Apolipoprotein L1'in Böbrek Hastalığıyla İlişkili Varyantları, Katyon Kanalı Aktivitesinde İşlev Kazanımını Gösteriyor

İletişim: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com

Jonathan Bruno ve John C. Edwards

Apolipoprotein L1'deki (ApoL1) varyantların, bazı ilerleyici hastalıkların artan riskinden sorumlu olduğu bilinmektedir.böbrekhastalıklarAfrika kökenli insanlar arasında. ApoL1, fosfolipid membranlara girebilen ve pH'a bağlı olarak fosfolipid membranlara anyon veya katyon seçici geçirgenlik kazandıran amfitropik bir proteindir. Bu aktivitelerin varyantlar arasında farklılık gösterip göstermediği veya hastalık patogenezine katkıda bulunup bulunmadığı bilinmemektedir. ApoL1 izoformları arasındaki farklılıkları değerlendirmek için fosfolipid veziküllerden voltajla yönlendirilen iyon akışı ve stabil membran ilişkisi analizlerini kullandık. Referans protein ile karşılaştırıldığında böbrek hastalığıyla ilişkili iki varyantın katyon seçici iyon permeaz aktivitesinde önemli (yaklaşık iki kat) bir artış vardır. Buna karşılık, izoformlar arasında düşük pH'da anyon seçici permeaz aktivitesinde hiçbir fark bulmuyoruz. Referans sekans ile karşılaştırıldığında, hastalıkla ilişkili iki varyant, katyonpermeaz aktivitesini destekleyen koşullar altında fosfolipid veziküller ile artan kararlı ilişki gösterir; artan aktivite, daha verimli membran birleşmesi ve yerleştirilmesi nedeniyle olabilir. Anyon permeaz aktivitesi için optimal koşullar altında izoformlar arasında membran birleşiminde hiçbir fark yoktur. Bu veriler, artan katyon geçirgenliğinin, yüksek riskli ApoL1 alelleri ile ilişkili ilerleyici böbrek hastalıklarına katkıda bulunabileceği bir modeli desteklemektedir.

ApoL1 proteinindeki iki farklı varyantın, artan progresif proteinürik riskinden sorumlu olduğu bilinmektedir.böbrekhastalıkAfrika kökenli insanlarda, özellikle fokal segmental glomerüloskleroz, hipertansif nefroskleroz ve HIV ile ilişkili nefropati nedeniyle (1-3). ApoL1'in insan hücrelerindeki işlevsel rolleri, hastalıkla ilişkili varyantların bu işlevler üzerindeki etkisi ve bu tür değişikliklerin hareketsizliği nasıl hızlandırabileceğiböbrek hastalığıbelirsizdir (4, 5).

ApoL1 proteininin sahip olduğu bilinen tek biyokimyasal aktivite, bir iyon kanalı olarak işlev görmesidir. ApoL1'in N terminal alanının, bakteriyel kolisin A1'e yapısal benzerliğe sahip olduğu kaydedilmiştir (6). Kolisin A1 gibi, ApoL1 de belirli koşullar altında sulu bir çözeltiden lipid membrana girebilen ve daha sonra bir iyon geçirgenliği olarak işlev görebilen bir amfitropik proteindir (6-9). Saflaştırılmış rekombinant vahşi tip ApoL1, nötr pH'da (8, 9) deterjan solüsyonunda stabildir. Düşük pH'da, ApoL1 fosfolipid membranlara girebilir ve membranların anyon seçici geçirgenliğini artırabilir(6, 7, 9). Cis pH'ı tekrar nötre yükseltildiğinde, anyon seçici geçirgenlik baskılanır ve bir katyon seçici kanal etkinleştirilir (8, 9). Bu veriler, ekzositik veya endositik yollar boyunca asidik bir bölmeye sunulan ApoL1'in, artan anyon geçirgenliğine yol açan organelin sınırlayıcı zarına girebildiği bir modeli desteklemektedir. Proteinin, cis pH'ın nötr olacağı (plazma zarı veya mitokondriyal zarlar gibi) diğer zar bölmelerine müteakip trafiği, anyon geçirgenliğini bastırır ve katyon-geçirgenliği aktive eder. Bu iyon geçirgenlik aktivitelerinin, ilişkili ApoL1- patogenezinde rol oynayıp oynamadığıböbrekhastalıklarbelirsizdir.

G0 olarak adlandırılan referans (yabani tip) sekans ile G1 ve G2 olarak adlandırılan iki hastalıkla ilişkili varyant arasındaki iyon permeaz aktiviteleri ve membran bağlanması farklılıklarını test etmek için vezikül bazlı yöntemler kullandık. G0 ile karşılaştırıldığında, hem G1 hem de G2 izoformlarının, düşük pH'ta anyon seçici geçirgenlik aktivitesini değiştirmeden nötr pH'ta katyon permeaz aktivitesinin artan spesifik aktivitesini gösterdiğini bulduk. Ayrıca, hastalıkla ilişkili izoformlar G1 ve G2, katyonpermeaz aktivitesini destekleyen koşullar altında G0 ile karşılaştırıldığında, anyon permeaz aktivitesini destekleyen koşullar altında değil, artan kararlı membran ilişkisi gösterir. Katyon kanalı aktivitesinin ne bağlanma aşamasının ne de dışarı akış aşamasının pH duyarlılığı modeli üzerinde herhangi bir etki bulmuyoruz ve anyon seçici geçirgenlik etkinliğinin pH duyarlılığı üzerinde hiçbir etki bulmuyoruz. ApoL1'in hastalıkla ilişkili varyantlarının, proteinin katyon kanalı aktivitesini, muhtemelen en azından kısmen membran girişini artırarak seçici olarak arttırdığı sonucuna varıyoruz. Bu gelişmiş kanal etkinliğinin ilerlemeye katkıda bulunmasını öneriyoruz.böbrekhastalıkyüksek riskli genotipleri taşıyan kişilerde.

Cistanche tedavi edebilirböbrek hastalığı

Sonuçlar

N-terminal sinyal dizisi çıkarılmış ve bir 6His/T7epitop etiketi ile değiştirilmiş ApoL1'in rekombinant izoformları eksprese edildi ve saflaştırıldı. Üçü de saflaştırma yoluyla aynı kromatografik özellikler gösterdi ve jel elektroforezi ile ayırt edilemezdi Şekil 1.

