JAK İnhibitörü, Glomerüler Hücrelerde COVID-19-sitokin kaynaklı JAK-STAT-APOL1 Sinyalini ve İnsan Böbreği Organoidlerinde Podositopatiyi Bloke Ediyor Ⅱ

Sonuçlarımız mevcut interferon kaynaklı paradigmayı değiştiriyorAPOL1-nefropati. Çeşitli örnekleryüksek riskli taşıyıcılarda glomerülopatinin çökmesine neden olan yüksek interferon durumlarıAPOL1genotipAPOL1-aracılı maddenin ikinci vuruştaki başlıca tetikleyicileri olarak interferonlara ayrıcalık tanıyan bir paradigmaya yol açtıglomerülopati (31, 36, 37). Bu paradigma, interferon alfa, beta,ve gama kaynaklıAPOL1kültürlenmiş podosit ve endotel hücre hatlarında ekspresyon (22). Fakat,Bu arketip, interferonların serumda her zaman yükselmediği gözlemiyle çelişmektedir.olan hastalarCOVID{0}} enfeksiyonuve COVAN, oysa IL-6, IL-1 dahil diğer sitokinler , ve IL-18arttırılmıştır (4, 17, 18). Bu çalışmada interferonların yokluğunda bile şunu gösterdik:bu interferon olmayan sitokinler ayrı ayrı ve toplu olarak sağlamlığı indüklediAPOL1insandaki ifadepodositler ve GEC'ler aynı zamanda daha önce takdir edilmemiş bir sinerjiyi de vurgulamaktadır. GöstererekJAK-STAT sinyallemesinin bu birleşik sitokin etkilerinin merkezi aracısı olduğunu gösteriyor, sonuçlarımız şunu sağlıyor:COVID-19 sitokin fırtınasının nasıl ilerlediğine dair makul bir açıklamaAPOL1ifade ve yüksekRisk varyantı olan hastalarda görülen kollabe glomerülopati insidansıAPOL1VeCOVID{0}}enfeksiyon. Bu bulguların başkaları için etkileri olabilirAPOL1-aracılı nefropatiler. 

Daha fazla bilgi için lütfen bizimle iletişime geçin:

E-posta:wallence.suen@wecistanche.com

Tel/Whatsapp: +86 15292862950

Sonuçlarımız bunu gösterirkenCOVID{0}}indüklenen sitokinlertetiklemek için yeterlidirAPOL1ifadeve kaybına neden olurböbrek mikro-organoid podositleriSAR'ların olasılığını dışlamazlar.CoV-2 yakın zamanda bildirildiği gibi böbrek hücrelerini de doğrudan enfekte edebilir (38, 39). Ancak SARs-CoV-2insan böbrek dokusunda sadece otopsi örneklerinde gösterilmiştir.doku otolizinin katkısı göz ardı edilememektedir (3, 4, 15, 16). Böbrek biyopsilerinden çoğu raporCOVAN'lı hastaların %50'si hassas yöntemler kullanılmasına rağmen SARs-CoV-2 virüsünü tespit edememiştir (3, 4),Bu çalışmada immünohistokimya ile test edilen dokuz vakanın ikisi dahil veyerinde hibridizasyon.

Sitokin kaynaklı podositopatiyi göstererek böbrek mikro-organoid modelimiz,yakın zamanda yayınlandıböbrek organoidiLiu ve arkadaşlarının APOL{0}}aracılı böbrek hastalığı modeliAfrikalı olmayan bir donörün CRISPR ile düzenlenen iPSC'lerinden böbrek organoidleri oluşturuldu; burada G0APOL1aleller G1 alellerine dönüştürüldü ancak G0 genetik arka planına dayanıyordu. İnterferon gama kaynaklıAPOL1organoidlerinde ekspresyonu sitotoksisiteye neden olmamıştır (40). Sitotoksisitenin bulunmamasıböbrek organoidimodel, G1 mutasyonlarının dayandığı daha az toksik genetik arka planı açıklayabilirüst üste bindirildi. sitotoksisitesinin olduğu bilinmektedir.APOL1Haplotip genetiğinden etkilenirarka plan (41).böbrek mikro-organoidBu çalışmada düzenlenmemiş iPSC'lerden oluşturulmuşturG1G2 genotipinin Afrika kökenli Amerikalı taşıyıcısı. Yerli genetik haplotipin korunması,ülkemizde görülen APOL1-ilişkili sitotoksisiteye katkıda bulunmuştur.böbrek mikroorganoidleri. 

