İfosfamid Toksisitesinin Araştırılması Karaciğer ve Böbrekte Ortak Upstream Regülatörü İndükler

İletişim: emily.li@wecistanche.com

Hyoung-Yun Han ve diğerleri

Soyut:

İfosfamid, çeşitli katı kanserleri tedavi etmek için kullanılan, siklofosfamidin sentetik bir analoğu olan bir alkilleyici ajandır. Bu çalışmada, ifosfamidin toksisitesi, sıçanlarda İyi Laboratuvar Uygulamaları kılavuzları kapsamında tek ve çoklu doz intraperitoneal uygulama kullanılarak değerlendirildi ve toksikolojik bulguları desteklemek için ek bir mikrodizi deneyi izlendi. Tek doz ifosfamid (50 mg/kg) herhangi bir patolojik değişikliğe neden olmadı. Bu arada, kan üre nitrojen ve kreatinin düzeylerinde önemli artışlarla birlikte 7 ve 28 gün ardışık uygulanan gruplarda şiddetli renal toksisite gözlendi. Tox-list analizinde en çok karaciğerde kolesterol sentezi ile ilgili genler, böbrek yetmezliği ile ilgili genler ise karaciğerde etkilenmiştir.böbrekifosfamid uygulamasından sonra. Ayrıca, interferon düzenleyici faktör 7, her iki durumda da değişen ana yukarı akış düzenleyicisi olarak seçilmiştir.karaciğerveböbrekubikuitine özgü peptidaz 18, 2 içeren radikal S-adenosil metiyonin alanı ve interferon ile uyarılan gen 15 gibi diğer hedef genlerle etkileşime girdiği bulundu ve bu gerçek zamanlı RT-PCR analizi ile daha da doğrulandı. Sonuç olarak, böbrek yanlı ifosfamid organ toksisitesini yeniden doğruladı ve her ikisinde de aynı şekilde değiştirilmiş genleri tanımladı.karaciğerveböbrek. İfosfamid kaynaklı genler ile organ toksisitesi arasındaki kesin ilişkiyi ortaya çıkarmak için daha kapsamlı toksikogenomik çalışmalara ihtiyaç vardır.

Anahtar Kelimeler:ifosfamid; hepatotoksisite; nefrotoksisite; intraperitoneal toksisite

Cistanche karaciğer ve böbrek için iyidir

1. Giriş

İfosfamid, sarkomlar ve lenfomalar dahil olmak üzere çeşitli katı kanserleri tedavi etmek için kullanılan, siklofosfamidin sentetik bir analoğu olan bir alkilleyici ajandır. İfosfamid, DNA replikasyonu ve RNA üretimine müdahale eden, hücre döngüsüne özgü olmayan bir antikanser ilacıdır [1]. İfosfamid, diğer toksik alkilleyici ajanlara kıyasla nispeten iyi tolere edilmesine rağmen, klinik kullanımını sınırlayan, yaşamı tehdit eden çok sayıda yan etki ile ilişkili olduğu bilinmektedir [2]. İfosfamidin başlıca yan etkileri, akut dahil olmak üzere ifosfamidin reaktif toksik türlerinden kaynaklanan ciddi böbrek hasarını içerir.böbrek incinme, interstisyel nefrit, hemorajik sistit ve Fanconi sendromu [3]. Kliniklerde, erken böbrek toksisitesi yaşayan ve tekrarlayan yüksek doz ifosfamidin neden olduğu tek organ yetmezliği olan ve ardından organ yetmezliğine yol açan hastalarda şiddetli çoklu organ toksisitesi bildirilmiştir [4,5].

İfosfamid, akrolein ve kloroasetaldehitin toksik metaboliti, ifosfamid organ toksisitesinden başlıca sorumlu faktördür. Önceki çalışmalar temel olarak ifosfamidin toksik metabolitlere, özellikle de sitokrom P450 (CYP)'ye dönüşümünü etkileyen faktörlere odaklanmıştır [6]. Böbrekte nispeten bol miktarda bulunan CYP3A4 ve CYP3A5, ifosfamidde toksik değişikliklere yol açar ve nefrotoksisiteyi indükler [7]. Akrolein, hücre içi reaktif oksidatif genler yolunu aktive edebilen ve hücre organeline zarar verebilen oldukça reaktif bir aldehittir. Kloroasetaldehit, hücre içi glutatyon (GSH) tükenmesine ve hücre ölümüne yol açabilecek mitokondriyal solunum zincirindeki kompleks I aktivasyonunun baskılandığını bildirmiştir [8].

Bir çoklu organ toksikolojik çalışması, ilaçların sistemik etkilerini anlamada, toksisite çalışmaları için belirli organları hedeflemekten daha faydalıdır. Karaciğer ve böbrekler, ilaç metabolizmasına ve atılımına katılan başlıca organlardır ve bu ana organlar advers ilaç reaksiyonlarına yatkındır; organ toksisitesi sıklıkla takip eder. Ayrıca, bütünleştirici toksikolojik değerlendirme, sistemdeki ilaca bağlı toksisiteyi anlamaya ve tahmin etmeye yardımcı olabilecek çeşitli patolojik bulgular sunabilir.