Pik fraksiyonlar 100 ug/ml'ye seyreltildi ve klorür ve potasyum geçirgenliği verme yeteneği için vezikül dışa akış tahlillerine tabi tutuldu. Tahlil iki ayrı aşamadan oluşur. İlişkilendirme aşamasında, ApoL1, KCl yüklü fosfolipid veziküller ile karıştırılır ve membranlara girmesine izin verilir. Ekstravehiküler KCl ve tampon daha sonra izotonik sakarozda dengelenmiş bir tuz giderme döndürme kolonundan geçirilerek çıkarılır ve her iki Kand'ın büyük içten dışa gradyanlarını oluşturur. Cl iyonları. Akış aşamasında, döndürme kolonu eluatı, KCl gradyanını istenen pH'da tutan bir izotonik tamponlu sakaroz çözeltisine seyreltilir. Araç dışı Cl konsantrasyonu, klorür seçici bir elektrot ile izlenir. K veya Cl seçici geçirgenlik mevcut olsa bile, karşı iyon hareketinin olmaması nedeniyle hiçbir iyon veziküllerden çıkamaz. Voltajla çalışan iyon akışı, bir karşı iyon iyonoforunun doygun bir konsantrasyonunun eklenmesiyle başlatılır. K-seçici iyonoforun, valinomisin(Val) eklenmesi, Cl geçirgenliği varsa, klorür seçici elektrot tarafından tespit edilecek olan KCl akışını yönlendirecek büyük bir negatif membran içi potansiyeli indükleyecektir; bu nedenle Val'den sonra Cl akış hızı Cl geçirgenliğini yansıtır. Tersine, Cl-seçici iyonofor, Klorür İyonofor 1(CI1)'nin eklenmesi, bir K geçirgenliği varsa KCl akışını sürdürecek bir pozitif membran potansiyeli indükleyecektir. Bu nedenle, CI1 eklendikten sonra Cl akış hızı K geçirgenliğini yansıtır. Dolayısıyla bu deney, hangi iyonoforun kullanıldığına bağlı olarak bir Cl veya K geçirgenlik deneyi olarak hizmet edebilir. İyonofor ilavesini takiben ilk iyon akışı hızı veziküllerin spesifik iyonik geçirgenliği olarak alınır. İyonofor ilavesinden önceki Cl akışı, hem Kan hem de Cl'ye bir miktar geçirgenlik gösterir. Bu durumda bile, karşı iyon iyonofor fazlasının eklenmesinden sonra Cl akış hızı, ilgilenilen iyona geçirgenliği temsil eder - Val eklenmesinden sonra Cl ve CI1 eklenmesinden sonra K.

Cistanche tedavi edebilirböbrek hastalığı

Klorür permeaz aktivitesi

Önceki çalışmalarımız, hem membran birleşme aşaması hem de akış aşaması pH 5'te gerçekleştirildiğinde anyon geçirgenliğinin en yüksek olduğunu gösterdi.0 ve bu koşullar, başlatmak için Val kullanılarak üç izoformun Cl geçirgenlik aktivitesini karşılaştırmak için kullanıldı. Cl geçirgenliğine bağlı akış. Ham veri örnekleri, zamana karşı çizilen milivolt cinsinden Cl seçici elektrottan çıktıyı gösteren Şekil 2A'da gösterilmektedir. Kayıt, mV değeri 10 μM Cl konsantrasyonunu yansıtan veziküller ve protein içeren spin kolon elüatı eklenmeden önce başlar. Cl içermeyen döndürme kolonu eluatı, mV izlemenin yukarı doğru sapmasına yansıyan Cl'yi seyrelterek ilk okta eklenir. İkinci okta Val eklenir, Cl geçirgenliği mevcutsa Cl akışını tetikler, bu da aşamalı düşüş inmV tarafından yansıtılır. Üçüncü okta Triton X-100 eklenir ve kalan tüm intraveziküler klorür salınır. Test koşulları altında elektrot için oluşturulan standart bir eğri kullanılarak mV'den klorür konsantrasyonuna dönüştürüldükten sonra, Val ilave edildikten sonra fraksiyonel başlangıç ​​Cl salımı hızı belirlenir ve klorür geçirgenliği olarak alınır. Proteinsiz kontrol (mavi izleme) ile karşılaştırıldığında, Val ilavesinden sonra yüksek Cl salımı oranı, ApoL1'in üç izoform (kırmızı, yeşil ve sarı izler) arasında karşılaştırılabilir görünen önemli Clgeçirgenlik sağladığını gösterir. Val'den önceki çok düşük akış hızı, potasyum geçirgenliğinin Cl geçirgenliğinden çok daha düşük olduğunu gösterir. ApoL1 izoformlarının bir dizi konsantrasyonu, Cl geçirgenliği için test edildi (Şekil 2B). Daha önce G0 için bildirildiği gibi, Clpermease aktivitesinin, üç izoformun tümü için testteki protein kütlesi ile doğrusal olarak ilişkili olduğunu bulduk. Her konsantrasyondaki permeaz aktivitesi, üç izoform arasında farklı değildir. Konsantrasyon eğrisi, aynı sonucu veren iki farklı protein preparatı seti kullanılarak iki kez gerçekleştirilmiştir.

Üç proteinin altı bağımsız preparasyonu, Şekil 2C'de özetlendiği gibi pH 5'te Cl permeaz aktivitesi için test edildi. Preparasyon setlerinin hiçbirinde izoformlar arasında Cl permeaz aktivitesinde önemli bir fark bulamadık (p > 0.05, her sette G0 ile G1 veya G2'nin karşılaştırılması için) . Altı preparasyonun tümünün ortalama akış oranları (Şekil 2C'de ALL etiketli) referans dizisi G0 için yüzde 1.21 ± 0.32 /s, yüzde 1.36 ± 0.41 /s idi. G1 için ve G2 için 1.18 ± 0.34(ortalama ± SD, her biri için n=6; G0 ile G1'in karşılaştırılması için p=0.47 ve 0.94) ve G2, sırasıyla). Hastalıkla ilişkili mutasyonların anyon geçirgenliğinin pH duyarlılığını değiştirip değiştirmediğini belirlemek için, her izoform tarafından verilen Cl geçirgenliği, testin hem birleşme hem de akış adımları için belirtilen pH kullanılarak bir dizi pH değeri aracılığıyla test edildi (Şekil 2D). izoformları arasında önemli farklılıklar vardır. Bu deney iki farklı protein preparatı seti kullanılarak iki kez yapıldı ve aynı sonucu verdi. Bu nedenle, Clpermease aktivitesi, iki hastalıkla ilişkili varyant ve referans dizi arasında önemli ölçüde farklı değildir.

Potasyum permeaz aktivitesi

Daha önceki çalışmalarımız, katyon geçirgenliğinin en yüksek pH 6'da membran birleşme adımı gerçekleştirildiğinde0 ve dışa akış adımının pH 7.5'te gerçekleştirildiğini gösterdi ve aksi belirtilmedikçe bu koşulları kullandık. Bir K geçirgenlik deneyinden elde edilen ham veri örnekleri Şekil 3'te gösterilmiştir. Cl geçirgenlik tahlillerinde olduğu gibi, birinci okta döndürme kolonu eluatı, ikinci okta iyonofor (bu durumda, Klorür İyonofor1, CI1) eklenir ve deterjan üçüncü okta eklenir. K geçirgenliğini temsil eden iyonofor ilavesinden sonraki başlangıç ​​akış hızları, gri kesikli çizgilerle gösterilmiştir. Mavi izleme, protein yok kontrolündendir ve yalnızca veziküllerin endojen arka plan geçirgenliğini gösterir. Kırmızı iz, G0(yabani tip) varyantının aktivitesini gösterir ve daha önce bildirildiği gibi protein tarafından verilen kontrol veziküllerinden daha büyük Kgeçirgenlik varlığını açıkça gösterir (9). Sarı ve yeşil izler, sırasıyla G1 ve G2 varyantlarının aktivitesini gösterir. İyonofor ilavesinden sonraki ilk eğimler, G0 için olduğundan G1 ve G2 için açıkça daha büyüktür, bu da hastalıkla ilişkili varyantların G0'den daha fazla K geçirgenlik aktivitesini desteklediğini gösterir.

