Retinoik Asit Reseptörü Responder1 Neden Glomerüler Hastalıkların Gelişimini Destekleyebilir?
Mar 11, 2022
Retinoik Asit Reseptör Yanıtlayıcı1 Nükleer Faktör-kB Sinyal Yolu Yoluyla Glomerüler Hastalıkların Gelişimini Destekler
İletişim:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Katja Möller-Hackbarth1,2 , Dina Dabaghie1,2 , Emmanuelle Charrin1,2 , Sonia Zambrano1,2, Guillem Genove´ 1,3 , Xidan Li1,3 , Annika Wernerson4, Mark Lal5 ve Jaakko Patrakka1,2
1 KI/AZ Entegre Kardiyo Metabolik Merkezi, Karolinska Üniversite Hastanesinde Karolinska Enstitüsü, Huddinge, Stockholm, İsveç; 2 Laboratuvar Tıbbı Anabilim Dalı, Patoloji Anabilim Dalı, Karolinska Üniversite Hastanesi Karolinska Enstitüsü, Huddinge, Stockholm, İsveç; 3 Huddinge Tıp Departmanı, Karolinska Institutet, Karolinska Üniversite Hastanesi, Huddinge, Stockholm, İsveç; 4 Klinik Bilimler, Müdahale ve Teknoloji Anabilim Dalı, Renal Tıp Anabilim Dalı, Karolinska Institutet, Stockholm, İsveç; ve 5 Bioscience Renal, Research and Early Development Cardiovasküler, Renal and Metabolism (CVRM), R&D Biopharmaceuticals, AstraZeneca, Göteborg, İsveç
Böbrek Uluslararası (2021) 100, 809-823; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2021.05.036
Telif Hakkı ª 2021, Uluslararası Nefroloji Derneği. Elsevier Inc tarafından yayınlanmıştır. Bu, CC BY lisansı altında açık erişimli bir makaledir.
Yazışma: Jaakko Patrakka, Laboratuvar Tıbbı Departmanı, Patoloji Bölümü, Karolinska Institutet, Blickagången 6, SE-141 57 Huddinge, İsveç. E-posta: jaakko.patrakka@ki.se 27 Temmuz 2020'de alındı; 11 Mayıs 2021'de revize edildi; 20 Mayıs 2021'de kabul edildi; 18 Haziran 2021 çevrimiçi yayınlandı
ANAHTAR KELİMELER: glomerülerendotelyal hücre; NF-kB; podosit; Nadir1
Enflamatuvar yollar çoğu durumda aktive olur.glomerüler hastalıklarancak onları böbrek dokusunda harekete geçiren moleküler mekanizmalar çok az bilinmektedir. tanımladıkretinoik asitsağlıklı böbreklerde yüksek oranda podosit açısından zengin bir protein olarak reseptör yanıtlayıcı 1 (Rarres1). Podosit spesifik nakavt hayvanlarda yapılan çalışmalar, glomerül filtrasyon bariyerinin normal gelişimi veya korunması için Rarres1'in gerekli olmadığını ve bir glomerülonefrit modelinde böbrek hastalığının sonucunu modüle etmediğini göstermiştir. İlginç bir şekilde, IgA ve diyabetik böbrek hastalığının yanı sıra ANCA ile ilişkili vaskülitte glomerüler ve peritübüler kılcal endotel hücrelerinde Rarres1 ekspresyonunun indüklendiğini tespit ettik. Kamuya açık RNA veri setlerinin analizi, Rarres1 ekspresyonunun indüklenmesinin kronik böbrek hastalıklarında yaygın bir moleküler mekanizma olduğunu gösterdi. Rarres1'i spesifik olarak endotelyal hücrelerde aşırı eksprese eden koşullu bir nakavt fare çizgisi, herhangi bir belirgin böbrek fenotipi göstermedi. Bununla birlikte, aşırı ekspresyon, bir glomerülonefrit modelinde böbrek hasarının ilerlemesini destekledi. Buna paralel olarak, endotel hücrelerinde Rarres1 bulunmayan koşullu nakavt fareler hastalık modelinde kısmen korunmuştur. Mekanik olarak, Rarres1, reseptör tirozin kinaz Axl'yi aktive ederek transkripsiyon faktörü Nükleer Faktör-kB sinyal yolu yoluyla iltihaplanma ve fifibrozu destekledi. Bu nedenle, endotel hücrelerinde Rarres1 ekspresyonunun indüklenmesi, insan glomerülopatilerinde yaygın bir moleküler mekanizmadır ve bunun, Nükleer Faktör-kB sinyal yolu yoluyla iltihaplanma ve fifibrozun tahrik edilmesinde patojenik bir rolü var gibi görünmektedir.
Çeviri Bildirimi
düzenlenmesini tespit ettik.retinoik asityaygın insan glomerülopatilerinin endotel hücrelerinde (EC'ler) reseptör yanıt veren protein 1 (Rarres1). İndüksiyonun patojenik bir rolü var gibi görünüyor.glomerüler hastalıkglomerülonefritin ilerlemesi (i) özellikle EC'lerde Rarres1'i aşırı eksprese eden bir farede ağırlaştırıldı ve (ii) EC'ye özgü bir Rarres1 nakavt çizgisinde iyileştirildi. Rarres1, böbrek hastalıklarında mikrovasküler hasarı tespit etmek için bir biyobelirteç ve potansiyel olarak yeni bir terapötik hedef olabilir.
glomerüler hastalıksüreçleri, son dönem böbrek hastalığının önemli bir nedenidir. Diyabetik nefropati (DN) küresel olarak son dönem böbrek hastalığının en yaygın nedenidir, oysa IgA nefropatisi (IgAN) en yaygın primer glomerülonefrittir (GN).1,2 Histolojik olarak, bu yaygın bozukluklardaki glomerüler hasar çok benzer bir şekilde kendini gösterir. moda. Bu, glomerüler endotel hücrelerinin (GEC'ler) aktivasyonunu, hücre dışı matrisin genişlemesini, mezanjiyal hücrelerin proliferasyonunu, podosit hasarını ve nihayetinde podosit kaybını içerir.3
İnsan böbrek biyopsilerinde global transkript profilleme çalışmaları, glomerüler bozukluklarda güçlü bir inflamatuar imza göstermiştir4–7 ve fare çalışmaları, nükleer faktör-kB (NF-kB) ve dönüştürücü büyüme faktörü-b'nin (TGF-b) aktivasyonunun olduğunu göstermiştir. sinyal yolaklarının hastalığın ilerlemesinde önemli rolleri vardır.8,9 Daha da önemlisi, NF-kB yolunun farmasötik olarak hedeflenmesi, hayvan modellerinde yolun tedavi edilmesi için potansiyel bir hedef olduğunu gösteren renoprotektif etkilere sahiptir.glomerüler hastalıklar.10,11 Podositlerde, yakın zamanda G protein-bağlı reseptör sınıf C grup 5 üye B'yi NF-kB aracılı inflamatuar yanıtın bir modülatörü olarak tanımladık.12 Bununla birlikte, glomerülopatilerde inflamatuar yolakların aktivasyonu muhtemelen çoklu hücre tipleri tarafından yönlendirilir. . Aslında, NF-kB sinyal yolunun aktivasyonu, birçok insan böbrek hastalığında GEC'lerde tespit edilir.13,14 GEC'lerde NF-kB aktivasyonunda yer alan moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılmamıştır.
Retinoik Asit Reseptörü Responder1, Retinoik Asit Reseptörünün Gelişimini Teşvik EdebilirGlomerüler Hastalıklar
Bu çalışmada, insan vücudunun moleküler imzalarını analiz ettik.glomerüler hastalıklarve indüksiyonu tanımladıretinoik asitDN, IgAN ve anti-nötrofil sitoplazmik otoantikor (ANCA) ile ilişkili vaskülitte ortak bir moleküler imza olarak GEC'lerde reseptör yanıt veren 1 (Rarres1) ifadesi. Endotel hücrelerinde (EC'ler) Rarres1 ekspresyonunun aktivasyonu/inaktivasyonu ile fare hatlarında yapılan çalışmalar, bu indüksiyonun bir fare GN modelinde patojenik bir rolü olduğunu göstermektedir. Mekanik olarak, Rarres1, reseptör tirozin kinaz Axl'yi aktive ederek NF-kB sinyal yolunun aktivasyonuna yol açar. Rarres1'i çekici bir terapötik hedef olabilecek yeni bir mikrovasküler hasar biyobelirteç olarak öneriyoruz.glomerüler hastalıkinflamatuar yanıtları modüle ederek süreçler.
