Karnovsky Fiksatifi, Antisens Oligonükleotid ile Tedavi Edilen Böbreklerde Doku İşlemesinden Kaynaklanan Vakuolasyon Olarak Ortaya Çıkan Artefaktları Önler Ⅰ

Soyut: Antisens oligonükleotid(ASO) tedavileri yeni bir tedavi yöntemi olarak tanımlanmıştır.tedavi edilemez hastalıklar. İçindeASO'larla tedavi edilen böbreklerProksimal tübüllerde bazofilik granüllere ek olarak vakuoller sıklıkla görülür. Bazı raporlar bu vakuollerin büyük olasılıkla ikincil bir olay olduğunu açıklamaktadır.ASO'ların çıkarılmasıDoku işleme sırasında. Bu çalışmada, Karnovsky fiksatifi veya %4 paraformaldehit fosfat tamponu (PFA) ile fiksasyon sonrası böbrek morfolojisini %10 nötr tamponlu formaldehit solüsyonu (NBF) ile karşılaştırdık. Antisens oligonükleotidler (LNA-ASO'lar) içeren 50 mg/kg kilitli nükleik asit ile 1 veya 2 hafta boyunca dört kez intravenöz olarak tedavi edilen dişi Sprague-Dawley sıçanları incelendi. Mikroskobik olarak NBF ile tespit edilen böbreklerde proksimal tübüllerde vakuoller ve bazofilik granüller gözlendi. Bazofilik granüller ASO'ların birikiminin göstergesidir. Üstelik bazı vakuoller aynı zamanda soluk bazofilik granüller de içeriyordu; bu da vakuollerin ASO'ların birikmesiyle ilgili olduğunu ortaya koyuyor. Proksimal tübüllerde orta derecede vakuolasyon gözlenmesine rağmen, vakuollü epitelyumun çoğunluğu immünohistokimyasal boyamada böbrek hasarı molekülü-1 açısından negatifti. Karnovsky fiksasyonuna tabi tutulan örneklerde bazofilik granüller gözlenmesine rağmen proksimal tübüllerde vakuoller gözlenmedi. PFA fiksasyonuna tabi tutulan örneklerde, NBF fiksasyonuna tabi tutulan örneklere benzer şekilde proksimal tübüllerde vakuoller ve bazofilik granüller gözlendi. Genel olarak bulgularımız, geleneksel NBF fiksasyonu kullanıldığında doku işleme sırasında artefaktlar nedeniyle vakuolasyonun fazla tahmin edilme olasılığını ortaya koydu. Karnovsky'nin fiksatifi, yapay vakuolleri gerçek nefrotoksisiteden ayırmak için yararlı bir alternatif olarak kabul edilir. (DOI: 10.1293/tox.2021-0007; J Toxicol Pathol 2021; 34: 367–371)

Anahtar Kelimeler:antisens oligonükleotid, artefakt,Karnovsky'nin fiksatifi, vakuolasyon, bazofilik granül, böbrek

Cistanche Takviyesi Böbrek Fonksiyon Desteği Takviyesi PhGs75% Ech 30% Act 12%

Son zamanlarda, antisens oligonükleotid (ASO) terapileri, tedavi edilemez hastalıkların tedavisi için yeni yöntemler olarak oluşturulmuştur1, 2. ASO'lar, ribonükleik asit'e bağlanan ve gen ekspresyonunu baskılayan kısa, sentetik, tek sarmallı oligodeoksinükleotidlerdir3.

