Karbon Monoksit (CO) Diyabetik Nefropatiyi (DN) Etkili Bir Şekilde Hafifletiyor
Mar 16, 2022
daha fazla bilgi için:ali.ma@wecistanche.com
Bölüm Ⅰ: Karbon monoksit, otofajiyi iyileştirerek diyabetik nefropatide yaşlanmayı hafifletir
Guibin Meil; Chunji Jiang; Xueer Cheng; & al.V
GİRİİŞ
diyabetik nefropati (DN) en yaygın ve ciddi diyabetik mikrovasküler komplikasyonlardan biridir. İstatistiksel olarak, DN'li hastaların yüzde 20'si -40 (diyabetik nefropati) diğer böbrek hastalıklarından 14 kat daha hızlı bir oranda son dönem böbrek hastalığına (SDBY) dönüşecektir. Ek olarak, DN'nin artan kardiyovasküler riski (diyabetik nefropati)hastalar yüksek mortaliteye büyük ölçüde katkıda bulunur.2 DN'nin karmaşık patogenezi (diyabetik nefropati)mevcut sınırlı tedavi yaklaşımı ile hala belirsizdir. Bu nedenle, DN'nin ilerleyici böbrek fonksiyon kaybını önlemek için patogenezi ve terapötik ajanları belirlemek acildir. (diyabetik nefropati).
Kalıcı hücre döngüsü durması ile karakterize edilen yaşlanmış hücreler, 'zombi hücreleri' olarak büyük ilgi görmüştür. Apoptoza direnç ve yaşlanmayla ilişkili salgı fenotipinin (SASP) devam eden üretimi nedeniyle, yaşlanan hücreler giderek yaşa bağlı hastalıkların önemli nedeni olarak kabul edilmektedir. DN'de yaşlanmaya bağlı böbrek fonksiyon bozukluğu yaygın olarak gözlenmiştir. (diyabetik nefropati)hastalar ve STZ ile indüklenen (tip 1 diyabet (T1D)) ve db/db(tip 2 diyabet(T2D)) fareler gibi deneysel modeller. Önemli olarak, yaşlı farelerin p16-pozitif hücrelerinin temizlenmesi glomerülosklerozu iyileştirdi. Ayrıca, T1D farelerinde p21 veya p27'yi devre dışı bırakmak, proteinüri ve glomerüler genişlemeyi hafifletti. Bu sonuçlar, yaşlanmanın DN patogenezinde önemli bir rol oynadığını göstermiştir. (diyabetik nefropati). Ancak, DN'de yaşlanmanın düzenlenmesi (diyabetik nefropati)belirsiz kalır.
Ortaya çıkan kanıtlar, hücre içi içeriğin bozulmasının bir mekanizması olan otofajinin geçerli bir yaşlanma düzenleyicisi olduğunu gösterdi." Otofajinin yaşlanma fenotipinin edinimini desteklediği bildirilmiş olsa da, otofajinin yaşlanma karşıtı etkisi daha yaygın olarak kabul edilmektedir. otofajinin yaşlı farelerin ve yaşlı sineklerin ömrünü uzattığı rapor edilmiştir.10 Daha ileri çalışmalar, Atg7'yi devre dışı bırakmanın kök hücre yaşlanmasını şiddetlendirdiğini göstermiştir.11 Daha da önemlisi, Atg5'in ağırlaştırılmış proteinüri ve fibrozisin silinmesi,böbrekyaşlanma.12.13 Bu nedenle, yaşlanmayı hafifletmek için otofajiyi hedefleyen ilaçlar, DN için en umut verici stratejilerden biri olabilir. (diyabetik nefropati)önleme ve tedavi.
Karbonmonoksit (CO) hem oksijenaz enzimleri tarafından hem'in katabolizması yoluyla üretilen endojen olarak gaz halinde bir moleküldür. Bir dizi yayın, CO'nun anti-inflamatuar, anti-apoptotik ve diğer koruyucu özelliklerini ortaya çıkardı (Karbonmonoksit) düşük dozlarda uygulandığında.14 CO (Karbonmonoksit)iskemi-reperfüzyona renoproteksiyon sağlamak için iyi çalışılmıştır veyaböbrektransplantasyon fareleri,15 CO'nun etkisi ve mekanizması (Karbonmonoksit)DN'de (diyabetik nefropati)belirsizdir. Son zamanlarda, literatür göstermiştir ki CO (Karbonmonoksit)hipoksi,16 sepsis fareleri7 ve kardiyak arrest olan yaşlı sıçanlar tarafından tehdit edilen adacıklarda bir otofaji aktivatörü olarak sitoprotektif roller kazandırdı.18 Ayrıca, CO uygulanması (Karbonmonoksit)ilaç toksisitesinin neden olduğu endotelyal hücrelerin yaşlanmasını hafifletti.1 Bu bulgular, CO tarafından hedeflenen otofajinin potansiyel aracılığını açıkça ilerletir. (Karbonmonoksit)yaşlanmayı iyileştirmek için.
Bu nedenle, yaşlanan hücrelerin biriktiğini varsaydık.böbrekDN'nin (diyabetik nefropati)fareler CO tarafından tersine çevrilebilir (Karbonmonoksit)otofaji aktivasyonu yoluyla, daha sonra böbrek fonksiyon bozukluğunu iyileştirir. Hipotezimizi test etmek ve altta yatan mekanizmaları keşfetmek için, in vivo (deneysel DN) karbon monoksit salan molekül-2 (CORM-2) tedavisini uyguladık. (diyabetik nefropati)fareler) ve in vitro (sıçan mezanjiyal hücreleri, insan tübüler epitel hücreleri ve insan podositi).
Böbrek fonksiyonu: Karbon monoksit (CO) nasıl etkiler?diyabetik nefropati (DN)
Böbrek hastalığı için Cistanches ve Cistanche ürünleri için tıklayın
MALZEMELER VE YÖNTEMLER
2.1|Hayvan deney tasarımı
Sekiz haftalık erkek C57BL/6J fareleri (Charles River) normal bir diyet (ND) veya yüksek yağlı diyet (HFD) (yağdan yüzde 60 enerji) ile standart bir aydınlık/karanlık döngüsünde (12:12 saat) tutuldu. ) 16 hafta boyunca.20 Çalışmanın 17. haftasında, HFD ile beslenen farelere 7 gün boyunca intraperitoneal STZ (50 mg/kg) enjeksiyonları yapılırken, ND'li farelere araç (sitrat tamponu, pH=4) enjekte edildi. .5). Enjeksiyonlardan bir hafta sonra, 24 saat arayla iki kez kuyruk dikeninin kan şekeri seviyeleri ölçüldü. Daha sonra, DN (diyabetik nefropati)16.9 mmol/L veya daha yüksek glikoz seviyelerine sahip fareler, her grupta 15 hayvan olacak şekilde rastgele üç gruba ayrıldı (DN (diyabetik nefropati), DN (diyabetik nefropati)artı CO ve DN (diyabetik nefropati)artı iCO): DN kontrolü olarak adlandırılan bir grup ve intraperitoneal enjeksiyonlarla (16 hafta boyunca haftada iki kez) CORM-2 (3 mg/kg) veya geçersiz CORM-2 ile tedavi edilen diğer gruplar CO salınımı ile üretilir (Karbonmonoksit)CORM-2'dan oda sıcaklığında. Deney süresinin sonunda, farelere anestezi uygulandı, göz kürelerinin enükleasyonu ile kan örnekleri toplandı ve analiz için böbrekler toplandı. Tüm hayvanlar, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımında Yol Gösterici İlkelere uygun olarak tedavi edildi ve tüm hayvan prosedürleri, Tongji Medical College Council on Animals Care Committee tarafından onaylandı.
2.2|Plazma biyokimyasal ve histolojik analiz
Toplanan tam kan ve serum, analiz için -80 derecede saklandı. Kan üre nitrojeni (BUN), ticari olarak temin edilebilen tahlil kitleriyle (Jiancheng Bioengineering Institute, Çin) ölçüldü. Böbrekler çıkarıldıktan ve yüzey salinle yıkandıktan sonra. Böbrek dokusu hematoksilen-eozin ve Masson'un tri-krom boyası ile boyandı ve son olarak mikroskopta gözlemlendi.
2.3|Elektron mikroskobu
Renal korteksin küçük parçaları glutaraldehit (yüzde 2.5) içinde sabitlendi ve Araldite içine gömüldü. Doku, bir ultramikrotom (Leica EM UC7) kullanılarak ultra ince kesitler (80-100 nm) halinde polimerize edildi. Bakır ağ ızgarası üzerindeki ince dilimler lekelendi ve bir transmisyon elektron mikroskobu (Tecnai G220 TWIN) altında gözlemlendi.
2.4|Kayma dalgası elastografisi
Deney periyodunun sonunda, farelere anestezi uygulandı ve yakında bir kapsam (Susonic Imagine) kullanılarak kesme dalgası elastografisi için ultrasonik laboratuvara (Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi, Wuhan, Çin) gönderildi. Ortalama Young modülü (Eman) renal parankim sertliğini ölçmek için kullanıldı.
2.5|SA- -gal boyama
Dondurulmuşböbrek6-kuyu plakasına ekilen kesitler ve hücreler, üreticinin talimatlarına göre ticari bir kit (Beyotime Biotechnology) tarafından SA- -gal aktivitesinin saptanması için kullanıldı. Mavi leke, yaşlanan hücrelerin birikim alanı olarak kabul edildi.
2.6|mRNA ifadesi için gerçek zamanlı nicel PCR
Talimatlara göre (TaKaRa BIO INC), böbrek dokusu RNA'sı TRlzol reaktifi kullanılarak ekstre edildi. mRNA'nın ifadesi, TB yeşili bazlı gRT-PCR kiti ve spesifik primerler ile nicelendirildi (Tablo 1). Her gen ekspresyonu, kendi standart eğrisi ile değerlendirildi ve Gapdh'nin mRNA seviyesi, bir endojen kontrol olarak nicelendirildi.
2.7|Western blotlama ve immünopresipitasyon
Böbrek dokusu veya hücresi homojenleştirildi ve parçalandı, ardından BCA protein tahlil kiti (Beyotime Biotechnology) ile nicelendirildi. Protein ayrıldı ve ardından PVDF zarlarına (Millipore) aktarıldı. Bloke edildikten sonra membranlar, gece boyunca birincil antikorlarla inkübe edildi(Tablo 2). Yıkandıktan sonra membranlar, karşılık gelen bir ikincil antikor ile inkübe edildi. Her bir hedef bandın yoğunluğu, Image Pro-Plus 6.0 yazılımı ile ölçüldü ve optik yoğunluk olarak GAPDH'ye normalleştirildi. Hayvanların veya hücrelerin tüm numune boyutları 3'e eşit veya daha büyüktü.
Böbrek dokusunun lizatı santrifüjlendi (14 000 g 4 derece C'de 30 dakika） ve süpernatant 20 μL protein A/G agaroz boncukları ile 2 saat önceden temizlendi ve gece boyunca Bcl ile inkübe edildi{{6} } veya fare lgG antikoru İmmün çökeltiler yıkandı, yeniden süspanse edildi, kaynatıldı ve daha önce açıklandığı gibi anti-Beclin-1 (Hücre Sinyal Teknolojisi) ve anti-Bcl-2 (Proteintech) kullanılarak Western blot ile analiz edildi. .21
TABLO 1 Gerçek zamanlı kantitatif PCR primer dizileri
2.8|immünofloresan
OCT ortamına gömülü böbrek dokusu 6-8 um kalınlığında donmuş bölümlere kesildi. Yüzde 10 normal keçi serumu ile bloke edildikten sonra, kesitler gece boyunca birincil antikorlarla inkübe edildi. Ertesi gün, doku ikincil antikorlarla etiketlendi. PBS ile durulandıktan sonra, slaytlar DAPI ile inkübe edildi ve ardından bir floresan mikroskobu (Olympus) altında fotoğrafları çekildi.
2.9|Hücre kültürü
HBZY-1, DMEM(Gibco) içinde ve HK-2, yüzde 10 fetal sığır serumu, 100 U mL-1 penisilin/streptomisin (Gibco) ile desteklenmiş DMEM/F12 (Gibco) içinde korunmuştur. ) yüzde 95 hava ve yüzde 5 CO içeren nemli bir atmosferde 37 derecede (Karbonmonoksit). Huazhong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi'nden Profesör Chun Zhang tarafından sağlanan HPC, RPMI 1640'ta (Gibco) muhafaza edildi. HPC önce 33 derecede çoğaldı ve daha sonra daha önce açıklandığı gibi deneylerde kullanılmadan önce farklılaşma için 37 dereceye aktarıldı.22
2.10|ELIS Testi
HPC farklı şekilde muamele edildikten ve 5 gün boyunca kültürlendikten sonra, süpernatantın yarısı tespit için çıkarıldı (serbest kalan VEGF). Hücreler, bir ultrasonik hücre kırıcı (SONICS) kullanılarak kırıldı ve proteinlerin tamamen kalan süpernatanta (toplam VEGF) salınmasına izin verildi. Daha sonra VEGF konsantrasyonları, ticari bir ELISA kiti (MEIMIAN) kullanılarak ölçüldü. Serbest kalan VEGF'nin toplam VEGF'ye oranı, VEGF sızıntı oranıydı.
2.11|gen susturma
HK-2 hücrelerinde Atg7'nin yıkılması, altı oyuklu plakalarda gerçekleştirilen bir ters siRNA transfeksiyon prosedürü kullanılarak sağlandı. Yüzde 70 birleşme noktasına kadar büyütüldüğünde, hücreler üreticinin protokolüne göre siRNA ile transfekte edildi veya Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) kullanılarak karıştırıldı. 48 saatlik transfeksiyondan sonra, transfeksiyon etkinliği, diziyi doğrulamak için Western blot ile doğrulandı (ACTCGAGTCTTTCAAGACT).
TABLO 2 Tüm antikor listeleri
2.12|Otofajik akışı izleyin
Lentiviral vektör RFP-GFP-LC3(Genecopoeia) içeren plazmitler inşa edildi ve daha sonra üreticinin talimatlarına göre (GeneCopoeia) HEK293T hücrelerinde paketlendi. Otofaji akışını izlemek için HK-2 ve HBZY-1 hücrelerini enfekte etmek için virüs süpernatanı toplandı. Bu prob, otofagozomları (GFP*/RFPt, sarı puncta) ve otolizozomları (GFP-/RFPt, kırmızı punkta) ayırt edebilir.
2.13|Veri analizi
Veriler Graph Pad Prism8 kullanılarak analiz edildi ve ortalama ± SEM olarak gösterildi. Gruplar arasındaki farklılıklar tek yönlü varyans analizi ile belirlendi. Önem P olarak belirlendi<>
SONUÇLAR
3.1|CO (Karbonmonoksit)DN'nin zayıflatılmış böbrek fonksiyon bozukluğu (diyabetik nefropati)fareler
CO renoprotection keşfetmek için (Karbonmonoksit), bir DN (diyabetik nefropati)modeli HFD ve STZ(Şekil 1A) tarafından indüklendi. 34 haftalık deneysel beslenmeden sonra, kan şekeri, ağırlık,böbrek-vücut oranı, kreatinin ve BUN ölçüldü. DN'de (diyabetik nefropati)grup,böbrek-vücut oranı, kreatinin ve BUN artarken, CO tedavisi (Karbonmonoksit)ters anormallikler (Tablo 3). Tutarlı bir şekilde, DN'nin renal morfolojisi (diyabetik nefropati)fareler, epitel hücrelerinin pul pul dökülmesi, vakuolar dejenerasyon, glomerüler Bowman boşluk genişlemesi ve mezanjiyal genişleme ile aşırı derecede düzensizdi (Şekil 1B). Ayrıca, glomerulusun ultrastrüktürü, bazal membran kalınlaşması ve podosit ayak prosesi silinmesi sergilemiştir (Şekil 1B). Aksine, CO (Karbonmonoksit)tedavi negatif morfolojik değişikliklerin üzerinde normalize edildi (Şekil 1B). Ek olarak, renal kortekste biriken fibriller kollajen(Şekil 1C) ve shear wave elastografi ile ölçülen renal sertlik, DN'de arttı (diyabetik nefropati)fareler (Şekil 1D). Beklendiği gibi, CO (Karbonmonoksit)DN'nin böbrek fonksiyon bozukluğunu önemli ölçüde iyileştirdi (diyabetik nefropati)fibrozis dahil.
ŞEKİL 1 CO (Karbonmonoksit)DN'nin zayıflatılmış böbrek fonksiyon bozukluğu (diyabetik nefropati)HFD ve STZ tarafından indüklenen fareler.
Deneysel tasarım şeması. B, Temsili görüntülerböbrekH&E (ölçek çubuğu: 50 μm), PAS (ölçek çubuğu: 10 um) ile boyanmış doku ve transmisyon elektron mikroskobu (ölçek çubuğu: 1 um) ile değerlendirilen glomerüler morfolojideki ultrastrüktürel değişiklikler.
Ve PAS-pozitifin glomerüler alana oranı, GBM kalınlığı, ayak işlem genişliği ve GBM'nin mm'si başına ayak işlemi sayısı (n=3).
C, Masson trikromu ile boyanmış böbrek dokusunun temsili görüntüleri ve pozitif alanın istatistiksel verileri (n=3). Ölçek çubuğu: 25 μm.
D, Sono kapsamı ve renal fibroz derecesi olarak Young modülünün niceliği ile saptanan Shear wave elastografi (n=7). *P < .05,="" **p="">< .01,="" ***p=""><>
TABLO 3 Tüm gruplardaki farelerin metabolik verileri
3.2|CO (Karbonmonoksit)DN'de hafifletilmiş yaşlanma (diyabetik nefropati)yüksek glikoz ile tehdit edilen fareler ve böbrek hücreleri
Yaşlanma giderek artan bir şekilde, yaşlanmanın bir özelliği olan renal fibrozisin ana nedeni olarak kabul edilmektedir.23 CO'nun yaşlanmayı önleyici etkisini araştırmak (Karbonmonoksit), böbrekte SA- -gal boyama yaptık. Artan SA- -gal* ve p16* hücreleri, DN'de renal korteks boyunca birikmiştir. (diyabetik nefropati)grup, kontrol ve CO (Karbonmonoksit)-tedavi böbrekleri ara sıra pozitiflik gösterdi (Şekil 2A, B). Böbreğin anatomik konumundan, mezanjiyal hücrelerde (sarı ok), renal tübüler epitel hücrelerinde (kırmızı ok) ve podositlerde (siyah ok) p16'nın pozitif ekspresyonu tespit edildi. DN'de meydana gelen yaşlanma (diyabetik nefropati)fareler ayrıca, p53, p21 ve p16 (Şekil 2C) dahil olmak üzere klasik yaşlanma ile ilişkili proteinlerin belirgin şekilde düzenlenmesiyle desteklenmiştir. Buna karşılık, CO yönetimi (Karbonmonoksit)yukarıdaki yaşlanma performansını hafifletti.
Yaşlanan hücrelerin ayırt edici sekretomu olan yaşlanmayla ilişkili salgı fenotipinin mikro-ortamı bozduğu ve hastalığın ilerlemesini kolaylaştırdığı bildirildi.2 Bu nedenle, I-1 , Il-6 dahil olmak üzere bazı temsili SASP'lerin mRNA seviyeleri ölçüldü. , Tgf- , Tnf-a, Vegf, Icam-1 ve Vcam-1. Sonuçlar, bu SASP'deki anormal artışların CO2 tarafından önlendiğini gösterdi. (Karbonmonoksit)müdahale(Şekil 2D).
CO'nun baskılayıcı yaşlanması göz önüne alındığında (Karbonmonoksit)in vivo, anti-yaşlanma etkisini ayrıca sıçan mesanjiyal hücreleri (HBZY-1), insan tübüler epitel hücreleri (HK-2) ve insan podositi dahil olmak üzere 3 tip böbrek hücresinin in vitro modelini araştırıyoruz. (HPC). Yüksek glikoza (HG,35 mmol/L) maruz kaldıktan sonra, 3 hücre tipi 7. günde(Şekil 2E), 5. günde ve 14. günde(Şekil 2l) daha büyük morfoloji ile SA- -gal artışı gösterdi. , sırasıyla. Özellikle, HBZY-1'nin LDH sızıntı oranındaki artış, HG'nin neden olduğu hücre yaşlanması ve hasarına işaret etmiştir (Şekil 2F). Uygun CO dozunu araştırmak için (Karbonmonoksit), HBZY-1, farklı CORM-2 konsantrasyonlarıyla işlendi. LDH(Şekil 2F), EdU-pozitif hücreler (Şekil 2G) ve SA- -gal (Şekil 2H) sızıntı oranını ölçerek, 1 μmol/L konsantrasyonunun daha iyi bir müdahale etkisi olduğunu bulduk. Sürekli olarak, CO (Karbonmonoksit)(1μmol/L）ayrıca HK-2 ve HPC'de SA- -gal'in pozitif ifadesini de azalttı (Şekil 2). Birlikte ele alındığında, bu bulgular CO'nun ortaya çıktığını ortaya çıkardı. (Karbonmonoksit)hem in vivo hem de in vitro olarak dikkate değer bir yaşlanma karşıtı rol oynamıştır.
ŞEKİL 2 CO (Karbonmonoksit)DN'de hafifletilmiş yaşlanma (diyabetik nefropati)HG tarafından meydan okunan fareler ve böbrek hücreleri.
A, Temsili görüntüböbrekSA- -gal ile boyanmış doku ve pozitif alanın istatistiksel verileri (n=3). Glomerulus, kırmızı noktalı daire ile gösterildi. Ölçek çubuğu: 25 μm.
B, p16'nın pozitif ifadesiböbrekimmünohistokimya (n=3) ile gösterildi. Sarı oklar mezangial hücreleri, kırmızı gösterilen renal tübüler epitelyal hücreleri ve siyah oklar podositleri gösterdi. Ölçek çubuğu: 25 μm.
C, p53, p21 ve p16'nın (n = 3) immünoblotları ve dansitometrik analizi ile belirlenen yaşlanma belirteçlerinin protein seviyeleri.
D, SASP mRNA'nın (Il-1 , Il-6, Tgf- , Tnf- , Vegf, Icam-1 ve Vcam-1) ifade düzeylerindeki katlama değişiklikleri (n 4'e eşit veya büyük).
NG'ye (5 mmol/L) veya HG'ye (35 mmol/L) maruz kalan E, HBZY{{0}} 0. günden 7. güne SA- -gal ile boyandı ve SA'nın istatistiksel verileri - -5 ve 7 d'de gal-pozitif hücreler (n=3). Ölçek çubuğu: 50 μm.
F, Farklı CORM-2 konsantrasyonları (0.1, 1, 10 ve 100 μmol/L) ile muamele edilmiş HBZY{{0}}'nin LDH salım hızı (n=6).
G, Farklı CORM-2 konsantrasyonları ile tedavi edilen EdU-pozitif HBZY-1 oranı (n=3).
Farklı CORM-2 (n=3) konsantrasyonları ile muamele edilmiş HBZY-1'de H, SA- -gal boyama. Ölçek çubuğu: 50 μm.
I, SA- -gal of HPC (5. gün) ve HK-2 (14. gün) ile CORM-2 (1μmol/L) ve istatistiksel veriler (n { {6}}). Ölçek çubuğu: 50 μm. *P < .05,="" **p="">< .01,="" ***p=""><>
3.3|CO (Karbonmonoksit)in vivo ve in vitro olarak aktive edilmiş otofaji ve geliştirilmiş otofaji akışı
Büyüyen bir araştırma grubu, otofajinin yaşlanmaya ve CO2'ye olumsuz düzenlemesini ortaya çıkardı. (Karbonmonoksit)otofaji aktivatörü olarak kabul edilmiştir. DN'de COon otofajisinin etkilerini araştırmak için (diyabetik nefropati), bir dizi otofaji ile ilgili protein ölçüldü. Diyabetik farelerle karşılaştırıldığında, CO (Karbonmonoksit)tedavi, otofaji başlatma proteini Beclin-1(Şekil 3A) ifadesini önemli ölçüde arttırdı ve otofaji substratı p62'yi azalttı(Şekil 3B), ancak otofagozom belirteci olan LC3Il'nin LC3l'ye oranını azalttı(Şekil3C). Önceki kanıtlar, bu çelişkinin, lizozomun işlev bozukluğunun neden olduğu bloke otofaji akışından kaynaklanabileceğini öne sürdü.25Sonuçlar, lizozomla ilişkili proteinlerin Katepsin B ve LAMP2'nin DN'de arttığını gösterdi. (diyabetik nefropati)artı DN ile karşılaştırıldığında CO grubu (diyabetik nefropati)grup (Şekil 3D). Ayrıca, LC3 puncta ve LAMP2'nin ortak lokalizasyon analizi, CO2'yi destekledi. (Karbonmonoksit)otofagozom birikimini önemli ölçüde azalttı ve otolizozom sayısını artırdı(Şekil 3E).
Tutarlı bir şekilde, otofaji ve lizozomun işlev bozukluğu, protein seviyeleri ve lizozomal problarla gösterildiği gibi in vitro bulundu (Şekil 3F, G). Ayrıca, HK-2 ve HBZY-1, otofaji akışını izlemek için lentivirüs RFP-GFP-LC3 ile transfekte edildi. HG koşulu altında, klorokin (CQ) tedavisi ile daha fazla değişmeyen HBZY-1 ve HK-2'de otofagozomların noktacıkları arttı ve otolizozomlar azaldı. CO (Karbonmonoksit)CQ eklenmesiyle inhibe edilen otolizozomların sayısını arttırdı ve otofagozomları azalttı(Şekil 3H, I). Özetle, bu sonuçlar CO2'nin (Karbonmonoksit)in vivo ve in vitro olarak aktive edilmiş otofaji ve geliştirilmiş otofaji akışı.
3.4|CO (Karbonmonoksit)in vitro otofajiyi geliştirerek yaşlanmayı hafifletti
CO'nun yaşlanma karşıtı mekanizmasında otofajinin rolünü daha fazla araştırmak (Karbonmonoksit), HG'ye maruz kalan böbrek hücrelerinde CORM-2 ve otofaji inhibitörlerinin bir kombinasyonu kullanıldı. Otofaji başlangıcını bloke etmek için wortmannin(WORT) ve otofaji akışını yeniden zorlamak için CQ olmak üzere iki tip inhibitör, CO tarafından SA- -gal azalmasını etkili bir şekilde tersine çevirdi (Karbonmonoksit)3 tip böbrek hücresinde(Şekil 4A). Sürekli olarak, CO (Karbonmonoksit)HBZY-1(Şekil 4B) ve HK-2(Şekil 4C)'deki iki inhibitör tarafından inhibe edilen EdU hücrelerinin oranını önemli ölçüde arttırdı. HBZY'de-1, yaşlanmayı hafifleten etki CO'nun (Karbonmonoksit)p53,p21 ve p16'nın azaltılmış ifadesi ile gösterilen, otofaji inhibitörlerinin eklenmesinden sonra yoktu(Şekil 4D). Benzer şekilde, immünofloresan analizi, otofaji inhibitörlerinin, CO2 tarafından p53- ve p16-pozitif hücrelerin azalmasını engellediğini gösterdi. (Karbonmonoksit)HK-2 （Şekil 4印） ve HPC'de (Şekil 4F). Ayrıca, Atg7'nin sessizliği (Şekil 4G) CO2'nin koruyucu etkilerini engelledi. (Karbonmonoksit), HK'de artan SA- -galt hücreleri ve azalan EdU* hücreleri ile gösterilir-2(Şekil 4H). Yukarıda belirtilen sonuçlar, CO (Karbonmonoksit)Otofajiyi geliştirerek yaşlanmayı bastırdı.
3.5|Etkinleştirilmiş otofaji, DN'de SASP'yi bozabilir (diyabetik nefropati)fareler
Otofaji ve yaşlanma arasındaki spesifik ilişkiyi daha da araştırdık. Araştırmalar, otofajinin, SASP'yi serbest bırakmak için NF-KB'yi pozitif olarak düzenleyen GATA4'ü seçici olarak bozarak yaşlanmayı azalttığını gösterdi.26Buna paralel olarak, DN'de büyük miktarda SASP geliştirildi. (diyabetik nefropati)grubu (Şekil 2D) ve p65'in ekspresyonu ve nükleer translokasyonu arttı (Şekil 5A). Bununla birlikte, GATA4'ün protein seviyesi değişmeden kaldı, bu da GATA4'ün yüksek glikoz durumunda SASP oluşumuna aracılık etmeyebileceğini düşündürmektedir (Şekil 5B). Ek olarak, çalışmalar mTOR, geç otofagozom ve lizozom kombinasyonu ile oluşturulan TOR-otofaji uzaysal kuplaj bölmesinin (TASCC) SASP salgısını artırarak yaşlanmayı hızlandırdığını ortaya koymuştur.27Ancak, immünofloresan sonuçları mTOR, LC3 üçlü kollokalizasyonunun olmadığını göstermiştir. ve LAMP2, böbreklerde TASCC'nin başarısız oluşumunu gösterir (Şekil 5C).
Bildiğimiz gibi, otofaji, esas olarak otofagozom ve lizozomun füzyonu ile oluşturulan otolizozom tarafından gerçekleştirilen sitozolik bileşenlerin bozulmasında işlev görür. Otofajinin, LPS ile uyarılan makrofajlarda pro-IL-1'yi bozarak IL-1 salgılanmasını azalttığı rapor edilmiştir.28 İlginç bir şekilde, IL'nin-1 (yeşil) birlikte konumlandırıldığını bulduk. CON ve DN'de LC3 puncta (kırmızı) ve LAMP2 (pembe) ile (diyabetik nefropati)artı CO (Karbonmonoksit)gruplar (Şekil 5D, kırmızı ok), SASP ve otofaji bozulması arasındaki kesişimi gösterir. Benzer şekilde, DN ile karşılaştırıldığında (diyabetik nefropati)grubunda, IL-6, TGF- ve VEGF dahil olmak üzere SASP'nin diğer sitokinleri de CON ve DN artı CO'da LC3 punkta ve LAMP2 ile mütevazı ancak belirgin bir birlikte lokalizasyona sahipti. (Karbonmonoksit)VEGF'nin en belirgin şekilde otolizozomlarla birlikte lokalize olduğu gruplar(Şekil 5E-G, kırmızı ok). Ancak, DN'deki örtüşen sarı lekelenme (diyabetik nefropati)grup SASP'nin yalnızca LC3 puncta ile birlikte konumlandırıldığını gösterdi(Şekil 5D-G, beyaz ok). Ayrıca VEGF'nin protein seviyesi, otofaji agonistleri (ABT737 ve rapamisin) veya CORM-2 eklendikten sonra HPC'de ölçülmüştür. VEGF'nin toplam protein seviyesinde anlamlı bir fark olmamasına rağmen (Şekil 5H), hem otofaji agonistlerinin hem de CO2'nin varlığı (Karbonmonoksit)HG tarafından indüklenen HPC'de VEGF salınımını belirgin şekilde azalttı (Şekil 5I, J). Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar bazı SASP'lerin otofaji yoluyla bozulduğunu gösterdi.
ŞEKİL 4 CO (Karbonmonoksit)in vitro otofajiyi geliştirerek yaşlanmayı hafifletti. HBZY-1, HPC ve HK-2, HG, CORM-2 ve otofaji inhibitörleri (WORT: 200nM ve CQ: 5 μmol/L) ile tedavi edildi.
A, 3 çeşit böbrek hücresinde (n=3) SA- -gal'in boyanması ve pozitif hücreleri. Ölçek çubuğu: 25 μm.
B, C, HBZY-1 ve HK-2'de EdU boyaması ile değerlendirilen hücre çoğalması ve pozitif hücrelerin oranı (n=3). Ölçek çubuğu: 50 μm.
D, HBZY-1 (n=5) içinde yaşlanma ile ilgili proteinin (p53, p16 ve p21) ifadesi.
E, F, p53 ve p16'nın Temsili immünofloresan görüntüleri ve HK-2 ve HPC'deki (n=3) pozitif hücre oranının ölçümü. Ölçek çubuğu: 50 μm.
G, HK-2'deki Atg7'nin protein ekspresyon seviyeleri siRNA (üç dizi) ile susturuldu.
H, SA- -gal (Ölçek çubuğu: 50 μm) ve EdU boyamasının (Ölçek çubuğu: 25 μm) temsili görüntüleri ve HK-2 (n {{4) cinsinden pozitif hücre oranının niceliği }}). *P < .05,="" **p="">< .01,="" ***p=""><>
3.6|CO (Karbonmonoksit)Beclin-1-Bcl-2 kompleksini kısmen ayırarak otofajiyi aktive etti
Beclin-1-Bcl-2 kompleksinin ayrışmasının otofajiyi iyileştirdiği ve yaşa bağlı böbrek değişiklikleri dahil erken yaşlanmayı önlediği bildirilmiştir.21 Ek olarak, CO (Karbonmonoksit)sepsis farelerinde Beclin-1 aracılığıyla aktive edilmiş otofaji.1/Bu nedenle, kompleks aracılı otofaji aktivasyonunun CO tarafından ayrıştırılıp ayrıştırılmadığını araştırdık. (Karbonmonoksit). Birlikte immünopresipitasyon sonuçları göstermiştir ki CO (Karbonmonoksit)DN'de azaltılmış Beclin-1-Bcl-2 bağlaması (diyabetik nefropati) fareler (Şekil6A). Ayrıca, HG ve CO tedavisi ile karşılaştırıldığında (Karbonmonoksit), HG, CO'nun kombine kullanımı (Karbonmonoksit), ve Beclin-1-Bcl-2 kompleks ayrışma ajanı ABT737, değişmeyen LAMP2 ile kanıtlandığı gibi, HBZY-1 otofajisini daha da aktive etti, p62'yi azalttı ve LC3ll/LC3l oranını artırdı (Şekil 6B). Ayrıca, sonuçlar CO'nun kombine kullanımının (Karbonmonoksit)ve ABT737, HBZY'de p53,p21 ve p16'nın ifadesini daha da aşağı regüle etti-1 (Şekil 6C) ve HBZY'de SA- -galt hücresini azalttı-1, HK{{9} } ve HPC (Şekil 6D), ABT737'nin CO2'nin yaşlanma karşıtı etkisini arttırdığını gösterir. (Karbonmonoksit). Bu gözlemler, CO (Karbonmonoksit)yaşlanmayı hafifletmek için Beclin-1-Bcl-2 kompleksini ayırarak otofajiyi etkinleştirebilir.
