Haloxylon Ammodendron (Chenopodiaceae) Ve Otsu Kök Holoparazit Cistanche Deserticola (Orobanchaceae) Arasında Büyük Ölçekli MRNA Transferi

Öne Çıkanlar
•Haloxylon ammodendron ve kök paraziti arasında on bin mRNA aktarımıCistanche Deserticola

•Ayçiçeği-Orobanche cumana sisteminde RNA hareketliliği ve fonksiyonel analizi yapılmıştır.

•CdNLR1 ve CdNLR2, köke özel HR'ye neden olur ve parazitik dengeyi etkiler

Cistanche Yetiştiriciliği ve Analizi

Özet
MRNA değişimleri, konakçı ve kök parazitler arasında gösterildi, ancak kök parazitler arasında gösterilmedi.Cistanche Deserticola(Orobanchaceae) birholoparazit bitkiodunsu bitki Haloxylon ammodendron'un (Chenopodiaceae) köklerinde parazitlenir. Yaklaşık on bin mobil mRNA'yı tanımlamak için transkriptom dizilimi ve biyoinformatik analizler kullandık. Transkript bolluğu, transfer olayı için itici bir güç gibi görünmektedir ve mRNA değişimleri, haustorial kavşak yoluyla gerçekleşir. Seçilen mRNA'ların hareketliliği yerinde ve ayçiçeği-Orobanche cumana heterolog parazit sisteminde doğrulandı. dörtC. Deserticola→ H. ammodendron mobil mRNA'larının haustoryum gelişimini kolaylaştırdığı görülmektedir. İlgi çekici olarak, varsayılan direnç genleri CdNLR1 ve CdNLR2'nin iki mobil mRNA'sı, köke özgü aşırı duyarlı tepkiye neden olur ve parazitik dengeye katkıda bulunabilecek parazit gelişimini geciktirir. Bu çalışma, odunsu bir konakçı ile bir kök paraziti arasındaki büyük ölçekli mRNA transfer olayı için kanıt sağlar ve altı tanesinin işlevsel ilişkisini gösterir.C. Deserticolakonak-parazit etkileşimlerinde genler.

konu alanları
Bitki biyolojisiBitkilerin organizmalarla etkileşimiOmicsTranscriptomics
giriiş
Artan kanıtlar, bitkilerde hem kısa hem de uzun mesafeli iletişimde proteinler ve mRNA'lar gibi makromoleküllerin önemini göstermektedir.1 Plasmodesmata kısa mesafeli taşıma kanalları olarak kabul edilirken, vasküler sistem uzak dokular arasında uzun mesafeli moleküler taşımayı gerçekleştirir.2 ,3 mRNA'nın floemde transfer olduğu bildirildi.4 Son çalışmalar, tRNA orijinli kök halka yapısının mRNA'ya uzun mesafe taşıma kapasitesi verdiğini göstermiştir.5 RNA eksozomunun bir alt birimi olan AtRRP44A'nın plazmodesmata ile etkileşime girdiği ve KNOTTED1 (KN1) mRNA.6'nın hücreden hücreye ticaretine aracılık etmek için

Parazit bitkiler, çiçekli bitkilerin yaklaşık yüzde 1'ini oluşturur. Parazit bitkilerin en önemli özelliği, konukçu ve parazit bitkiler arasında fiziksel ve fizyolojik bağlantı kanalları kuran ve böylece etkileşimlerinin çoğuna hakim olan, haustorium adı verilen özel bir yapıdır.7 Parazit bitkiler, büyümelerini sürdürmek, su emmek ve fotosentatlar, amino asitler ve diğer ara metabolitler gibi besin maddelerini konakçıdan haustorium yoluyla alır.8 Haustoria ayrıca, otobur sinyali gibi sinyal moleküllerini iletmek için konakçılar arasında bağlantı köprüsü görevi görür.9 Ayrıca, proteinleri içeren biyomoleküllerin ve RNA'lar, konak-parazit bağlantıları aracılığıyla çift yönlü olarak değişir. Konakçı ve asalak bitkiler arasındaki RNA transferinin en eski örneği, RNA virüsünün enfekte konakçıdan enfekte olmamış bitkiye küsküt aracılığıyla iletilmesidir.10 Küçük enterferans RNA (siRNA) ve mikroRNA (miRNA) gibi küçük RNA'lar (sRNA'lar) gösterilmiştir. alıcı organizmalarda hedef gen ekspresyonunu düzenlemek için konak-parazit arasında hareket etmek.11,12,13 mRNA transferine gelince, konakçı domates, balkabağı ve yoncadan parazit Cuscuta chinensis'e kadar mobil mRNA'ların başlangıçta birkaç gen için olduğu gösterilmiştir. test.14 Mikroarray analizi yoluyla, Roney ve ark. 474 mRNA'nın domatesten küspeye aktarıldığını buldu.14 Ancak, transfer mRNA'larının büyük ölçekli tanımlaması yalnızca yeni nesil dizileme teknolojisinin kullanımıyla sağlandı. Kim ve ark. parazit Cuscuta pentagona ile Arabidopsis thaliana ve domates gibi konakçılar arasındaki büyük ölçekli ve çift yönlü mRNA transferini belirlemek için transkriptom dizileme teknolojisini kullandı.15 Ancak transfer mRNA'larının konak-parazit etkileşimlerindeki işlevsel önemi açık değildi.

