Kolon Kanserinin Etkin Tedavisi İçin TLR Agonist ve CD47-SIRP Kontrol Noktası Blokajı ile Lipozom Tabanlı Ko-İmmünoterapi

Soyut:

Antitümör immünitesi, kanser tedavisinin önemli bir bileşenidir ve öncelikle edinsel immün tepkinin başlatılmasında ve şekillendirilmesinde kritik bir rol oynayan doğuştan gelen immün tepkiye aracılık eder. Ortaya çıkan kanıtlar, doğuştan gelen bağışıklık kontrol noktalarını ve CD47 ve Toll benzeri reseptör 7 (TLR7) gibi örüntü tanıma reseptörlerini kanser tedavisi için umut verici terapötik hedefler olarak tanımlamıştır. Yüksek afiniteli bir SIRP varyantı (CV1) ve insan IgG1 antikorunun Fc fragmanını içeren füzyon proteini Fc-CV1'e dayanarak, Fc-CV1'i imikimod (TLR7 agonisti) yüklü lipozomlara bağlayan bir preparattan yararlandık ( CILP'ler) aktif olarak CT26'yı hedeflemek için kullanılır. WT singeneik kolon tümörü modelleri. İn vitro çalışmalar, CILP'lerin, serbest imikimoda kıyasla üstün sürekli salım özellikleri ve hücre alım etkinliği sergilediğini ortaya çıkardı. İn vivo analizler, CILP'lerin tümörlerde daha verimli birikim sergilediğini ve kontrol gruplarına göre daha anlamlı bir tümör baskılama etkisi sergilediğini kanıtladı. Bu immünoterapi preparatı, düşük doz ve düşük toksisite avantajlarına sahipti. Bu sonuçlar, bağışıklık kontrol noktası blokajı (ICB) tedavisi ile bu çalışmada kullanılan Fc-CV1 ve imikimod yüklü lipozom preparasyonu gibi doğal bağışıklık agonistlerinin bir kombinasyonunun, tümör tedavisi için oldukça etkili bir stratejiyi temsil edebileceğini gösterdi.

Cistanche tubulosa'nın faydaları-Antitümör

Anahtar Kelimeler:

imikimod; lipozom; Fc-CV1; immünoterapi; kolon kanseri

1. Giriş

Kanserin küresel görülme sıklığı her geçen yıl artmaya devam etmekte, dünya nüfusunun sağlığına ciddi bir tehdit oluşturmakta ve sağlık sistemlerine ağır bir yük getirmektedir. Dünya Sağlık Örgütü raporuna göre 2020 yılında dünya çapında 19,29 milyon yeni kanser vakası ve 9,96 milyon kanser ölümü meydana geldi[1]. Ancak klinik tanı, cerrahi, radyoterapi ve kemoterapideki sürekli ilerlemeyle birlikte kanser hastalarının genel sağkalımı ve yaşam kalitesi önemli ölçüde iyileşti. Özellikle, 1890'larda Coley aşısıyla ortaya çıkan immünoterapi [2], hem radyoterapiden hem de kemoterapiden önce ortaya çıkmıştır ve son on yılda önemli ilerlemeler kaydederek kanser hastalarına fayda sağlamıştır.