Ayrıca, burada rapor ettiğimiz yukarı regüle edilmiş APOL1 protein ekspresyonunun aksine, yeni bir çalışmahiçbir fark bulunamadıAPOL1COVAN'lı bir hastanın böbrek biyopsisindeki mRNA düzeyi ile karşılaştırıldığındasağlıklı kontroller (26). Sonuçlarımızdaki bu anlaşmazlık geçici doğası ile açıklanabilir.APOL1Özellikle biyopsiler ilk biyopsiden birkaç hafta sonra alındığında proteine ​​göre mRNACOVID-19-'in akut etkilerinin sitokin fırtınasını tetiklediği vekarşılık gelen mRNA ekspresyon profili dağılmış olabilir. Daha uzak olanı düşünülebilirCOVİD-19-indüklenen sitokin fırtınasından sonra akut faz reaktanları aşağı akışta o kadar zayıf olurfosforile edilmiş STAT proteinleri dahil olmak üzere sitokin reseptörü haline gelir veAPOL1mRNA. Sonuçlarımızindüklenen APOL1 proteininin ötesinde devam ettiğini öne sürüyorAPOL1mRNA ve fosforile edilmiş STAT'lar.

Bu çalışmanın üç önemli klinik anlamı vardır. Birincisi, Siyah veyaAktif veya yakın zamanda geçirilmiş COVID bağlamında glomerülopatinin çöktüğü tespit edilen İspanyol kökenli bireyler-19enfeksiyon. Ancak eğerböbrek biyopsisimümkün veya mümkün değil,APOL1Siyah genotiplemesi veyaYeni veya kötüleşen proteinürisi olan ve AKI'si olan Latin kökenli-19-COVID ile enfekte bireylerde de muhtemelenyüksek verim. İkinci olarak, birden fazla COVID{0}indüklü sitokin, JAK-STAT'ı gereksiz şekilde etkinleştirdiği içintetikleme yoluAPOL1ekspresyonu, seçici uzaklaştırmaya dayalı terapötik bir strateji veyaHerhangi bir sitokinin inhibisyonunun COVAN'ın önlenmesinde veya tedavisinde etkili olması muhtemel değildir. Şu anda,baricitinib'in yalnızca COVID tedavisine yönelik acil kullanım izni kapsamında kullanılmasına izin verilmiştir-19ek oksijen gerektirir. Bu nedenle COVAN'a yönelik tedavi potansiyeli ciddi bir gerektirmektedir.özellikle yüksek riskli Siyah ve Hispanik taşıyıcılar için dikkate alınması gereken bir husustur.APOL1sahip olan genotiplerCOVID{0}} enfeksiyonu. Son olarak, interferon eksikliğinin ciddi hastalıklarla ilişkili olduğuna dair kanıtlara dayanarakKOVİD-19 enfeksiyonu nedeniyle, KOVİD-19 tedavisi için interferonun uygulanması önerildi. ŞundaClinicalTrials.gov'a göre bu yazının yazıldığı tarihte interferonun tedavi amaçlı kullanıldığı otuz altı klinik çalışma vardı.COVID{0}} ya devam ediyor ya da tamamlandı. Bu klinik deneylerin ardındaki mantığın aksine, bizimsonuçları, taşıyıcılarda COVID-19 enfeksiyonunun tedavisi için interferonların uygulanmasına karşı uyarıda bulunulmasını sağlar.yüksek riskAPOL1genotip çünkü interferonlar patojenik genotiplerin ekspresyonunu yukarı doğru düzenleyebilirAPOL1içindetheböbrek ve çökelti COVAN. 

Çalışmamızın bazı sınırlılıkları bulunmaktadır. Biyopsi ile kanıtlanmış dokuz çöküşten oluşan COVAN vaka serimizGlomerülopati vakaları nispeten küçük bir örneklem büyüklüğüdür ve ilişkiyi hafife almış olabiliryüksek riskli genotip ile COVAN arasında veya örnekleme yanlılığına maruz kalmış. Lojistik zorlukakut bakım ortamında aktif COVID-19 enfeksiyonu olan hastalardan böbrek biyopsisi alınması,sıklığıböbrek biyopsileribu popülasyonda. Muhtemelen aynı faktör bundan sorumludur.Bu çalışmadaki biyopsilerin çoğu, ilk teşhisten birkaç hafta veya ay sonra gerçekleştirildi.COVID{0}} enfeksiyonu. Enfeksiyöz tetikleyiciye daha yakın elde edilen böbrek biyopsilerinin analizi aşağıdakileri sağlayabilir:erken hücresel fenotiplere ilişkin ek bilgiler. Ek olarak, mevcut çalışma kiminve COVAN'ın JAK inhibitörleriyle ne zaman tedavi edileceği. Bu soruların cevapları ve kararların verilmesiCOVAN tedavisinde JAK inhibisyonunun etkinliği gelecekteki araştırmaların odak noktası olacaktır.Bu çalışma yüksek risk ilişkisini vurgulamaktadırAPOL1genotip ve JAK-STAT-APOL1'in rolüCOVAN'ın geliştirilmesine işaret ediyor. COVID-19 salgınına ilişkin anlayışımız geliştikçe,böbrek komplikasyonları konusunda klinisyenlerin ve halk sağlığı farkındalığının artırılmasına acil ihtiyaç vardırCOVID-19. COVAN tedavisine de acil ihtiyaç vardır. Çalışmamız JAK hakkında yeni veriler sunuyorAPOL1-ilişkili COVAN için güçlü terapötik adaylar olarak inhibitörler.

