. Preparatif HPLC, bir Shimadzu LC-6AD serisi üzerinde bir ters faz kolonu (Cosmosil C18-AR-II kolonu, 250 mm x 20 mm id; NacalaiTesque, Inc., Kyoto, Japonya) kullanılarak yapıldı. Prominence HPLC UV-Visdedektörlü aparat (Kyoto, Japonya).

Ekinakozit (1):Beyaz toz; ESI−MS m/z: 785 [M − H]−; 1H NMR (CD3OD, 500 MHz):δ 1.07 (1H, d, J=6.2 Hz, Rha-H{{10} }), 2.79 (2H, t, J=5.2 Hz, H-7), 3.56 (1H, m, Ha{{20}}), 3.79 (1H, m, H-30 ),3.91 (1H, m, Hb-8), 4.29 (1H, d, J=7.7, Glc-H-1), 4.38 (1H, d, J=7.9 Hz, H-10 ), 5.00 (1H, t, J=9.6 Hz, H-40 ), 5.17(1H, d, J=1.5 Hz, Rha-H-1), 6.27 (1H, d, J=15.9 Hz, H-800 ), 6.58 (1H, dd, J=8.1,2.0 Hz,H-6), 6.67 (1H, d, J=8.1 Hz, H-5), 6.70 (1H, d, J=2.0 Hz, H-2), 6.77 (1H, d, J=8.2 Hz, H{ {86}} ), 6.94 (1H,dd, J=8.3, 2.0 Hz, H-600 ), 7.05 (1H, d, J=2.0 Hz, H{ {100}}), δ 7.59 (1H, d, J=15.9 Hz, H-700); 13C-NMR(CD3OD, 125 MHz): δ 18.5 (Rha-C-6), 36.6 (C-7), 62.6 (Glc-C-6), 69.4 (C{{ 124}} ), 70.5 (C-40 ), 70.6 (Rha-C-5),71.5 (Glc-C-4), 72.0 (Rha-C-3) , 72.3 (C-8), 72.4 (Rha-C-2), 73.8 (Rha-C-4), 74.7 (C-50 ), 75.1 (Glc-C -2),76.1 (C-20 ), 77.8 (Glc-C-5), 77.9 (Glc-C-3), 81.7 (C-30 ) , 103.1 (Rha-C-1), 104.2 (C-10 ), 104.7 (Glc-C-1),114.7 (C-200 ), 115.3 (C{{ 188}} ), 116.3 (C-500 ), 116.5 (C-2), 117.1 (C-5), 121.3 (C-6), 123.3 (C{{ 203}} ), 127.6 (C-100 ),131.5 (C-1), 144.7 (C-3), 146.1 (C-4), 146.9 (C{{ 218}} ), 148.2 (C-700 ), 149.8 (C-300 ), 168.5 (C-900 ) (Şekil S3–S5)

Acteoside (2):Beyaz toz; ESI−MS m/z: 623 [M − H]−; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 0.94(3H, d, J =5.9 Hz, H{{1{{ 156}}}} ), 2.68 (2H, m, Y-7), 4.33 (1H, d, J=7.8 Hz, H{{20}} ), 4.70 (1H, t, J=9.0 Hz, H-400 ),5.01 (1H, s, H-1000 ), 6.18 (1H, d, J=15 .9 Hz, H-80 ), 6.48 (1H, dd, J=7.9, 1.4 Hz, H-6), 6.62 (1H, d, J=7 .1Hz, H-5), 6.73 (1H, d, J=2.0 Hz, H-2), 6.75 (1H, d, J=7.9 Hz , H-50 ), 6.97 (1H, d, J=8.1 Hz, H-60 ),7.01 (1H, s, H-20 ), 7.44 (1H , d, J=15.8 Hz, H-70); 13C NMR: (DMSO-d6, 125 MHz): δ 18.2 (C-6000), 35.1(C-7), 60.8 (C-600), 68.8 (C{{94} } ), 69.2 (C-400 ), 70.3 (C-3000 ), 70.3 (C-8), 70.4 (C-2000 ), 70.6 (C{{109} } ), 71.7 (C-500 ),74.5 (C-200 ), 79.2 (C-300 ), 101.3 (C-1000 ), 102.3 (C{{124} } ), 113.6 (C-80 ), 114.7 (C-20 ), 115.5 (C-5), 115.8 (C-50 ),116.3 (C{{139} }), 119.6 (C-6), 121.5 (C-60 ), 125.6 (C-10 ), 129.2 (C-1), 143.6 (C{{154} }), 145.0 (C-3), 145.0 (C-30 ), 145.6(C-70 ), 148,5 (C-40 ), 165,7 (C{{169} } ) (Şekil S6–S8).

