Cistanche Deserticola'nın ağ farmakolojisi ve deneysel doğrulama kullanarak Alzheimer hastalığını tedavi ettiği mekanizmanın araştırılması

[Soyut]

 

Amaç: KeşfetmekAlzheimer Hastalığı Üzerine Cistanche Deserticola'nın Potansiyel Mekanizması (AD)başından sonuna kadarAğ farmakolojisive hayvan deneyleri.

Yöntemler:ÖngörmeAğ farmakolojisini kullanarak Cistanche ve Alzheimer hastalığına bağlı hedefler; 40 Erkek 7- aylık Samp8 fareleri rastgele bir model kontrol grubuna (model), düşük doza (L-GCS), bir orta doza (M-GCS) ve yüksek doz (H-GCS) tedavi grubuna ve aynı yaştaki 10 erkek anti-çağrışım SAMR1 faresine SAMR1 kontrol grubu olarak kullanıldı. GC'lerin 30 gün içi intragastrik uygulamasından sonra, her fare grubunun öğrenme ve bellek yeteneklerini test etmek için Morris su labirent ve Y labirent deneyleri kullanıldı. Farelerin hipokampal CA1 bölgesindeki nöronların sayısını ve morfolojisini gözlemlemek için NISSL boyaması kullanıldı. Farelerin hipokampüsünde PI3K, P-Akt ve P-tau ekspresyonunu tespit etmek için immünohistokimyasal boyama ve Western blot deneyleri kullanıldı. Bulgular: Verbascosid dahil 8 etkili bileşen, Cistanche Deserticola'dan tarandı ve AD tedavisinde yer alan çekirdek genler AKT1, TNF, CASP3, vb. İdi. Hayvan deneyleri, model grubuna kıyasla, Morris Water labirent navigasyon testindeki kaçış gecikmesi ve toplam mesafenin önemli ölçüde azaldığını gösterdi (P<0.05), and the number of platform crossings significantly increased (P<0.05) in the spatial exploration test of the GCs group. In the immunohistochemical staining and Western blot experiments, the ratio of PI3K and P-Akt/Akt in the GCs group significantly increased (P<0.05), while the expression of P-Tau/Tau significantly decreased (P<0.05). Conclusion: GCs may improve the learning and cognitive abilities of SAMP8 mice by regulating the PI3K-AkT signaling pathway and regulating the expression of P-Tau protein.

[Anahtar Kelimeler]Ağ farmakolojisi;Alzheimer hastalığı; Cistanche Deserticola; SAMP8 fareleri; Apoptoz

 

 

 

Yüksek kaliteli Cistanche Bitkisel Takviyeleri

 

1 Malzeme ve Yöntem

1.1 Malzeme

1.1.1 Veritabanları ve Analiz Platformları

Bu çalışmada kullanılan ana veritabanları ve analiz platformları (Tablo 1).

 

Sekme 1 Bu çalışmada kullanılan ilgili analitik platformlar ve veritabanları

İsim	Web sitesi	Versiyon
Geleneksel Çin Tıp Sistemleri Farmakoloji Veritabanı (TCMSP)	https://www.tcmsp-e.com/	2.3
Tekrot	https://www.uniprot.org/
Pubchem	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
Venny	https://bioinfo.cis.cornell.edu/tools/venn/
Genekler	https://www.genecards.org/
NCBI Veritabanı	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Omim	https://omim.org/
Dize veritabanı	https://cytoscape.org/	11
Cytoscape yazılımı	https://cytoscape.org/	3.8.0 - 3.9.1
Metascape	https://metascape.org/

 

1.1.2 Deneysel Hayvanlar

Bu deneyde kullanılan deney hayvanları, 2 aydan 7 aylıktan eskiden büyüyen ve deneye dahil edilen erkek SPF sınıfı yaşlanma ile hızlandırılmış fare eğilimli 8 (SAMP8) farelerdir. Tüm hayvanlar, Moğolistan İç Moğolistan Bilim ve Teknoloji Üniversitesi Hayvan Tıp Merkezi'nin SPF sınıfı hayvan odasında [Syxk (Meng) 2018-0001} ± 1. 0} ± 1. Yeterli yem ve içme suyu sağlandı ve fareler yemek ve içmek için serbest kaldı. Işık/karanlık döngü, farelerin normal sirkadiyen ritmini sağlamak için 12 saat/12 saat idi. Bu deneyde yer alan tüm hayvan operasyonları ve deney protokolleri, Baotou Tıp Koleji Deneysel Hayvan Etik Komitesi (Baoyi Ethics 2018 No. 011) tarafından onaylanan protokol uyarınca gerçekleştirilmiştir.

