Karnovsky Fiksatifi, Antisens Oligonükleotid II ile Tedavi Edilen Böbreklerde Doku İşlemesinden Kaynaklanan Vakuolasyon Olarak Ortaya Çıkan Artefaktları Önler
Apr 03, 2024
Makroskopik olarak anormal bir değişiklik gözlenmedi. Ek olarak kan kimyasında böbrek parametreleri (örn. BUN ve CRE) hiçbir grupta anlamlı değişiklik göstermedi (Tablo 1).
Cistanche Takviyesi Böbrek Fonksiyon Desteği Takviyesi PhGs75% Ech 30% Act 12%
%10 NBF ile sabitlenmiş böbreklerdeki histopatolojik bulguların bir özeti Tablo 2'de gösterilmektedir. Mikroskobik olarak, hem ASO-1W'de proksimal tübüllerde, özellikle S1 ve S2 segmentlerinde bazofilik granüller ve vakuoller gözlendi. ve %10 NBF ile sabitlenmiş böbrekler için ASO-2W grupları (Şekil 1A). Bu değişiklikler ASO-2W grubunda ASO-1W grubuna göre daha şiddetliydi. Bazofilik granüllerin birikimi ağırlıklı olarak proksimal tübüllerin fırçamsı kenarlarında agregatlar ve/veya noktasal yapılar halinde gözlendi. Bazofilik granüllerin hem endozomlarda hem de lizozomlarda ve proksimal tübüler epitelyumun14 sitoplazmasında serbestçe mevcut olduğu bildirildiğinden, bu farklı formlar birikmiş alanlarını yansıtabilir; yani agregatlar ve noktasal yapılar sırasıyla lizozomlarda ve sitoplazmada birikebilir. Proksimal tübüllerdeki vakuoller yuvarlak ve kaba şekilliydi ve çoğu komşu vakuollerle kaynaşmıştı. Üstelik bazı vakuoller soluk bazofilik granüller içeriyordu (Şekil 1E), bu da vakuollerin ASO'ların birikmesiyle ilgili olduğunu ortaya koyuyor. İmmünohistokimyasal olarak LAMP-2, vakuollerin membran yüzeyinde pozitifti (Şekil 1G ve 1H). Sonuçlar vakuolasyonun lizozomların genişlemesi olduğunu gösterdi. ASO-1W ve ASO-2W grupları arasındaki vakuolleşmenin ciddiyeti farkı, lizozomlarda biriken ASO sayısındaki farklılığa işaret ediyor olabilir. ASO'lara maruz kalma süresi arttıkça lizozomlarda biriken ASO miktarının arttığını tahmin ediyoruz. Sonuç olarak lizozomal genişleme, doku işlenmesinden dolayı vakuolasyon olarak ortaya çıktı.
Tablo 1. Kan Kimyası Verileri
Tablo 2. %10 N ile Sabitlenmiş Böbreklerdeki Histopatolojik Bulgular
Orta derecede vakuolasyon gözlenmesine rağmen, proksimal tübüler dejenerasyon belirgin değildi ve vakuollü epitelin çoğunluğu immünohistokimyasal boyamada KIM-1 için negatifti (Şekil 1D). Bunun tersine, Karnovsky fiksatifinde sabitlenen numunelerde proksimal tübüllerdeki vakuoller tüm bireylerde mevcut değildi, oysa bazofilik granüller sıklıkla gözlendi (Şekil 1B). Bazofilik granüller, hücre yapısı iyi korunduğu için %10 NBF fiksasyonuna tabi tutulan numunelerdekilerden daha belirgindi (Şekil 1F). %4 PFA fiksasyonuna tabi tutulan numunelerde vakuoller ve bazofilik granüller gözlendi; ancak vakuolasyonun şiddeti, %10 NBF fiksasyonuna tabi tutulan numunelerdekinden biraz daha düşüktü (Şekil 1C).
Oligonükleotidler suda yüksek oranda çözünür moleküllerdir ve hücresel bileşenlerin tamamen çapraz bağlanmaması nedeniyle işlem sırasında dokulardan ekstrakte edilir.
Bu sonuçlara dayanarak, proksimal tübüllerdeki vakuollerin fiksasyon yönteminden etkilendiği ve %10 NBF ve %4 PFA fiksasyonuna tabi tutulan dokularda gözlenen morfolojik değişikliklerin, doku işleme sırasında ASO birikimi alanında artefakt olabileceği sonucuna vardık. Başka bir deyişle vakuolasyon toksikolojik olarak önemsiz olabilir çünkü hiçbir tübüler dejenerasyon, KIM-1 ekspresyonunda artış veya böbrek parametrelerinde anormal değişiklikler gözlenmedi. Bu nedenle, ASO ile tedavi edilen hayvanlarda böbreğin doğru patolojik incelemesi için Karnovsky fiksatifinin isteğe bağlı fiksasyon yöntemi olarak kullanılmasını öneriyoruz.
Sonuç olarak, mevcut bulgularımız geleneksel NBF sabitleme yöntemini kullanırken vakuolasyonun olası olduğundan fazla tahmin edildiğini ortaya çıkardı. Karnovsky fiksatifi, yapay vakuolleri gerçek nefrotoksisiteden ayırmak için yararlı bir araç olabilir.