Yöntemler

Antikorlar ve reaktifler.

Aşağıdaki proteinlere karşı birincil antikorlar kullanıldı: APOL1 tavşananti-insan [Genentech, 3.1C1&3.7D6; Western blot [WB] 1:5000 (nihai konsantrasyon 0,05 ug/mL);Genentech, 5.17D12 [IHC] 1:4000 (nihai konsantrasyon 0,95 ug/mL) yakın tarihli rapora göre (42)];APOL1 fare anti-insan [Genentech, 4.17A5; İmmünofloresan [IF] 1:2000 (son konsantrasyon2,13 ug/mL)]; GAPDH fare anti-insan (Santa Cruz Bioteknoloji, sc47724; WB 1:200); Vinkulinfare anti-insan (Sigma-Aldrich, V9131; WB 1:200); NEPH1 fare anti-insan (Santa CruzBiyoteknoloji, sc373787; WB 1:300); WT1 tavşan anti-insan (Abcam, ab89901; WB 1:1000); STAT1fare anti-insan (Cell Signaling Technology [CST], 9176s; WB 1:1000); STAT2 tavşan anti-insan(CST, 72604: WB 1:1000); STAT3 fare anti-insan (CST, 9139; WB 1:1000); fosforileSTAT1 (Y701) tavşan anti-insan (CST, 9167; WB 1:1000); Fosforile-STAT2 (Y690) tavşan antiinsan (CST, 88410; WB 1:1000); Fosforile edilmiş STAT3 (Y705) tavşan anti-insan (CST, 9145; WB)1:2000); PODXL keçi anti-insan (R&D, AF1658; IF 1:500), E-Cadherin tavşanı anti-insan (CellSinyalleşme, 3195S; IF 1:200), NEPH1 fare anti-insan (Santa Cruz, sc-373787; IF 1:100). İkincilantikorlar arasında keçi anti-tavşan IgG, HRP'ye bağlı antikor (CST, 7074s; WB 1:1000); at karşıtıfare IgG, HRP'ye bağlı antikor (CST, 7076s; WB 1:1000); Alexa Fluor 488 konjuge eşek antifare (Jackson ImmunoResearch, 715-546-150; IF 1:1000), Alexa Fluor 594 konjuge eşek antikeçi (Jackson ImmunoResearch, 705-585-147; IF 1:1000) ve Alexa Fluor 405 konjuge eşekanti-tavşan (Thermo Scientific, A48258; 1:000). qRT-PCR için TaqMan Gen İfade TestleriAPOL1 (Hs01066280_m1), GAPDH (Hs03929097_g1) ve PECAM-1 (Hs00169777_m1) dahil.APOL1, synaptopodin ve CD31 için Böbrek İmmünohistokimya boyaması. Formalin sabitiyle başlayarakparafine gömülmüş böbrek biyopsi slaytları, antijen geri kazanımı (pH 8'de EDTA çözeltisi) ile gerçekleştirildi.0)100 derecede 56 dakika. APOL1'e (5.17D12, Genentech), sinaptopodine (Progen) karşı birincil antikorlarBiotechnik, 61094) ve CD31 (Hücre Sinyali, 3528s) 1:4000'de uygulandı (son konsantrasyon 0,95)ug/mL), 36 derecede 60 dakika boyunca sırasıyla 1:100 ve 1:1600. Kullanıma hazır HQ-konjugeikincil anti-tavşan multimerleri (760-4815) 36 derecede 12 dakika süreyle inkübe edildi. Bu takip edildi12 dakika boyunca anti-HQ HRP'nin eklenmesiyle. DAB (760-159) odada 5 dakika süreyle inkübe edildisıcaklık. Doku bölümü, oda sıcaklığında 4 dakika boyunca hematoksilin (760-2021) ile zıt boyandı.Bluing reaktifi (760-2037) oda sıcaklığında 4 dakika süreyle ilave edildi.

Kültürlenmiş hücrelerin sitokin tedavisi.