1.1.3 Ana reaktifler ve enstrümanlar

Yüksek verimli RIPA lizis tamponu (R0010), ECL artı ultra duyarlı lüminesan çözelti (PE0010), elektroforez tamponu (T1070), transfer tamponu (D1060), protein yükleme tamponu (P1015) vb. İmmünohistokimya kiti (PV -9000) Pekin Zhongshan Jinqiao'dan satın alındı; BCA protein tespit kiti (23227) Thermo Scientific, ABD'den satın alındı. Fosfoinositid 3- kinaz (PI3K) antikoru, protein kinaz B protein Kinaz B (AKT) antikoru (AF6261), P -AKT antikoru (AF6261), Wuhan Qinke Biological Research Center Co., LTD.'den satın alındı. Keçi anti-tavşan ikincil antikoru (SA 00001-2) ABD'den ProteIntech'ten satın alındı.
Parafin dilimleyici (Leica, Almanya), optik mikroskop (Leica, Almanya), Açık Saha Test Odası (Şangay Xinruan), Morris Water Labirent (Thermo Fisher, ABD), Elektroforez Aparatları (Beijing Lijing Lijing LiJing LiJing LiJing LiJing LiJing LiJing LiJing LiJing LiJing LiJing LiJing LiJing (Pekin Liuyi Biotechnology Co., Ltd.), protein jel görüntüleme analiz sistemi (Shanghai Tanon teknolojisi) ve mikroplaka okuyucu (Thermo Fisher, ABD).

 

1.2 Yöntemler

1.2.1 Ağ Farmakoloji Analizi

1.2.1.1 Aktif malzemelerin taranması ve Cistanche Deserticola'nın hedef noktaları

Cistanche Deserticola'nın hedef noktalarının taranması: tüm kimyasal aktif bileşenler, tcmsp veritabanında (https://www.tcmsp-e.com) anahtar kelime olarak Cistanche deserticola ile arandı ve 3 {{2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2 {2} 'den daha büyük veya eşit olduğu gibi ob), 21'e eşit olarak kullanıldı. toplanan bileşikler; Swiss ADME platformu, TCMSP platformunda bulunmayan kimyasal bileşenleri, standart olarak bir gastrointestinal absorpsiyon (GI emilim) "yüksek" ve ilaç benzerliği ile takviye etmek için kullanıldı ve literatür araştırması ile toplanan Cistanche Çölümlüsola'nın ortak aktif bileşenleri ile birlikte, hedeflerin standart isimleri elde edildi.
(https://www.uniprot.org) [10].

 

1.2.1.2 AD hastalığı hedeflerinin edinilmesi

Arama terimi olarak "Alzheimer Hastalığı" nı kullanarak OMIM, Geneksel ve NCBI veritabanlarında hastalık hedeflerini arayın.

 

1.2.1.3 Venn Diyagramı Oluşturma ve Protein-Protein Etkileşim Ağı (PPI) İnşaat

Venny Diyagramı web sitesinde ilaç hedeflerine ve hastalık hedeflerine girin, bir Venn diyagramı oluşturun ve hedeflerin kesişimini elde edin. Bir protein etkileşim ağı oluşturmak için dize veritabanını içe aktarın, biyolojik türleri "homo sapiens" olarak ayarlayın ve bir protein etkileşim ağı diyagramı elde edin. Temel hedefleri hedeflerin derecesine, yakınlığına ve hedeflerin arasındaki değerlere göre filtrelemek için Cytoscape yazılımını kullanın ve grafiği çizmek için Analiz eklentisini kullanın.

1.2.1.4 Git ve Kegg Analizi

Yukarıda belirtilen ilgili temel hedeflerde Go ve Kegg Zenginleştirme Analizi gerçekleştirmek için David Online Platformu ve Metascape Online Platformunu kullanın ve 0. Go ve Kegg zenginleştirme analizinin kabarcık diyagramları çevrimiçi çizim platformu mikro bilgi kullanılarak çizilmiştir.

 

1.2.2 Deneysel Hayvan Gruplama ve Model Hazırlığı

40 Samp8 fareleri, rastgele model grubuna, düşük doz cistanche deserticola grubuna (L-GCS), orta doz cistanche deserticola grubuna (M-GCS) ve yüksek doz cistanche deserticola grubuna (H-GCS) bölündü; SAMR1 kontrol grubu olarak aynı cinsiyet ve ağırlıktaki 10 SAMR1 faresi kullanıldı. L-GCS grubu, M-GCS grubu ve H-GCS grubu, 25 mg/(kg · d), 50 mg/dozda GCS ile gavalandı.
(kg · d) ve sırasıyla 100 mg/(kg · d). SAMR1 grubuna ve model grubuna aynı normal salin dozu verildi ve tüm gruplar arka arkaya 30 gün boyunca gavalandı.

 

1.2.3 Davranışsal Deney

1.2.3.1 Morris Su Labirent Deneyi

Yer Navigasyon Deneyi: GCS yönetiminin 24. ila 30. gününde, konum navigasyon deneyi ilk 1 ila 5 gün içinde gerçekleştirildi. Su labirent dört kadran haline getirildi ve platform, üçüncü kadranda, su yüzeyinden biraz daha yüksek, 2 cm yerleştirildi. Fare, başı havuzun duvarına bakacak şekilde suya yerleştirildi ve platformu belirtilen 60 saniye içinde bulup bulamayacağı ve 2 ila 3 saniye boyunca platformda kalıp kalamayacağı gözlendi. Her fare için eğitim frekansı günde dört kez ve her seferinde başlangıç ​​noktası farklı bir kadrandı. Her iki eğitim arasındaki zaman aralığı 15 dakikadan az olmamalıdır. Fare platformu 60 saniye içinde bulamazsa, platformda 3 ila 5 saniye boyunca kalması yönlendirildi. Deney sırasında, her fare grubunun kaçış gecikmesi ve yol uzunluğu kaydedildi; {{12}. Keşif süresi 60 saniye idi ve platform geçişlerinin sayısı ve her bir fare grubunun hedef kadranındaki zaman yüzdesi kaydedildi.