Orobanchaceae, birçoğunun fakültatif veya zorunlu kök paraziti olduğu en büyük parazitik anjiyosperm ailesidir.16 Cistanche, Orobanchaceae'deki holoparazit çöl bitkilerinin dünya çapında bir cinsidir. C. Deserticola, odunsu bir psammofit olan Haloxylon ammodendron'un (Chenopodiaceae) köklerinde parazitlenen bir holoparazittir.17 Kloroplast rpoC2 geninin H. ammodendron'dan C. Deserticola'ya yatay gen transferi ile aktarıldığı gösterilmiştir.18 Burada, yeni nesil transkriptom dizileme ve biyoinformatik analiz yoluyla C. Deserticola ve H. ammodendron arasında yaklaşık on bin mobil mRNA. Mobil mRNA'lar, çoklu dizi hizalaması, PCR doğrulaması ve özellikle bir ayçiçeği-Orobanche cumana parazit sisteminin kullanılmasıyla belirlendi. Mobil mRNA'ların işlevi, bu heterolog parazitik sistem tarafından birkaç gen için de gösterildi. Bugüne kadar, konak ve parazit arasındaki fonksiyonel mRNA alışverişi hakkındaki raporlar çok sınırlıydı. Bu nedenle çalışmamız, mobil mRNA'ların bakış açısından parazitik mekanizma hakkında yeni bilgiler sağlar.

Sonuçlar
C. Deserticola ve H. ammodendron arasındaki mobil mRNA'ların tanımlanması
Konak H. ammodendron kökü ve parazit C. Deserticola'nın sıkı fiziksel bağlantısı, onları haustorium'da ayırmayı imkansız kılar. Bu nedenle, konakçı ve parazit arasındaki mobil transkriptleri tanımlamak için yüksek verimli RNA dizilimi (RNA-seq) ve aşamalı biyoinformatik sınıflandırmayı birleştirdik. Illumina HiSeq2500 platformunda RNA-seq analizleri için dört farklı numune seti toplandı. Bunlar arasında parazitsiz konakçı H. ammodendron'un (HA) kök dokusu,C. Deserticola(CD), ile parazitlenen konakçı H. ammodendron'un kök dokusuC. Deserticola(HC) ve evsel arayüz (HI). HC ve CD numuneleri için, ilgili konakçı kök ve parazit sapı, kökten 1 cm uzakta toplandı.parazit kavşağı(Şekil 1A).

Şekil 1. RNA-seq analizi ve mobil RNA'ların teyidi

(A) RNA-seq analizi için seçili dokuların gösterimi. CD, haustorial kavşağın yakınında C. Deserticola'nın taze etli sapları; HC, CD istilasına uğramış H. ammodendron'un kökleri; Merhaba, evsel arayüz. Ölçek çubukları belirtilmiştir.

(B) Sekans montajı ve mobil RNA'ların teyidi için stratejilerin ana hatları. RNA-seq, yeni nesil RNA dizilemesi. ISO-Seq, tam uzunlukta transkriptom sıralaması. HA, parazitlenmemiş H. ammodendron'un kökleri. HA.FL_NR, H. ammodendron'un tam uzunluktaki transkriptom dizisi. CD.FL_NR, C. Deserticola'nın tam uzunluktaki transkriptom dizisi.

(C) ORF tahmini ve montaj sonucunun daha fazla teyidi. ORF tahmini için ORF bulucu (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) uygulandı ve yukarıda (FPKM Greater than or equal to 0.3) ifade eşik değeri ile birleştirilmiş unigenler kullanıldı. ) çapraz kontrol edildi. Örtüşen tekgenler, Cis ve HAC tekgenlerine karşı ikili BLASTN (E değeri=1e−10) ile daha fazla filtrelendi.

(D) CD, HA ve HC örnekleri arasında ortak ve farklı transkript kümelerini gösteren Venn diyagramları.