Birincil insan glomerüler endotel hücreleri, birincil podositlerinsan donör böbreğinden alt kültürlendi ve organoid türevli podositler 50ng/mL ile tedavi edildi,Aşağıdaki sitokinlerin 20ng/mL veya 10ng/mL konsantrasyonu: Rekombinant İnsan CXCL9(Biolegend, 578102); Rekombinant İnsan CXCL10 (Biolegend, 573502); Rekombinant İnsanCXCL13 (Biolegend, 573502); IL-1 (PeproTech, 200-01B); IL-15 (PeproTech, 200-15); IL-18(Biolegend, 592102); IL-8 (Biolegend, 574202); İnterferon (IFN) alfa 1 (Sigma-Aldrich, SRP4596); EĞERbeta (Peprotech, 300-02BC); IFN gama (Sigma-Aldrich, I17001); IL-6 (Peprotech, 200-06); TNF-alfa(Peprotech, 300-01A); MCP-1 (CCL2) (Peprotech, 300-04); MIP-1alfa (CCL3) (Peprotech, 300-08);IL-10 (Peprotech, 200-10); IL-7 (Peprotech, 200-07); IL-2 (Peprotech, 200-02); G-CSF (Peprotech, 300-23). 50ng/mL'lik standartlaştırılmış bir sitokin konsantrasyonu, daha önceki örneklere dayanarak önceden belirlenmiştir.COVID-19 enfeksiyonunda sitokin şok sendromlarını değerlendiren insan hücre tedavileri (17). Takip etmekdeneylerde 20ng/mL ve 10ng/mL konsantrasyonları kullanıldı. Organoid dahil sonraki tedavilerve organoid türevli podosit deneyleri 10ng/mL kullanılarak yapıldı. JAK 1/2 inhibitörü,baricitinib (INCB028050) (Selleckchem, S2851), hepsinde 10uM nihai konsantrasyonda kullanıldıdeneyler.

Birincil insan glomerüler endotel hücre kültürü. Donmuşdüşük riskli (G0G0) birincil insan stoğuglomerüler endotel hücreleri Celprogen'den (36066-05) satın alındı, çözüldü ve insanda kültürlendiglomerüler endotelyal primer hücre kültürü serumlu, antibiyotik içermeyen tam ortam (Celprogen,Tescilli hücre dışı matris (Celprogen, E36066-05-PD10 ve) ile kaplanmış plakalar üzerinde M36066-05SA)E36066-05-12Well) 37 derece ve %5 CO'da nemlendirilmiş ortamda2. Hücreler 1X kullanılarak pasajlandıTripsin EDTA (Celprogen, T1509-014). Hücreler 2'den 4'e kadar olan pasajlar arasındaki deneyler için kullanıldı.Hücreler, PECAM1 gen ekspresyonunda (endotel hücresi) zenginleşmeyi gösteren qRT-PCR ile doğrulandıişaretleyici, aynı zamanda CD31 olarak da bilinir).

Donör insan böbreği ve podosit alt kültüründen glomerüler izolasyon.İnsan donör böbreğiUlusal Hastalık Araştırma Değişimi (NDRI) aracılığıyla temin edilmiştir. Donör APOL1 genotipiG0G1. Glomerüler izolasyon, önceki yayından uyarlanan eleme yöntemi kullanılarak gerçekleştirildi (43,44). Kısaca, steril bir kap içinde buz üzerinde çalışılırken, böbrek ilk önce dekapsüle edildi ve sagittal olarak ikiye bölündü.. Medulla disseke edildi ve korteks kaldı. Daha sonra korteks kıyıldıve sırasıyla paslanmaz çelik ağlı eleklerden (425μm, 250μm boyutlarında) geçirildi veönceden soğutulmuş Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile sık sık yıkarken üçüncü bir eleğin (150 µm) üst kısmı%1 BSA ile (kalsiyum ve magnezyum olmadan) (Endecotts, Sieves 100SIW.150, 100SIW.250,100SIW.425). Glomerüller toplandı, santrifüjlendi ve 5 mL PBS içerisinde yeniden süspanse edildi. 10μL numuneNucBlue Live ReadyProbes Reaktifi (Hoechst 33342) (Thermo Fisher Scientific,R37605) ve ışık mikroskobu ile görselleştirildi. Glomeruli daha sonra sindirim tamponunda inkübe edildi[DMEM/F12, (kollajenaz I, IV ve V), DNAse I'in (50 U/mL veya 50 µg/mL) her biri 1 mg/mL] 37 derecedeTek hücre süspansiyonu elde etmek için 1 saat (Thermo Fisher Scientific, 10565018; StemCell Technologies,07415m 07426, 07430; Sigma-Aldrich, 11284932001). %10 FBS'li DMEM/F12 (Ar-Ge Sistemleri,Sindirimi durdurmak için S10350H) ilave edildi ve numune, 4 derecede 450 g dakikada santrifüj edildi.İzole edilmiş podositler, %10 FBS içeren Gelişmiş RPMI'de (Fischer Scientific, MT10040CV) alt kültürlendi.ve vitronektin kaplı plakalarda %1 penisilin-streptomisin (Thermo Fisher Scientific, 15070063)(StemCell Technologies, 07004) 37 derecede ve %5 CO2. Alt kültürlenmiş hücreler ~5 günde görünür hale geldi ve2 hafta kültürde bekletildikten sonra tedavi edildi.