Şekil 1|(Devam ediyor) (c) Murin böbrek dokusunun RNAseq verilerinde spesifik olarak podositlerde (PD) Rarres1 ekspresyonunu gösteren BackSPIN analizi (Woroniecka ve ark.6'dan alınan veriler). (d) İnsan numunelerinden izole edilmiş Tub ve Glom'da Rarres1'in nispi mRNA seviyeleri. Veriler, Küvet ile karşılaştırıldığında Glom'da Rarres1 ifadesinin kat değişimi olarak ifade edilir. *P < 0.05,="" küvet'e="" karşı.="" (e)="" normal="" deneklerden="" insan="" glomerüllerindeki="" podositler="" tarafından="" rarres1="" ekspresyonunun="" (yeşil)="" temsili="" konfokal="" fl="" floresan="" mikroskobik="" görüntüsü.="" (f)="" insan="" deneklerden="" alınan="" podositlerde="" rarres1="" ekspresyonunu="" gösteren="" temsili="" konfokal="" mikroskobik="" görüntüler;="" vimentin="" majör="" süreçler="" için="" bir="" belirteç="" olarak="" ve="" nefrin="" podositlerin="" ayak="" süreçleri="" için="" bir="" belirteç="" olarak="" kullanıldı.="" cd31,="" endotel="" hücreleri="" için="" bir="" belirteç="" olarak="" kullanıldı="" ve="" ⍺-düz="" kas="" aktin="" (⍺sma)="" bir="" mesanjiyal="" hücre="" belirteci="" olarak="" kullanıldı.="" çubuklar="50/10" mm.="" veriler,="" ortalama="" ±="" sem="" olarak="" ifade="" edilir.="" 2="" grup="" arasındaki="" karşılaştırmalarda="" öğrenci="" t="" testi="" kullanıldı.="" bu="" resmin="" görüntülenmesini="" optimize="" etmek="" için="" lütfen="" bu="" makalenin="" çevrimiçi="" versiyonuna="" www.kidney-international.org="" adresinden="">
YÖNTEMLER
RNA ekstraksiyonu ve gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu
Glomerüller daha önce tarif edildiği gibi izole edildi.15 RNA, TRIzol reaktifi (Invitrogen) ve RNeasy Kiti (Qiagen Inc.) kullanılarak ekstre edildi. cDNA üretmek için iScript cDNA Sentez Kiti kullanıldı. Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu, SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) ile CFX96 Touch Real-Time PCR Tespit Sistemi kullanılarak yapıldı. Kullanılan astarlar Ek Tablo S1'de listelenmiştir. Göreceli ifade seviyeleri 2-DDCT yöntemi kullanılarak hesaplandı.
Hücre kültürü
Human podocytes were cultured as described.16 JetPEI transfection reagent (Polyplus-transfection SA) was used for stable transfection of pRP[Exp]-CMV>hRARRES1[ORF011242]:T2A: Bsd – plazmit (VectorBuilder Inc. Klonlar puromisin (Merck KGaA) seçimi altında genişlemiştir. Axl/Rarres1 için kısa enterferans yapan RNA'nın (siRNA) transfeksiyonu Origene'den siRNA kullanılarak gerçekleştirildi. Hücreler 30 nM ile transfekte edildi siRNA ve ardından TGF-bl uyarıcılı veya uyarıcısız JetPEI transfeksiyon reaktifi (Polyplus-transfection SA) ile kompleksleştirme (kültür ortamında 10 ng/ml) Axl-inhibitörü R428 (Selleck Chemicals) işlemden 1 saat önce ilave edildi (3 mmol/ l).
Batı lekesi
Hücreler, proteaz/fosfataz inhibisyon kokteylleri (Roche) ile desteklenen RIPA lizis tamponu ile parçalandı. Nükleer fraksiyonlardan gelen proteinler, Nuclear Extract Kit (Active Motif Europe) kullanılarak izole edildi. Lizatlar yüzde 4 – yüzde 12 Tris-glisin sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel (Invitrogen) üzerinde ayrıldı ve poliviniliden diflorür membranlara (Bio-Rad) aktarıldı. Zarlar, yüzde 5 sığır serum albümini (Merck) ile bloke edildi. Birincil antikorlarla inkübasyon, gece boyunca gerçekleştirildi (Ek Tablo S2'deki antikorlar). Sinyalleri saptamak için yaban turpu peroksidazla konjuge ikincil antikorlar ve Clarity Western ECL Substrate (Bio-Rad) kullanıldı. Western blot analizleri en az iki kez yapıldı.
RNA in situ hibridizasyon
RNAscope analizleri, üreticinin protokolüne (ACD) göre parafine gömülü insan böbreklerinde gerçekleştirilmiştir. Kullanılan problar NPHS1 - Kat No. 416071-C2, PECAM{4}} Kat No. 487381-C3 ve RARRES1 - özelleştirilmiş prob hedefleme nükleotidleriydi {{8 }}.
Böbrek hasarının değerlendirilmesi
İdrar albümin ve kreatinin oranı, Fare Albümin ELISA Kiti (Allbuwell M; Ethos Biosciences) ve QuantiChrom Kreatinin Test Kiti (BioAssay Systems) kullanılarak değerlendirildi. Böbrek dokuları yüzde 10 nötr tamponlu formalin solüsyonunda sabitlendi ve parafine gömüldü, ardından kesme ve periyodik asit-Schiff boyaması yapıldı. Yüzde 2,5 glutaraldehit içinde sabitlenmiş numunelerde elektron mikroskopisi yapıldı.
İmmün boyamalar
Parafine gömülen dokular formalin içinde 24 saat sabitlendi. Beş mikrometrelik kesitler parafinden arındırıldı ve ya Tris-etilendiamin tetraasetik asit tamponu (10 mM Tris bazı, 1 mM etilendiamintetraasetik asit tampon çözeltisi, 0) içinde mikrodalga ile işleme tabi tutuldu.0Yüzde 5 Tween 20, pH 9.0) veya sodyum sitrat tamponu (10 mM sodyum sitrat, yüzde 0.05 Tween 20, pH 6.0), ardından yüzde 0.3 Triton X-100 ile geçirgenleştirme ve bloke yüzde 10 normal keçi serumu, yüzde 3 hidrojen peroksidaz ve Vektör Engelleme Kiti (Vektör Laboratuvarları) ile. Slaytlar, DAB peroksidaz (yaban turpu peroksidaz) substrat kiti, 3,30 -diaminobenzidin (Vector Laboratories) kullanılarak geliştirildi.
Dondurulmuş bölümler için, asetonla sabitlenmiş bölümler 0.1 yüzde Tween 20 ile geçirgenleştirildi ve yüzde 10 normal keçi serumu ile bloke edildi. Kullanılan birincil antikorlar, Ek Tablo S1'de listelenmiştir. İmmünofloresan için Alexa-Fluor ikincil antikorları Molecular Probes'tan (Life Technologies) elde edildi. Görüntüler Leica SP8 Konfokal Mikroskobu (Leica Microsystems) kullanılarak elde edildi.
İnsan örnekleri
Renal biyopsiler Karolinska Üniversite Hastanesi'nden (Stockholm, İsveç) alındı. Tümör nefrektomisi yapılan bireylerin sağlıklı böbrek kutuplarından kontrol örnekleri alındı. Yerel etik kurul çalışmayı onayladı (onay no. 2010/579-31/1, Stockholm, İsveç).
kontrole karşı (Ctrl.) veya ***P < {{0}}.001'e="" karşı="" si-negatif="" kontrol="" (karıştırma)="" (rarres1,="" n="6" ;="" sirarres1,="" n="4)." (c)="" temsili="" western="" blot="" belgeleri="" ve="" 10="" ng/ml="" tgf-b1="" ile="" muamele="" edilmiş="" podositlerin="" izole="" nükleer="" fraksiyonlarında="" pp65'in="" nispi="" protein="" seviyelerini="" gösteren="" verileri="" özetler.="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< {{40}}.001'e="" karşı="" kontrol="" podositleri="" (ctrl.="" )="" (n="3)." (d)="" temsili="" western="" blot="" belgeleri="" ve="" 10="" ng/ml="" tgf-b1="" ±3="" mmol/l="" r428,="" n="2" ile="" muamele="" edilmiş="" podositlerin="" izole="" nükleer="" fraksiyonlarında="" pp65'in="" nispi="" protein="" seviyelerini="" gösteren="" verileri="" özetler.="" (e)="" rarres1'in="" aşırı="" ekspresyonunun="" axl'yi="" yapısal="" olarak="" aktive="" ettiğini="" gösteren="" temsili="" western="" blot.="" *p="">< 0.05="" (n="2)." (f)="" aşırı="" rarres1="" (rarres1)="" eksprese="" eden="" podositlerdeki="" veya="" axl="" (siaxl),="" si-negatif="" kontrol="" (karıştırma),="" ##p="">< 0.01,="" ##="" için="" sirna="" ile="" transfekte="" edilmiş="" kontrol="" podositlerindeki="" (ctrl.)="" emt="" ile="" ilgili="" genlerin="" nispi="" mrna="" seviyeleri="" #p="">< 0.001,="" karıştırmaya="" karşı,="" n="3" veya="" 3="" mmol/l="" r428="" ile="" işleme="" tabi="" tutulmuştur.="" ##p="">< 0.01,="" ###p="">< 0.001="" ve="" ctrl.,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001="" ve="" rarres1,="" *p="">< 0.05="" ve="" rarres1,="" n="4." veriler,="" ortalama="" ±="" sd="" olarak="" ifade="" edilir.="" 2="" grup="" arasındaki="" karşılaştırmalarda="" student's="" t="" testi="" kullanıldı.="" ut,="" tedavi="">