Şekil 1. Antisens oligonükleotid (ASO) ile tedavi edilen böbreklerin temsili fotomikrografları. (A) %10 nötr tamponlu formaldehit çözeltisi (NBF) ile sabitlenmiş böbrekler için 2-hafta kilitli nükleik asit içeren antisens oligonükleotid (LNA-ASO) ile tedavi edilen grupta (ASO-2W) histopatolojik değişiklikler, ( B) Karnovsky fiksatifi veya (C) %4 paraformaldehit fosfat tamponu (PFA). (D) %10 NBF ile sabitlenmiş böbrekler için ASO-2W'nin böbrek hasarı molekülü-1 (KIM-1) için immünohistokimyasal boyama.(E) %10 NBF ve (F) Karnovsky fiksatifiyle sabitlenen böbrekler için 1-hafta LNA-ASO ile tedavi edilen grupta (ASO-1W) histopatolojik değişiklikler. %10 NBF ile sabitlenmiş böbrekler için (G) ASO-1W ve (H) ASO-2W'nin lizozomal ilişkili membran proteini 2 (LAMP-2) için immünohistokimyasal boyama. (A) Proksimal tübüllerde bazofilik granüller (siyah oklar) ve vakuoller (siyah ok uçları) gözlenir. Hematoksilen ve eozin (H&E) boyama. Bar=20 μm. (B) Vakuoller gözlenmez, ancak bazofilik granüller (siyah oklar) gözlenir. H&E boyama. Bar=20 μm. (C) Bazofilik granüller (siyah oklar) ve vakuoller (siyah ok uçları) gözlenir. Ancak vakuolasyonun şiddeti %10 NBF fiksasyonuna tabi tutulan örneklere göre daha düşüktü. H&E boyama. Bar=20 μm. (D) Vakumlu proksimal tübüllerin çoğunluğu KIM-1 açısından negatiftir. Bar=20 μm. (E, F) Proksimal tübüllerde gözlenen vakuollerin bazıları hafif bazofilik granüller içeriyordu (yeşil oklar). Bazofilik granüller açıkça görülüyor ve hücre yapısı korunuyor (yeşil ok uçları). H&E boyama. Çubuk=20 μm. (G, H) Kofulların membran yüzeyi LAMP-2 (mavi oklar) için pozitiftir. Çubuklar=20 mm.
Olası Çıkar Çatışmalarının Açıklanması: Yazarlar herhangi bir çıkar çatışmasının olmadığını beyan ederler.
Teşekkür: Yazarlar nazik tavsiyeleri için Keisuke Yoshikawa ve Tetsuya Ohta'ya minnettardır.
Referanslar
1. Rinaldi C ve Wood MJA. Antisens oligonükleotidler: nörolojik bozuklukların tedavisinde bir sonraki sınır. Nat Rev Neurol. 14: 9–21. 2018. [Medline] [CrossRef]
2. Uemura Y ve Kobayashi K. Antisens oligonükleotidler içeren kilitli nükleik asidin intratrakeal uygulanmasıyla fare alveoler makrofajlarının hedeflenmesi. İlaç Dağıtımı 26: 803–811. 2019. [Medline] [CrossRef]
3. Bennett CF. Terapötik antisens oligonükleotidler yaşlanıyor. Annu Rev Med. 70: 307–321. 2019. [Medline] [CrossRef]
4.Frazier KS. Antisens oligonükleotid tedavileri: toksikolojik patoloğun bakış açısından vaatler ve zorluklar. Toksikol Pathol. 43: 78–89. 2015. [Medline] [CrossRef]
5. Engelhardt JA. Antisens oligonükleotidlerin karşılaştırmalı renal toksikopatolojisi. Nükleik Asit Ter. 26: 199–209. 2016. [Medline] [CrossRef]
6. Frazier KS, Sobry C, Derr V, Adams MJ, Besten CD, De Kimpe S, Francis I, Gales TL, Haworth R, Maguire SR, Mirabile RC, Mullins D, Palate B, Doorten YPS, Ridings JE, Scicchitano MS , Silvano J ve Woodfine J. İkinci nesil bir antisens oligonükleotidin kronik uygulanmasını takiben farelerde ve maymunlarda glomerüler lezyonların gelişimi için birincil bileşen olarak türe özgü inflamatuar yanıtlar. Toksikol Pathol. 42: 923–935. 2014. [Medline] [CrossRef]
7. Sewing S, Gubler M, Gérard R, Avignon B, Mueller Y, Braendli-Baiocco A, Odin M ve Moisan A. GalNAc konjugasyonu, renal tübüler hücrelerdeki antisens oligonükleotid ilaçların sitotoksisitesini azaltır. Mol Ther Nükleik Asitler. 14: 67–79. 2019. [Medline] [CrossRef]
8. Kakiuchi-Kiyota S, Koza-Taylor PH, Mantena SR, Nelms LF, Enayetallah AE, Hollingshead BD, Burdick AD, Reed LA, Warneke JA, Whiteley LO, Ryan AM ve Mathialagan N. Kilitli karaciğer transkripsiyon profillerinin karşılaştırılması ribonükleik asit antisens oligonükleotidleri: farelerde hedef dışı aracılı toksisiteye katkıda bulunan farklı yolların kanıtı. Toksikol Sci. 138: 234–248. 2014. [Medline] [CrossRef]
9. Hagedorn PH, Yakimov V, Ottosen S, Kammler S, Nielsen NF, Høg AM, Hedtjärn M, Meldgaard M, Møller MR, Ørum H, Koch T ve Lindow M. Terapötik oligonükleotidlerin hepatotoksik potansiyeli dizilerinden tahmin edilebilir ve değişiklik modeli. Nükleik Asit Ter. 23: 302–310. 2013. [Medline] [CrossRef]