Protein ekstraksiyonu ve Western blotlama.Tüm kültür plakaları ve numuneler 4 derecede tutuldu. Tek katmanlıHücrelerin tamamı lize edildi ve Hücre Lizis Tamponu (Hücre Sinyali, 9803) ile tam olarak toplandımini proteaz inhibitörü ve fosfataz inhibitörü (Sigma-Aldrich, 04693159001, 04906837001).

Numunelerin her biri 10 saniye boyunca seviye 4'te sonikasyona tabi tutuldu, 12000 rpm x 5 dakika hızında santrifüjlendi, süpernatanyeni bir Eppendorf tüpünde toplandı ve protein konsantrasyonu BCA protein tahlili ile belirlendi.(Pierce, 23225). Protein lizatları 4x LaemmLi örnek tamponu 2-merkaptoetanol ile seyreltildi(BioRad, 1610747; Thermo Fisher, 21985023) ve 95-100 derecede 5 dakika ısıtıldı. Protein lizatlarıdaha sonra Criterion TGX lekesiz jeller (%4-20) kullanılarak ayrıldı ve Bio-Rad Trans kullanılarak aktarıldıBlot Turbo transfer sistemi. Aktarılan membranlar Tris tamponlu %3 yağsız sütte 1 saat süreyle bloke edildisalin ve spesifik primer antikorlarla gece boyunca 4 derecede inkübe edildi. Ertesi gün sonrastandart yıkama, membranlar yaban turpu peroksidaz konjuge sekonder ile inkübe edildiBio-Rad ChemiDoc MP Görüntüleme Sistemi ile görüntülemeden önce oda sıcaklığında en az 1 saat boyunca antikorüreticinin talimatlarına göre.

RNA ekstraksiyonu ve qRT-PCR.RNA, RLT liziz tamponu kullanılarak hücre tek katmanından izole edildi veQiagen RNEasy Mini Kiti (74106) üreticinin talimatlarına göre. RNA kullanılarak cDNA'ya kopyalandıInvitrogen SuperScript IV Ters Transkriptaz reaktifleri ve protokolü (Thermo Fisher, 18091050).qRT-PCR reaksiyonları Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix ile gerçekleştirildi(Fischer Scientific, 44-445-57) ve QuantStudio 6 Flex Sistemi kullanılarak Gen İfadesi Testleri(Thermo Fisher Scientific) ∆∆C kullanarakt Referans geni olarak GAPDH'yi kullanan yöntem.

Genotipleme.DNA, QIAamp DNA FFPE Doku Kiti kullanılarak FFPE doku bloklarından ekstrakte edildi(Qiagen, 56404) üreticinin protokolüne göre. Genotipleme Applied Biosystems kullanılarak yapıldıG1 SNP (p.Ser342Gly) ve G2 polimorfizmi için Taqman alelik ayrım analizleri(p.Asn388_Tyr389del) QuantStudio 6 Flex Sistemi kullanılarak. Bu testin %100 analitik özgüllüğü vardır vetespiti için 1.0ng DNA'nın analitik duyarlılığı (tespit sınırı)APOL1DNA'daki risk varyantlarıperiferik kan monositlerinden ekstrakte edilir. Testler daha önce sonuçların karşılaştırılmasıyla doğrulanmıştı.doğrudan sıralama (Sanger sıralaması). Genotipleme kalite kontrol önlemleri şunların kullanımını içeriyordu:teknik kopyalar, her genotipin pozitif kontrollerinin ve negatif kontrollerinin %100 eşleşmesi.