Birçok çalışma, kimyasalların potansiyel olumsuz etkilerini tahmin etmek için gen ekspresyon profillerini kullanmıştır. Bununla birlikte, daha önceki çalışmaların çoğu, yalnızca sınırlı patolojik semptomlarla tek hedefli organ toksisitesini değerlendirmeye odaklanmıştır [9]. Ayrıca, mikrodizi tabanlı gen profili oluşturma ile birleştiğinde, ilaca bağlı potansiyel toksisiteyi önleyebilen sistem düzeyinde kapsamlı bir toksisite anlayışı üretecektir [10]. Bu bağlamda, sistemdeki ilaçların toksik mekanizmalarını anlamak için yetersiz olan tek organ toksisite değerlendirmesinden elde edilen toksisite verilerinin üstesinden gelmek için toksisite tahmin modeli çalışmalarında gen ekspresyon profili ile bütünleştirici çok organlı toksikolojik yaklaşımlar kullanılmıştır [11].

Bu çalışmada, ifosfamidin toksisitesini tanımladık.böbrekvekaraciğerSprague-Dawley (SD) sıçanlarında akut ve tekrarlanan maruziyetten sonra. Hem karaciğerde hem de karaciğerde ifosfamid tarafından değiştirilen ortak hedef geni ortaya çıkarmak için destekleyici gen ekspresyonu profilleme deneyleri yapıldı.böbrek, bütünleştirici ifosfamid toksisitesi hakkında bir fikir önermektedir.

2. Sonuçlar

2.1. Tek Doz Toksisite Çalışması

12.5, 25 ve 50 mg/kg ifosfamid gruplarında ölüm, toksik semptomlar, vücut ağırlığı değişiklikleri veya histopatolojik bulgular değil toksisite gözlenmedi.

Bu arada, hematoloji çalışmasında, göreceli retikülosit (RET) sayıları ve mutlak nötrofil (NEUA) ve lenfosit (LYMA) sayıları doza bağlı bir şekilde azaldı.

2.2. Bir Haftalık Tekrarlanan Doz Toksisitesi Çalışması

1 haftalık ifosfamid uygulamasından sonra genel vücut ağırlığı azaldı ve 100 mg/kg grubundaki vücut ağırlığı kaybının ortalama değerleri, 75 mg/kg grubundakilerden daha yüksekti (Tablo 1). Bu arada, ifosfamid ile tedavi edilen gruplarda nispi organ ağırlığı kademeli olarak arttı (Tablo 2).

Bir haftalık ardışık ifosfamid IP uygulaması, RBC, HGB, HCT, MCV ve PLT dahil olmak üzere hematoloji indeksini doza bağlı bir şekilde bastırdı (Tablo 3). Ayrıca BUN ve CREA, kontrol grubunda ifosfamid grubuna göre 1.2 kat arttı (Tablo 4).Böbrekincinmehistopatolojik bir çalışma ile daha da desteklenmiştir.

75 ve 100 mg/kg ifosfamid gruplarındaki farelerin karaciğerlerinde hiçbir histopatolojik belirti gözlenmedi (Şekil 1A). Bu arada,böbrekler75 ve 100 mg/kg ifosfamid gruplarından tübüler dejenerasyon/dilatasyon (100 mg/kg grubunda 1 orta), tek hücreli nekroz, ürotelyum hiperplazisi ve fokal kanama dahil olmak üzere minimal ila hafif dereceli patolojik değişiklik olduğu bulundu. /tıkanıklık (Tablo 5). Ek olarak, böbrek tübül alanında KIM-1 ekspresyonunda belirgin bir artış gözlendi.böbrek100 mg/kg grubu (Şekil 1B).

2.3. Dört Haftalık Tekrarlanan Doz Toksisite Çalışması

Sırasıyla 21 ve 10 gün ardışık uygulamadan sonra 50 (5/10) ve 70 (10/10) mg/kg ile tedavi edilen gruplarda ölüm gözlendi. Ayrıca, artan nispi organ ağırlığı ile azalan vücut ağırlığı,karaciğer, veböbrekifosfamid ile tedavi edilen tüm gruplarda, 4-hafta tekrarlanan doz toksisitesini destekler.

Hayatta kalan denekler üzerinde hematolojik ve serum biyokimyasal analizleri yapıldı. RET, RBC, MONA, EOSA ve LUCA dahil olmak üzere çeşitli kan parametreleri, 4 haftalık ifosfamid uygulamasından sonra önemli ölçüde azaldı.

Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, biyokimyasal analizler 4 haftalık ifosfamid uygulamasından sonra istatistiksel farklılıklar gösterdi. Örneğin, 50 mg/kg tedavi edilen grupta kontrol ile karşılaştırıldığında AST ve CK seviyeleri önemli ölçüde arttı ve A/G oranı, GLU ve GGT azaldı (p < 0.01).="">

2.4. İfosfamide Bağlı Gen Ekspresyonu Analizi

İfosfamidin neden olduğu DEG'ler karaciğerde tanımlandı veböbrekdokular (Tablo 6). Karaciğer için, diferansiyel olarak eksprese edilen genler, 100 mg/kg BW/gün'de 2672 gen, 1283 gen yukarı regüle edildi ve 1389 gen aşağı regüle edildi. Böbreklerde, 100 mg/kg BW/gün'de 401 gen diferansiyel olarak ifade edildi - 149 gen yukarı regüle edildi ve 252 gen aşağı regüle edildi. Hem karaciğerde hem de böbrekte, aşağı regüle edilmiş genlerin sayısı, yukarı regüle edilmiş genlerin sayısından daha fazlaydı. Bu, ifosfamid tedavisinin gen ekspresyonunu engellediği izlenimini verebilir.

Biyolojik fonksiyon analizi sonuçları Tablo 7'de listelenmiştir. 1-haftalık ifosfamid uygulamasının, çoğunlukla karaciğerde, organ gelişimi ile ilgili genleri değiştirdiği bulunmuştur. İçindeböbrek, bağışıklık hücre lokalizasyonu ile ilgili genlerin en çok etkilendiği doğrulandı.