Şekil 3|Podosit spesifik Rarres1 nakavt (CreD/Rarres1flfl/flfl) farelerinin oluşturulması. (a) Cre-LoxP rekombinasyon sistemi kullanılarak Rarres1'in podositlerde spesifik olarak kesildiği koşullu nakavt farelerin üretilmesi. Exon 3, NPHS2-Cre aracılı rekombinasyonda silinir. (b) Genotipleme, 4 haftalıkken kuyruk hazırlığı ve polimeraz zincir reaksiyonu ile doğrulandı. (Devam etti)
Şekil 3|(Devam ediyor) (c) Podosit spesifik Rarres1 nakavt (Creþ/Rarres1flfl/flfl ) farelerinden izole edilmiş glomerüllerde Rarres1'in azalmış ifadesini gösteren temsili Western blot. (d) Podosit spesifik Rarres1 kaybı, farklı fare gruplarında idrar albümin-kreatinin oranı ile analiz edildiği gibi nefrotoksik serum (NTS) ile tedavi edilen farelerde albüminüri düzeylerini etkilemez (NTS-ctrl., n {{1{{ 15}}}}–7; NTS-Rarres1_cKO, n - 7). (e) Farklı fare gruplarında tipik glomerüler yapı değişikliklerini gösteren fotomikrograflar ve nicelemeler. Periyodik asit-Schiff lekeli kesitlerde glomerüler lezyonlar tespit edildi. #P < 0.0001="" ile="" tedavi="" edilmemiş="" kontrol="" (ctrl.)="" (ctrl.,="" n="" -="" 6;="" nts-ctrl.,="" n="" -="" 9);="" nts-rarres1_cko,="" n="9)." (f)="" transmisyon="" elektron="" mikroskobu="" analizleri="" ile="" farklı="" fare="" gruplarında="" ortalama="" glomerüler="" bazal="" membran="" (gbm)="" kalınlığının="" ve="" mm="" gbm="" başına="" yarık="" sayısının="" temsili="" fotomikrografları="" ve="" miktarları.="" ##p="">< 0.01,="" ###p="">< 0.001,="" ####p="">< 0.0001="" ile="" tedavi="" edilmemiş="" kontrol="" (ctrl.,="" n="3;" nts-ctrl.,="" n="4;" nts-rarres{)="" {33}}cko,="" n="6)." veriler,="" ortalama="" ±="" sem="" olarak="" ifade="" edilir.="" 3="" veya="" daha="" fazla="" kişilik="" gruplar="" için="" tek="" yönlü="" varyans="" analizi="" ve="" ardından="" çoklu="" karşılaştırmalar="" için="" tukey'nin="" son="" testi="" kullanıldı.="" bu="" resmin="" görüntülenmesini="" optimize="" etmek="" için="" lütfen="" bu="" makalenin="" çevrimiçi="" versiyonuna="" www.kidney-international.org="" adresinden="">
Fare çizgileri
C57Bl/6J arka planı (Rarres1flfl/flfl; Cyagen) olan Floxed Rarres1 fareleri, podosin (B6.Cg-Tg [NPHS2-cre] 295Lbh/J; Jackson Laboratory) ve Tie2 cre fareleri (B6.Cg-Tg(B6.Cg-Tg( Tek-cre)12Flv/J) hücreye özgü nakavt fareler oluşturmak için. GT(ROSA)26Sortm1(CAG-Rarres1-T2A EGFP)/J fareleri, Rarres1 ekspresyonunu özellikle EC'lerde etkinleştirmek için bir Tie2-cre çizgisi ile çaprazlandı.17 Yetiştirme ve genotiplendirme, standarda göre yapıldı prosedürler. Tüm hayvan çalışmaları Klinik Öncesi Laboratuarda (Karolinska Institutet) ilgili kılavuz ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirildi ve Araştırma Hayvanları Bakımı Etik Kurulu (Linköpings djurförsöksestiska nämd; DNR 1336) tarafından onaylandı.
Farelerde nefrotoksik serum (NTS) kaynaklı nefropati
Yedi ila 9-haftalık farelere 50 ml Complete Freund Adjuvant (Merck) sc, ardından 4.18. günde NTS enjeksiyonu (iv; 6 ml/kg vücut ağırlığı; Probetex Inc.) verildi. İdrar 3, 7'de toplandı. enjeksiyondan 10 ve 14 gün sonra ve fareler 14. günde öldürüldü.
istatistiksel analiz
İstatistiksel analiz, Prism 9.0 yazılımı (GraphPad) kullanılarak yapıldı.
Veriler önce normallik açısından incelenmiştir (Shapiro-Wilk testi). Dağılım Gaussian olduğunda, veriler parametrik bir test kullanılarak analiz edildi (2 grup için Student's t-testi ve 2'den fazla grup için Tukey's son testi ile varyans analizi). Dağılım Gaussian olmadığında parametrik olmayan testler (2'den fazla grup için Dunn's son testi ile Friedman testi ve 2 grup için Mann-Whitney U testi) kullanıldı. Farklılıklar, P < 0.05="" olduğunda="" önemli="" kabul="">
SONUÇLAR
Rarres1, podositler tarafından ifade edilir
İlk önce, fare ve insan böbrek dokusunda Rarres1'in ekspresyon modelini değerlendirdik. Polimeraz zincir reaksiyonu analizleri, Rarres1'in, fare renal korteksinin tubulointerstisyel fraksiyonuna göre glomerülerlerde önemli ölçüde daha yüksek eksprese edildiğini gösterdi (Şekil 1a ve b6). Murin böbrek dokusunun tek hücreli RNA dizileme analizi, Rarres1'in yalnızca podositler tarafından eksprese edildiğini ortaya koydu (Şekil 1c). İnsanlarda, Rarres1, glomerüler dokuda da zenginleştirilmiştir (Şekil 1d). Normal insan böbrek dokusunun immünofloresansında, Rarres1, glomerüllerde yüksek bir sinyal gösterdi (Şekil 1e). Çift boyamalar, Rarres1'in kılcal halkalarda nefrin reaktivitesinin "dışarıda" bulunduğunu ve bu da podosit ekspresyonunu düşündürdüğünü gösterdi (Şekil 1f). Vimentin ile birlikte yerelleştirme, ana süreçlere yerelleştirmeyi gösterdi. EC belirteci CD31 veya mezangial belirteç - düz kas aktin için örtüşen bir reaktivite görülmedi (Şekil 1f).
Rarres1, reseptör tirozin kinaz Axl aracılığıyla NF-kB ve TGF-b1 sinyalleşmesini destekler
Rarres1'in podositlerdeki rolünü aydınlatmak için, ölümsüzleştirilmiş insan podositlerinde ekspresyon seviyelerini manipüle ettik.16 Rarres1 seviyeleri, insan Rarres1 cDNA'sı ile stabil bir şekilde transfekte edilmiş podositlerde önemli ölçüde yukarı regüle edildi ve Rarres1-hedefleme siRNA ile transfeksiyondan sonra aşağı regüle edildi (Şekil 2a). Rarres1'in aşırı ekspresyonu, epitelyal-mezenkimal geçişle ilgili genlerin ekspresyonunu yukarı regüle ederken, endojen Rarres1'in aşağı regülasyonu zıt etkiye sahipti (Şekil 2b). NF-kB sinyalinin, GN'de fifibroz ve iltihaplanmaya yol açan epitelyal-mezenkimal geçişte önemli bir rolü olduğundan,19 TGF-b1 ile indüklenen NF-kB sinyal aktivasyonunu in vitro ölçtük. Rarres1 aşırı ekspresyonu, başlangıçta ve TGF-b1 stimülasyonundan sonra NF-kB yolunun aktivasyonunun artmasına neden oldu (Şekil 2c). Rarres1'in reseptör tirozin kinaz Axl'yi aktive ettiği ve bu şekilde inflamatuar meme kanserinde NF-kB sinyal yolunu desteklediği bildirildiği için, Axl'nin böbrek dokusunda Rarres1'in potansiyel bir fonksiyonel ortağı olup olmadığını değerlendirdik. TGF-b1 ile indüklenen NF-kB aktivasyonu, seçici bir küçük moleküllü Axl kinaz inhibitörü olan R428 tarafından inhibe edilebilir21,22 (Şekil 2d) ve Rarres1'in aşırı ekspresyonu, Axl kinazın yapısal aktivasyonu ile pozitif korelasyon gösterdi (Şekil 2e). Axl aktivitesinin R428 ile tükenmesi, ancak Axl'nin siRNA tarafından gen susturulması değil, azalmış mRNA seviyeleri ile kanıtlandığı gibi, epitelyal-mezenkimal geçişle ilgili genlerin Rarres1- indüklenen ekspresyonunu azaltabilir (Şekil 2f). Not olarak, kanonik olmayan NF-kB yollarının aktivasyonu tespit edilmedi (Ek Şekil S1). Böylece, Rarres1, Axl kinazın aktivasyonu yoluyla kültürlenmiş podositlerde NF-kB sinyalini destekledi.
Retinoik Asit Reseptörü Responder1 Neden Glomerüler Hastalıkların Gelişimini Destekleyebilir?
Rarres1'in podositlerde etkisizleştirilmesi, glomerüler anormalliklere yol açmaz veya bir anti-glomerüler bazal membran (GBM) GN modelinde nefropatinin sonucunu modüle etmez
Rarres1'in podositlerdeki rolünü in vivo analiz etmek için, yeni bir Rarres1flfl/flfl (floxed) fare çizgisi oluşturduk ve bunu podocin-Cre fareleri ile çaprazlayarak Podocin-Cre Rarres1flfl/flfl fareleri (Creþ/Rarres1flfl/flfl ) ürettik (Şekil 3a). ). Floxed/Cre alelleri için genotipler, kulak genotiplemesi ile tanımlandı (Şekil 3b). Tubulointerstisyel ve glomerüler fraksiyonların yanı sıra karaciğer dokusunun polimeraz zincir reaksiyonu analizi, ekson 3'ün özellikle glomerülde silindiğini doğruladı (Ek Şekil S2A) ve Rarres1 protein seviyeleri Creþ / Rarres1flfl / flfl farelerinden glomerüllerde azaldı (Şekil 3c).