G1G2 hastası iPSC böbrek mikro organoidinin türetilmesi.Böbrek mikro-organoitleri şu şekilde türetilmiştir:bazı değişikliklerle yayınlanmış protokol (27). Kısaca uyarılmış insan pluripotent kök hücreleri (iPSC)TrypLE Select kullanılarak tek hücrelere ayrıştırıldı ve vitronektin kaplı plakalara ekildi.10uM Rho kinaz inhibitörü (Tocris) ile StemFlex ortamı (Thermo Fisher Scientific, A3349401)Bioscience, 1254) 11,000-14,000 hücre/cm yoğunlukta2 ve nemli ortamda kültüre edildi.37 derece ve %5 CO2. Hücreler daha sonra TeSR-E6 ortamına (Stemcell Technologies, 05946) aktarıldı.4 gün boyunca 8 uM CHIR99021 (Tocris Bioscience, 4423). 5. günden 7. güne kadar hücreler,200 ng/mL FGF9, 1 µg/mL heparin ve 1 µM CHIR99021. 7. günde hücreler PBS ile yıkandı veTrypLE ile ayrışır. Ayrışmış hücreler daha sonra düz DMEM ile yıkandı ve5 dakika boyunca 300xg. Hücre topağı Aşama 1 ortamında [200 ng/mL içeren TeSR-E6] yeniden süspanse edildiFGF9, 1 µg/mL heparin, 1 µM CHIR99021, %0,1 PVA, 10 µM Rho kinaz inhibitörü (Tocris Bioscience)]ve yaklaşık 1,2 milyonda bir 24-kuyu AggreWell 400 plakasına (Stemcell, 34411) aktarıldıhücreler / kuyu. Plaka daha sonra 100xg'de 3 dakika santrifüj edildi ve 37 derecede 48 saat inkübe edildi ve%5 CO2 standart bir hücre kültürü kuluçka makinesinde. 48 saat (gün7+2) sonra AggreWell'den gelen organoidlerStage2 ortamına sahip bir 6-iyi düşük bağlantı plakasına aktarılır [200 ng/mL FGF9, 1 içeren TeSR-E6µg/mL heparin, 1 µM CHIR99021, %0,1 PVA] hücre inkübatörü içindeki yörünge çalkalayıcı üzerinde 72 dakika dahasaat. 7+5. günden itibaren, tüm organoidler Aşama 3 ortamıyla [TeSR-E6 içeren] yenilendiDenemeler için kullanılana kadar alternatif günlerde 0%1 PVA).

Mikro organoidlerden podosit izolasyonu.Glomerüllerin böbrek organoidlerinden izolasyonudaha önce açıklanan protokol (45). Kısaca, iPSC'den türetilmiş böbrek organoitlerinin grupları bir başlangıç ​​ile1,2x10 başlangıç ​​hücre numarası6 iPSC'ler, TrypLE seçimi (ThermoFisher) 37 derecede 5 dakika süreyle. Yardımcı olması için her 2-3 dakikada bir 1 mL'lik bir pipet kullanılarak hafifçe karıştırma uygulandı.ayrışma. Grup başına, 50 mL'lik bir tüpün (Falcon) üzerine tek bir 70 µm'lik hücre süzgeci (PluriSelect) yerleştirildi.ve ağ PBS ile hidratlandı. Hücre çözeltisi, 1 mL'lik bir pipet kullanılarak eklendi ve akışa izin verildi.çözüm yerçekimi ile. 1 mL steril şırınganın pistonu kullanılarak kalan hücreSüzgeçte yakalanan çözelti ağın içinden yavaşça itildi. Süzgeç yıkandıPBS ve hücre akışının devam etmesini sağlayarak atılır. Hücre akışı daha sonra önceden hidratlanmış bir tüpe pipetlendi.40 µm hücre süzgeci (Pluriselect) ve tek hücrelere izin veren yeni bir 50 mL tüp (Falcon) üzerine yerleştiriliryerçekimi ile akacak ve kalan tek parçayı çıkarmak için eleği PBS ile kapsamlı bir şekilde yıkayacakhücreler. Daha sonra en büyük glomerüller, elek ters çevrilerek 40 µm'lik hücre süzgecinden toplandı.50 mL'lik taze bir tüp ve yakalanan glomerülleri temizlemek için PBS kullanılarak yıkandı. Bu süreçson 30 µm hücre süzgeci (PluriSelect) kullanılarak 40 µm'lik prosesten akış yoluyla tekrarlanarakdaha küçük glomerülleri toplayın. IPSC'den türetilen böbrek organoidlerinden izole edilmiş glomerüller kültürlendi.Standart bir hücre kültüründe %10 FBS içeren gelişmiş RPMI 1640'a sahip vitronektin kaplı plakalarkuluçka makinesi 37 derecede artı %5 CO2. Medya, hücreler kullanılıncaya kadar günaşırı yenilendi.deneyler.