DEG'lerin kanonik yol analizinde, kolesterol sentezindeki değişiklikler ve antijen sunum yolu ile ilgili genlerdeki değişiklikler,karaciğerveböbrekdokular, sırasıyla (Şekil 2). Ayrıca, LXE/RXR ve akut faz tepkisi sinyalizasyonu, dünyadaki ortak üst-düzenlenmiş kanonik yoldu.karaciğerveböbreksırasıyla lipid homeostazı ve inflamatuar sitokin sinyallemesinde rol oynayan .

Karaciğer toksin listesi analizinde en çok kolesterol sentezi ile ilgili genler etkilenmiş, bunu pozitif akut faz yanıt proteinleri ve akut böbrek yetmezliği paneli izlemiştir (Tablo 8). Ayrıca, böbrek listesi sonuçları, böbrek yetmezliği ile ilgili genlerin, geri dönüşümlü glomerülonefrit biyobelirteçleri ve akut böbrek yetmezliği paneli dahil olmak üzere, genellikle ifosfamidden etkilendiğini ortaya koydu.

IPA bilgi tabanına dayalı olarak, ortak bir yukarı akış düzenleyicisi, ifosfamid tedavisini takiben karaciğer ve böbrekteki gen ekspresyonunu düzenler (Şekil 3). IRF7, hem karaciğerde hem de böbrekte değişen ve USP18, RSAD2 ve ISG15 gibi diğer hedef genlerle etkileşime girdiği bulunan ana düzenleyiciydi. Ayrıca, gerçek zamanlı RT-PCR analizi, IRF7, USP18, RSAD2 ve ISG15'in ifadesini doğruladı. Her bir gendeki değişikliklerin kapsamı karaciğer ve böbrek arasında farklı olmasına rağmen, 1 haftalık ifosfamid uygulamasından sonra hem karaciğer hem de böbrek dokularında ekspresyon baskılanmıştır. RSAD2 ve USP18, sırasıyla karaciğer ve böbrekte ifosfamid tedavisi ile çoğunlukla genleri değiştirmiştir.

3. Tartışma

Bu çalışmada, sıçanlarda GLP standardı altında farklı dozlar ve maruziyet terimleri ile çoklu organlarda kapsamlı ifosfamid toksisitesi araştırıldı. Kliniklerde, ifosfamid, adaptif immünoterapi ile birlikte sitotoksik ve immünomodülatör etkilerle bimodal bir antitümör etki gösterebilir [12]. İfosfamidin başlıca böbrek yolu ile elimine edildiği bilinmektedir ve dozun yaklaşık yüzde 80'i değişmemiş formdadır, nefrotoksisite ifosfamidin yaygın olarak bilinen bir yan etkisidir ve klinik kullanımından kloroasetaldehit ve akrolein gibi metabolitler sorumludur [13, 14].

Bu çalışmada, ifosfamid türevli organ toksisitesini araştırmak için 1-hafta tekrarlanan bir toksisite çalışması uygun olmuştur. Bir haftalık ifosfamid uygulaması, kan indeksini doza bağlı bir şekilde bastırdı, bu da tipik ifosfamid türevli miyelosupresyonu yansıtabilir. Nefrotoksisite ile birlikte, birkaç rapor miyelosupresyonun ifosfamidin başlıca doz sınırlayıcı toksisitelerinden biri olduğunu ve lökopeninin genellikle trombositopeniden daha şiddetli olduğunu göstermiştir [15,16]. İfosfamid nefrotoksisitesi, proksimal tübül fonksiyonunda geri dönüşü olmayan hasarla sonuçlanan bir bozulmanın olduğu ve toksik metabolit akroleinin hemorajik sistit ile ürotoksisiteyi tetiklediği Fanconi sendromuna yol açabilir [17]. Bu, mevcut çalışmanın sonuçları ile uyumludur. Histopatolojik çalışmada, ifosfamid kaynaklı patolojik değişiklikleri araştırmak için böbrekler ve karaciğerler incelendi. Hem 75 hem de 100 mg/kg ifosfamid uygulanan gruplarda, renal pelvis bölgesinde ürotelyum hiperplazisi ile birlikte geniş tübüler dejenerasyon ve dilatasyon alanları tespit edildi. Ayrıca, bir renal proksimal tübül hasar molekülü olan KIM-1'nin ekspresyonu, ifosfamide bağlı nefrotoksisitenin varlığını destekledi. Bu arada, karaciğerde sadece minimal periportal vakuolasyon gözlendi. Ayrıca, AST ve ALT değerleri doza bağlı olarak azalmasına rağmen, değişiklikler referans aralığındaydı [18]. Karaciğer enzim düzeylerinin azalmasının daha derin nedenlerinin daha fazla araştırılması gerekecektir. İfosfamidin alkilleyici bir ajan olduğu ve hepatotoksisite ile nadiren ilişkili olduğu genel olarak kabul edilmektedir ve özellikle doksorubisin gibi diğer kemoterapötik ilaçlarla kombine edildiğinde karaciğer hasarını indükleyen sadece birkaç vaka bildirilmiştir [19].