Şekil 4|Kronik böbrek hastalığı olan hastalarda glomerüler ve peritübüler kılcal endotel hücrelerinde Rarres1'in düzenlenmesi. (a) Diyabetik nefropati (DN), vaskülit, IgA nefropatisi (IgAN) ve kontrol (Ctrl.) deneklerinden izole edilen glomerüllerin mikrodizi verilerinde Rarres1, kollajen1a2 (COL1A2) ve nefrin (NPHS1) gen ekspresyonunun analizleri. 4,6,24–26 *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0="" .001="" ve="" kontrol="" denekleri.="" (b)="" dn'li="" hastalardan="" (n="5)" ve="" kontrollerden="" (n="5)" izole="" edilmiş="" glomerüllerdeki="" rarres1,="" col1a2="" ve="" nphs1="" genleri="" için="" kantitatif="" polimeraz="" zincir="" reaksiyonu="" analizi.="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001="" kontrol="" deneklerine="" karşı.="" (c)="" dn,="" vaskülit,="" igan="" ve="" kontrol="" hastalarından="" izole="" edilen="" tübüler="" fraksiyonun="" mikrodizi="" verilerinde="" rarres1="" ve="" col1a2="" gen="" ekspresyonunun="" analizleri.="" *p="">< 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001="" kontrol="" deneklerine="" karşı.="" (d)="" dn="" (n="5)," anti-nötrofil="" sitoplazmik="" otoantikor="" (anca)="" vasküliti="" (n="4)" ve="" igan="" (="" n="5)." oklar,="" rarres1-pozitif="" podositleri="" (kontrol)="" ve="" endotelyal="" hücreleri="" (ec'ler)="" (dn,="" igan="" ve="" vaskülit)="" gösterir.="" (devam="">
Şekil 4|(Devam ediyor) (e) DN'li hastaların glomerüllerinde Rarres1 ekspresyonunu gösteren temsili konfokal mikroskobik görüntüler. CD31, EC'ler için bir işaretleyici olarak kullanıldı. Çubuklar=50/10 mm. (f) DN'li hastaların tübüler fraksiyonunda PECAM1-birlikte ifade eden hücrelerde Rarres1 gen ekspresyonunu gösteren RNAscope'un temsili konfokal FL floresan resimleri. Veriler, ortalama±SEM olarak ifade edilir. 2 grup arasındaki karşılaştırmalarda öğrenci t testi kullanıldı. Çubuklar=50/10 mm. Bu resmin görüntülenmesini optimize etmek için lütfen bu makalenin çevrimiçi versiyonuna www.kidney-international.org adresinden bakın.
Creþ/Rarres1flfl/flfl fareleri, beklenen bir Mendel kalıtım oranında doğdular ve yaşayabilir ve verimliydiler (veriler gösterilmemiştir). Böbrekler, rutin ışık ve elektron mikroskobik inceleme ile analiz edildiği gibi kontrol yavrularından (Cre-/Rarres1flfl/flfl) ayırt edilemezdi (Ek Şekil S2B ve C). Ayrıca, podosit proteinleri nefrin ve sinaptopodinin dağılımı Creþ / Rarres1flfl / flfl farelerinde etkilenmedi (Ek Şekil S2D)
Rarres1'in böbrek hasarındaki rolünü in vivo aydınlatmak için Creş/Rarres1flfl/flfl, GBM'de IgG birikintilerine, albüminüriye ve progresif GN'ye yol açan NTS ile tedavi edildi.23 Albüminüri seviyeleri hem Creş/Rarres1flfl/flfl hem de kontrol grubunda benzerdi fareler (Şekil 3d). Işık mikroskobik inceleme, etkilenen glomerül oranında anlamlı bir farklılık göstermedi (Şekil 3e). Elektron mikroskopisi, GBM'nin kalınlığında veya ayak işleminin silinmesinde hiçbir fark göstermedi ve GEC'ler her iki grupta da benzer şekilde etkilenmiş gibi görünüyordu (Şekil 3f). Podosit belirteçleri nefrin, Wt1 ve sinaptopodin her iki grupta da benzer şekilde etkilenmiştir (Ek Şekil S3A). Ayrıca, CD31 kullanılarak EC'ler için boyama, gruplar arasında glomerül veya peritübüler kılcal damarlarda hiçbir fark göstermedi (Ek Şekil S3B ve C). Ek olarak, NTS ile tedavi edilen her iki grupta da fifibroz ve iltihaplanma ile ilgili genlerin ekspresyonu benzer şekilde yükselmiştir (Ek Şekil S4).
Rarres1 ekspresyonu, kronik böbrek hastalığında (CKD) glomerüler ve peritübüler kılcal EC'lerde indüklenir
Rarres1'in CKD'deki rolünü araştırmak için, halka açık RNA veri setlerinde ifadesini analiz ettik. DN, ANCA ile ilişkili vaskülit ve IgAN (Şekil 4a),4,6,24-26 olan hastalardan izole edilen glomerüllerde önemli ölçüde yüksek Rarres1 seviyeleri gözlemledik, diğer podosit ile ilişkili genler, örneğin nefrin, önemli ölçüde aşağı regüle edildi veya değişmedi . DN'li hastalardan (n=5) izole edilen glomerüllerin kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu analizimiz, Rarres1 ekspresyonunun indüksiyonunu doğruladı (Şekil 4b). Podositlerin kaybı nedeniyle, podosit genlerinin ekspresyonu genellikle ilerleyici olarak azalır.glomerüler hastalıklar,6 ve glomerüler Rarres1'in nefrin ekspresyonuna oranı, sağlıklı glomerüllere kıyasla DN'de yaklaşık 20-kat artmıştır (Şekil 4b). Rarres1'in ekspresyonu ayrıca DN, ANCA ile ilişkili vaskülit ve IgAN'deki tubulointerstisyel doku veri setlerinde de yukarı doğru düzenlenmiştir (Şekil 4c).8–11
Daha sonra, DN (n=5), IgAN (n=5) ve ANCA ile ilişkili vaskülit (n=4) olan hastalardan alınan böbrek biyopsilerinde Rarres1 ekspresyonunu immünohistokimyasal olarak analiz ettik. Hastalıklı glomerüllerde, Rarres1 boyaması, kılcal duvarların iç yüzündeki immünoreaktivite ile gösterildiği gibi GEC'lere lokalize gibi görünüyordu (Şekil 4d, iç kısımlar), oysa podositlerden gelen sinyal daha zayıf görünüyordu. Tubulointerstisyel boşlukta, boyama, peritübüler kılcal damarlarda (Şekil 4d, iç metinler) tespit edildi ve bu, EC ekspresyonunu düşündürdü. CD31 ile çift immün etiketleme, hem glomerül hem de peritübüler kılcal damarlarda EC'lere lokalizasyonu doğruladı (Şekil 4e). Benzer şekilde, çift RNAscope deneyleri, Rarres1 mRNA'nın DN'de PECAM1 mRNA ile birlikte yerleşimini gösterdi (Şekil 4f). Birlikte ele alındığında, glomerüler ve peritübüler kılcal EC'lerde Rarres1 ekspresyonunun indüksiyonu, CKD'de yaygın bir fenomendi.
EC'lerde Rarres1'i aşırı ifade eden bir fare çizgisinin üretilmesi ve karakterizasyonu
Rarres1 insan CKD'sinde indüklendiğinden, Rarres1 cDNA'nın CAG promotörü 27 altındaki Rosa26 lokusuna, ekleme alıcı bölgeleri arasında bir lox-STOP-lox kaseti ile yerleştirildiği yeni bir transgenik fare çizgisi oluşturduk (Şekil 5a). Çizgi, Rarres1_Tie2_KI farelerini oluşturmak için bir Tie2-cre çizgisi ile çaprazlandı ve fareler, knockin ve Cre alelleri için kulak genotiplemesi ile tanımlandı (Şekil 5a). Rarres1_Tie2_KI fareleri, böbrek dokusunda önemli ölçüde artan Rarres1 proteini seviyeleri gösterdi (Şekil 5b) ve başarılı nakavt stratejisi, FACS'ye göre sıralanmış GFP-pozitifte Rarres1 mRNA ekspresyonunun analizi ile daha da doğrulandı. GEC'ler (Şekil 5c).
Yaş uyumlu gruplarda Rarres1_Tie2_KI farelerinin ve kontrol farelerinin böbreklerini fenotipledik. Işık mikroskobik inceleme ile, böbrek morfolojisi Rarres1_Tie2_KI farelerinde kontrol yavrularından ayırt edilemezdi (Şekil 5d). Benzer şekilde, elektron mikroskobu, değişmeyen bir GBM kalınlığı ve podosit ayak işlem genişliği gösterdi (Şekil 5e). Ayrıca, podosit belirteçleri nefrin ve sinaptopodinin ifadesi, glomerülleri aşırı ifade eden Rarres1'de etkilenmemiş görünüyordu (Şekil 5f). Not olarak, diğer ana organlar makroskopik veya mikroskobik olarak herhangi bir belirgin anormallik göstermedi (veriler gösterilmemiştir).