İmmünofloresan boyama, mikro-organoid.Böbrek mikroorganoidleri PBS ile yıkandı vebuz üzerinde 30-45 dakika süreyle PBS'deki %4 PFA'da sabitlendi. Sabit organoidler daha sonra üç kez PBS ile yıkandı.ve PBS içindeki %30 sakaroz içinde gece boyunca 4 derecede inkübe edildi. Organoidler OCT'ye yerleştirildi veLaica Cryostat ile 10 µm kriyoseksiyona tabi tutuldu. Organoid kriyoseksiyonlar üç kez yıkandıkez PBS ile bloke edildi ve ardından bloke edici tampon 1 (%1 balık jelatini, %2 eşek serumu, 0%3 Triton) ile bloke edildiX-100 (PBS içinde) oda sıcaklığında bir saat süreyle bekletilir. Daha sonra, kriyoseksiyonlar primer ile inkübe edildi.antikorlar tampon 1'i gece boyunca 4 derecede bloke etti. Kriyoseksiyonlar üç kez PBS ile yıkandı. Sonrasındayıkama, kriyoseksiyonlar, oda sıcaklığında 2 saat süreyle bloke edici tampon 1'de ikincil antikorlarla inkübe edildisıcaklık. PBS ile beş yıkamadan sonra, kriyoseksiyonlar bir Prolong Glass antifade ile monte edildimontaj çözümü (Thermo Scientific, P36980). Floresan görüntüler bir ECHO kullanılarak oluşturuldumikroskop.

İmmünofloresan boyama, podosit.Podosit kültürleri PBS ile yıkandı ve %4'te sabitlendiPBS içinde PFA, oda sıcaklığında 10-15 dakika süreyle. Fiksasyondan sonra hücreler üç kez PBS ile yıkandı.ve 30-60 için bloklama tamponu 2'de (%1 balıkçı jelatini, %2 eşek serumu, 0%.1 saponin) bloke edildi.dk. Hücreler, oda sıcaklığında 2 saat boyunca bloke edici tampon 2'de birincil antikorlarla inkübe edildi.(veya gece boyunca 4 derecede). Hücreler üç kez bloke edici tampon 2 ile yıkandı veikincil antikorlar oda sıcaklığında 1 saat süreyle tampon 2'yi bloke eder. Üç yıkamadan sonraTampon 2'nin bloke edilmesi ve PBS ile son bir yıkamanın ardından hücreler bir Drop-n-Stain EverBrite ile monte edildimontaj ortamı (Biotium, 23008). Floresan görüntüler bir ECHO mikroskobu kullanılarak yakalandı.

Canlılık Testi. Hücre canlılığı ve ATP ölçümleri için organoid türevli podositler kaplandı100 uL ortamda vitronektin kaplı 96-kuyu plakasına (StemCell Technologies, 07004; Corning,CLS3603) ve Gelişmiş RPMI+10%FBS+1%PS'de (Fischer Scientific, MT10040CV; Thermo) kültürlendiFisher Scientific, 15070063) nemlendirilmiş ortamda 37 derece ve %5 CO2'de2. Organoid türetilmişpodositler eş zamanlı olarak qPCR için RNA ekstraksiyonunda kullanılmak üzere 6-kuyu plakasına yerleştirildi veimmünohistokimya (IHC) için kullanılacak bir 24-kuyu plakasına yerleştirin. Hücreler ~%80 birleşme noktasında tedavi edildialtı koşulla [kontrol, IFNG (10ng/mL), IFNG (10ng/mL) + baricitinib (son konsantrasyon 10uM),Tüm Sitokinler (10ng/mL) ve Tüm Sitokinler (10ng/mL) + barisitinib (son konsantrasyon 10uM)]. Medya48 saatte değiştirildi ve hücreler 96 saatte değerlendirildi. 96-kuyu plakası Promega kullanılarak işlendiaşağıda daha ayrıntılı olarak belirtildiği gibi hücre canlılığı ve ATP analizleri; 6-kuyu plakası RNA için işlendiekstraksiyon, cDNA sentezi ve qRT-PCR; ve 24-kuyu plakası IHC için %4 PFA'da sabitlendi. HücreTiterFlorTMHücre Canlılığı Testi (Promega, G6080) ve CellTiter-Glo® 2.0 Tahlil (Promega, G9241)üretici tarafından sağlanan standart protokol talimatları kullanılarak gerçekleştirilir. Analizler çoğaltıldıprotokol başına. Floresan (litik olmayan proteaz tahlili) ve lüminesans (litik ATP tahlili)SpectramaxM3 florometre kullanılarak ölçülmüştür. Ölçülerdeki fark Öğrencinin kararına göre belirlendi.eşleştirilmemiş t testi.

İstatistik.Tüm veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. Veriler için GraphPad Prism 8.3.1 yazılımı kullanıldıanalysis. Cytokine conditions inducing >1,5 katAPOL1ortamla işlenmiş kontrolle karşılaştırıldığında transkriptçoklu ölçümler için Holm-Sidak düzeltmeli eşleştirilmemiş bir t testi kullanılarak anlamlılık açısından analiz edildi.karşılaştırmalar. Bildirilen P değerleri düzeltilmiş p değerleridir. Anlamlılık p olarak ayarlandı<0.05.

