Proantosiyanidinler Tarafından Bağırsak Koruması İnsülin Duyarlılığının, Lipid ve Glikoz Homeostazının İyileştirilmesiyle Birlikte Anti-oksidatif ve Anti-inflamatuar Eylemleri İçerir Bölüm 2

Lütfen iletişime geçinoscar.xiao@wecistanche.comdaha fazla bilgi için

Western blot kullanarak tein ifadesi. Şekil 6, Caco-2/15 hücrelerine Fe/Asc eklenmesinin iki önemli enzimin seviyesini yükselttiğini, ancak PAC'lerin Fe/Asc ile indüklenen yukarı regülasyonlarını dengelediğini göstermektedir.

İnsülin sinyali, lipogenez, FA oksidasyonu ve glukoneogenez süreçlerini modüle ettiğinden, iki ana insülin sinyal yolu olan MAPK'ler ve PI3K/Akt üzerindeki Fe/Asc ve PAC'lerin etkisini araştırmak önemliydi. Bu amaçla, Caco-2/15 hücreleri, diğer Caco{5}}/15 hücresinden önce insülin ile önceden inkübe edildi.

Şekil6. PAC'lerin Caco-2/15 hücrelerinde glukojenez üzerindeki etkileri. Proantosiyanidinler (PAC'ler, 250 ug/mL), 6 saat boyunca 37 derecede Fe/Asc （200μM/2 mM） ile muameleden önce 24 saat boyunca apikal hücre bölmesine ilave edildi. (A) G6Pase ve (B)PEPCK'nin protein ifadesi Western blot ile değerlendirildi.cistanche tozuSonuçlar, her biri üç kopya halinde 3 bağımsız deneyin ortalama ± SEM'ini temsil eder. Aynı jel üzerinde ve aynı maruziyette üç kopya halinde bir deneyi gösteren temsili bir Western blot gösterilmektedir.*P<0.05 vs="" untreated=""><0.05 vs="" fe/asc="" treated="" cells.="">cistanche köküG6Pase glikoz-6-fosfataz, PEPCK fosfoenolpiruvat karboksikinaz.

Daha fazla bilgi için lütfen buraya tıklayın

sinyal yolunu aktive etmek için tedaviler. Fe/Asc, p38-MAPK protein ekspresyonunu ve fosfo p38-MAPK/p38-MAPK oranını yükseltirken, PAC'ler bu eylemleri engelledi (Şekil 7A-C). Öte yandan, Fe/Asc fosfo Akt (pAkt) protein kütlesini ve Akt/Akt oranını düşürürken, PAC'ler normal seviyelerini koruma yeteneği gösterdi. PI3K için benzer bir eğilim kaydedilmiştir(Şekil 7D-I. Bu nedenle, bu gözlemler PAC'lerin insülin sinyalleşmesindeki olumlu rolünü desteklemektedir.

Tartışma

Polifenoller, birçok bilim adamının ve gıda endüstrisinin bu büyüleyici bitki türevli doğal ürünlere olan ilgisini açıklayan, pleiotropik biyolojik ve tıbbi etkileri ile iyi bilinmektedir. PAC'ler, kronik bozukluklar üzerindeki farmakolojik ve terapötik etkileri nedeniyle, polifenollerin çeşitliliği ve yüksek sayısı arasında öne çıkmaktadır2021. Övgüye değer özelliklerine rağmen, genişletilmiş sindirim, immünolojik, nöronal ve metagenomik ağları kullanan GI yolu üzerindeki etkileri hakkında hala bilinmeyen çok şey var2.cistanche uykusuBu nedenle, mevcut araştırmada, PAC'lerin intestinal OxS, antioksidan savunma, inflamasyon, FA oksidasyonu, lipogenez ve glukoneogenezdeki rolünü açıklığa kavuşturmak ve aynı zamanda insülin sinyali gibi altta yatan mekanizmaları aydınlatmaya çalışmak için çaba sarf edilmiştir. ve transkripsiyon faktörlerinin durumu.