İzo-acteoside (3):Beyaz toz; ESI−MS m/z: 623 [M − H]−; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz):δ 1.07 (3H, d, J=6.1 Hz, H{{10} } ), 2.65 (2H, m, H-7), 4.35 (1H, d, J=10.0 Hz, H-100 ), 5.10 (1H, s, H{{ 24}} ),6.27 (1H, d, J=15.9 Hz, H-80 ), 6.45 (1H, dd, J=8.0, 1.8 Hz, H{{ 38}}), 6.58 (1H, d, J=8.8 Hz, H-5), 6.73(1H, d, J=1.6 Hz, H{{50} }), 6.74 (1H, d, J=8.1 Hz, H-50 ), 6.94 (1H, d, J=8.2 Hz, H-60 ) , 7.04 (1H, s, H-20),7.46 (1H, d, J=15.8 Hz, H-70); 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): δ 17.9 (C-6000), 35.2 (C-7), 63.5 (C-600),68.2 (C-5000 ), 70.4 (C-400 ), 70.6 (C-3000 ), 71.7 (C-8), 72.1 (C-2000 ), 73.7 (C-4000 ), 74.1 (C-500 ), 74.5 (C-200 ), 80.9(C-300 ), 100,7 (C-1000 ), 102.7 (C-100 ), 113.9 (C-20 ), 114.9 (C-80 ), 115.5 (C-5), 115.8 (C-50 ), 116.3 (C-2 ), 119.6(C-6), 121.5 (C-60), 125.5 (C-10), 129.2 (C-1), 143.5 (C-4 ), 145.0 (C-3), 145.3 (C-30 ), 145.6 (C-70 ), 148,5 (C-40 ),165.6 (C-90 ) (Şekil S9–S11).

4.4. Cistanche Tubulosa Sulu Ekstresinin (CTE) Hazırlanması

Cistanche tubulosa tozunun sapı, 1.5 saat su ile geri akıtılarak iki kez özümlendi ve özüt çözeltisi süzüldü. filtrelenmişCistanche tübülozasulu ekstrakt(CTE) kullanılmadan önce 4 ◦C'de saklandı.

5. Sonuçlar

Bu çalışma 1-3'ün anti-AD aktivitesi için CTE'nin aktif bileşeni olduğunu göstermiştir. Demir şelasyonu, AD tedavisi için yeni nesil ilaçlar tasarlamak için yeni konsept haline geldi [41]. CTE, demir şelasyonu ile indüklenen A agregasyonunu ve birikimini hedefleyen potansiyel bir botanik anti-AD Çin tıbbıdır. Ek olarak, 1-3'ün beyne kan-beyin bariyeri (BBB) ​​yoluyla ulaşacağını da kanıtladık. Aktif bileşenler ve CTE'nin altında yatan mekanizma doğrulaması, gelecekte kalite kontrolüne ve ürün çalışmalarının biyoyararlanımına büyük ölçüde yardımcı olacaktır. Aynı zamanda sunulan gelişmiş ve verimli analiz yöntemi, kimyasal parmak izi ve farmakokinetik araştırmalar için bitkilerde, gıdalarda, kanda ve beyin dokularında 1-3'ün belirlenmesinde faydalı olacaktır.