Etkileşen organizmalardan belirli bir transkript için kaynak dokunun güvenilir bir şekilde tanımlanması zorlu bir konudur. Bu nedenle Ikeue ve ark. konakçı ve parazit transkriptlerini ayırt etmek için yararlı bir biyoinformatik yöntem geliştirdiler.¹⁹Burada, aralarındaki mobil mRNA'ları tanımlama yöntemlerine dayanan değiştirilmiş bir biyoinformatik yaklaşım kullandık.C. çöl şerbeti VeH. ammodendron(Şekil 1B). Yukarıdaki kitaplıklardan toplam 723.382.940 temiz okuma üretildi (Tablo S2) ve bu okumalar farklı stratejilerle birleştirildi (Şekil 1B). Sonuç olarak, on numunenin tamamı 222.899 unigene (bundan sonra "Kombine" olarak adlandırılacaktır, Tablo S3) hibrit birleştirildi.C. çöl şerbetiVeH. ammodendronnumuneler ayrıca sırasıyla 107.752 ve 194.720 unigene birleştirildi (bundan sonra "Cis" ve "HAC" olarak adlandırılacak, Tablo S3). Tüm numuneler için benzerliğin yanı sıra varyasyonu görselleştirmek için, "Kombine unigenes" te tespit edilen tüm genlerin normalize edilmiş FPKM değerleri üzerinde bir temel bileşen analizi (PCA) gerçekleştirdik. PCA çizimi, üç biyolojik kopya için verilerin yakın bir şekilde kümelendiğini ve özellikle aralarında farklı örneklerde ayrıldığını gösterdi.H. ammodendronVeC. çöl şerbeti(Şekil S1). Bu arada, ORF tahmini, "Kombine" unigenlerin 149.825'inin (yüzde 67.23) varsayılan proteinleri kodladığının varsayıldığını gösterdi (Şekil 1C). Dört farklı numuneden FPKM ifade eşik değeri 0.3'e eşit veya daha büyük olan ayrı ayrı birleştirilmiş tek genler, ORF tahmin sonuçlarıyla çapraz kontrol edildi (Tablo S4–S6). Bu analiz, CD, HC, HA ve HI dört örneğindeki unigenlerin yüzde 69,01-75,90'ının varsayılan ORF'ye sahip olduğunu belirledi (Şekil 1C). Tam uzunlukta transkriptom sıralaması yapıldı ve veriler, CD_FL içinC. çöl şerbetive HA_FL içinH. ammodendron, her iki ana bilgisayar için montaj hatası düzeltmesi için kullanıldıH. ammodendronve parazitC. çöl şerbetiçünkü her iki tür de genomik veriden yoksundur (Tablo S8–S11). Yukarıdaki dört numuneden atanan unigenes ikili BLASTN (E değeri=1e⁻¹⁰) Cis, HAC, CD_FL ve HA_FL'ye karşı, 94,78–99.00 yüzdesi güvenilir fikir birliği dizilerine sahipti (Şekil 1C ve Tablo S7). Yukarıdaki analize dayanarak, 17.379 (HA'ya özel 14.810 ve HA içeren 2.569) ortak unijen nihayet CD, HC ve HA'dan alınan unijenlerin Venn diyagramı analizinde HC ve CD'den alındı ​​(Şekil 1D). Bunların arasında, eski 14.810 unigen, HA'da bulunmamaları nedeniyle büyük olasılıkla parazit CD kökenlidir, ancak bunların bir kısmı, yukarı regülasyonları nedeniyle HA'da bulunmayan ancak yalnızca HC'de bulunan HC → CD mobil mRNA'ları da temsil edebilir. parazit eki üzerinde. Son 2,569 unigen, HA'da da mevcut oldukları için büyük olasılıkla tek yönlü HC → CD transfer mRNA'larını temsil eder. Diğer unigenler, HC ve CD arasında paylaşılmadıkları için aday mobil mRNA'lardan çıkarıldı. Ayrıca, [HC, CD]'deki 14,810 yaygın tekgenlerin sayısının [HA, CD]'deki 166 ortak tekgenden 89 kat daha fazla olduğuna dikkat edilmelidir; montaj veya biyoinformatik analizler (Şekil 1D).