PAC etkilerini araştırmak için, ağırlıklı olarak bilimsel topluluk tarafından takdir edilen ve Gıda ve İlaç İdaresi tarafından alım ve taşıma süreçleri4 için tanınan popüler bir bağırsak modeli olan Caco-2/15 hücre hattını kullandık. Caco-2/15 hücreleri yalnızca işlevsel ve morfolojik olarak insan enterositlerine benzer şekilde kendiliğinden farklılaşmakla kalmaz3,25, aynı zamanda bağırsak absorpsiyonunun ve etkileşimlerinin, beslenmenin, toksikolojinin, gıda mikrobiyolojisinin, biyoyararlanım testlerinin ve taramanın verimli bir şekilde araştırılmasına da hizmet eder. keşif programında ilaç geçirgenliği2²627. Çeşitli konularla ilgili 28-3】 önceki raporlarımızda olduğu gibi, Caco-2/15 hücre dizisi, mevcut çalışmada PAC'lerin çeşitli metabolik yolları düzenleme potansiyelini ortaya çıkarmak için etkili olmuştur. Önemli olarak, bu çalışmada, hücreler bipolar bağırsak epitelinin her iki tarafına erişime izin veren gözenekli filtrelere ekildi: sırasıyla bağırsak lümenine veya serozal dolaşıma karşılık gelen apikal ve bazolateral bölmelere Ek olarak, Caco'yu önceden inkübe ettik-2 /15 Fe/Asc içeren hücreler, bu sistem laboratuvarımızda güçlü OxS ve inflamasyonu indüklemek için oldukça uygun olduğundan, bu da geniş bir efektör spektrumu tarafından zorlandı17,1932-3 Dikkate değer, güçlü bir oksijen olarak Fe/Asc -radikal üretici sistem biyolojik makromoleküllerde oksidatif hasara neden olur, hücre içi redoks ortamını değiştirir ve çok sayıda patolojik duruma dahil olur2.35,56.Bulgularımız, hassas antioksidan savunma (düşük GPx ve SOD2 protein ifadeleri).cistanche tubulosa faydalarıAyrıca, lipid peroksitler üretme kabiliyeti sayesinde Fe/Asc kompleksi, artan TNFa, COX2 ve NF-is ekspresyonunun kanıtladığı gibi iltihabı destekler. Toplu olarak, mevcut sonuçlar Fe/Asc'ye yanıt olarak radikal ve inflamatuar oluşumu doğrular.

PAC'lerin varlığı, Fe/Asc aracılı lipid peroksidasyonunu önledi. Antioksidan savunmanın başarısızlığı, OCS'nin indüklenmesini açıklayabildiğinden, endojen antioksidan enzimler üzerindeki etkisini inceledik. Aslında, PAC'ler Fe/Asc aracılı SOD2 ve GPx düşüşünü geri yükleyebildi. OxS'nin Fe/Asc ile alevlenmesi ve PAC'ler tarafından hafifletilmesi için mekanizmayı betimlemek için, en güçlü endojen antioksidan olarak kabul edilen Keap1-NRF2-antioksidan yanıt elemanı (ARE) sinyal yolunu değerlendirdik. düzenleyici37.cistanche çayıNRF2, işlevi redoks homeostazını korumak olan bir hücresel OCS sensörüdür. Normal koşullarda. NRF2, sürekli olarak her yerde bulunur ve negatif bağlı düzenleyicisi Keap18 tarafından proteazomal bozunmayı hedef alır. Endojen ve eksojen efektörlerin varlığında, Keapl inaktive edilir ve aşağı regüle edilir, böylece Keapl-NRF2 etkileşimini bozar ve hücre çekirdeğine yer değiştiren NRF2'yi serbest bırakır, aşağıdakileri içeren promotörlere bağlanır.

Şekil 7. Caco-2/15 hücre hattında PAC'lerin insülin duyarlılığı üzerindeki etkileri. Proantosiyanidinler (PAC'ler, 250 ug/mL), 6 saat boyunca 37 derecede Fe/Asc（200μM/2 mM） ile muameleden önce 24 saat boyunca apikal hücre bölmesine ilave edildi. Fe/Asc karışımı ile 6 saatlik inkübasyonun bitiminden iki saat önce, insülin duyarlılığını değerlendirmek için insülin (100 nM) eklendi. (A) p38-MAPK,(B) fosfor p38-MAPK,(D)Akt,(E)fosfo Akt,(G) PI3k ve (H) fosfo PI3k'nin protein ifadesi şu şekildeydi: Western blot ile değerlendirildi. (C) fosfo p38-MAPK/p38-MAPK,(F)fosfo Akt/Akt ve (Dfosfo PI3k/PI3k) oranları daha sonra hesaplanmıştır. Sonuçlar, 3 bağımsız deneyin ortalama±SEM'ini temsil eder. her biri iki kopya halinde Aynı jel üzerinde ve aynı maruziyetle üç kopya halinde bir deneyi gösteren temsili bir Western blot gösterilmektedir.*P<0.05 vs+/-insulin="" untreated=""><0.05 vs="" fe/asc+/-insulin-treated="" cells.p38-mapkp38-mitogen-activated="" protein="" kinase,="" pi3k="" phosphoinositide="" 3-kinase,="" akt="" protein="" kinase="">