Şekil 5|Endotel hücresine özgü Rarres1 knockin (Rarres1_Tie2_KI) farelerinin oluşturulması. (a) Cre-LoxP rekombinasyon sistemi kullanılarak Rarres1 ekspresyonunun endotel hücrelerinde (EC'ler) spesifik olarak indüklendiği bir koşullu nakavt fare nesli. Kravat2-Cre fareleri, ekleme arasında bir lox-STOP-lox kaseti içeren hedefleme vektörünü (Rarres1_kasetş) ifade eden farelerle çaprazlandı (devam)
Şekil 5|(devamı) alıcı siteler ve Rosa26 lokusuna eklenen CAG promotörü altındaki Rarres1 cDNA, kulak genotiplemesi ile tanımlandı. Genotiplendirme, 4 haftalıkken kulak hazırlığı ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile doğrulandı. (b) EC'ye özgü Rarres1 knockin (Rarres1_Tie2_KI) farelerinden renal kortekste artan Rarres1 ekspresyonunu gösteren temsili Western blot. **P < 0.01'e="" karşı="" kontrol="" (ctrl.;="" cre-="" arres1_tie2_ki,="" n="5," mann-whitney="" u="" ölçek).="" (c)="" izole="" ec'lerde="" rarres1="" için="" kantitatif="" pcr.="" **p="">< 0.01="" kontrole="" karşı="" (cre-="" arres1_tie2_ki,="" n="3," student="" t-testi).="" (d)="" farklı="" fare="" gruplarında="" tipik="" glomerüler="" yapıları="" gösteren="" periyodik="" asit-schiff="" lekeli="" bölümlerin="" temsili="" fotomikrografları.="" (e)="" transmisyon="" elektron="" mikroskobu="" analizleri="" (student's="" t-test)="" ile="" farklı="" fare="" gruplarında="" ortalama="" glomerüler="" bazal="" membran="" (gbm)="" kalınlığının="" ve="" mm="" gbm="" başına="" yarık="" sayısının="" temsili="" fotomikrografları="" ve="" miktarları.="" (f)="" ec'ye="" özgü="" rarres1="" nakavt="" farelerde="" (rarre1_tie2_ki)="" ve="" ctrl'de="" podosit="" spesifik="" marker="" sinaptopodin="" ve="" nefrin="" ekspresyonunu="" gösteren="" temsili="" konfokal="" mikroskobik="" görüntüler.="" fareler.="" çubuklar="10" mm.="" veriler,="" ortalama="" ±="" sem="" olarak="" ifade="" edilir.="" bu="" resmin="" görüntülenmesini="" optimize="" etmek="" için="" lütfen="" bu="" makalenin="" çevrimiçi="" versiyonuna="" www.kidney-international.org="" adresinden="">
EC'lerde Rarres1'in uyarılması, Axl aktivasyonunu düzenleyerek NF-kB sinyal yolunu ve nefropatinin sonucunu modüle eder
EC'lerde Rarres1 ekspresyonunun hastalık ilerlemesini modüle edip etmediğini değerlendirmek için, transgenik farelerde ve onların yavrularında tek bir NTS enjeksiyonu ile GN'yi indükledik. Rarres1_- Tie2_KI fareleri, 3 gün sonra kontrollerden önemli ölçüde daha yüksek albüminüri seviyeleri geliştirirken, 7, 10 ve 14 günlerde albüminüri açısından anlamlı bir fark görülmedi (Şekil 6a). İndüksiyondan 14 gün sonra histolojik analiz, Rarres1_Tie2_KI farelerinin sklerotik ve kresent lezyonlar gibi daha fazla glomerüler değişikliğe sahip olmadığını gösterdi (Şekil 6b). Bununla birlikte, elektron mikroskobik değerlendirme, Rarres1_Tie2_KI farelerinde önemli ölçüde daha kalın bir GBM ve daha fazla ayak işlemi silinmesi gösterdi (Şekil 6c). Ayrıca, Rarres1_Tie2_KI fareler böbrek korteksinde -düz kas aktin düzeylerinin arttığını gösterdi (Şekil 6d). Podosit belirteçleri nefrin, sinaptopodin ve WT1'in analizi, farklılaşmayı ve önemli bir podosit kaybını düşündüren derin bir azalma gösterdi (Şekil 6d). Önemli olarak, Rarres1_Tie2_KI glomerülleri, kontrol hayvanları ile karşılaştırıldığında daha az WT1-pozitif podosit gösterdi, bu da EC tarafından eksprese edilen Rarres1'in podosit hasarını desteklediğini gösterir. Ayrıca Rarres1_Tie2_KI glomerüllerinde daha fazla fibrin trombüsü tespit edildi (Şekil 6e). Buna paralel olarak, Il için gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu analizi ile gösterildiği gibi, Rarres1_- Tie2_KI farelerinde farklı iltihaplanma, fifibroz ve renal tübüler yaralanma ile ilgili genlerin ekspresyonu önemli ölçüde yukarı regüle edildi. Böbrek korteks dokusunda -1beta, Col1a1, TGF-b1 ve böbrek hasarı molekülü-128 (Şekil 6f). Ancak kan üre nitrojen ve S-kreatinin değerlerinde gruplar arasında fark saptanmadı (Şekil 6g). Ayrıca, CD31 kullanılarak EC'ler için boyama, gruplar arasında glomerül veya peritübüler kılcal damarlarda hiçbir fark göstermedi (Ek Şekil S5A ve B). Birlikte ele alındığında, Rarres1 ekspresyonunun EC'ye özgü indüksiyonu, NTS'nin neden olduğu nefropatide glomerüler patolojiyi şiddetlendirdi.
Mekanik olarak, EC'lerde Rarres1 aşırı ekspresyonunun, in vitro gözlemlerimize benzer şekilde in vivo olarak Axl ve NF-kB sinyalinin aktivasyonunu destekleyip desteklemediğini analiz ettik (Şekil 2). Hem Rarres1_Tie2_KI hem de NTS ile tedavi edilen kontrol fareleri, artan Axl fosforilasyonu ile gösterildiği gibi Axl sinyal yolunun bir aktivasyonunu sergiledi (Şekil 6h). Ancak bu aktivasyon Rarres1_- Tie2_KI farelerinde daha anlamlıydı (Şekil 6h). Buna uygun olarak, glomerüllerdeki pP65-pozitif çekirdek sayısıyla gösterildiği gibi bu farelerde NF-kB yolu aktivasyonu desteklenmiştir (Şekil 6i). pP65 seviyeleri Western blotlama ile ölçüldüğünde, muhtemelen bir aykırı değer nedeniyle bu önemli olmasa da NF-kB yolu aktivasyonu için benzer bir eğilim tespit ettik (Ek Şekil S5C).
EC'lerde Rarres1'in etkisizleştirilmesi, anti-GBM glomerülonefrit modelinde glomerüler hasarı azaltır
EC'den türetilen Rarres1'in CKD'deki patojenik rolünü doğrulamak için, Rarres1'in EC'lerde Tie2-Cre kullanılarak silindiği bir fare çizgisi oluşturduk (Şekil 7a). Floxed ve Cre alelleri için genotipler, kulak genotiplemesi ile tanımlandı (Şekil 7b). NTS ile tedavi edilen farelerde, Rarres1_Tie2_KO farelerinde kaldırılan Rarres1'in yukarı regülasyonu için bir eğilim vardı (Şekil 7c). Fareler herhangi bir belirgin böbrek anormalliği göstermedi (veriler gösterilmemiştir). NTS enjeksiyonu, Rarres1_Tie2_KO ve kontrollerde benzer albüminüriye neden oldu (Şekil 7d). Bununla birlikte, indüksiyondan 14 gün sonra histolojik analiz, Rarres1_- Tie2_KO farelerinde daha az glomerüler değişiklik gösterdi (Şekil 7e). Elektron mikroskobunda, Rarres1_Tie2_KO fareleri, ayak işleminde daha az silinme ve GBM'de kalınlaşma gösterdi (Şekil 7f). İmmün boyama, aSMA, nefrin veya sinaptopodin için önemli bir farklılık göstermedi (Şekil 7g). Bununla birlikte, Rarres1_Tie2_KO farelerinde WT1-pozitif podositlerin sayısı önemli ölçüde daha fazlaydı (Şekil 7g). pP65 için boyama, Rarres1_Tie2_KO glomerüllerinde, NF-kB sinyal yolunun dahil olduğunu düşündüren pozitif çekirdek sayısında azalma gösterdi (Şekil 7h).