Referanslar

1. Wu, YT; Beiser, AS; Breteler, MMB; Fratiglioni, L.; Helmer, C.; Hendrie, HC; Honda, H.; İkram, MA; Langa, KM; Lobo, A.; et al. Demansın zaman içinde değişen prevalansı ve insidansı – güncel kanıtlar. Nat. Rev. Neurol. 2017, 13, 327-339. [Çapraz Referans]

2. Robinson, L.; Tang, E.; Taylor, JP Demans: Zamanında tanı ve erken müdahale. BMJ 2015, 350, h3029. [Çapraz Referans]

3. Mitchell, R.; Draper, B.; Harvey, L.; Brodaty, H.; Close, J. Kasıtlı kendine zarar verme sonrasında hastaneye kaldırılan demansı olan ve olmayan yaşlı insanların hayatta kalma ve özellikleri. Int. J. Geriatr. Psikolog 2017, 32, 892–900. [CrossRef] [PubMed]

4. Ott, A.; Breteler, MM; van Harskamp, ​​F.; Claus, JJ; van der Cammen, TJ; Grobbee, DE; Hofman, A. Alzheimer hastalığı ve vasküler demansın yaygınlığı: eğitimle ilişki. Rotterdam araştırması. BMJ 1995, 310, 970-973. [Çapraz Referans]

5. Kalarya, RN; Üstat, GE; Arizaga, R.; Friedland, RP; Galasko, D.; Salon, K.; Luchsinger, JA; Ogünniyi, A.; Perry, EK; Potoknik, F.; et al. Gelişmekte olan ülkelerde Alzheimer hastalığı ve vasküler demans: Prevalans, yönetim ve risk faktörleri. Lancet. Nörol. 2008, 7, 812-826. [Çapraz Referans]

6. 2018 Alzheimer hastalığı gerçekleri ve rakamları. Alzheimer Demansı. 2018, 14, 367-429. [Çapraz Referans]

7. Hardy, J.; Selkoe, DJ Alzheimer hastalığının amiloid hipotezi: Tedaviye giden yolda ilerleme ve sorunlar. Bilim 2002, 297, 353-356. [Çapraz Referans]

8. Querfurth, HW; LaFerla, FM Alzheimer hastalığı. N. İngilizce J. Med. 2010, 362, 329-344. [Çapraz Referans]

9. Ayton, S.; Lei, P.; Bush, Alzheimer hastalığında AI Metallostasis. Ücretsiz Radic. Biol. Med. 2013, 62, 76-89. [Çapraz Referans]

10. Kim, AC; Lim, S.; Kim, YK Metal iyonunun A ve Tau agregasyonuna etkileri. Int. J. Mol. bilim 2018, 19, 128. [CrossRef]

11. Robert, A.; Liu, Y.; Nguyen, M.; Meunier, B. Metal şelatörler tarafından bakır ve demir homeostazının düzenlenmesi: Alzheimer hastalığı için olası bir kemoterapi. A. Kimya Araş. 2015, 48, 1332-1339. [CrossRef] [PubMed]

12. Opare, SKA; Rauk, Alzheimer hastalığı için A. Copper(I) şelatörleri. J. Fizik Kimya B 2017, 121, 11304–11310. [CrossRef] [PubMed]

13. Santos, MA; Chand, K.; Chaves, S. Alzheimer hastalığı için potansiyel ilaçlar olarak çok işlevli metal şelatörlerde son gelişmeler. Koord. Kimya Rev. 2016, 327–328, 287–303. [Çapraz Referans]

14. D'Acunto, CW; Kaplanek, R.; Gbelçova, H.; Kacik, Z.; Briza, T.; Vasina, L.; Havlık, M.; Rum, T.; Kral, V. Alzheimer hastalığı tedavisi için Metallomics: Metal katyon bağlama ve taşıma özelliklerini birleştiren yeni nesil şelatörlerin kullanımı. Avro. J. Med. Kimya 2018, 150, 140-155. [CrossRef] [PubMed]

15. Wang, X.; Wang, X.; Guo, Z. Metal içeren teranostikler: Alzheimer hastalığıyla savaşmak için ortaya çıkan bir strateji. Koord. Kimya Rev. 2018, 362, 72–84. [Çapraz Referans]

16. Shao, ML; anne, XW; Wu, Z.; Yu, WM; Chen, XN Çin Farmakopesi; Kimyasal ve Endüstriyel Yayınevi: Beijing, China, 2005; p. 90.