ARE ve antioksidan enzimlerin transkripsiyonunu hızlandırır39. Verilerimize göre, Caco-2/15 hücrelerinin PAC'lerle tedavisi Keapl'i baskıladı ve muhtemelen NRF2'nin antioksidan genlerin promotör bölgesindeki ARE'ye (çekirdek dizi: 5'TGACnnnGC3') bağlanmasına izin vererek çekirdeğe yer değiştirmesine izin verdi. (SOD2 ve GPx), transkripsiyonlarının uyarılması ve koordineli yukarı regülasyon ile sonuçlanır. Bu veriler doğrultusunda, fenolik resveratrol bileşiği, H, O ile tedavi edilen romatoid artrit fibroblast benzeri sinoviyositlerde NRF2 ekspresyonunu teşvik ederek ve Keap12 ekspresyonunu azaltarak OxS'yi önledi. Ek olarak, Kanzaki ve arkadaşlarına göre, antioksidan ve sitoprotektif enzimlerin aktivasyonu, NRF2/Keapl oranı ile ilişkilendirilebilir1.

OCS'nin iyileştirilmesinden beklendiği gibi, PAC'ler, TNFa ve COX2'nin aşağı regülasyonu ile kanıtlandığı gibi iltihabı önemli ölçüde azalttı. NF-KB, proinflamatuar sitokinlerin anahtar düzenleyicisi olduğundan, PAC'lere yanıtını inceledik. İnflamatuar ajanların eğilimine paralel olarak, PAC'ler Fe/Asc aracılı NF-KB indüksiyonunu iptal etti ve NF-KB/IikB oranını azalttı. Bu nedenle, PAC'lerin, inflamatuar yanıtın ana düzenleyicisi olan NF-kB'nin kontrolü yoluyla bağırsak hücre fonksiyonlarını tehlikeye atan inflamasyona karşı korunmaya yardımcı olduğunu makul bir şekilde varsayabiliriz. Redoks dengesizliğinin biyobelirteçleri ile inflamasyon arasında yakın bir ilişki bulunduğundan, PAC'lerin hücresel antioksidan savunma mekanizmalarını uyararak inflamasyondan koruyabileceğini belirtmekte fayda var2.

Bu çalışma, Pac'in intestinal lipid homeostazı üzerindeki etkilerini araştırmayı amaçlamıştır. İlginç bulgularımız, PAC'lerin bir yandan CPTla'yı yukarı regüle ettiğini ve sırasıyla FA oksidasyonu ve lipogenezin biyobelirteçlerini temsil eden FAS'ı aşağı regüle ettiğini gösterdi. Bu nedenle, bu enzimler, birçok dokuda*3 OxSand iltihabının patolojik bir tezahürü olarak kabul edilen lipid birikimini önlemeye yönelik polifenolik potansiyeli gösteren PAC'lerin potansiyel hedefleridir. Moleküler mekanizmalar muhtemelen lipid metabolizmasını düzenleyen iki transkripsiyon faktörü olan PPARa'nın yukarı regülasyonu ve SREBPlc'nin aşağı regülasyonu ile ilgilidir. FAS, malonil-CoA'nın FAs45'e dönüşümünü katalize etmekten sorumlu lipogenezdeki merkezi enzimdir. Diğer yandan, ACC, FAS için temel bir substrat olan malonil-CoA'nın oluşumunu katalize eder. Bulgularımız doğrultusunda, Solanum nigrum polifenollerinin ayrıca oleik asitle muamele edilmiş hepatositlerde CPTla ve PPARa'yı arttırırken FAS ve SREBP'leri azalttığı bulundu"6.

Polifenollerin etki mekanizmaları genellikle AMPKa fosforilasyonunun aktivasyonu ile ilişkilidir7. Önemli olarak, çalışmamızda fosforile edilmiş AMPKa, Fe / Asc tarafından düşürüldü, ancak fosfo ACC'nin aşağı regülasyonunu açıklayan PAC'ler tarafından uyarıldı, bu da lipogenezin inhibe edilmesine ve enerji metabolizmasının artmasına neden oldu. Bununla birlikte, AMPKa'nın protein ekspresyonu, Caco2/15 hücrelerinde Fe/Asc ile indüklenen OxS tarafından arttırıldı. Buna göre, ROS ve OxS, farklı yukarı akış kinazlar8 yoluyla AMPKa'yı indükleyebilir.