Son zamanlarda, yüksek verimli teknolojiler ile toksikolojide gen ekspresyon verilerindeki kayda değer ilerleme, toksisite çalışmalarında yeterince büyük veri setlerinin üretilmesine yol açmıştır ve gen profilini kimyasal toksisite tahminine uygulamak için birçok girişimde bulunulmuştur [10,20]. Bu çalışmada, ifosfamid uygulamasının neden olduğu transkriptom yanıtını analiz etmek için mikroarray analizi yapıldı ve kat değişikliği 1.5'ten büyük veya buna eşit olan DEG'ler hedef gen olarak seçildi ve biyolojik fonksiyon, kanonik yol ve Tox listesi analizi kullanıldı. ifosfamid kaynaklı genlerin işlevini anlamak. Karaciğer ve böbrekte çoklu organ toksisitesi olasılığını değerlendirmek için ek bir yukarı akış düzenleyici analizi yapıldı.

Bu çalışmada DEG'ler 1.5-kat değişti ve aşağı regüle edilmiş genler, hem karaciğerde (yüzde 52) hem de böbrekte (yüzde 62) yukarı regüle edilmiş genlerden biraz daha baskındı. Biyolojik fonksiyon analizi sonuçları, ifosfamidin hem karaciğerde hem de böbrekte yaygın olarak gözlenen doku gelişimi ile ilgili biyolojik fonksiyonlarla birlikte genleri değiştirdiğini göstermiştir.

Snouber ve ark. [21], ifosfamid tedavisinin, mikroakışkan kültürde Nrf-2 aracılı stres oksidatif yanıt yollarını aşağı regüle ettiğini bildirmiştir [21]. Önceki çalışmalarla tutarlı olarak, NRF2-aracılı oksidatif stres yanıt yolu, hem mevcut kanonik yol hem de toksin listesi analizi ile onaylanan üst ağlar tarafından önemli ölçüde modüle edildi. Mevcut değiştirilmiş Nrf-2 aracılı stres oksidatif yanıt yolları, ifosfamid toksik metaboliti ile yakından ilişkili olabilir. Çoklu ifosfamid toksik metabolitleri, yol boyunca farklı bölgelerde konjugatlar oluşturmak için güçlü bir antioksidan olan GSH ile reaksiyona girebilir ve GSH seviyesindeki bir düşüş, oksidatif stresin ifosfamid organ toksisitesindeki etkisini gösteren artan toksisite ile sonuçlanır [8,22]. ]. Bu bağlamda, ifosfamid organ toksisitesini hafifletmek için mesna ve N-asetilsistein kullanılmıştır. Mesna, daha az zararlı bir madde oluşturmak için bir Michael ilavesi yoluyla, esas olarak akroleine karşı ifosfamid toksik metabolitine bağlanarak bölgesel bir detoksifiye edici olarak hizmet eder [23]. Ek olarak, N-asetilsisteinin antioksidan aktiviteye sahip olduğu ve oksidatif stres koşulları altında GSH tükenmesini iyileştirdiği bildirilmektedir [24]. İfosfamid antidotu ile nefrotoksik koşullar altında düzenlenen yolak arasındaki kesin ilişkiyi aydınlatmak için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Mesna veya N-asetilsistein tarafından ifosfamid toksisitesinin iyileştirilmesinin, gelişmiş Nrf-2-aracılı stres oksidatif yanıt yolakları tarafından takip edilebileceğini tahmin edebiliriz.

Bu çalışmada, kanonik yol analizinde akut faz sinyallemesi ile tanınabilen, hem karaciğerde hem de böbrekte iltihaplanma ile ilgili sinyaller yaygın olarak yukarı regüle edilmiştir. Bu sonuç, her iki dokuda da ifosfamid organ toksisitesinin patofizyolojisinde inflamatuar reaksiyonun etkisini gösterdi ve bu, yukarı akış regülatör analizi ile daha da desteklendi. Yukarı akış düzenleyici analizinde, USP18, RSAD2 ve ISG15 dahil olmak üzere IRF7 ve interferon (IFN) sinyaliyle ilgili genler, karaciğer ve böbrekte ortak yukarı akış düzenleyicileri olarak seçildi. IRF7, immün hücre sitoplazmasında yapısal olarak eksprese edilen ve ayrıca tip I interferon, virüs enfeksiyonu ve çeşitli hücrelerde dış uyaranlarla indüklenebilen lenfoid spesifik bir faktördür [25]. Önceki bir çalışma, çeşitli tümör hücrelerinde IRF7'nin tartışmalı pro- veya anti-onkojenik özelliklerini bildirmiştir ve IRF7 ekspresyonundaki değişiklikler, DNA hasarı ile ilişkilendirilmiştir [26-28].

Antiviral işlevler için tip I IFN'deki önemli düzenleyici rolüne ek olarak, IRF7'nin TLR4 sinyal yolu yoluyla inflamatuar yanıtları baskıladığı rapor edilmiştir [29]. Ayrıca, Stout-Delgado ve ark. [30] yaşlanmanın neden olduğu oksidatif artışın IRF7 aktivitesini bozduğunu, buna karşın antioksidan ajanlar tarafından stresin azaltılmasının IRF7 aktivitesini iyileştirdiğini bildirdi. Bu çalışmada, ifosfamid uygulaması yukarı akış düzenleyicilerinin ekspresyonunu baskıladı ve ekspresyon paternleri hem karaciğerde hem de böbrekte aynıydı. IRF7 ekspresyonundaki mevcut değişiklikler, ifosfamidin inflamatuar reaksiyonu ve sitotoksik alkile edici ajan özelliği ile ilgili olabilir, bu da ifosfamid organ toksisitesi için umut verici bir hedef olarak IRF7'yi önerebilir.