 

1.2.3.2 Y-Maze Deneyi

Y-labirent aynı boyutta ve şekildeki üç koldan oluşur: başlangıç ​​kolu, yeni kol ve diğer kollar. Deneyden önce, yeni kolun girişi bloke edildi ve farelerin kalan iki kolu 10 dakika serbestçe keşfetmesine izin verdi. Keşiften 1 saat sonra, yeni kolun girişi açıldı ve fare başlangıç ​​kolunun başlangıcına yerleştirildi. Farenin yeni kolu 5 dakika içinde araştırdığı zaman kaydedildi ve farenin başarıyla girip çıkma sayısı yeni koldan hesaplandı. Farenin spontan değişim oranı hesaplandı [alternatif oranı (%)=başarılı değişim sayısı/(toplam kol giriş sayısı -2) ×%100] [14].

 

1.2.4 Nissl Boyama

30 günlük ilaç uygulamasından sonra, fareler anestezi uygulandı ve kalpte salin ile perfüze edildi. Kan boşaltıldıktan sonra fareler öldürüldü ve beyin dokusu alındı. Farelerin beyin dokusu, 24-48 H için% 4 paraformaldehid içine daldırılarak sabitlendi, artan gradyan alkol ile dehidre edildi, ksilen ile şeffaflaştırıldı ve parafine gömüldü. Dilim kalınlığı 5 μm idi. Suya rutin dewaxing, metilen mavisi boyama, farklılaşma, etanol dehidrasyonu, ksilen şeffaf ve reçine sızdırmazlığı. Fare hipokampusunun CA1 bölgesindeki morfoloji ve nöron sayısı, bir mikroskop altında 200 kez gözlendi.

1.2.5 İmmünohistokimyasal Boyama

Beyin dokusu kesitleri rutin olarak suya çiğnedildi, sodyum sitrat antijen onarım çözeltisine yerleştirildi ve yüksek basınçlı mikrodalga ile ısıtıldı, 5 dakika × 3 kez PBS tamponu ile durulandı, 5 dakika x3 kez ilave edilmiş, PBS ile durulandı, 5 dakika boyunca durulandı, birincil antikor ile inkübe edildi ve 4 derece inkübe edildi. Ertesi gün, 5 dakika x 3 kez PBS tamponu ile durulandı, daha sonra 5 dakika x 3 kez PBS ile tekrar yıkandı, 5 dakika boyunca 37 derecede ikincil antikor ile inkübe edildi, daha sonra renk gelişimi için dabingize edilen, hematoksilin ile birlikte, dibegolasyon çözeltisi ile inkübe edildi, daha sonra, hematoksilin ile uyuşturuldu. ksilen.

 

1.2.6 Western Blot

Fare hipokampal dokusunun bir kısmı protein RIPA lizis tamponuna, bir taşlama çubuğu ile tamamen öğütülmüş, bir buz banyosunda ultrason ile homojenleştirilmiş ve 30 dakika buz üzerinde bırakılmıştır. Ardından, 15 dakika boyunca 000 r/dk'ta santrifüj yapmak için düşük sıcaklıklı bir ultrasantrifüj kullanın, süpernatanı alın ve protein konsantrasyonunu belirlemek için BCA yöntemini kullanın. 20 ug protein alın ve protein yükleme tamponuna ekleyin, 5 dakika boyunca 100 derece denatüre ekleyin, önceden yapılandırılmış konsantre jel ve elektroforez deposuna 80 V sabit voltaj elektroforezi yükledikten sonra 60 dakika boyunca takın ve daha sonra 80 dakika boyunca 120 V sabit volta elektroforeze ayarlayın. Ardından 300 mA sabit akım kullanın ve membranı 130 dakika aktarın. Yağsız sütü 2 saat boyunca oda sıcaklığında bloke edin, birincil antikoru 1: 1 500 kez seyreltin, bir buzdolabında gece boyunca 4 derecede inkübe edin, zarı yıkayın ve ikincil antikoru oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. Bir görüntüleme analiz sistemi ile geliştikten sonra, her bant grubunun gri değerini analiz edin.

 

1.2.7 İstatistiksel analiz

Tüm veriler ortalama ± standart sapma (x  s) ve SPSS 25 olarak ifade edildi. Çift karşılaştırma için SNK-Q testi kullanıldı ve çoklu örnek karşılaştırması için tek yönlü Anona kullanıldı. P<0.05 indicated statistically significant differences.