OCS ve inflamasyon, insülin direncini ve ek metabolik bozuklukları güçlü bir şekilde indükler9,50, bu da Pac'ın insülin sinyal yolağına göre bazı temel proteinleri düzenleme kapasitesini değerlendirmemize neden oldu. İlk olarak, insülin reseptörü sinyalleme kaskadına müdahale ederken ifadesi OxS tarafından yukarı regüle edilen p38-MAPK'ye odaklandık. p38-MAPK fosforilasyonunun Bothe analizi ve fosfo p38-MAPK/p38-MAPK oranının hesaplanması, Caco'da bozulmuş IS ile uyumlu olan Fe/Asc'ye yanıtta önemli bir artış ortaya çıkardı{ {6}}/15 hücre. Doğrulama, pAkt ve PI3K'nın azalmasıyla elde edildi. Buna karşılık, PAC'ler, PI3K/Akt sinyal yolunu geliştirirken p38-MAPK fosforilasyonunu ve fosfo p38-MAPK/p38-MAPK oranını azaltma yeteneğini sergiledikleri için eğilimi tersine çevirdi, glukoz taşınmasını, protein sentezini, hücresel proliferasyonu, hücre hayatta kalmasını ve glukoneogenezi düzenleyerek insülinin başlıca biyolojik etkilerine aracılık ettiği bilinmektedir. OxS ve kronik inflamasyona bağlı IS'deki bozulma da glukoneogenez sürecini etkileyebilir3,54. De novo glikoz sentezinde yer alan iki ana enzimin (PEPCK, G6Pase) analizi, Fe/Asc'ye yanıtta önemli bir artış ortaya çıkarırken, PAC uygulaması onları Caco2/15 hücrelerinde normal seviyelere geri getirdi.

Sonuç olarak, bilimsel literatürdeki çok sayıda çalışma, dolaylı kanıtlarla ya spesifik bir fenolik molekül olarak ya da birkaç polifenol karışımı olarak fenolik bileşiklerin önemli sağlık etkilerini göstermektedir. Mevcut çalışma, OxS, inflamasyon ve ilgili metabolik bozuklukları önleyerek PAC'lerin (kompleks flavanoller) bağırsak homeostazındaki önemli etkisine işaret etmektedir. PAC'ler ince bağırsak tarafından tamamen absorbe edilemeyebileceğinden, ince bağırsakta yararlı sağlık etkilerine dahil olan mekanizmaları araştırmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.

araç ve yöntemler

Bağırsak Caco-2/15 hücre kültürü ve tedavisi. Tüm deneyler için, insan epitelyal kolorektal adenokarsinoma Caco-2/15 hücre hattını, ana Caco-2 hücrelerinin stabil bir klonunu kullandık (Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu, Rockville, Md., ABD), JF Beaulieu'den (Hücresel Biyoloji Departmanı, Tıp Fakültesi, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Kanada) elde edilmiştir. Caco-2/15 hücre çizgisi, in vitro olarak polarize olgun enterositlere farklılaşma ve geçirimsiz bir mono-over oluşturma gibi benzersiz bir özelliğe sahiptir. Caco-2/15 hücreleri, daha önce 323455'te tarif edildiği gibi kültürlendi ve hücre bütünlüğü, OCS ve inflamasyon17,19 ve IS56'nın incelenmesi için kullanıldı.

İmmünoblotlama ile protein ekspresyon analizi. Çeşitli tedavilerle inkübasyonun ardından, Caco-2/15 hücreleri, 20 mM Tris-HCl(pH 7.4),150 mM NaCl,1 mM Na2E-DTA, 1 mM EGTA, yüzde 1 NP içeren buz gibi soğuk tamponda lize edildi. -40, yüzde 1 deoksikolat,2,5 mM sodyum pirofosfat,1 mM Na2V04, 1 ug/mL leupeptin ve 1 mM PMSF. Her numunenin protein konsantrasyonu, Bradford yöntemi "Bio-Rad" kullanılarak belirlendi. Proteinler daha sonra SDS ve ß-merkaptoetanol içeren bir numune tamponunda 5 dakika boyunca denatüre edildi. 15 ug toplam protein içeren homojenatlar, protein moleküler ağırlıklarına göre yüzde 10'luk bir SDS-poliakrilamid jel üzerinde ayrıldı ve nitroselüloz membranlar üzerinde elektro-lekelendi. 4 derecede gece boyunca birincil antikorlar eklenmeden önce zarların spesifik olmayan bölgelerini bloke etmek için yağsız süt kullanıldı. Antikorların seyreltilmesi Ek Bilgilerde ve son yayınımızda rapor edilmiştir. Reaktif bantlar, bir ChemiDoc MP Görüntüleme Sistemi (Bio-Rad) kullanılarak yakalandı. Tüm veriler, aynı numunede hedef proteinin -aktine oranı olarak ifade edilir.

İstatistiksel analiz. Tüm değerler, üç kopya halinde gerçekleştirilen en az üç farklı deneyin ortalama±SEM'si olarak ifade edilir. Veriler tek yönlü ANOVA ile analiz edildi, ardından Tukey'nin PRISM 70(GraphPad Software, San Diego, CA, ABD) kullanılarak çoklu karşılaştırma testleri yapıldı. Farklılıklar P'de önemli kabul edildi<>

Bu makale Scientifc Reports|(2021) 11:3878|https://doi.org/10.1038/s41598-020-80587-5