Şekil 6|(devamı) transmisyon elektron mikroskobu analiz bölümleri ile farklı fare gruplarında ortalama glomerüler bazal membran (GBM) kalınlığının ve mm GBM başına yarık sayısının nicelleştirilmesi (Ctrl., n=4; NTS-ctrl., n { {3}}; NTS-Rarres1_Bağ2_KI, n=12). (d) Farklı fare gruplarından alınan böbrekte nefrin, sinaptopodin, ⍺-düz kas aktin (⍺Sma) ve WT1 ifadelerini gösteren temsili konfokal mikroskobik görüntüler. Çubuklar {{10}}/10 mm. ⍺Sma-pozitif alan kortikal kesit başına sayıldı ve WT1 glomerulus başına sayıldı (Ctrl., n=2; NTS-ctrl., n=3; NTS-Rarres{{18}) }Bağ2_KI, n {{20}}). (e) Trikom boyama ile saptanan glomerüllerde fibrin trombüsü varlığı (glomerüler kesit başına sayılır) (Ctrl., n=3; NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres{{) 26}}Bağ2_KI, n=5). (f) NTS ile tedavi edilen farelerin renal korteksindeki farklı inflamasyon, fifibroz ve renal tübüler hasarla ilgili genlerin nispi mRNA seviyeleri (Ctrl., n=4; NTS-ctrl., n=6) –10; NTS-Rarres1_Bağ2_KI, n=6–10). (g) NTS-ctrl'de serum kreatinin ve kan üre nitrojen (BUN) seviyeleri. (n=3) ve NTS-Rarres1_Tie2_KI (n=3) fareler. (h) NTS ile tedavi edilen farklı fare gruplarında (NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres1_) böbrek korteksindeki Paxil'in nispi protein seviyelerini gösteren temsili Western blot belgeleri ve özetlenmiş veriler Kravat2_KI, n=5). (i) NTS ile tedavi edilen farklı fare gruplarından böbrek kortikal dokusunda pP65 immünohistokimyasal boyamanın temsili fotomikrografları. Glomerül başına pP65-pozitif çekirdek, farklı fare gruplarında ölçülmüştür (Ctrl., n=7; NTS-ctrl., n=8; NTS-Rarres1_Tie 2_KI, n=14). EC'ye özgü Rarres1 nakavt fareler (Rarres1_Tie2_KI fareler); Rarres1 kaseti olan ve Cre ifadesi (Ctrl.) olmayan fareler kontrol olarak kullanıldı. #P < 0.05,="" ##p="">< 0.01,="" ###p="">< 0.001="" ile="" muamele="" edilmemiş="" kontrole="" (ctrl.),="" *p="">< 0.05="" ile="" nts="" ile="" muamele="" edilmiş="" kontrole="" (nts-ctrl.)="" karşı.="" veriler,="" ortalama="" ±="" sem="" olarak="" ifade="" edilir.="" 2="" grup="" arasındaki="" karşılaştırmalarda="" öğrenci="" t="" testi="" kullanıldı.="" 3="" veya="" daha="" fazla="" kişilik="" gruplar="" için="" tek="" yönlü="" varyans="" analizi="" ve="" ardından="" çoklu="" karşılaştırmalar="" için="" tukey'nin="" son="" testi="" kullanıldı.="" bu="" resmin="" görüntülenmesini="" optimize="" etmek="" için="" lütfen="" bu="" makalenin="" çevrimiçi="" versiyonuna="" www.kidney-international.org="" adresinden="">
TARTIŞMA
Rarres1 ilk olarak tazaroten ile tedavi edilen cilt sal kültürlerinde tanımlandı29 ve prostat kanseri hücre dizilerinde bir istila baskılayıcı olarak hareket ettiği gösterildi.30 İltihaplı meme kanserinde, Rarres1, Axl sinyal yolu aracılığıyla kanser hücrelerinin istilasını in vitro olarak düzenler. . Ayrıntılı olarak, Rarres1, Axl'nin proteazoma bağlı bozunmasını inhibe ederek Axl'yi stabilize eder. Ayrıca, SUM149 hücrelerinde Rarres1'in tükenmesi, Axl ekspresyonunu aşağı regüle eder ve NF-kB'yi inaktive ederek, inflamatuar meme kanseri hücrelerinin invazyonunun azalmasına yol açar.20 Ek olarak, ileri fifibrozlu hastalarda Rarres1 ekspresyonu indüklenir ve Rarres1'in profibrotik bir rolü olmuştur. bir sıçan akciğer fifibrozis modelinde ve hepatik yıldız hücrelerinin fibrojenik aktivasyonu sırasında önerilmiştir.31 Birlikte ele alındığında, önceki in vitro çalışmalar Rarres1'in fifibroz, iltihaplanma ve kanser istilasında bir rolü olduğunu düşündürmektedir.
Başlangıçta, Rarres1, podosit hücrelerinde oldukça zengin olduğu için ilgimizi artırdı. Rarres1'in, Axl aracılı NF-kB yolu aktivasyonu yoluyla podositlerde inflamatuar ve profibrotik sinyalleşmeyi desteklediğini gösterebiliriz. Öte yandan, podosit-spesifik nakavt hayvanlar, GN'nin bir fare modelinde olduğu kadar sağlıklı koşullar altında kontrollerle karşılaştırıldığında herhangi bir bariz farklılık gösteremedi. Bu, NF-kB sinyal yolu bir dizi molekül ve biyolojik süreç tarafından düzenlendiği için telafi edici mekanizmalara bağlı olabilir.
Diyabetli hastaların moleküler profili, Rarres1'in DN'de glomerüler ve peritübüler kılcal EC'lerde indüklendiğini gösterdi. Önemli olarak, nefropatisi olmayan diyabetik hastalarda EC'lerde Rarres1 ekspresyonu tespit edilmedi. Bu nedenle, Rarres1'in diyabetik mikrovasküler hastalık için yeni bir belirteç olabileceğini tahmin ediyoruz ve plazma ve idrar örneklerindeki çalışmaların, Rarres1'in invaziv olmayan bir biyobelirteç olarak uygulanabilirliğini araştırmak için endike olduğu belirtiliyor. IgAN ve vasküliti olan hastalarda da Rarres1 indüksiyonunu belirledik. Rarres1'in bu glomerülopatilerde patojenik bir rolü olduğunu ve hastalığın ilerlemesine katkıda bulunduğunu tahmin etmek caziptir. İşlevsel olarak, EC'lerde Rarres1'in indüklenmesinin, bir murin GN modelinde böbrek hasarını arttırdığını, oysa Rarres1'in EC'lerde etkisizleştirilmesinin hasarı iyileştirdiğini gösterdik. Fenotipik analiz, EC'lerde Rarres1'i aşırı eksprese eden farelerde podositlerin etkilendiğini gösterdi. Bu, Rarres1'in podositlere doğrudan etkisi olabilir, çünkü Nadirlerin çözünür bir formu tarif edilmiştir.32 Alternatif olarak, podosit hasarı glomerulus filtrasyon bariyerinin hasarına ikincil olabilir.
Önceden, endotelyal NF-kB aktivasyonunun vaskülitte böbrek hastalığının gelişiminde patojenik bir rol oynadığı gösterilmişti.13 Özellikle, bir kresentik GN modelinde endotelyal NF-kB yolunun inhibisyonu ilerlemeyi durdurdu. Axl inhibitörlerinin deneysel anti-GBM nefritte faydalı olduğu gösterilmiştir. En seçici küçük moleküllü inhibitör R428 ile tedavi edilen fareler, böbrek fonksiyonunun önemli ölçüde korunduğunu ve inflamatuar sitokin üretimini azalttığını gösterdi.33 Bu, yolun aşağıdakiler için terapötik bir seçenek olabileceğini gösterir.glomerüler hastalıksüreçler. Bununla birlikte, hem Axl hem de NF-kB vücutta bir dizi farklı hücresel süreci modüle ettiğinden, CKD'de farmasötik hedefleme için iyi bir aday olması pek olası değildir. Rarres1 daha böbrekle ilişkili bir hedef sağlayabilir.
Tie2-Cre'nin hematopoietik hücrelerin bir alt popülasyonunda ekspresyonu yönlendirdiği gösterilmiştir.34 Bu hücrelerin bazıları NTS ile indüklenen modelde inflamatuar yanıtı modüle edebilir ve bu nedenle hematopoietik hücre kaynaklı Rarres1'in katkıda bulunduğunu göz ardı edemeyiz. Tie2-Cre hatlarında hastalık ilerlemesi. Ancak, sızan bağışıklık hücrelerinde belirgin bir Rarres1 ifadesi tespit edemediğimiz için bunun daha az olası olduğunu düşünüyoruz.
Bu el yazması hazırlanırken, Chen ve ark.32, Rarres1'in çözünür bir formu olduğunu bildirmiştir.glomerüler hastalıkilerleme. Bize benzer şekilde, yaygın insan glomerüler hastalıklarında Rarres1'in yukarı regülasyonunu tanımladılar. Çalışma, artan Rarres1 ekspresyonunun böbrek fonksiyonundaki düşüşle ilişkili olduğu bulgumuzu desteklemektedir.insan glomerüler hastalığı. Bununla birlikte, sonuçlarımızın aksine, Rarres1'in yukarı regülasyonunun podositlerdeki aşırı ekspresyondan kaynaklandığı sonucuna varmışlardır. Bu olasılığı dışlayamayız, ancak insan hastalıklarında EC'lerde belirgin bir Rarres1 ekspresyonu indüksiyonu tespit ettik. Bulgularımızı açıklayan bir mekanizma, podositler tarafından üretilen çözünür Rarres1 formunun GEC'ler tarafından alınması olabilir. Bununla birlikte, in situ hibridizasyon yoluyla EC'lerde Rarres1 mRNA'yı tespit ettiğimiz ve Rarres1'in peritübüler kılcal EC'lerde de indüklendiğinin sonuçları, Rarres1'in böbrek hastalıklarında ekspresyonunun esas olarak endotel kaynaklı olduğu fikrini kuvvetle desteklemektedir.
Şekil 7|Rarres1'in endotelyal spesifik ablasyonu, nefrotoksik serum (NTS) ile tedavi edilen farelerde böbrek hasarını hafifletir. (a) Cre-LoxP rekombinasyon sistemi kullanılarak Rarres1'in endotel hücrelerinde spesifik olarak ablasyona tabi tutulduğu koşullu nakavt farelerin üretilmesi. Ekson 3, Tie2-Cre aracılı rekombinasyonda silinir. (b) Genotipleme, (devamı)'da kuyruk hazırlama ve polimeraz zincir reaksiyonu ile doğrulandı.