17. Li, Z.; Lin, H.; Gu, L.; Gao, J.; Tzeng, C.-M. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): Geleneksel Çin Tıbbının en iyi ilaç hediyelerinden biridir. Ön. Farmakol. 2016, 7, 41. [CrossRef] [PubMed]

18. Guo, Q.; Zhou, Y.; Wang, CJ; Huang, YM; Lee, YT; Su, MH; Lu, J. Orta dereceli Alzheimer Hastalığını tedavi etmek için Cistanche tubulosa glikozit kapsülleri (rekabet (R)) üzerinde açık etiketli, plasebo kontrollü olmayan bir çalışma. Ben. J. Alzheimer Dis. Diğer Demen. 2013, 28, 363–370. [Çapraz Referans]

19. Wu, CR; Lin, HC; Su, MH Alzheimer hastalığı benzeri sıçan modelindeki davranışsal eksikliklerden Cistanche tubulosa'nın sulu özleri ile tersine çevrilmesi: Amiloid birikimi ve merkezi nörotransmitter fonksiyonu için alaka düzeyi. BMC Tamamlayıcı. Alternatif. Med. 2014, 14, 202. [CrossRef]

20. Wang, YM; Zhang, SJ; Luo, GA; Hu, YN; Hu, JP; Liu, L.; Zhu, Y.; Wang, HJ Herba Cistanchis özündeki feniletanoid glikozitlerin LC/ESI-MS/MS ile analizi. Acta Ecz. Çin. 2000, 35, 839-842.

21. Geng, XC; Tian, ​​XF; Tu, PF; Pu, XP Parkinson hastalığının fare MPTP modelinde ekinakozidin nöroprotektif etkileri. Avro. J. Pharmacol. 2007, 564, 66-74. [Çapraz Referans]

22. Zhao, Q.; Yang, X.; Cai, D.; Evet, L.; Hou, Y.; Zhang, L.; Cheng, J.; Shen, Y.; Wang, K.; Bai, Y. Ekinakozit, ROS/ATF3/CHOP yolu düzenlemesi yoluyla MPP(artı) kaynaklı nöronal apoptoza karşı korur. Nörobilim. Boğa. 2016, 32, 349-362. [CrossRef] [PubMed]

23. Wang, YH; Xuan, ZH; Tian, ​​S.; Du, GH Echinacosit, ROS üretimini azaltarak, 6-hidroksidopamin kaynaklı mitokondriyal işlev bozukluğuna ve PC12 hücrelerinde inflamatuar yanıtlara karşı koruma sağlar. Kötü. Temelli Tamamlayıcı. alternatif. Med. 2015, 2015, 189239. [CrossRef] [PubMed]

24. Shiao, YJ; Su, MH; Lin, HC; Wu, CR Echinacoside, amiloid birikimi ve toksikolojinin inhibisyonu yoluyla amiloid-beta peptitlerin neden olduğu hafıza bozukluğunu ve kolinerjik açığı iyileştirir. Gıda Fonksiyonu. 2017, 8, 2283–2294. [CrossRef] [PubMed]

25. Shiao, YJ; Su, MH; Lin, HC; Wu, CR Acteoside ve iso-acteoside, Vitro ve Vivo'da amiloid-beta peptit kaynaklı sitotoksisite, bilişsel eksiklik ve nörokimyasal rahatsızlıkları korur. Int. J. Mol. bilim 2017, 18. [ÇaprazRef]