Bu çalışmada, ifosfamid uygulamasından sonra hem karaciğerde hem de böbrekte aynı şekilde inhibe edilmiş bir gen bulduk, ancak toksikolojik öneminin yorumlanması, mevcut keşfi sınırlayan sadece böbrek üzerinde odaklandı. Ayrıca, ticari olarak temin edilebilen ifosfamid antidotunun halihazırda değiştirilmiş gen üzerindeki etkisiyle ilgili başka doğrulayıcı çalışmalar mevcut bulguları destekleyebilir.

Sonuç olarak, ifosfamid uygulamasının tekrarlanan bir toksisite çalışmasının (1 hafta) hepatotoksisiteden ziyade yanlı nefrotoksisiteye sahip olduğu bulundu. Ek olarak, mevcut sonuçlar, ifosfamidin neden olduğu hepatotoksisite ve IRF-7 inhibisyonunu içeren nefrotoksisite mekanizması için kanıt sağlar. İfosfamidin sistemik toksikolojik mekanizmasını aydınlatmak ve gen ile organ toksisitesi arasındaki ilişkiyi desteklemek için bağışıklıkla ilgili organlarla ilgili daha fazla toksikogenomik çalışmalara ihtiyaç vardır.

4. Malzemeler ve Yöntemler

4.1. Hayvan Çalışması

Sekiz haftalık, erkek spesifik patojen içermeyen Sprague–Dawley (SD) sıçanları (n=140) Orient Bio Inc.'den (Seongnam, Kore) elde edildi. Hayvanlar deneyden bir hafta önce incelenmiş ve laboratuvar ortam koşullarına alıştırılmıştır. Tüm hayvanlar, kontrollü laboratuvar koşullarında (sıcaklık, 23 ± 3 ◦C; nem, yüzde 55 ± 10 ve 12/12-saat aydınlık/karanlık döngüsü) laboratuvar yemi ve ad libitum su ile plastik kafeslerde barındırıldı. Hayvan çalışması, Kore Toksikoloji Enstitüsü'nün (Daejeon, Kore) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı ve tüm prosedürler, Kore Gıda ve İlaç İdaresi'nden İlaçların Güvenlik Değerlendirmesi için Test Kılavuzlarına uygun olarak yapıldı. Hayvan çalışması üç bölüme ayrılmıştır: tek doz (akut) ve tekrarlanan doz (1 hafta ve 4 hafta) ardışık uygulama toksisite çalışması. Kırk sıçan, her toksisite çalışmasında Path/Tox sistemi (versiyon 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, ABD) kullanılarak dört gruba (kontrol, t1, t2 ve t3) rastgele atandı.

4.2. Toksisite Deneyi

Toksisite çalışması üç bölüme ayrılmıştır: tek doz (akut) ve iki tekrarlı doz (1 hafta veya 4 hafta ardışık doz) toksisite çalışmaları. Her toksisite çalışması için, sıçanlar rastgele olarak yeterli gruplara ayrıldı (tek ve 4-haftalık toksisite çalışmaları için kontrol, doz 1, doz 2 ve doz 3; 1- için kontrol, doz 1 ve doz 2 haftalık toksisite çalışması) Path/Tox sistemini (sürüm 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, ABD) kullanarak. Toksisite çalışmasında, ifosfamid intraperitoneal (İP) yoldan uygulandı ve kontrol grubuna distile su (DW) verildi. Toksisite çalışmasında kullanılan ifosfamid dozu şu şekildeydi: akut toksisite çalışması (12.5, 25 ve 50 mg/kg), 1-haftalık toksisite çalışması (75 ve 100 mg/kg BW/gün) ve {{19 }}haftalık toksisite çalışması(25, 50 ve 70 mg/kg BW/gün). Hayvanların genel klinik semptomları, vücut ağırlığı ve mortalitesi uygulama sırasında günlük olarak kaydedildi ve tüm hayvanlar son ifosfamid uygulamasından 24 saat sonra kurban edildi. Kan örnekleri toplandı ve serum biyokimyası ve hematolojik analiz için sırasıyla mikrosantrifüj tüplerine ve EDTA-K2 tüplerine yerleştirildi. Karaciğer ve böbrek dokuları formaldehit içinde sabitlendi ve histopatolojik analize tabi tutuldu. Subakut toksisite çalışmasından (100 mg/kg BW/gün) karaciğer ve böbrek dokuları üzerinde ek immünohistokimya, mikroarray analizi ve gerçek zamanlı RT-PCR gerçekleştirilmiştir.

4.3. Hematolojik ve Serum Biyokimyasal Analizleri

Standart hematolojik testler, bir ADVIA 120 hematoloji sistemi (Bayer, Fernwald, Almanya) kullanılarak yapıldı. Aşağıdaki göstergeler kullanıldı: beyaz kan hücresi sayısı (WBC), kırmızı kan hücresi sayısı (RBC), hematokrit (HCT), hemoglobin konsantrasyonu, ortalama korpüsküler hacim (MCV), ortalama korpüsküler hemoglobin (MCH), trombosit sayısı (PLT), lenfosit (LYM), monosit (MON), nötrofil (NEU), bazofil (BAS), eozinofil (EOS) ve büyük boyanmamış hücreler (LUC) ve retikülosit (RET) sayısı.

Biyokimya tahlili, santrifüjlenmiş serumlu bir otomatik analizör (TBA 120FRNEO; Toshiba Corp., Tokyo, Japonya) kullanılarak gerçekleştirildi. Ana biyokimyasal göstergeler alanin aminotransferaz (ALT), aspartat aminotransferaz (AST), alkalin fosfataz (ALP), kan idrar azotu (BUN), kreatinin (CREA), glukoz (GLU), toplam kolesterol (TCHO), albümin/globulin oranıydı. (A/G), trigliseritler (TG), toplam bilirubin(TB), gama-glutamil transferaz (GGT), fosfolipidler (PL), kalsiyum, klorür, inorganik sodyum, fosfor ve potasyum.