Şekil 7|(devamı) 4 haftalık. (c) NTS ile tedavi edilen farklı fare gruplarında (NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres1_) renal kortekste Rarres1'in nispi protein seviyelerini gösteren temsili Western blot belgeleri ve özetlenmiş veriler Tie2_KO, n=4) ve tedavi edilmemiş fareler (Kontrol [Ctrl.], n {{10}}). **P < 0.01.="" (d)="" nts="" tedavisinde="" farklı="" fare="" gruplarında="" uacr="" (idrar="" albümin-kreatinin="" oranı)="" (ctrl.,="" n="7–11;" rarres1_tie2_ko,="" n="" {="" {19}}–8).="" (e)="" farklı="" fare="" gruplarında="" tipik="" glomerüler="" yapı="" değişikliklerini="" gösteren="" fotomikrograflar="" ve="" nicelemeler.="" glomerüler="" lezyonlar="" periyodik="" asit-schiff="" lekeli="" kesitlerde="" tanımlandı="" (ctrl.,="" n="3;" nts="" ile="" tedavi="" edilen="" kontrol="" [nts-ctrl.],="" n="12;" nts="" rarres1_tie{="" {27}}ko,="" n="8)." (f)="" transmisyon="" elektron="" mikroskobu="" analiz="" bölümleri="" ile="" farklı="" fare="" gruplarında="" ortalama="" glomerüler="" bazal="" membran="" (gbm)="" kalınlığının="" ve="" mm="" gbm="" başına="" yarık="" sayısının="" temsili="" fotomikrografları="" ve="" miktarları="" (ctrl.,="" n="6;" nts-ctrl.="" ,="" n="13;" nts-rarres1_bağ2_ko,="" n="16)." (g)="" farklı="" fare="" gruplarından="" alınan="" böbrekte="" nefrin,="" sinaptopodin,="" -düz="" kas="" aktin="" (sma)="" ve="" wt1="" ifadelerini="" gösteren="" temsili="" konfokal="" mikroskobik="" görüntüler.="" çubuklar="50/10" mm.="" sma-pozitif="" alan="" kortikal="" kesit="" başına="" sayıldı="" (nts-ctrl.,="" n="8;" nts-rarres1_tie2_ko,="" n="4)." (h)="" nts="" ile="" tedavi="" edilen="" farklı="" fare="" gruplarından="" böbrek="" kortikal="" dokusunda="" pp65="" immünohistokimyasal="" boyamanın="" temsili="" fotomikrografları.="" glomerül="" başına="" pp65-pozitif="" çekirdek,="" farklı="" fare="" gruplarında="" ölçülmüştür="" (nts-ctrl.,="" n="7;" nts-rarres1_tie2_ko,="" n="" {{="" 56}}).="" ####p="">< 0.001="" ile="" tedavi="" edilmemiş="" ctrl.,="" *p="">< 0.05="" ve="" nts-ctrl.="" veriler,="" ortalama±="" sem="" olarak="" ifade="" edilir.="" 2="" grup="" arasındaki="" karşılaştırmalarda="" öğrenci="" t="" testi="" kullanıldı.="" 3="" veya="" daha="" fazla="" kişilik="" gruplar="" için="" tek="" yönlü="" varyans="" analizi="" ve="" ardından="" çoklu="" karşılaştırmalar="" için="" tukey'nin="" son="" testi="" kullanıldı.="" bu="" resmin="" görüntülenmesini="" optimize="" etmek="" için="" lütfen="" bu="" makalenin="" çevrimiçi="" versiyonuna="" www.kidney-international.org="" adresinden="">
Bu çalışmada kabul edilmesi gereken birkaç sınırlama vardır. İlk olarak, podositlerde in vitro çalışmalar yapılmıştır, oysa in vivo olarak EC'lerde ekspresyonu manipüle ettik. Bu nedenle, EC'lerde Rarres1'i Axl aktivasyonuna doğrudan bağlayamayız. İkincisi, podositlerde NF-kB sinyalinin Rarres1- ile indüklenen (Axl'ye bağlı) aktivasyonunu belirleyebilsek de, bu işlemin arkasındaki moleküler mekanizmayı araştırmadık. Rarres1'in proteazom bağımlı bozulmasını engelleyerek Axl aktivasyonunu desteklediğine dair önceki bulguyu araştırmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. Son olarak, nakavt/in hayvanlarımıza yalnızca NTS'nin neden olduğu nefropati modeliyle meydan okuduk. Bu nedenle, Rarres1'in diğer hastalık süreçlerinde de patojenik bir rolü olup olmadığını görmek için hayvan modellerinde daha fazla çalışma belirtilmiştir.
Özetlemek gerekirse, çalışmamız yaygın insan glomerülopatilerinde, podositle zenginleştirilmiş protein Rarres1'in EC'lerde indüklendiğini ve iltihaplanma, podosit hasarı ve fifibrozise yol açtığını göstermektedir. Bu, potansiyel olarak, reseptör tirozin kinaz Axl'nin aktivasyonu yoluyla NF-kB sinyal yolunun güçlendirilmesiyle aracılık edilir (Şekil 7). Rarres1, mikrovasküler hasarın yeni bir biyobelirteçidir ve KBH'de iltihaplanma ve fifibrozu baskılamak için potansiyel olarak yeni bir terapötik hedef olabilir.
AÇIKLAMA
ML, AstraZeneca, Göteborg, İsveç'in bir çalışanıdır. JP'nin araştırması AstraZeneca tarafından destekleniyor. Diğer tüm yazarlar, rekabet eden çıkarlar beyan etmemiştir.
TEŞEKKÜRLER
Bu çalışma, Diabetes Wellness Sverige'den KM-H ve KI/AZ Integrated Metabolic Center, Marianne och Marcus Wallenberg Vakfı, İsveç Diyabet Vakfı, İsveç Böbrek Vakfı ve Yenilikçi Tıp Merkezi'nden JP'ye desteklenmiştir.
YAZAR KATKILARI
Araştırmayı KM-H, ML ve JP tasarladı; Araştırmayı KM-H, DD, EC, SZ ve GG gerçekleştirdi; KM-H ve XL verileri analiz etti; AW insan örnekleri sağladı; ve KM-H ve JP makaleyi yazdı.
Retinoik Asit Reseptörü Responder1 Neden Glomerüler Hastalıkların Gelişimini Destekleyebilir?
EK MATERYAL
Ek Dosya (PDF)
Tablo S1. Bu çalışmada gerçek zamanlı RT-PCR için hedef genlerin primer çiftleri kullanıldı.
Tablo S2. Bu çalışmada antikorlar kullanıldı. Ek Dosya (PowerPoint)
Şekil S1. Rarres1 aşırı ekspresyonu, kanonik olmayan NF-kB sinyal yolunu aktive etmez. Temsili Western blot belgesi ve Rarres1'in aşırı ekspresyonunun 10 ng/ml TGF-b1 (n=2) ile tedavi edilen podositlerde p100/p52'yi aktive etmediğini gösteren özetlenmiş veriler. Veriler, ortalama ± SD olarak ifade edilir. İki grup arasındaki karşılaştırmalarda öğrenci t testi kullanıldı. UT, tedavi edilmemiş.
Şekil S2. Podosit-spesifik Rarres1 nakavt (Creş/Rarres1flfl/flfl ) farelerinin oluşturulması. (A) Tübüler ve glomerüler fraksiyonlarda ve ayrıca karaciğer dokusunda geleneksel PCR analizi. (B) Cre– /Rarres1flfl/flfl ve Creþ/Rarres1flfl/flfl farelerinde böbrek patolojisinin histolojik incelemesi (PAS boyama). (C) Temsili transmisyon elektron mikrografları (TEM) ve ortalama glomerüler bazal membran (GBM) kalınlığının ölçümü ve farklı fare gruplarında (n=3) mm GBM başına yarık sayısı. (D) Podosit spesifik Rarres1 nakavt (Creþ/Rarres1flfl/flfl ) ve kontrol (Cre- /Rarres1flfl/flfl ) farelerinde podosit spesifik belirteçler, sinaptopodin ve nefrin ekspresyonunu gösteren temsili konfokal mikroskobik görüntüler. Çubuk=10 mm.
Şekil S3. NTS ile tedavi edilen farelerin böbreklerinde podosit belirteçleri ve CD31 ekspresyon seviyeleri. (A) NTS ile tedavi edilen Rarres1 podosit spesifik nakavt farelerden (Creþ/Rarres1flfl/flfl ) ve kontrol yavrularından (Cre– /Rarres1flfl/) alınan podositlerde nefrin, WT-1 ve sinaptopodin ekspresyonunu gösteren temsili konfokal mikroskobik görüntüler flfl). Çubuk=10 mm (NTS Cre– /Rarres1flfl/flfl , n=4; NTS-Creş/Rarres1flfl/flfl , n=5). (B) Peritübüler alanlarda CD31-pozitif kılcal damarların oranı. Fare başına otuz peritübüler alan değerlendirildi. (NTS Cre– /Rarres1flfl/flfl , n= 4; NTS-Creş/Rarres1flfl/flfl , n=4). Öğrencinin t testi. (C) Glomerüllerde CD31 sinyalinin yarı niceliksel puanlaması: 0=sinyal yok, 1=zayıf sinyal, 2=orta sinyal, 3=güçlü sinyal. Her fareden değerlendirilen on glomerül (NTS Cre–/ Rarres1flfl/flfl , n=4; NTS-Creş/Rarres1flfl/flfl , n=4). Öğrencinin t testi.
Şekil S4. NTS ile tedavi edilen farelerin böbreklerinde fifibroz, iltihaplanma ve tübüler yaralanma belirteçleri için ifade seviyeleri. (A) NTS ile tedavi edilen Rarres1 podosit spesifik nakavt farelerden (Creþ/Rarres1flfl/flfl ) ve kontrol yavrularından (Cre– /Rarres1flfl/flfl) alınan böbrekte -Sma ifadelerini gösteren temsili konfokal mikroskobik görüntüler. Çubuk=100 mm. (B) NTS ile tedavi edilen farelerin renal korteksindeki farklı inflamasyon, fifibroz ve renal tübüler hasarla ilgili genlerin nispi mRNA seviyeleri. #P < 0.05,="" ##p="">< 0.01="" kontrole="" karşı="" (ctrl.);="" veriler,="" ortalama="" ±="" sem="" olarak="" ifade="" edilir.="" 2="" grup="" arasındaki="" karşılaştırmalar="" için="" student="" t="" testi="" kullanıldı="" (sham="" n="2;" nts–="" cre–="" arres1flfl/flfl,="" n="3;" nts-creş/rarres1flfl/flfl="" ,="" n="3)">
Şekil S5. NTS ile tedavi edilen böbreklerde C31 ve aktif P65'in ifadesi. (A) Peritübüler alanlarda CD31-pozitif kılcal damarların oranı. Fare başına otuz peritübüler alan değerlendirildi (NTS Cre–/ Rarres1flfl/flfl, n=4; NTS Creş/Rarres1flfl/flfl, n=4). Öğrenci t testi. (B) Glomerüllerde CD31 sinyalinin yarı niceliksel puanlaması: 0=sinyal yok, 1=zayıf sinyal, 2=orta sinyal, 3 =güçlü sinyal. Her fareden on glomerül değerlendirildi (NTS Cre –/Rarres1flfl/flfl, n =4; NTS-Creş/Rarres1flfl/flfl, n= 4). Öğrenci t testi. (C) Temsili Western blot belgeleri ve NTS ile tedavi edilen farelerin ve tedavi edilmeyen kontrollerin farklı gruplarında renal kortekste pP65'in nispi protein seviyelerini gösteren verileri özetler (ctrl., n=3; NTS-ctrl. , n=9; NTS-Rarres1_Bağ2_KI, n=10). Veriler, ortalama ± SEM olarak ifade edilir. 2 grup arasındaki karşılaştırmalarda öğrenci t testi kullanıldı.
REFERANSLAR
1. Reidy K, Kang HM, Hostetter T, Susztak K. Diyabetik böbrek hastalığının moleküler mekanizmaları. J Clin Invest. 2014;124:2333–2340.
2. Lai KN, Tang S, Schena F, et al. IgA nefropatisi. Nat Rev Dis Primerler. 2016;2:16001.
3. Lal MA, Patrakka J. Yeni böbrek terapötikleri geliştirmek için podosit biyolojisini anlamak. Ön Endokrinol (Lozan). 2018;9:409.
4. Ju W, Greene C, Eichinger F, et al. İnsan hastalığında transkripsiyonel düzeyde hücre tipi özgüllüğünün tanımlanması. Genom Araş. 2013;23:1862–1873.
5. Ju W, Nair V, Smith S, et al. Kronik böbrek hastalığı biyobelirteç olarak epidermal büyüme faktörünün doku transkriptom odaklı tanımlanması Sci Transl Med. 2015;7:316ra193.
6. Woroniecka KI, Park A, Mohtat T, et al. İnsan diyabetik böbrek hastalığının transkriptom analizi. Diyabet. 2011;60:2354–2369.
7. Wiggins JE, Patel S, Shedden K, et al. NFkappaB, yaşlanan glomerülde iltihaplanma, pıhtılaşma ve fifibrozu teşvik eder. J Am Soc Nephrol. 2010;21:587-597.
8. Prakoura N, Kavvadas P, Korman R, et al. NFkappaB'nin neden olduğu periostin, GN'de böbrek hasarını teşvik etmek için integrin-beta3 sinyalini aktive eder. J Am Soc Nephrol. 2017;28:1475–1490.
9. Chang AS, Hathaway CK, Smithies O, Kakoki M. Transforming büyüme faktörü-beta1 ve diyabetik nefropati. J Physiol Renal Physiol Am. 2016;310:F689–F696.
10. Çamur SJ, Paizis K, Auwardt RB, et al. Pasif Heymann nefritinin otolog fazında podositler tarafından nükleer faktör-kappa B'nin aktivasyonu. Böbrek İnt. 2001;59:923-931.
11. Tomita T, Takano M, Tomita R, et al. NFkappaB için transkripsiyon faktörü tuzağı, romatoid artritten türetilen sinovyal hücrelerde sitokin ve adezyon molekülü ekspresyonlarını inhibe eder. Romatoloji (Oxford). 2000;39:749–757.
12. Zambrano S, Möller-Hackbarth K, Li X, et al. GPRC5b, inflamatuar yanıtı modüle ederglomerüler hastalıklarNF-kappaB yolu ile. J Am Soc Nephrol. 2019;30:1573–1586.
13. Choi M, Schreiber A, Eulenberg-Gustavus C, et al. Endotelyal NF-kappaB blokajı, ANCA kaynaklı GN'yi ortadan kaldırır. J Am Soc Nephrol. 2017;28:3191–3204.
14. Zheng L, Sinniah R, Hsu SI. İnsan lupus nefritinde ve başka bir proliferatif olmayan proteinürik glomerülopatide aktive edilmiş NF-kappaB'nin yerinde glomerüler ekspresyonu. Virchows Arch. 2006;448:172–183.
15. Takemoto M, He L, Norlin J, et al. Böbrek glomerül gelişimi ve işlevinde rol oynayan genlerin büyük ölçekli tanımlanması. EMBO J. 2006;25:1160–1174.
16. Saleem MA, O Hare M, Reiser J, et al. Nefrin ve podosin ekspresyonu gösteren koşullu olarak ölümsüzleştirilmiş insan podosit hücre dizisi. J Am Soc Nephrol. 2002;13:630–638.
17. Kisanuki YY, Emoto N, Ohuchi T, et al. Endotel hücresine özgü endotelin 1 nakavt farelerde düşük kan basıncı. Hipertansiyon. 2010;56:121–128.
18. McAdoo SP, Pusey CD'si. Antiglomerüler bazal membran hastalığı. Clin J Am Soc Nephrol. 2017;12:1162–1172.
19. Qi XM, Wang J, Xu XX, et al. FK506, diyabetik sıçanlarda podosit nefrin ve podosin ekspresyonunu iyileştirerek albüminüriyi azaltır. Inflflamm Araş. 2016;65:103–114.
20. Wang X, Saso H, Iwamoto T, et al. TIG1, Axl kinazın aktivasyonu yoluyla inflamatuar meme kanserinin gelişimini ve ilerlemesini destekler. Kanser Araş. 2013;73:6516–6525.
21. Holland SJ, Pan A, Franci C, et al. Axl kinazın seçici bir küçük moleküllü inhibitörü olan R428, metastatik meme kanseri modellerinde tümörün yayılmasını engeller ve hayatta kalma süresini uzatır. Kanser Araş. 2010;70:1544–1554.
22. Myers SH, Brunton VG, Uniti-Broceta A. Kanserde AXL inhibitörleri: tıbbi bir kimya perspektifi. J Med Chem. 2016;59:3593–3608.
23. Salant DJ, Darby C, Couser WG. Sıçanlarda deneysel membranöz glomerülonefrit. İzole glomerüllerde ve bütün hayvanlarda glomerüler immün birikinti oluşumunun kantitatif çalışmaları. J Clin Invest. 1980;66:71-81.
24. Berthier CC, Bethunaickan R, Gonzales-Rivera D, et al. Türler arası transkripsiyonel ağ analizi, murin ve insan lupus nefritinde paylaşılan inflamatuar yanıtları tanımlar. J İmmünol. 2012;189:988–1001.
25. Grayson P, Eddy S, Taroni J, et al. Nadir böbrek hastalıklarında metabolik yollar ve immünmetabolizma. Ann Rheum Dis. 2018;77: 1226–1233.
26. Liu P, Lassen E, Nair V, et al. Transkriptomik ve proteomik profil oluşturma, IgA nefropatisinde mesanjiyal hücre fonksiyonu hakkında bilgi sağlar. J Am Soc Nephrol. 2017;28:2961–2972.
27. Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J. Yeni bir ökaryotik vektöre sahip yüksek ekspresyonlu transfektanlar için verimli seçim. Gen. 1991;108:193-199.
28. Loefflfler I, Wolf G. Diyabetik nefropatide epitelden mezenkimal geçiş: gerçek mi kurgu mu? Hücreler. 2015;4:631–652.
29. Nagpal S, Patel S, Asano A, et al. Tazaroten kaynaklı gen 1 (TIG1), bir romanretinoik asitderide reseptöre yanıt veren gen. J Yatırım Dermatol. 1996;106:269-274.
30. Jing C, El-Ghany M, Beesley C, et al. Prostat karsinomlarında tazaroten kaynaklı gen 1 (TIG1) ekspresyonu ve bunun tümörijenite ile ilişkisi. J Natl Kanser Enst. 2002;94:482-490.
31. Teufel A, Becker D, Weber SN, et al. RARRES1'in karaciğer fifibrozunda çekirdek düzenleyici olarak tanımlanması. J Mol Med (Berl). 2012;90:1439–1447.
32. Chen A, Feng Y, Lai H, et al. Çözünür RARRES1, teşvik etmek için podosit apoptozunu indüklerglomerüler hastalıkilerleme. J Clin Invest. 2020;130:5523–5535.
33. Zhen Y, Lee IJ, Finkelman FD, Shao WH. Axl reseptörü tirozin kinazın hedeflenen inhibisyonu, anti-GBM kaynaklı lupus benzeri nefriti iyileştirir. J Otoimmün. 2018;93:37–44.
34. Tang Y, Harrington A, Yang X, et al. Tie2+ soyunun ilkel ve kesin hematopoietik hücrelere katkısı. Yaratılış. 2010;48:563–567