Çalışma onayı. Bu çalışma Duke Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylandı.Kuzey Carolina. Bu belgenin vaka kısmı nedeniyle IRB tarafından hastanın bilgilendirilmiş onamına gerek duyulmamıştır.çalışma yalnızca klinik ve arşivlenmiş patolojik materyalin retrospektif bir incelemesiydi. İnsan böbreğiGlomerüler izolasyon ve podosit alt kültürü Ulusal Hastalık Araştırması aracılığıyla sağlandıDeğişim (NDRI); bu insan dokusu araştırması aynı zamanda Duke'un IRB'si aracılığıyla da ön onay aldı. NDRItüm doku kaynağı bölgelerinin doku donörü veya vekilinden bilgilendirilmiş onam almasını gerektirir.

Yazar KatkılarıSEN, GL, SD, KS ve DS deneyler gerçekleştirdi ve taslakları düzenledi. AW ve DT uygulandı vehistopatolojiyi ve IHC'yi yorumladı ve makaleyi düzenledi. GH temel reaktiflere katkıda bulundu veel yazması. SEN ve OAO çalışmayı tasarladı, verileri analiz edip yorumladı, rakamları tasarladı vetaslağı yazdı ve düzenledi.

TeşekkürBu çalışma 1DP2DK124891-01, 1R01MD016401-01 ve Whitehead Scholar Ödülü tarafından desteklenmiştir(OAO); SEN, Duke Nefroloji T32 Eğitim Bursu (5T32DK007731-24) tarafından desteklenmiştir. Teşekkür ederizAPOL1-'e özgü antikorların cömert hediyesi için Suzie Scales (Genentech). Araştırmaya teşekkür ederizDuke BRPC'deki Histoloji Laboratuvarı ve Duke Patoloji Bölümü PhotoPath'ten Steven R. Colon.

Referanslar

1. Chan L, Chaudhary K, Saha A, Chauhan K, Vaid A, Zhao S, ve diğerleri. Hastanede Yatan COVID Hastalarında AKI-19. J Am Soc Nephrol.2021;32(1):151-60.

2. Hirsch JS, Ng JH, Ross DW, Sharma P, Shah HH, Barnett RL, ve diğerleri. Hastalarda akut böbrek hasarıCOVID-19 nedeniyle hastaneye kaldırıldı.Böbrek Uluslararası2020;98(1):209-18. 

3. May RM, Cassol C, Hannoudi A, Larsen CP, Lerma EV, Haun RS, ve diğerleri. Çok merkezli retrospektif bir kohortçalışma, Coronavirüs 2019 Hastalığındaki (COVID-19) böbrek patolojisinin spektrumunu tanımlamaktadır.Böbrek Uluslararası2021.

4. Wu H, Larsen CP, Hernandez-Arroyo CF, Mohamed MMB, Caza T, Sharshir M, ve diğerleri. AKI ve ÇökenCOVID-19 ve APOL 1 Yüksek Riskli Genotip ile İlişkili Glomerülopati.J Am Soc Nephrol.2020;31(8):1688-95. 

5. Genovese G, Friedman DJ, Ross MD, Lecordier L, Uzureau P, Freedman BI ve diğerleri. dernekAfrikalı Amerikalılarda böbrek hastalığı olan tripanolitik ApoL1 varyantları.Bilim.2010;329(5993):841-5.

6. Friedman DJ ve Pollak MR. APOL1 Nefropati: Genetikten Klinik Uygulamalara.Clin J Am SocNefrol.2020. 

7. Friedman DJ ve Pollak MR. APOL1 ve Böbrek Hastalığı: Genetikten Biyolojiye.Annu Rev Physiol.2020;82:323-42. 8. Tzur S, Rosset S, Shemer R, Yudkovsky G, Selig S, Tarekegn A, ve diğerleri. APOL1'deki yanlış mutasyonlargeni, daha önce MYH9 genine atfedilen son dönem böbrek hastalığı riskiyle yüksek oranda ilişkilidir.Hım Genet.2010;128(3):345-50. 

Wecistanche Destek Hizmeti-Çin'deki en büyük cistanche ihracatçısı:

E-posta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Daha Fazla Özellik İçin Alışveriş Yapın Detaylar:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

BÖBREK ENFEKSİYONU İÇİN %25 EKİNAKOSİT VE %9 AKTEOSİT İÇEREN DOĞAL ORGANİK CISTANCHE EKSTRESİ ALIN