4.4. Histopatolojik ve İmmünohistokimya İncelemesi

Parafine gömülü dokular 5-µm kalınlığında kesitler alındı, hematoksilen ve eozin (H&E) ile boyandı ve mikroskobik olarak incelendi.

Böbrek dokusu immünohistokimyaya tabi tutuldu. Parafinden arındırılmış ve yıkanmış kesitler, spesifik olmayan boyamayı engellemek için yüzde 10 keçi serumu ile ön inkübe edildi. Slaytlar daha sonra gece boyunca birincil anti-KIM1 antikoru (1:750; Santa Cruz, CA, ABD) ile inkübe edildi. Birincil antikorların çıkarılmasından sonra kesitler VECTASTAIN Elite ABC HRP Kiti (Vector Laboratories, Peterborough, UK) ile işlendi ve KIM1 ekspresyonu ışık mikroskobu altında incelendi.

4.5. Mikroarray Analizi ve Protein-Protein Etkileşimi (PPI) Analizi

1-hafta (100 mg/kg) grubundan karaciğer ve böbrek homojenize edildi ve toplam RNA, bir RNase mini kiti (Qiagen) ile ekstre edildi. cDNA sentezi, bir cDNA Sentez Kiti (Affymetrix, Affymetrix, Santa Clara, CA, ABD) kullanılarak sağlandı ve mikrodizi ve PPI analizlerine tabi tutuldu.

Mikrodizi analizi, Affymetrix GeneChip Rat {{0}} kullanılarak yapıldı.0 GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix Santa Clara, CA, ABD) ve sonuçlar GeneSpring GX v13.0 analiz yazılımı (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ABD) kullanılarak işlendi. İfosfamid uygulamasından sonra 1.5-kattan fazla değişen diferansiyel olarak eksprese edilen genler (DEG'ler), Tukey'nin post hoc testi ile tek yönlü bir varyans analizi (ANOVA) kullanılarak seçildi. Seçilen DEG'lerin biyolojik işlevleri ve kanonik yolları, Ingenuity Pathway Analysis yazılımı (IPA, sürüm 9.0; Ingenuity Systems, Redwood City, CA, ABD) kullanılarak analiz edildi ve olası yukarı akış düzenleyicilerini tanımlamak için bir yukarı akış düzenleyici analizi yapıldı. ifosfamid toksisitesinden türetilen DEG'lerden sorumlu olun. DEG'lerin ek protein-protein etkileşimi (PPI) ağ analizi, STRING yazılımı (versiyon 10) kullanılarak yapıldı ve etkileşim, ortam güven puanı 0.4'ün üzerinde olduğunda doğrulandı. Protein etkileşimi, Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi yolundaki iki protein arasında tahmin edilen bir bağlantının var olduğu yaklaşık olasılıktır.

4.6. Nicel Gerçek Zamanlı RT-PCR Çalışması

Mikrodizi çalışmasında ortak düzenleyici genlerin ifadesi, nicel gerçek zamanlı RT-PCR kullanılarak doğrulandı. Gene özgü primerler Bioneer'den (Daejeon, Kore) elde edildi. Primer dizileri aşağıdaki gibidir: interferon düzenleyici faktör 7 (IRF7): ileri, 5-TGCTTGTCTAGCACCAATAG-3 ve ters, 5-CACAAGGTCCACTAGAGATG-3; ubiquitin spesifik peptidaz 18 (USP18): ileri, 5-CTGTAGTTTGTCTCCCAACA-3 ve ters 5-GAACTGATTACCTCCCACTG-3; 2(RSAD2): ileri, 5-ACCAATCATCAGAGGTTGAC-3 ve geri, 5-CTGCATGATTGTTCTTGGAC-3 içeren radikal S-adenosil metiyonin alanı; interferon ile uyarılan gen 15 (ISG15): ileri, 5-AAGTCTCCCCAAGACCAATTC-3ve geri, 5-CTACATTGGCTCTGGATAGG-30.

Toplam RNA, üreticinin talimatlarına göre SuperScript II (Invitrogen, Carls bad, CA, ABD) ve oligo-dT primerleri kullanılarak cDNA'ya ters kopyalandı. Yukarı akış düzenleyici ile ilgili genlerin mRNA ekspresyon seviyeleri, üreticinin protokolüne göre, bir SYBR Green ana karışımı (Applied Biosystems) ile StepOnePlus Real-Time PCR Sistemi (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, ABD) kullanılarak analiz edildi. 18S ribozomal RNA primeri dahili kontrol olarak kullanıldı ve sonuçlar normal kontrol grubuna göre kat değişimi olarak ifade edildi.