Varsayılan mobil mRNA'ların kaynağı, dizi kökenlerini atamak için ikili BLAST analizleri yoluyla daha da doğrulandı (Şekil 1B ve Tablo S12). Hem konakçı hem de parazit için genomik verilerin bulunmaması nedeniyle, Chenopodiaceae ve Orobanchaceae familyası organizmaları için mevcut sekans verilerini kullandık.H. ammodendronVeC. çöl şerbetisırasıyla aittir. Hipotezimiz, mobil mRNA'larınH. ammodendronOrijin orijinleri büyük olasılıkla diğer Chenopodiaceae türlerinden ortologları ile Orobanchaceae türlerinden ortologlarından daha yüksek homolojilere sahipken, mobil mRNA için bunun tersi geçerlidir.C. çöl şerbetiköken ve korunmuş ortologlar muhtemelen hem Orobanchaceae hem de Chenopodiaceae ile yüksek benzerliklere sahiptir. Bu analiz, homoloji araştırması yoluyla aile düzeyine atanabileceklerinden, mobil mRNA'ların kökenlerini belirlememize yardımcı olabilir. Hipotezimizi kanıtlamak için, OrthoFinder kullanılarak altı Orobanchaceae ve dört Chenopodiaceae türü dahil olmak üzere otuz yedi türün filogenetik ağacı oluşturuldu. Orobanchaceae ve Chenopodiaceae türleri arasındaki uzak evrimsel mesafe, hipotezimizin güvenilirliğini ortaya koydu (Şekil 2A ve Tablo S13). Gen kaybı analizi, birçok ortogrup için transkriptlerin ve fotosentezle ilgili genlerinC. çöl şerbeti(Şekil 2B ve 2C, Tablo S14, Veri S2 ve S3). Ayrıca, Venn şeması analizi arasındaC. çöl şerbetive sıralanmış diğer üç asalak bitki de eksik ortogrupların yüzde 53.84'ünün (926/1.720) olduğunu gösterdi.C. çöl şerbetidiğer üç parazit bitkide de yoktu, yani yüzde 50.81 (755/1486), yüzde 48.09 (377/784) ve yüzde 50.00 (260/520)C. Avustralyalı, Asya strigaVePhtheirospermum japonicumsırasıyla (Şekil S2). Bu sonuçlar, yalnızca bu türün parazitik özelliğini değil, aynı zamanda analizlerimizden elde edilen unigene düzeneğinin güvenilirliğini de gösterdi ve aynı zamanda, sekans kökeninin teyidi için ilgili bitki türlerini kullanma hipotezimizi destekledi. Bu nedenle, yukarıdaki analizlerden aday transfer unigenleri dual BLASTN (E değeri=1e⁻¹⁰) Orobanchaceae'den halka açık sekans veri kümelerinin bir koleksiyonuna karşı (transkriptomTrifizarya çok renkli, Striga hermonthica ve Phelipanche aegyptiaca; NCBI'dan EST ve mRNA dizileri) ve Chenopodiaceae (yeni nesil ve tam uzunlukta transkriptomH. ammodendron; NCBI'dan EST ve mRNA dizileri) (Şekil 1B ve Tablo S12). Sonuç olarak, 7.496 unigenin parazitten kaynaklandığı doğrulandı.C. çöl şerbeti, hedef HC numunelerinde ve kaynak CD'de sırasıyla yüzde 9,66 (7,496/77,615) ve yüzde 13,70 (7,496/54,721) unigene karşılık gelir; ve 2.370 unigen, barındırmaya atandıH. ammodendron, sırasıyla kaynak HC ve hedef CD numunelerindeki unigenlerin yüzde 3,38'ini (2,370/70,119) ve yüzde 4,15'ini (2,370/57,091) oluşturur (Şekil 2D ve 2E, Tablo S7, S12 ve S15). Ortak 2.931 unigen, tam kaynak organizmaya atanamayacak kadar homologdu. Bu sonuçlar, kök parazit bitki arasında yaklaşık on bin (7,496 artı 2,370 = 9,866) unigenin aktarılabileceğini gösterdi.C. çöl şerbetive odunsu bitki konakçısıH. ammodendron. Çok daha fazla (7.496/2,370 = 3.16-kat) mobil RNA'lar parazittendiC. çöl şerbetiana bilgisayardan daha kökenH. ammodendronorijin, bir parazit → konak yönünde mRNA transfer yanlılığını gösterir.

Şekil 2. Gen kaybı analizi ve çoklu hizalama yoluyla mobil RNA'ların daha fazla doğrulanması

(A) Çiçekli bitki genomlarının filogenisi. OrthoFinder, 37 türün tüm protein dizilerinin evrimini analiz etmek ve türler arasında doğrudan homolog genler ve kollateral homolog genler içeren ortogonal grubu bulmak için kullanıldı.

(B) Kayıp ortogrupların yüzdesi. Yarı parazit bitkilerde ve toplam parazit bitkilerde ortogrup delesyonlarının sayısı.

(C) Kayıp unigenlerin yüzdesi. Fotosentez ve metabolizma ile ilgili genlerin oranı gösterildi.

(D) Çoklu hizalamada CD ve HC örnekleri arasındaki ortak ve farklı transkript kümelerini gösteren Venn diyagramları. CD_trans, CD→HC mobil RNA'lar. HC_trans, HC→CD mobil RNA'lar.

(E) Pasta grafikler, CD (dış daire) ve HC (iç daire) transkriptomlarıyla eşlenen mobil okumaların oranlarını gösterir.