Toksikolojik olarak, ASO'nun neden olduğu toksisiteler, ASO sekansıyla ilgili olan hibridizasyona bağlı toksisiteler ve kimyasal modifikasyonla ilgili olan hibridizasyondan bağımsız toksisiteler olarak kategorize edilir. Hibridizasyondan bağımsız toksisiteler üç ana mekanizma tarafından indüklenir: 1) ASO birikimi, 2) proinflamatuar etkiler ve 3) aptamerik bağlanma etkileri4. ASO'ların birikimi öncelikle karaciğer ve böbreklerde görülür ve aşırı birikim bu organların fonksiyon bozukluklarına yol açar5. Pro-inflamatuar etki, kemirgenlerde ve maymunlarda Toll benzeri reseptörlere bağlanarak doğuştan gelen bağışıklık sisteminin uyarılmasıyla veya maymunlarda faktör H'nin ASO'lar tarafından inhibisyonu yoluyla alternatif kompleman yolunun aktivasyonuyla indüklenir6. Aptamerik bağlanma etkisi, trombosit aktivasyonunu ve trombosit spesifik reseptöre bağlanmak için agregasyonu/trombositopeniyi indükler7. Ayrıca hepatositlerdeki hücre içi proteinlere aptamerik bağlanma, hepatotoksisitenin nedenlerinden biri olarak kabul edilir8-10. Bu toksisiteleri tespit etmek için araştırmacılar çeşitli klinik olmayan testler geliştirdiler; bunlar arasında histopatolojik inceleme ASO birikimini tespit etmede en duyarlı testlerden biridir.

Histopatolojik olarak ASO'ların birikimi genellikle karaciğerdeki Kupffer hücrelerinin sitoplazmasında veya böbreklerin proksimal tübüllerinde bazofilik granüller halinde gözlenir. Bazofilik granüllerin belirgin birikimi, genellikle böbreklerdeki proksimal tübüler epitelde vakuolasyon veya dejenerasyon/nekroz olarak gözlenen dejeneratif değişikliklerin görülme sıklığı veya şiddetinin artmasıyla ilişkilidir4. Bazofilik granüller tek başına toksikolojik açıdan önemli kabul edilmez11; bu nedenle bazofilik granül birikiminin dejeneratif değişikliklerden ayrılması ASO ile ilişkili toksisitelerin değerlendirilmesi için önemlidir.

ASO ile tedavi edilen sinomolgus maymunlarının böbreklerinin proksimal tübüllerinde sıklıkla gözlenen vakuoller, bazofilik materyal içerir ve hücreler içinde bazofilik granüllerle aynı genel dağılımı sergiler11, 12. Birkaç rapor, fiksasyon sürecinin, fagolizozomal bölme içinde ASO birikiminin görünümü5, 11. Ayrıca Henry ve ark. ve Engelhardt, proksimal tübüllerdeki vakuollerin, işlem sırasında ASO'ların ekstraksiyonundan kaynaklanan ikincil bir fenomen olabileceğini, çünkü vakuollerin paraformaldehit/glutaralde hide perfüzyonla sabitlenmiş böbreklerde bulunmadığını açıkladı5, 11. Tedavi edilen sinomolgus maymunlarının proksimal tübüllerindeki vakuoller mipomersen ile fiksasyon işlemi sırasında ortaya çıktığı tahmin edildi13.

Bu nedenle, ASO tedavisine bağlı vakuolizasyon bazı durumlarda bir artefakt olsa da, bu hipotez açıkça kanıtlanmamıştır ve toksikolojik değerlendirme için uygun sabitleme yöntemini hiçbir rapor tanımlamamıştır. Buna göre, bu çalışmada Karnovsky fiksatifi veya %4 paraformaldehit fosfat tamponu (PFA) ile fiksasyon sonrası böbrek morfolojisini %10 nötr tamponlu formaldehit solüsyonu (NBF) ile karşılaştırdık. Ek olarak, artefakt kaynaklı vakuolasyonu önlemek için Karnovsky fiksatifinin alternatif bir fiksatif olarak faydasını gösterdik.