4.7. İstatistiksel analiz

Veriler, çoklu karşılaştırma yöntemleri kullanılarak istatistiksel olarak analiz edildi. Bartlett testi, varyans homojenliğinden önemli bir sapma göstermediğinde, grup ortalamalarından herhangi birinin p < {{0}}.05="" anlamlılık="" düzeyinde="" farklılık="" gösterip="" göstermediğini="" belirlemek="" için="" varyans="" analizi="" (anova)="" kullanıldı.="" ek="" olarak,="" anova="" testinden="" elde="" edilen="" veriler="" anlamlı="" bulunduğunda="" kontrol="" ve="" tedavi="" grupları="" arasındaki="" verilerdeki="" farklılıkları="" belirlemek="" için="" dunnett="" testi="" kullanıldı.="" ayrıca,="" bartlett="" testinden="" varyans="" homojenliğinden="" önemli="" sapmalar="" gözlemlendiğinde,="" grup="" ortalamalarından="" herhangi="" birinin="" p="">< 0.05'te="" farklılık="" gösterip="" göstermediğini="" belirlemek="" için="" parametrik="" olmayan="" bir="" karşılaştırma="" testi="" olan="" kruskal-wallis="" (h)="" testi="" yapıldı.="" kruskal-wallis="" (h)="" testinde="" anlamlı="" bir="" fark="" gözlemlendiğinde,="" ortalamadan="" önemli="" ölçüde="" farklı="" olan="" belirli="" grup="" verisi="" çiftlerini="" ölçmek="" için="" dunn's="" rank="" alt="" testi="" yapıldı.="" fisher'in="" kesin="" testi,="" veri="" çiftlerini="" (prevalans="" ve="" yüzde="" dahil)="" karşılaştırmak="" için="" yapıldı.="" olasılık="" düzeyi="" yüzde="" 1="" veya="" 5="" olarak="" ayarlandı.="" path/tox="" (versiyon="" 4.2.2,="" xybion="" medical="" systems="" corporation,="" lawrenceville,="" nj,="" abd)="" kullanılarak="" farklı="" tedavi="" gruplarından="" alınan="" veriler="" ile="" kontrol="" grubunun="" verileri="" karşılaştırılarak="" istatistiksel="" analizler="">

Veri Kullanılabilirlik Bildirimi:

Veriler makale veya Ek Materyaller içinde yer almaktadır.

Çıkar çatışmaları:

Yazarlar, rekabet eden çıkarları olmadığını beyan eder.

Referanslar

1. Palmerini, E.; Setola, E.; Grignani, G.; D'Ambrosio, L.; Komando, A.; Righi, A.; Longhi, A.; Cesari, M.; Paioli, A.; Hakim, R.; et al. Nükseden ve rezeke edilemeyen yüksek dereceli osteosarkom hastalarında yüksek doz ifosfamid: Retrospektif bir seri. Hücreler 2020, 9, 2389. [CrossRef]
2. Klastersky, J. İfosfamidin yan etkileri. Onkoloji 2003, 65, 7–10. [Çapraz Referans]
3. Sprangers, B.; Lapman, S. İfosfamidin büyüyen ağrıları. Klinik. Böbrek J. 2020, 13, 500–503. [Çapraz Referans]
4. İlyas, AD; Ayaş, LJ; Wheeler, C.; Schwartz, G.; Tepler, İ.; McCauley, M.; Mazanet, R.; Schnipper, L.; Frei, E., 3.; Antman, KH Otolog hematopoietik kök hücre destekli yüksek doz ifosfamid/karboplatin/etoposid: Güvenlik ve geleceğe yönelik talimatlar. Semin. Onkol. 1994, 21, 83-85. [PubMed]
5. Mollenkopf, A.; Du Bois, A.; Meerpohl, HG İfosfamidin neden olduğu çoklu organ toksisitesinin sıralı seyri ve ileriye dönük yönetimi. Geburtshilfe Frauenheilkd. 1996, 56, 525-528. [Çapraz Referans]
6. Aleksa, K.; Matsell, D.; Krausz, K.; Gelboin, H.; İto, S.; Gelişmekte olan böbrekte Koren, G. Sitokrom P450 3A ve 2B6: İfosfamid nefrotoksisitesinin etkileri. Pediatr. Nefrol. 2005, 20, 872-885. [CrossRef] [PubMed]
7. Lowenberg, D.; Diken, CF; Desta, Z.; Flockhart, DA; Altman, RB; Klein, TE PharmGKB özeti: İfosfamid yolakları, farmakokinetik ve farmakodinamik. farmakogenet. Genom. 2014, 24, 133. [CrossRef] [PubMed]
8. MacAllister, SL; Martin-Brisac, N.; Lau, V.; Yang, K.; O'Brien, PJ Acrolein ve kloroasetaldehit: Hücre ve hücre içermeyen toksisite biyobelirteçlerinin incelenmesi. Kimya Biol. Etkileşime girmek. 2013, 202, 259–266. [Çapraz Referans]
9. Kim, J.; Shin, M. Gen ekspresyonu verilerini kullanarak çok organlı ilaca bağlı toksisite tahmininin bütünleştirici bir modeli. BMC Biyoinform. 2014, 15, S2. [Çapraz Referans]
10. Alexander-Dann, B.; Pruteanu, LL; Oerton, E.; Sharma, N.; Berindan-Neagoe, I.; Modos, D.; Bender, A. Toksikogenomikteki gelişmeler: Gen ekspresyon verilerinden bileşik kaynaklı toksisiteyi anlamak ve tahmin etmek. Mol. Omics 2018, 14, 218–236. [Çapraz Referans]
11. An, YR; Kim, JY; Kim, YS Çoklu organ toksisitesini değerlendirmek için öngörücü bir modelin inşası. Mol. Hücre Toksikolü. 2016, 12, 1–6. [Çapraz Referans]
12. Binotto, G.; Trentin, L.; Semenzato, G. İfosfamid ve siklofosfamid: İmmün gözetim üzerindeki etkiler. Onkoloji 2003, 65, 17–20. [Çapraz Referans]
13. Schwerdt, G.; Gordjani, N.; Benesiç, A.; Freudinger, R.; Wollny, B.; Kirchhoff, A.; Gekle, M. Chloroacetaldehyde- ve akrolein, insan proksimal tübül hücrelerinin ölümüne neden oldu. Pediatr. Nefrol. 2006, 21, 60-67. [Çapraz Referans]
14. Ensergueix, G.; Palet, N.; Joly, D.; Levi, C.; Chauvet, S.; Trivin, C.; Augusto, JF; Boudet, R.; Abudagga, H.; Touchard, G.; et al. Erişkin hastalarda ifosfamid nefrotoksisitesi. Klinik. Böbrek J. 2020, 13, 660–665. [Çapraz Referans]
15. Dechant, KL; Brogden, RN; Pilkington, T.; Faulds, D. İfosfamid/mesna. Antineoplastik aktivitesinin, farmakokinetik özelliklerinin ve kanserdeki terapötik etkinliğinin gözden geçirilmesi. Uyuşturucular 1991, 42, 428-467. [Çapraz Referans]
16. Pronk, LC; Schrijvers, D.; Schellens, JHM; De Bruijn, EA; Dikim, A.; Locci-Tonelli, D.; Groult, V.; Verweij, J.; Van Oosterom, AT Faz I ilerlemiş katı tümörlü hastalarda docetaxel ve ifosfamid üzerinde çalışma. Br. J. Kanser. 1998, 77, 153-158. [CrossRef] [PubMed]
17. Skinner, R. Çocuklarda kronik ifosfamid nefrotoksisitesi. Med. Pediatr Oncol. 2003, 41, 190–197. [Çapraz Referans]
18. Keskin, P.; Vilano, JS Laboratuvar Faresi; CRC Press: Boca Raton, FL, ABD, 2012.
19. Cheung, MC; Jones, RL; Judson, I. Sarkom tedavisinde ifosfamid ile akut karaciğer toksisitesi: Bir olgu sunumu. J. Med. Case Rep. 2011, 5, 180. [CrossRef]
20. Cui, Y.; Paules, RS İlaca bağlı toksisite mekanizmalarını anlamada transkriptomik kullanımı. Farmakogenomik 2010, 11, 573–585. [Çapraz Referans]
21. Snouber, LC; Jacques, S.; Monge, M.; Legallais, C.; Leclerc, E. İfosfamidin mikroakışkan biyoçiplerde yetiştirilen MDCK hücreleri üzerindeki etkisinin transkriptomik analizi. Genomik 2012, 100, 27–34. [CrossRef] [PubMed]
22. Dirven, HA; Megens, L.; Oudshoorn, MJ; Dingemanse, MA; van Ommen, B.; Van Bladeren, sitostatik ilaç ifosfamidin PJ Glutatyon konjugasyonu ve insan glutatyon S-transferazlarının rolü. Kimya Araş. Toksikol. 1995, 8, 979-986. [Çapraz Referans]
23. Jeelani, R.; Jahanbakhsh, S.; Kohan-Ghadr, İK; Thakur, M.; Han, S.; Aldhaheri, SR; Yang, Z.; Andreana, P.; Morris, R.; Abu-Soud, HM Mesna (2-merkaptoetan sodyum sülfonat), miyeloperoksidazın düzenleyicisi olarak işlev görür. Ücretsiz Radic. Biol. Med. 2017, 110, 54–62. [Çapraz Referans]

24. Alnahdi, A.; John, A.; Raza, H. N-asetil sistein, pankreas Rin-5F hücrelerinde yüksek glikoz/yüksek palmitik asit tedavisinin neden olduğu oksidatif stresi ve glutatyona bağlı redoks dengesizliğini hafifletir. PLoS BİR 2019, 14, e0226696. [Çapraz Referans]

25. Zhang, L.; Pagano, JS IRF-7, Epstein–Barr virüs gecikmesi ile ilişkili yeni bir interferon düzenleyici faktör. Mol. Hücre Biol. 1997, 17, 5748-5757. [Çapraz Referans]
26. Pagano, JS Virüsleri ve lenfomalar. N. Engl. J. Med. 2002, 347, 78-79. [Çapraz Referans]
27. Romieu-Mourez, R.; Solis, M.; Nardin, A.; Goubau, D.; Baron-Bodo, V.; Lin, R.; Massie, B.; Salcedo, M.; Hiscott, J. İnsan makrofajlarının antitümör özelliklerinin aktivasyonunda IFN düzenleyici faktör (IRF)-3 ve IRF-7 için farklı roller. Kanser Araş. 2006, 66, 10576–10585. [Çapraz Referans]
28. Ning, S.; Pagano, JS; Barber, GN IRF7: Etkinleştirme, düzenleme, değişiklik ve işlev. Genler Bağışıklık. 2011, 12, 399–414. [Çapraz Referans]
29. Chen, PG; Guan, YJ; Zha, GM; Jiao, XQ; Zhu, HS; Zhang, CY; Wang, YY; Li, HP Domuz IRF3/IRF7, bir TLR4 sinyal yolu aracılığıyla inflamatuar yanıtları hafifletir. Oncotarget 2017, 8, 61958. [CrossRef]
30. Stout-Delgado, HW; Yang, X.; Walker, BİZ; Tesar, BM; Goldstein, DR Yaşlanma, TLR9 aktivasyonu sırasında plazmasitoid dendritik hücrelerde IFN düzenleyici faktör 7 yukarı regülasyonunu bozar. J. İmmünol. Araş. 2008, 181, 6747-6756. [Çapraz Referans]