Cl geçirgenlik deneyinin aksine ve G0 izoformu (9) için daha önce bildirildiği gibi, K geçirgenlik tahlili koşulları altında, aşağı doğru eğimle temsil edilen üç izoformdan herhangi birini içeren veziküllerde iyonofordan önce bir miktar akış vardır. örnek eklenmesinden sonra ve iyonofor eklenmesinden önce kayıtların. İyonofor ilavesinden sonraki yüksek akış hızı, önemli miktarda K geçirgenliğinin varlığını gösterirken, iyonofordan önceki akış, bir miktar Cl geçirgenliğinin varlığını da gösterir ve her iki iyonun da iyonofor yokluğunda veziküllerden dışarı sızmasına izin verir. Bu, muhtemelen hem döndürme kolonu eluatının eklenmesinden hemen sonra elektrot çıkışındaki körelmiş artışı hem de ApoL1 içeren tüm kayıtlarda görülen CI1'den önceki müteakip aşağı eğimi açıklar. Bu sızıntının numune döndürme kolonundan geçerken başladığını varsayarsak, döndürme kolonunda herhangi bir KCl kaybı teste daha az toplam KCl eklenmesi anlamına geleceğinden, deterjan ilavesinden sonra nihai Cl konsantrasyonundaki farklılıkları da hesaba katacaktır. İyonofor oranının nicel yorumu, her iki Kan ve Cl'ye karşı geçirgenliklerin bir fonksiyonu olması gerektiğinden başka basit değildir. Daha önce olduğu gibi (9), bu aktiviteyi Şekil 2D'de olduğu gibi pH 7.5'te gördüğümüz artık Cl permeaz aktivitesine bağlıyoruz (ayrıca bakınız Bruno ve diğerleri (9), Şekil 4D).

Potasyum permeaz tahlilleri, bir dizi protein konsantrasyonu üzerinde gerçekleştirilmiştir (Şekil 4A). Aktivite, her izoform için tahlildeki protein kütlesi ile lineer olarak ilişkiliydi, ancak hastalıkla ilişkili iki izoform, G0 ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde artan akış aktivitesi gösterdi. Bu konsantrasyon eğrisi, çok benzer sonuçlar veren üç ayrı protein hazırlama seti ile yeniden üretildi.

Üç izoformun altı bağımsız preparasyonu, her tahlilde 2 ug protein kullanılarak K akış aktivitesi için tahlil edildi. Altı kümenin her birinde, G1 ve G2 izoformları için aktivite, G0'den önemli ölçüde daha büyüktü (Şekil 4B). Altı veri setinin tümünün ortalaması 0.349 ± 0 akış hızı sağladı.0G{{10}} için yüzde 63 /s, {{15} G1 için }.709 ± 0.176 /s ve G2 için 0.673 ± 0.142 /s (ortalama ± SD, n Her biri için=6; G0'ın G1 veya G2) ile karşılaştırılması için p < 0.00001.="" g1="" ve="" g2'nin="" k="" permeazının="" spesifik="" aktiviteleri,="" bu="" tahlilde="" g0'dan="" sırasıyla="" 2.03-="" ve="" 1.93-kat="" daha="">

K permeaz aktivitesinin membran birleşme aşamasının pH'ına ve iyon dışarı akış aşamasına bağımlılığı ayrı ayrı analiz edildi. G1 ve G2'nin toplam akış aktivitesinin "standart" koşullar altında (pH 6'da bağlanma, pH 7.5'te akış) G0'den daha büyük olduğunu doğrulamamıza rağmen, eğrinin şeklinde önemli bir fark bulamadık ya membran birleşme aşamasının (Şekil 4C) ya da iyon dışarı akış aşamasının (Şekil 4D) dış (cis) pH'ına karşı aktivite. Aynı zamanda, yüksek intraveziküler (trans) pH'a aktivite bağımlılığında veya iki değerlikli katyonun mevcudiyetinin gerekliliğinde (Şekil 4E) izoformlar arasında hiçbir fark bulamadık ve ayrıca kalsiyum veya magnezyumun tam için gerekli iki değerli katyonu sağlamada eşit derecede etkili olduğunu not ettik. aktivite. Bu deneylerin her biri, farklı saflaştırılmış protein setleri kullanılarak iki kez gerçekleştirildi ve aynı sonuçlar verdi.

Kararlı membran birliği

Daha önce saflaştırılmış rekombinant ApoL1'in fosfolipid membranlara kendiliğinden bağlandığını ve pH ve fosfolipid bileşimine iyon geçirgenlik aktivitelerininkiyle benzer bağımlılık gösterdiğini göstermiştik (9). Benzer yöntemler kullanarak, ApoL1'in referans versiyonunun lipid vezikül bağlama özelliklerini, optimal Cl veya K permeaz aktivitelerini destekleyen koşullar altında böbrek hastalığı ile ilişkili varyantlarla karşılaştırdık (Şekil 5). Clpermease koşulları için, protein, veziküllerle kararlı bir şekilde ilişkili olmayan proteinleri çıkarmak için kaotropik ekstraksiyondan önce pH 50'da lipid vezikülleri ile inkübe edildi. Membran bağlı protein, bir sakaroz yastık aracılığıyla yüzdürme yoluyla izole edildi ve nicel western blotlama ile değerlendirildi. Sonuçlar Şekil 5A'da gösterilmiştir. G{{10}} ile G1 veya G2 izoformları arasında veziküllere bağlanan protein miktarında önemli bir fark yoktu. Her reaksiyondaki 500 ng proteinden veziküllere bağlanan miktar G0,239 ± 38 ng G1 için 223 ± 33 ng ve G2 için 191 ± 28 ng idi (ortalama ± SD ; n her grup için=8, sırasıyla G0'ın G1 ve G2 ile karşılaştırılması için p=0.35 ve 0.076). Bu koşullar altında tahlildeki proteinin yaklaşık yüzde 40-50'si zarlara bağlanır. Bu deney iki kez yapıldı ve çok benzer sonuçlar verdi.