Dört haftalık dişi Sprague-Dawley sıçanları, Charles River Laboratories Japan Inc.'den (Kanagawa, Japonya) satın alındı ​​ve laboratuvar koşullarına alıştırıldı. Hayvanlar kontrollü koşullar altında tutuldu (12-saat aydınlık/karanlık döngüsü, 23 ± 2 derece sıcaklık, %50 ± 25 bağıl nem) ve standart bir ticari diyete (otoklavlanmış CR-LPF; Oriental Yeast Co., Ltd., Tokyo, Japonya) ve musluk suyu. Yirmi hayvan, aşağıdaki dört gruba ayrıldı (her birinde beş hayvan olacak şekilde): 1-haftalık salinle tedavi edilen grup (Kontrol- 1W), 2-haftalık salinle tedavi edilen grup (Kontrol{ {14}}W), antisens oligonükleotid (LNA-ASO) içeren 1-hafta kilitli nükleik asit grubu (ASO-1W) ve 2-hafta LNA ASO ile tedavi edilen grup (ASO-2W). 50 mg/kg LNA-ASO uygulamasının başlangıcında hayvanlar 5 haftalıktı. LNA-ASO, aşağıdaki rejime göre toplamda dört kez intravenöz olarak uygulandı: ASO-2W grubunda 1, 4, 8 ve 11. günler; ve ASO-1W grubunda 1, 2, 3 ve 4. günler. Kontrol-1W ve ASO-1W gruplarındaki hayvanlar 7. günde feda edildi. Kontrol-2W ve ASO-2W gruplarındaki hayvanlar ise 7. günde feda edildi 14. Her terminal otopsisinde, izofluran ile derin anestezi altında abdominal vena kavadan klinik patolojiye yönelik kan örnekleri toplandı. Kan numunesi alındıktan sonra tüm sıçanlara abdominal aorta hemen kesilerek kanları kesilerek ötenazi uygulandı. Vücudun dış yüzeyi, göğüs ve karın boşlukları ile iç organlar makroskobik olarak incelendi ve sol böbrekler çıkarılarak mikroskobik inceleme için işleme tabi tutuldu. Tüm prosedürler, Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation'ın Deney Hayvanlarının Beslenmesi ve Saklanması ve Hayvan Deneyleri Kurallarına uygun olarak gerçekleştirildi.

Kan örneklerinin 4 derecede santrifüj edilmesiyle serum örnekleri elde edildi. Kan üre nitrojeni (BUN) ve kreatinin (CRE) seviyelerini değerlendirmek için bir TBA-2000FR cihazı (Canon Medical Systems Corporation, Tochigi, Japonya) kullanılarak serum biyokimyasal analizi yapıldı.

Böbrekler, üç fiksatif solüsyon kullanılarak aşağıdaki şekilde sabitlendi: Böbreği enine olarak üç parçaya böldükten sonra, böbrek pelvisini de içeren orta kısım, 5 gün boyunca %10 NBF'de sabitlendi; kranyal kısım Karnovsky fiksatifinde (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Tokyo, Japonya) sabitlendi; ve kaudal kısım 4 derecede 17 saat boyunca %4 PFA'da sabitlendi ve daha sonra 24 saat boyunca %10 NBF'ye yerleştirildi. Her sabit numune dehidre edildi ve parafine gömüldü. Hematoksilen ve eozin (H&E) boyama için doku kesitleri hazırlandı. İmmünohistokimyasal boyama, böbrek hasarı molekülünü-1 (KIM-1; R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, ABD; 1:300 seyreltme) ve lizozomal ilişkili membran proteini 2'yi (LAMP{{) hedef alan antikorlar kullanılarak yapıldı. 13}}; Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ABD; 1:1000 seyreltme) antijen geri kazanıldıktan sonra (sitrat tamponu, pH 6,0, 10 dakika ısıtıldı veya basınç altında 20 dakika ısıtıldı). İkincil antikor olarak Histofine Simple Stain Rat MAX PO (Nichirei Biosciences Inc., Tokyo, Japonya) kullanıldı.

Wecistanche'nin Destekleyici Hizmeti:

E-posta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Daha Fazla Özellik İçin Alışveriş Yapın Detaylar:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop