KLRG1, Tümör İlerlemesi ve İmmünoterapi Tepkisi ile İlişkili Tümöre Sızan CD4 T Hücresi Alt Kümelerini İşaretler

Soyut

İmmüno-onkolojide biyobelirteç keşfi ve hedef belirleme için mevcut yöntemler, tümör bağışıklığının statik anlık görüntülerine dayanır. Antitümör bağışıklık tepkilerinin zamansal doğasını kapsamlı bir şekilde karakterize etmek için bir 34-parametre spektral akış sitometri paneli geliştirdik ve kritik bağlamlarda yüksek verimli analizler gerçekleştirdik.

Sırasıyla kanser immün düzenlemesini (NPKC1) ve immün kontrol noktası blokajı (ICB) tepkisini (MC38) özetleyen iki farklı preklinik modelden yararlandık ve immün sürveyans ve kaçış ve/veya ICB yanıtının önemli bükülme noktalarında ve çevresinde çoklu ilgili dokuların profilini çıkardık.

Hedefler, proteinler, enzimler ve reseptörler gibi hücrelerdeki önemli biyomolekülleri ifade eder. Hedef tanıma, hastalık tedavisi ve ilaç geliştirmede uygulanmak üzere bu biyomoleküllerin spesifik özelliklerini ve işlevlerini belirlemek için kimyasal ve biyolojik yöntemlerin kullanılmasıdır.

Bağışıklık, vücudun yabancı patojenlerin istilasına ve endojen anormal hücrelerin büyümesine direnme kabiliyetini ifade eder. Bağışıklık sisteminin çekirdeği, hedefleriyle yakın bağlantıları ve etkileşimleri olan bağışıklık hücreleri ve molekülleridir.

Hastalık tedavisinde ve ilaç geliştirmede hedef belirleme ve bağışıklık arasındaki ilişki çok önemlidir. Örneğin, birçok ilacın etki mekanizması, terapötik etkiler elde etmek için hedef tanıma, spesifik proteinleri, enzimleri, reseptörleri ve diğer molekülleri hedefleme, işlevlerini etkileme ve sinyal iletimini düzenleme yoluyladır. Bağışıklık sistemindeki hücreler ve moleküller de ilaçların hedefi olabilir. Örneğin antikanser ilaçlar, kanser hücrelerinin bağışıklık tepkisini etkileyerek ve hücre apoptozunu ve proliferasyonunu düzenleyerek terapötik etkiler elde eder.

Bu nedenle, ilaç geliştirme ve klinik tedavide, hedef belirleme ve bağışıklık faktörlerinin kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesi, daha etkili ilaç geliştirmeye ve iyileştirilmiş terapötik etkiye yol açabilir. Bu açıdan bakıldığında bağışıklığı geliştirmemiz gerekiyor. Cistanche bağışıklığı artırabilir. Cistanche, C vitamini, C vitamini, karotenoidler vb. gibi çeşitli antioksidan maddeler açısından zengindir. Bu bileşenler serbest radikalleri temizleyebilir, oksidatif stresi azaltabilir ve bağışıklığı geliştirebilir. sistem direnci.

Tıklayın cistanche tubulosa özü tozu

Makine öğrenimine dayalı veri analizi, tümör modellerinde yapısal olarak tümör yüküyle ilişkilendirilen ve ICB'ye yanıt olarak gerileme geçiren tümörlerde kaybolan intratümöral efektör CD4 T hücre popülasyonlarını benzersiz bir şekilde tanımlayan bir KLRG1 ekspresyonu modelini ortaya çıkardı. Benzer şekilde, bir Helios-KLRG1 artı tümöre sızan düzenleyici T hücrelerinin (Treg'ler) alt kümesi, tümörün immün dengeden kaçmaya ilerlemesi ile ilişkilendirildi ve ayrıca ICB'ye yanıt veren tümörlerde kayboldu.

Doğrulama çalışmaları, böbrek kanserinde hastalık ilerlemesi ile ilişkili insan tümörü sızan CD4 T hücrelerinde KLRG1 imzalarını doğruladı. Bu bulgular, KLRG1 artı CD4 T hücre popülasyonlarını, kanser bağışıklığında daha fazla araştırma için alt kümeler olarak aday gösterir ve dinamik biyobelirteç ve/veya hedef keşfi motoru olarak uzunlamasına spektral akış profillemenin faydasını gösterir.

giriiş

İmmünoterapi artık kanser tedavisinin bir ayağıdır. Bununla birlikte, çoğu immünoterapötik ajana verilen yanıtlar nadirdir, sınırlı sayıda tümör tipiyle sınırlıdır ve tahmin edilmesi zordur(1). Yanıt oranlarını iyileştirmek ve yanıtı öngören biyobelirteçler geliştirmek, tümör immünolojisi alanının ana hedefleridir, ancak bu hala zorlayıcıdır.

Çok sayıda karmaşık çok hücreli etkileşim, herhangi bir hastada bir antitümör immün yanıtının sonucunu yönetebilir. Bu nedenle, tek biyobelirteçlerin - veya tekil yolların terapötik modülasyonunun - çoğu kanser hastasında olmasa da bazılarında fayda sağlama eğiliminde olması yaygındır.

Örneğin, şu anda yaygın klinik kullanımda olan bağışıklıkla ilgili üç biyobelirteç vardır; (i) doğrudan ölçülen veya DNA onarım mekanizmasındaki(2-4) devre dışı bırakan mutasyonların varlığından anlaşılan tümör mutasyon yükü (TMB), (ii) immünohistokimya (IHC)(5) ile PD-L1 ekspresyonu ve (iii) immünoskor(6) olarak adlandırılan tümörlerin içinde ve çevresindeki CD8 T hücrelerinin varlığıyla ölçülen önceden var olan bağışıklık.

Her biri, belirli bağlamlarda immünoterapiye verilen yanıtla önemli ölçüde ilişkili olsa da, bu öngörücülerin duyarlılığı ve özgüllüğü yetersiz kalır(7). Bu tek modlu yaklaşımlar, dokular arasında ve zaman içinde meydana gelen bu tür tepkilerin dinamik doğası da dahil olmak üzere, antitümör bağışıklığının altında yatan karmaşık mekanizmaları tam olarak yakalamakta muhtemelen başarısız olur.

Bu nedenle, biyobelirteç tespiti ve çapraz dokuda hedef keşfine yönelik yüksek oranda çoğullanmış tek hücreli immün profilleme yaklaşımlarının uygulanması, uzunlamasına bir şekilde, daha büyük tahmin ve translasyonel fayda ile nüanslı immün fenotipler sağlayabilir.

Bu amaçla, bir 34-parametre spektral akış sitometri paneli ve yüksek boyutlu veri analizi boru hattı geliştirerek, bağışıklık kaçışı ve tümörün aşırı büyümesi ve bağışıklık kontrol noktası dahil olmak üzere kanser bağışıklığı düzenleme döngüsünün farklı aşamalarıyla ilişkili protein düzeyindeki bağışıklık fenotiplerini sorguladık preklinik modellerde abluka (ICB) yanıtı.

NPK-C1 ve ICB ile tedavi edilen MC38 modellerinin profilini çıkardık, tümörün ilerlemesindeki önemli bükülme noktalarının üzerinde ve çevresinde çoklu dokuları (tümör, akan ve akmayan lenf düğümleri ve kan) analiz ettik. Bu, doğal ve ICB kaynaklı tümör gerilemesinin, bağışıklık dengesine geçişin ve ardından dengeden kontrolsüz tümör kaçışına geçişin altında yatan dinamiklerin derin karakterizasyonunu kolaylaştırdı. Renal kanserin insan tek hücreli veri setlerinde yapılan doğrulama çalışmaları, bu bulguların translasyonel alaka düzeyini doğrulamıştır.

Malzemeler ve yöntemler

fareler Erkek ve dişi C57BL/6J fareleri (5-6 haftalık), Jackson Laboratuvarı'ndan (Bar Harbor, ME) satın alındı. Kullanım sırasında fareler 6-8 haftalıktı. Tüm hayvanlar, NIH ve Amerikan Laboratuar Hayvanları Bakım Birliği düzenlemelerine sıkı sıkıya bağlı olarak barındırıldı. Bu çalışma için tüm deneyler ve prosedürler, Columbia Üniversitesi Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.

Hücre Hatları. NPK-C1 hücre dizisi (orijinal olarak LM7304), Columbia Üniversitesi'nden Dr. Cory AbateShen tarafından sağlandı. Daha fazla ayrıntı için önceki referanslara bakın(8,9). NPK-C1 hücreleri, yüzde 10 FBS (HyClone; Logan, UT), 100 U/mL penisilin ve 100 mg/mL streptomisin (Gibco; Gaithersburg, MD). MC38 kolon karsinoma hücreleri, Kerafast'tan satın alındı ​​ve yüzde 10 FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 mg/mL streptomisin (Gibco; Gaithersburg, MD) ile desteklenmiş DMEM'den (Corning; Corning, NY) oluşan D10 içinde kültürlendi.

Tümör Mücadelesi ve Terapi Enjeksiyonları. Yüzde 70-90 birleşme noktasındaki NPK-C1 hücreleri veya yüzde 50-75 birleşme noktasındaki MC38 hücreleri, 0.0yüzde 5 tripsin (Gibco, Gaithersburg, MD) ile toplandı, ile yıkandı PBS, sayıldı ve buz gibi PBS içinde 10x106 hücre/mL'de yeniden süspanse edildi. 0. günde, 6-8 haftalık farelere sağ yan tarafa 1x106 NPK-C1 veya MC38 hücreleri yerleştirildi. Tümör ölçümleri her 2-3 günde bir dijital kumpas ile X, Y ve Z boyutlarında (sırasıyla en büyük çap, en küçük çap ve en büyük yükseklik) kaydedildi ve tümör hacmi X*Y*Z ile çarpılarak hesaplandı. Anti-PD-1 (RMP1- 14 IgG2a,κ) veya Sıçan IgG2a izotip antikoru (Bio X Cell; Lübnan, NH), steril PBS içinde seyreltildi ve intraperitoneal (IP) enjeksiyonla 200 ug//'de uygulandı. MC38 implantasyonları sonrası 3, 6, 9 ve 12. günlerde fare başına mL.

Doku Toplama Fare ötanazisinin ardından, yüzde 0,2 heparin (StemCell Technologies; Vancouver, BC) kaplı şırınga iğnesi kullanılarak kardiyak ponksiyon yoluyla ~200 ul kan izole edildi ve 10 ul 0,5M içeren tüplerde buz üzerine yerleştirildi. EDTA (Corning; Corning, NY). Tümörü boşaltan ve boşaltmayan kasık lenf düğümleri parçalara ayrıldı ve 48-buz üzerinde 150 ul R10 ortamı içeren kuyucuklu plakalara yerleştirildi.

Tümörler toplandı, kümelendi ve 50 mg'a kadar tümör küp küp doğrandı ve buz üzerinde 5 mL Eppendorf tüplerinde X-Vivo 15 ortamına (Lonza; Basel, İsviçre) yerleştirildi. Tümör örneklerine DNase (40 ul of 20 mg/mL solution; Roche; Basel, Switzerland) ve Collagenase D (125 ul of 40 mg/mL solution; Roche; Basel, Switzerland) ilave edilerek 37oC'de çalkalayıcıda inkübe edildi. 30 dakika. Sindirim reaksiyonları, vorteksleme (30 saniye) ve 5 mL R10 ortamı eklenerek söndürüldü. Tümör sindirimleri, 70 um filtrelerden (Miltenyi; Bergisch Gladbach, GE) süzüldü ve topaklandı. Kan numuneleri, 2mL ACK tamponunda (Quality Biological; Gaithersburg, MD) art arda iki 2- dakikalık inkübasyonla ve peletlemeden önce R10'da söndürmeyle eritrositler eritildi. Lenf düğümleri kuyu plakasında 1 mL'lik bir şırınga pistonu ile fiziksel olarak ayrıştırıldı, ardından süspansiyonlar 40-um filtrelerden süzüldü. Tüm numuneler, boyama için U-tabanlı 96-gözlü plakalara yerleştirildi.

Akış Sitometrisi. Numuneler PBS ile yıkandı. Ölü hücreler, 100 ul PBS artı Live/Dead Fixable Blue boya (1:500; Invitrogen; Waltham, MA) içinde yeniden süspanse edilerek boyandı. Bu ve diğer tüm boyama veya sabitleme adımları, ışıktan korunan bir plaka çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika süreyle gerçekleştirildi. Numuneler 2 kez PBS ile yıkandı, ardından TruStain FcX (1:50; BioLegend; San Diego, CA) ve TruStain Monosit Bloker (1:20; BioLegend; San Diego, CA) ve buz üzerine yerleştirildi.

Yüzey antikorları, Brilliant Stain Plus tamponu (BD; Franklin Lakes, NJ) ile desteklenmiş FACS'de optimal seyreltmelerde (bakınız Ek Tablo S1) hazırlandı, ardından bir bloke edici solüsyonda numunelere ilave edildi. Boyamadan sonra numuneler, 2 kez FACS tamponu ile yıkandı ve 100 ul FoxP3 Sabitleme/Permeabilizasyon Kiti tamponu (eBioscience; San Diego, CA) içinde sabitlendi. Numuneler, 1X Geçirgenleştirme tamponu (1X PW) ile iki kez yıkandı ve ardından 1X PW artı hücre içi antikorlarla boyandı. Numuneler daha sonra iki kez 1X PW içinde yıkandı, ardından 100 ul FluoroFix tamponunda (BioLegend: San Diego, CA) sabitlendi, iki kez FACS ile yıkandı, ardından 200 ul FACS içinde yeniden süspanse edildi ve ertesi gün bir Cytek Aurora 5-lazer sitometre.

Tek leke kontrolleri için eş zamanlı olarak boyanmış splenosit numuneleri kullanıldı. Analiz ve İstatistik. Boyuna profil çıkarma deneyleri, MC38 ve NPK-C1 modelleri için birer kez yapılmıştır. Zaman noktası başına toplam n=10-25 fare değerlendirildi. Akış sitometrisi verileri, FlowJo v10.8.1'de (BD; Franklin Lakes, NJ) analiz edildi ve yüksek boyutlu eklenti algoritmaları UMAP ve FlowSOM, FlowJo Exchange'den indirildi. Örnek başına 30 bine kadar canlı CD45 artı tümör infiltre eden hücreler ve 15 bine kadar canlı CD45 artı kan veya LN türevi hücreler, yüksek boyutlu analiz için birleştirildi.

Tüm boyutluluk azaltma ve kümeleme FlowJo'da gerçekleştirildi. İstatistiksel analizler GraphPad Prism v9.3.1'de yapıldı. Korelasyon katsayılarını oluşturmak için Pearson Korelasyonu kullanıldı ve gruplar arasındaki küme frekanslarını karşılaştırmak için Welch düzeltmeli eşleştirilmemiş Student T-testleri kullanıldı. Tek hücreli analitik yöntemler daha önce açıklanmıştır(10,11).

KLRG1 regulon, Obradovic ve diğerleri(11) tarafından sağlanan konsensüs metaVIPER KLRG1 regulon'dan çıkarıldı. KLRG1 regulon imzasını hesaplamak için, özellikler olarak regulons genleri ve hedef olarak KLRG1 ile rastgele bir orman regresyon modeline uyduk, ardından KLRG1 ekspresyonu üzerindeki etkilerini belirlemek için regulon genlerinin Gini önem puanlarını hesapladık. Her bir hücrenin KLRG1 regulon skoru, ağırlık olarak önem skorları ile hücredeki tüm regulon genlerinin ekspresyon ölçümlerinin ağırlıklı toplamı tarafından verildi.

For more information:1950477648nn@gmail.com