Kpermease aktivitesi için optimal koşullar altında bağlanmayı değerlendirmek için, protein, pH6'da veziküllerle inkübe edildi.0, daha sonra, stabil olmayan eklenmiş proteini çıkarmak için kaotropik ekstraksiyondan önce pH 7.5'e kaydırıldı. Membran bağlı protein, zar veziküllerinin asarkoz yastığı aracılığıyla yüzdürülmesiyle izole edildi ve kantitatif western blotlama ile değerlendirildi. Sonuçlar Şekil 5B'de gösterilmektedir. Hastalıkla ilişkili varyantlar, G0 ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha verimli bağlanma gösterir. Her reaksiyona eklenen 500 ng proteinden veziküllere bağlanan miktar G{{30}} için 43.5 ± 14.5 ng (n=8) idi. ,73.0 G1 için ± 17,7 ng (n=7) ve G2 için 69,3 ± 10,3 ng (n=8)(ortalama ± SD; p=0.00076 ve G0'ın sırasıyla G1 ve G2 ile karşılaştırılması için 0,0018). Bu koşullar altında G1 ve G2'nin yaklaşık yüzde 14'ü ile karşılaştırıldığında, reaksiyondaki G0 proteininin yaklaşık yüzde 9'u veziküllerle kararlı bir şekilde ilişkilendirildi. Bu deney, benzer sonuçlar veren bağımsız preparasyonlar kullanılarak iki kez yapıldı.

Tartışma

Burada, ApoL1'in iyon geçirgenliği aktivitelerine ilişkin çalışmaların sonuçlarını ve onunböbrek-hastalık-birkaç önemli sonuç veren ilişkili varyantlar. İlk olarak, ApoL1'in hastalıkla ilişkili varyantlarının, tahlillerimizdeki G0 izoformunun yaklaşık iki katı olan Kpermease aktivitesini önemli ölçüde arttırdığını bulduk. İkincisi, Kpermease'in aksine, pH 5'te Cl permeaz aktivitesinin spesifik aktivitesinde izoformlar arasında önemli farklılıklar yoktur.0. Üçüncüsü, K veya Cl permeaz aktivitelerinin pH duyarlılığında veya izoformlar arasında yüksek trans pH gereksinimi ve Kpermease aktivitesi için iki değerli katyon gerekliliğinde hiçbir fark yoktur. Dördüncüsü, K permeazını destekleyen optimal koşullar altında, hastalıkla ilişkili varyantlar G0 ile karşılaştırıldığında gelişmiş stabil membran ilişkisi gösterir, ancak Cl permeaz aktivitesi için optimal koşullar altında membran birleşiminde hiçbir fark yoktur.

Cl geçirgenliği üzerinde hiçbir etkisi olmayan artan K geçirgenliğini gösteren bulgularımız çok sağlamdır. Her permeaz aktivitesi için optimal koşulları kullanarak, hastalıkla ilişkili varyantların Kpermease aktivitesinin her birinde G0'den önemli ölçüde büyük olduğu, altı bağımsız preparat grubu arasında esasen aynı sonuçları bulduk. Her set hazırlandı ve ortak reaktifler kullanılarak aynı anda test edildi. BCA testi ile belirlenen protein konsantrasyonlarının geçerliliği, SDS-PAGE üzerindeki Coomassie boyamasının karşılaştırılabilir yoğunluğu ile doğrulandı. Bu veriler, eşzamanlı saflaştırmadaki tüm başarılı girişimleri içerir - bu göreli aktivitelerin gözlemlenmediği üç varyanttan hiçbir zaman başarılı bir şekilde oluşturmadık.

Benzer şekilde, pH 5'te anyon-geçirgenlik spesifik aktivitede farklılıkların olmaması, tüm müstahzar setleri arasında tutarlıydı. Bu nedenle, birincil sonucumuz, ApoL1'in hastalıkla ilişkili varyantlarının, bu etkinliklerin her biri için optimal koşullar altında tahlil edildiği gibi, Cl geçirgenlik etkinliğini etkilemeden K geçirgenlik etkinliğinde seçici işlev kazanımı sağladığıdır. ApoL1 varyantlarının katyon kanalı aktivitesinde, hastalığa neden olma kapasitesiyle ilişkili önemli farklılıkların varlığı, olası patojenik mekanizmalar için çıkarımlara sahiptir. Artan iyon geçirgenliğinin seçici doğası, hastalıkla ilişkili varyantların artan katyon geçirgenlik aktivitesinin hastalığa katkıda bulunabileceğini, ancak izoformlar arasında farklı olmayan düşük pH'daki anyon geçiş aktivitesinin kritik bir rol oynamasının muhtemel olmadığını gösterir.

Aktivitelerin pH-duyarlılıkları ve protein tarafından stabil membran bağlanmasının kapsamı üzerindeki varyantların etkilerinin araştırılması, K permeaz aktivitesinin arttırılabileceği mekanizmaya ışık tuttu. İlk olarak, optimal koşullar altında K permeazının arttırılmış aktivitesini doğrulamanın dışında, K permeaz aktivitesinin membran birleşimi ve akış basamakları veya pH'ın genel Cl permeaz aktivitesi üzerindeki etkisi üzerinde pH etkilerini gösteren eğrilerin şekillerinde hiçbir farklılık bulamadık. Ayrıca, tüm izoformlar arasında veziküllerin iç kısımlarının yüksek pH'ı veya K permeaz aktivitesi için reaksiyonda iki değerli katyonun mevcudiyeti gerekliliğinde hiçbir fark yoktu. Bu nedenle, kanalın kendisinin içsel özelliklerinde bir fark olduğuna dair hiçbir kanıt bulamadık. Buna karşılık, varyantlar, Kpermease aktivitesini destekleyen koşullar altında fosfolipid veziküller ile önemli ölçüde artan kararlı ilişki gösterdi; bu etkinin ölçeği, değişiklik hareketsizliği ile kabaca aynı aralıktır. Birlikte ele alındığında, veriler, artan K permeaz aktivitesinin temelinin, eklenen proteinin özelliklerinde temel bir değişiklik başlatmaya gerek kalmadan, aktiviteyi destekleyen koşullar altında basitçe daha verimli membran yerleştirilmesi olduğunu göstermektedir.

ApoL1 yapısında(6) üç alan tanımlanmıştır. İyon kanalı aktivitesinin, N ucunda proteinin yaklaşık yüzde 60'ını kaplayan kolisin homolog "gözenek oluşturucu" alanda yattığı düşünülmektedir. Hastalıkla ilişkili dizi varyasyonları, gözenek oluşturan alanda değil, ondan uzakta, C ucunda proteinin yaklaşık yüzde 16'sını oluşturan bir sarmal-sarmal alanındadır. Bu alanın silinmesinin tripanolitik aktivite üzerinde hiçbir etkisi yoktur, ancak hem türler içinde hem de türler arasında Apol izoformları arasında yüksek oranda korunur (10). Bu bölgenin kontrollü bir alan (10) olarak işlev gördüğü öne sürülmüştür ve verilerimiz bu alandaki hastalığa neden olan mutantların katyon kanalı aktivitesini ve artan katyon kanalı aktivitesini destekleyen koşullar altında gerçekten de artmış membran bağlanmasına sahip olduğunu göstermektedir. Bir yorum, C-terminal alanının, katyon permeaz aktivitesi için gerekli olan membran birleşmesini/yerleşmesini baskılamaya hizmet ettiği ve bu alanın mutasyonunun bu baskılamayı gevşettiğidir.

Cistanche tedavi edebilirböbrekhastalık

Membran bağlanmasına ilişkin gözlemlerin daha fazla anlamı vardır ve anyon ve katyon permeaz aktiviteleri arasındaki ilişkinin bazı yönlerini aydınlatır. Burada, katyon permeaz aktivitesini (pH 6.0) destekleyen atoptimal bağlanma koşullarından (pH 5.0) çok daha fazla proteinin membranlara bağlı olduğunu bulduk ve bu herkes için geçerlidir. izoformlar (Şekil 5). Anyon permeaz aktivitesinin (Şekil 2D) ve katyonpermeaz aktivitesinin membran bağlama adımının (Şekil 4C) pH duyarlılıklarındaki farklılığa dikkat edin: anyon permeaz, pH 6'nın altında önemli ölçüde artarken, membrana eklenen proteinin katyonu destekleme yeteneği permease aktivitesi önemli ölçüde düşer. Daha önce rapor edilen verilerimiz, G0'un kararlı membran ilişkisinin, pH aynı pH aralığında düştükçe önemli ölçüde arttığını ve bu, protein yapısında önemli bir geçişi gösteren, içsel protein floresansının en çarpıcı biçimde bastırıldığı aralıktır(9) olduğunu gösterdi. . Hep birlikte ele alındığında, veriler pH 6'da membran yerleştirmenin, pH 50'de membran yerleştirmeden temel olarak farklı olduğunu göstermektedir.0. pH 6.0'da, proteinin daha küçük bir kısmı membranlarla birleşir, buna sadece intrinsik floresanda küçük bir değişiklik ve sınırlı anyon geçirgenlik aktivitesi eşlik eder, ancak cis bölmesi pH7'ye titre edildiğinde katyon geçirgen bir forma geçme kapasitesi ile birliktedir. .5. Ayrıca, bu bağlanmanın etkinliği, pH kaymasından sonra artan katyonpermeaz aktivitesine paralel olarak, hastalıkla ilişkili varyantlar için daha fazladır. Buna karşılık, pH 5'te 0 proteinin çok daha büyük bir kısmı zarlarla ilişkilidir; bu bağlanmaya, intrinsik flüoresansta büyük bir değişiklik ve çok daha büyük anyonpermeaz aktivitesinin görünümü eşlik eder. Ne membran bağlanması ne de anyonpermeaz aktivitesi izoformlar arasında farklı değildir. Eklenen bu proteinin katyon permeaz onayına geçiş kapasitesi büyük ölçüde azalır. pH 6'dan 5'e düşerken içsel floresanda daha önce bildirilen değişikliğin, katyon geçirgenlik konformasyonuna geçemeyen bir forma yapısal bir dönüşümü yansıttığını ve izoformlar arasındaki farklılıkların bu konformasyonun iyon geçirgenlik özellikleri üzerinde hiçbir etkisi olmadığını varsayıyoruz.

Ek bir yeni gözlem, kalsiyum ve magnezyum iyonlarının ApoL1'in katyon kanalı aktivitesini desteklemede eşit derecede etkili olduğudur. Bu, iki değerlikli katyonun rolünün, protein tarafından bazı yüksek afiniteli bağlanma yoluyla olmadığını, ancak daha büyük olasılıkla, negatif yüklü proteinin, fosfolipid zarların negatif yüklü yüzeyi ile etkileşime girmesine izin veren daha az spesifik bir yük köprüleme etkisi olduğunu gösterir.

ApoL1 izoformlarının iyon kanalı aktivitesindeki farklılıkları değerlendiren diğer araştırmalar yayınlanmıştır. Thompson ve Finkelstein (8) saflaştırılmış rekombinant ApoL1'in kanal aktivitesini değerlendirmek için düzlemsel lipid çift katmanlı tekniklerle elektrofizyolojik yöntemler kullanmış ve izoformlar arasında kanal özelliklerinde hiçbir farklılık olmadığını bildirmiştir. Düzlemsel lipid çift katmanlı yöntemlerin ve vezikül bazlı akış deneylerinin, her ikisi de kanal deneyleri olmakla birlikte, farklı türde bilgiler verdiğini ve tamamlayıcı deneysel sistemler olarak düşünülebileceğini belirtmek önemlidir. Lipid çift katmanlı yöntemler, saflaştırılmış proteinin tek kanallı özelliklerini tanımlamak için benzersiz bir yaklaşımdır, ancak spesifik aktiviteyi ölçmek için daha az güçlü araçlardır, oysa vezikül akış deneyleri bir popülasyonun aktivitesi hakkında nicel veriler sağlayabilir, ancak tek kanal özellikleri hakkında çok az bilgi sağlayabilir. Böylece, Thomp son ve Finkelstein'ın gözlemleri, kanalın içsel özelliklerinde de belirgin bir farklılık göstermeyen bizimkilerle tutarsız değildir, ancak sadece özgül aktivitede yaklaşık iki kat bir farklılık gösterir, bu farklılık ölçeğinin belirlenmesi oldukça zor olacaktır. lipit çift katmanlı sistemlerde tespit.

Saflaştırılmış protein ve lipidlerin kullanıldığı araştırmalar, açıkça proteinin kendisine bağlı olan ve daha karmaşık sistemleri tehlikeye atan başka bileşenler, ekspresyon kinetiği veya membran trafiği tarafından değiştirilmeyen özellikleri ortaya çıkarma erdemine sahiptir. Ancak, bu aktivitelerin canlı hücreler üzerindeki nihai etkisi konusunda ister istemez sessiz kalıyorlar. ApoL1'in iyon kanalı aktivitelerini belirlemek için hücre bazlı ekspresyon sistemlerini kullanan çalışmalar rapor edilmiştir (Friedman ve Pollak, 2019 (3)'te gözden geçirilmiştir). Olabisi ve diğerleri(11), HEK hücrelerinde ApoL1 izoformlarını eksprese etti ve kararlı durum hücre içi potasyum konsantrasyonunu değerlendirdi. G1 ve G2 ifade eden hücrelerde, G0 ifade eden hücrelere kıyasla daha düşük hücre içi potasyum buldular. Bu gözlem, artan plazmamembran K geçirgenliği ile tutarlı olabilirken, düşük hücre içi K, varyantın herhangi bir mekanizma yoluyla daha büyük sitotoksik etkisinin spesifik olmayan bir sonucu olabilir, bu da daha az aktif NaK ATPaz aktivitesine ve/veya plazmamembran bütünlüğünün bozulmasına yol açar. O'Toole et al. (12) HEK hücrelerinde ekspresyon seviyelerini dikkatlice kalibre etti ve izoformlar arasında hiçbir fark bularak plazma membranı katyon kanalı aktivitesinin görünümünü değerlendirdi. Şah ve ark. (13), tripanozom sitotoksisitesi için son kanıtlarla tutarlı olarak, hastalıkla ilişkili varyantların mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin açılmasını indüklediği ApoL1'in mitokondriyi hedeflediğini bildirdi. Bu etkinin ApoL1'in iyon kanalı aktivitesini gerektirip gerektirmediği belirsizdir. Bu çalışmaların her biri ile, hücre bazlı ekspresyon sistemlerinin karmaşıklığından dolayı, belirtilen farklılıkların proteinin içsel özelliklerinden mi yoksa hücrelerde bulunan diğer etkileşimli bileşenlerden mi kaynaklandığı kesin olamaz.

Patojenik işlev kazanımı mutasyonları tipik olarak baskın kalıtım paterni gösterirken,böbrek hastalığı fenotipiApoL1 varyantları ile ilişkili resesiftir. Bir fonksiyon kazancı mutasyonunun çekinik olabileceği bir mekanizma, proteinin bir homomultimer olarak işlev görmesi ve WT'nin aktive edilmiş varyant üzerinde baskın-negatif bir etki uygulayabilmesidir. ApoL1'in bir monomer olarak bir kanal olarak mı yoksa bir multimer olarak mı işlev gördüğü şu anda bilinmemektedir.

Verilerimiz, benzer protein ekspresyon seviyelerinde artan katyon geçirgenliğinin, podositlerde veya diğer hücrelerde sitotoksisiteye katkıda bulunabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, aktivitede sadece iki katlık bir artışın, görünüşte iyi huylu bir molekülü tek bir sürücü hastalığına dönüştürmesi pek olası görünmeyebilir. Bununla birlikte, ApoL1 varyantları ile ilişkili hastalıklar yavaş ilerleme eğilimindedir ve uzun bir zaman periyodundaki (aylar ila yıllar arası) ince farklar muhtemelen büyük kümülatif etkiye sahip olabilir. ApoL1action'ın diğer potansiyel mekanizmaları şunlardan sorumludur:böbrekincinmediğerlerinin yanı sıra, onapoptoz, otofaji, mitokondriyal fonksiyon, hücre içi zar kaçakçılığı ve hücre dışı sinyal moleküllerinin aracılık etkileri dahil olmak üzere kanıtlarla desteklenmiştir (3-5, 11-16). ApoL1 kanal aktivitesindeki farklılıkların, hastalığa neden olan diğer potansiyel etki mekanizmalarına karşı göreli önemi henüz belirlenmemiştir.

Cistanche tedavi edebilirböbrekhastalık

deneysel prosedürler

ifade yapıları

N-terminal 6His ve T7 epitop etiketli ApoL1'i (G0 versiyonu) kodlayan pET-ApoWT daha önce tarif edilmişti (9). Kodlanmış protein, 28 ila 398 amino asitten Genbank erişim#BC143038 (haplotip 150K, 228I, 255K) ile aynıdır, amino asitler 1-27'deki sinyal dizisini elimine eder ve N-terminal {{ ilavesiyle 17}}His ve T7 epitop etiketleri, pET28a plazmidi tarafından kodlanmıştır. G1 ve G2 varyantlarını kodlayan plazmitler, AleI'den XhoI'ye kısıtlama fragmanının Integrated DNA Technologies, Coralville, IA tarafından sentezlenen varyant sekansları içeren fragmanlarla ikame edilmesi ve doğrudan sekanslama ile teyit edilen nihai plazmitlerin kimliği ile pET-ApoWT'den üretildi. G1 izoformundaki S342G ve I384M amino asit ikameleri ve G2 izoformundaki N388-Y389 silinmesi dışında üç yapı da aynıydı. Rekombinant ApoL1 izoformları bakterilerde eksprese edildi ve S200 kolon tamponunun yüzde 0.03 n dodesil- -D-maltoside (DDM) (Millipore-Sigma) içermesi dışında tarif edildiği gibi(8) saflaştırıldı. İzoformları karşılaştıran tüm deney setleri için, malzemeler aynı reaktifler kullanılarak aynı koşullar altında aynı anda hazırlandı. Protein konsantrasyonu, bovineserum albümin standardı kullanılarak BCA Protein Test Kiti (Thermo Fisher Scientific) ile belirlendi. Şekil 1'deki toplam protein için jeller Instant Blue (Expedeon Inc) ile boyandı. S200buffer içindeki protein, sıvı nitrojen içinde hızlı bir şekilde donduruldu ve -80°C'de saklandı. Alikotlar, deneylerden önce buz üzerinde eritildi ve S200 tamponunda seyreltildi.

iyonoforlar

Valinomisin (Millipore Sigma), 50 mM mutlak etanolde çözündürüldü ve kullanımdan hemen önce mutlak etanol içinde 1 mM'ye seyreltildi. Klorür İyonofor 1 (MilliporeSigma), 1-heksanol içinde 100 mM'de çözündürüldü ve kullanımdan hemen önce mutlak etanol içinde 0,2 mM'ye seyreltildi.

Membran veziküller

Asolektin (soya fasulyesi fosfatidilkolin tip II, Sigma) tarif edildiği gibi (30) asetonla ekstre edildi, kurutuldu ve daha sonra kloroformda çözüldü ve -20°C'de saklandı. 20 mg/ml'de 200 mM KCl, 5 mM HEPES pH8.0'da beş donma-çözülme döngüsü ve kuvvetli vorteksleme ile. Bu süspansiyon –20 derecede saklandı. Yaklaşık 200 nm çapında KCl yüklü tek lamelli veziküller üretmek için, thelipid süspansiyonu, bir ekstrüder odası (Avanti Polar Lipids) ve üretici tarafından sağlanan protokol (17, 18) kullanılarak 200 nm'lik bir gözenekli polikarbonat membran filtreden 15 kez geçirildi. Ekstrüde veziküller buz üzerinde tutuldu ve 24 saat içinde kullanıldı.

Aktivite testleri

Bir klorür seçici elektrot ile tespit edilen membran potansiyeli tahrikli KCl akışı kullanılarak iyon permeaz aktivite deneyleri, daha önce tarif edildiği gibi gerçekleştirildi (9). S200 tampon (15{{20}} mM NaCl, 10 mM Tris pH8.3, yüzde 0,3 DDM) içinde yirmi mikrolitre ApoL1 eklenir 82 mM KCl, 127 mM sakaroz, belirtilen pH'ta 42.1 mM tampon (pH 5-6.5 için MES, pH 7.0-8.0 için HEPES), 2.63 mMCa(glukonat)2 ve 1.84 mg/ml ekstrüde izolektin içeren 380 ul reaksiyon karışımı veziküller. Karışım, 330 mM sakaroz içinde dengelenmiş 3 ml'lik bir Bio-Gel P-6DG (Bio-Rad) döndürme kolonundan geçirilmeden önce 4 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir. Elüat, belirtildiği gibi 2 ml 330 mM sakaroz, 10-5 M KCl,2.5 mM Ca(glukonat)2 ve 10 mM tampona (pH 5-6.5 için MES; pH 7-8 için HEPES) hemen eklenir, bir klorür seçici elektrot ile sürekli izleme ile ve tarif edildiği gibi kaydedilir. 20 s sonra, bir iyonofor (2.5 ul 1 mM valinomisin veya etanol içinde 0.2 mMChlorid İyonofor 1) ilave edilerek voltajla yönlendirilen akış başlatıldı ve 30 s devam etmesine izin verildi. ardından kalan intraveziküler klorürü serbest bırakmak için yüzde 0.1'e Triton X-100 ilave edildi. mV cinsinden ham veriler, test koşulları altında elektrot için oluşturulan standart bir eğri kullanılarak Cl konsantrasyonuna dönüştürüldü. İlk fraksiyonel klorür salımı hızları, iyonofor ilavesine verilen maksimum ani tepki sırasında 3 saniyeden türetilmiştir.

Tüm aktivite karşılaştırmaları, testten önce S200 tamponunda 100 ug/ml proteine ​​seyreltilmiş olan üç izoformun eşzamanlı preparasyonlarından elde edilen materyal kullanılarak yapıldı. Varyantlar arasında doğrudan karşılaştırma için kullanılan tüm testler, aynı taze hazırlanmış reaktifler kullanılarak aynı gün gerçekleştirildi.

Membran ilişkilendirme deneyi

Zar birleştirme deneyleri, Cl süzüntü aktivitesi ve K süzüntü aktivitesi için optimal koşullar altında ayrı ayrı gerçekleştirildi. Clpermease aktivitesini destekleyen koşullar için, 1{{30}} mM Tris pH8.2, 150 mM NaCl içinde 5 ul 100 ug/ml protein , 0.03 yüzde DDM, 95 ul reaksiyon karışımına (3.4 mg/ml izolektin veziküller (200 mM KCl,5 mM HEPES pH 8 ile yüklenmiş), 20 mM MES pH 5.0, 2.5 mM Ca(glukonat) eklenmiştir. 2, 100 mM KCl, 100 mM sakaroz) ve oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edildi. Testteki protein-lipid oranı 1:680 kütle/kütledir. Numune, 200 ul 60 mM MES pH 5.0, 2.5 mMCa(glukonat)2, 100 mM KCl, 100 mM sakaroz ilave edilerek pH kayması olmadan seyreltildi ve 20 s inkübe edildi. Yüz mikrolitre 8 M üre ilave edildi, karıştırıldı ve daha sonra oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edildi. Sükroz konsantrasyonu, 1,6 ml yüzde 50 sükroz ilavesiyle yüzde 40'a getirildi. 2 ml numune 8 mM MES pH 5.0'da yüzde 30 sakarozun 1 ml'sinin altında katmanlandı, bu da 1.7 ml sakaroz içermeyen 8 mM MES pH 5.0'ın altındaydı. Dik eğimler 200,000g'de bir Beckman Coulter TLA-110rotorda 90 dakika boyunca 4°C'de santrifüjlendi. Veziküller yüzde 0 ila 30 sakaroz arayüzünden toplandı. Örneklerin eşit fraksiyonları 4 kat seyreltildi ve 100,000g'de 1 saat santrifüjlendi. Membran topakları kurutuldu, SDS-PAGE ile ayrıldı, topoliviniliden florür membranı lekelendi ve bir dijital görüntüleme sistemi kullanılarak kemilüminesans saptaması ile T7 epitopuna (MilliporeSigmaproduct no. 69522-3) yönelik antikor ile westernblotlama ile problandı. Her protein için bir izotip ve lekeye özgü standart eğri oluşturmak üzere jel üzerine saflaştırılmış proteinin seri dilüsyonları dahil edildi.

K permeaz aktivitesini destekleyen koşullar için, 10 mM Tris pH 8.2, 150 mM NaCl, yüzde 0.03 DDM içindeki 5 ul 1{6}}0ug/ml protein, 95 ul'ye ilave edildi. reaksiyon karışımı (3.4 ug/ml izolektin veziküller (200 mM KCl, 5 mM HEPES pH 8 ile yüklenmiş), 20 mM MES pH 6.0, 2.5 mM Ca(glukonat)2, 100 mM KCl,100 mM sakaroz) ve oda sıcaklığında 1 süre inkübe edildi dk. Numune, 200 ul 60 mM HEPES pH 8.0, 2.5 mM Ca(glukonat)2,100 mM KCl, 100 mM sakaroz ilave edilerek pH kayması ile 7.5'e seyreltildi ve 20 saniye süreyle inkübe edildi. Yüz mikrolitre 500 mM Na2CO3 eklendi ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edildi. Sükroz konsantrasyonu, 1,6 ml yüzde 50 sükroz ilavesiyle yüzde 40'a getirildi. 2 ml numune 8 mM Tris pH 8.3'te 1 ml yüzde 30 sakarozun altına katmanlandı, bu da 1.7 ml sakaroz içermeyen 8 mM Tris pH 8.3'ün altındaydı. Sükroz yastıkları santrifüjlendi ve bir numune toplandı ve yukarıdaki gibi işlendi.

İstatistik

Veri setleri içindeki ortalama çiftleri arasındaki farkların önemi, varyans analizi (ANOVA)(19) kullanılarak belirlendi. İstatistiksel parametreler, Excel'e gömülü bir işlev kullanılarak belirlendi. P değerleri socscistatistics.com kullanılarak hesaplandı. Tüm veri noktaları, her bir kopya grubu için Excel'in STDEV.S işleviyle belirlenen ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulur.

Veri kullanılabilirliği Bu makaleyi destekleyen tüm veriler, talep üzerine Dr. John C. Edwards, john.edwards@health.slu.edu ile paylaşılacaktır.

Cistanche tedavi edebilirböbrekhastalık

Teşekkür—Saint Louis Üniversitesi Nefroloji Anabilim Dalı ve İç Hastalıkları Anabilim Dalı'na bu çalışmayı gerçekleştirmek için gerekli olan destek için teşekkür ederiz.

Yazar Katkıları—JCE çalışmayı tasarladı ve denetledi, finansman sağladı, akış tahlillerini gerçekleştirdi, verileri yorumladı ve makaleyi yazdı; JB proteinleri saflaştırdı, zar birleştirme deneylerini gerçekleştirdi, verileri yorumladı, rakamları hazırladı ve kağıdı düzenledi.

Finansman ve ek bilgiler—Çalışma, Saint Louis Üniversitesi'nin kurumsal kaynakları ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından JCE'ye R01 DK120651 hibesi ile finanse edilmiştir. Bu makalenin içeriği yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmez.

Çıkar çatışması—Yazarlar, bu makalenin içeriği ile herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Kısaltmalar—Kullanılan kısaltmalar şunlardır: ApoL1, apolipoproteinL1; CI1, klorür iyonofor 1; DDM, n-dodesil- -D-maltoside;PVDF, poliviniliden florür; SD, standart sapma; Val, valinomisin.

İtibaren: 'Böbrek-hastalıkApolipoprotein L1'in ilişkili varyantları, katyon kanalı aktivitesinde fonksiyon kazanımı gösterir.Jonathan Bruno ve John C. Edwards

---J. Biol. Kimya (2021) 296 100238

Referanslar

1. Genovese, G., Friedman, DJ, Ross, MD, Lecordier, L., Uzureau, P., Freedman, BI, Bowden, DW, Langefeld, CD, Oleksyk, TK, Uscinski Knob, AL, Bernhardy, AJ, Hicks, PJ, Nelson, GW, Vanhollebeke, B., Winkler, CA, et al. (2010) ile tripanolitik ApoL1 varyantlarının birlikteliğiböbrekhastalıkAfrikalı Amerikalılarda. Bilim 329, 841-845
2. Parsa, A., Kao, WH, Xie, D., Astor, BC, Li, M., Hsu, CY, Feldman, HI, Parekh, RS, Kusek, JW, Greene, TH, Fink, JC, Anderson , AH, Choi, MJ, Wright, JT, Jr., Lash, JP, et al. (2013) APOL1 risk varyantları, ırkı ve kronik hastalığın ilerlemesiböbrekhastalık. N. İngilizce J. Med. 369, 2183–2196
3. Friedman, DJ ve Pollak, MR (2020) APOL1 veböbrekhastalık: Genetikten biyolojiye. Annu. Rev. Physiol. 82, 323–342
4. Bruggeman, LA, O'Toole, JF ve Sedor, JR (2017) APOL1'in hücre içi işlevini belirleme. J. Am. Soc. Nefrol. 28, 1008-1011
5. Kopp, JB, Roshanravan, H. ve Okamoto, K. (2018) Apolipoprotein L1 nefropatileri: 2017 gözden geçirildi. Kör. Görüş. Nefrol. Hipertens. 27, 153–158
6. Perez-Morga, D., Vanhollebeke, B., Paturiaux-Hanocq, F., Nolan, DP, Lins, L., Homble, F., Vanhamme, L., Tebabi, P., Pays, A., Poelvoorde, P., Jacquet, A., Brasseur, R. ve Pays, E. (2005) Apolipoprotein LI, lizozomal membranlarda gözenekler oluşturarak tripanozom lizisini destekler. Bilim 309, 469-472
7. Harrington, JM, Howell, S. ve Hajduk, SL (2009) Bir sitolitik insan yüksek yoğunluklu lipoproteini olan tripanozom litik faktör ile membran geçirgenliği. J. Biol. Kimya 284, 13505-13512
8. Thomson, R. ve Finkelstein, A. (2015) İnsan tripanolitik faktörü APOL1, düzlemsel lipid çift katmanlarında pH kapılı katyon seçici kanallar oluşturur: Tripanozom lizisine uygunluk. Proc. Natl. Acad. bilim ABD 112, 2894–2899
9. Bruno, J., Pozzi, N., Oliva, J. ve Edwards, JC (2017) Apolipoprotein L1, fosfolipid veziküllere pH ile değiştirilebilir iyon geçirgenliği verir. J. Biol. Kimya 292, 18344–18353
10. Vanhollebeke, B. ve Pays, E. (2006) Apolipoproteins L. Cell Mol. Hayat Bilimi. 63, 1937–1944
11. Olabisi, OA, Zhang, JY, Verplank, L., Zahler, N., DiBartolo, S., 3rd, Heneghan, JF, Schlondorff, JS, Suh, JH, Yan, P., Alper, SL, Friedman, DJ ve Pollak, MR (2016) APOL1böbrekhastalıkrisk varyantları, hücresel potasyumu tüketerek ve indükleyerek sitotoksisiteye neden olur.
stresle aktive olan protein kinazlar. Proc. Natl. Acad. bilim ABD 113, 830-837
12. O'Toole, JF, Schilling, W., Kunze, D., Madhavan, SM, Konieczkowski, M., Gu, Y., Luo, L., Wu, Z., Bruggeman, LA ve Sedor, JR (2018) ApoL1 aşırı ekspresyonu, varyanttan bağımsız sitotoksisiteyi tetikler. J. Am. Soc. Nefrol. 29, 869–879
13. Shah, SS, Lannon, H., Dias, L., Zhang, JY, Alper, SL, Pollak, MR ve Friedman, DJ (2019) APOL1böbrekrisk varyantları, mitokondriyal translokasyon ve mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin açılması yoluyla hücre ölümünü indükler. J. Am. Soc. Nefrol. 30, 2355–2368
14. Hayek, SS, Koh, KH, Grams, ME, Wei, C., Ko, YA, Li, J., Samelko, B., Lee, H., Dande, RR, Lee, HW, Hahm, E. , Peev, V., Tracy, M., Tardi, NJ, Gupta, V., et al. (2017) Podositler üzerinde suPAR, APOL1 risk varyantları ve alphavbeta3 integrin'in üçlü bir kompleksi kronik aracılık ederböbrek hastalık. Nat. Med. 23, 945-953
15. Ma, L., Chou, JW, Snipes, JA, Bharadwaj, MS, Craddock, AL, Cheng, D., Weckerle, A., Petrovic, S., Hicks, PJ, Hemal, AK, Hawkins, GA, Miller, LD, Molina, AJ, Langefeld, CD, Murea, M., et al. (2017) APOL1 renal risk varyantları mitokondriyal disfonksiyonu indükler. J. Am. Soc. Nefrol. 28, 1093–1105
16. Wan, G., Zhaorigetu, S., Liu, Z., Kaini, R., Jiang, Z. ve Hu, CA (2008) Apolipoprotein L1, yeni bir Bcl-2 homoloji alanı {{4 }}sadece lipid bağlayıcı protein, otofajik hücre ölümüne neden olur. J. Biol. Kimya 283, 21540–21549
17. Hope, MJ, Bally, MB, Webb, G. ve Cullis, PR (1985) Hızlı bir ekstrüzyon prosedürü ile büyük tek lamelli veziküllerin üretimi: Boyut dağılımının, tutulan hacmin ve bir zar potansiyelini koruma yeteneğinin karakterizasyonu. Biyokimya. Biyofiz. Açta 812, 55-65
18. Olson, F., Hunt, CA, Szoka, FC, Vail, WJ ve Papahadjopoulos, D. (1979) Polikarbonat membranlardan ekstrüzyon yoluyla tanımlanmış boyut dağılımına sahip lipozomların hazırlanması. Biyokimya. Biyofiz. Açta 557, 9–23
19. Armitage, P. (1971) Tıbbi Araştırmalarda İstatistiksel Yöntemler, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Birleşik Krallık