Tümör immünoterapisi, mükemmel biyouyumluluğu ve yüksek özgüllüğü ile tanınmaktadır ve tümör hücrelerini ortadan kaldırmak için immün tepkileri tetikleme kapasitesine sahiptir [3-5]. Tümör immünoterapisi için iki ana strateji, immün güçlendirme ve immün normalleştirmedir [6]. Bağışıklık güçlendirme modelleri temel olarak sitokin tedavisi, tümör tedavi edici aşılar ve monoklonal antikorlardan oluşur. Ücret benzeri reseptörler (TLR'ler), doğuştan gelen bağışıklık sisteminin aktivasyonundaki rollerinden dolayı kanser immünoterapisi için potansiyel hedefler olarak kabul edilir. TLR agonistleri bir immün adjuvan olarak geliştirilmiştir ve çeşitli TLR agonistleri klinik denemelerden geçmektedir [7]. Sırasıyla monofosforil lipid A ve imikimod, TLR4 ve TLR7 agonistleri, klinik uygulama için Gıda ve İlaç İdaresi'nden onay almıştır [7-9]. Bir TLR7 agonisti olan imiquimod [9], immün yanıtları aktive eder ve TLR7'yi tetikleyerek anti-tümör aktivitesini arttırır [10,11]. Bağışıklık normalleştirme stratejisi, kusurlu adaptif tümör bağışıklık tepkisini düzenleyen bağışıklık kontrol noktası blokajı (ICB) ilaçları ile temsil edilir. İlk kontrol noktası inhibitörü ipilimumabın 2011 yılında ABD'de klinik uygulama için onaylanmasından bu yana, PD1/PDL1 inhibitörleri gibi immün kontrol noktası inhibitörleri, kanser immünoterapisinde bir atılım yapmıştır [12-14]. PD1/PDL1'e benzer uyarlanmış bağışıklık kontrol noktaları dışında, SIRP -CD47 gibi bazı doğuştan bağışıklık kontrol noktaları da büyük ilgi çekmiş ve antikor ilacı geliştirmede önemli ilgi alanları haline gelmiştir [15-17].

SIRP -CD47 kontrol noktası ilk olarak 1999'da tanımlandı [18,19]. SIRP, merkezi sinir sistemi nöronlarında [20] ve monositler, makrofajlar, granülositler ve dendritik hücreler dahil olmak üzere miyeloid hücrelerde eksprese edilen bir CD47 reseptörüdür. CD47, neredeyse tüm normal hücrelerde eksprese edilen ve çoğu tümör hücresinde aşırı eksprese edilen "kendini etiketleyen bir moleküldür" [21]. Tümör hücrelerinin yüzeyinde CD47, SIRP'ye bağlanarak, tümör immün kaçışının önemli bir yolu olan makrofaj aracılı fagositozu inhibe eder [22]. Tümör mikroçevresindeki makrofajların fagositozunun, CD47 ve SIRP'nin bağlanması bloke edildiğinde artırılabileceği gösterilmiştir [20-25]. Bu nedenle CD47/SIRP yolunu bloke eden immün kontrol noktası inhibitörleri geliştirilmiş ve kanser tedavisinde uygulanmıştır [26].

cistanche tubulosa-bağışıklık sistemini iyileştirir

Cistanche Enhance Immunity ürünlerini görüntülemek için buraya tıklayın

【Daha fazlasını isteyin】 E-posta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Bu çalışmada kolon kanserini tedavi etmek için imikimod ve füzyon proteini (Fc-CV1) kombinasyonunu kullandık. CV1, CD47 için orijinal proteinden 50000- kat daha yüksek afiniteye sahip olan değiştirilmiş bir insan rekombinant SIRP proteinidir [27]. Fc-CV1, insan IgG1'in CV1 monomeri ve Fc fragmanına dayanan "Deliklere düğmeler" teknolojisi kullanılarak oluşturuldu. İmikimodla ilişkili zayıf terapötik etkinlik ve sistemik toksisite sınırlamalarının üstesinden gelmek için [28,29], etanol enjeksiyon yöntemiyle nanolipozomlar hazırladık. Nanolipozomlar ilaç dağıtımında düşük toksisite özelliklerine sahiptir [30,31]. Daha sonra imikimod, Fc-CV1'i yüzeye konjuge eden lipozomlar içinde kapsüllendi. Son olarak, bu yeni nano preparat, TLR7 agonistlerini aktif olarak tümör dokularına iletebilir ve bir ICB ilacı ve bir TLR agonisti olarak ikili işlevlere sahiptir. CD47+ CT26.WT sinjeneik kolon tümörü modelini tedavi etmek için kullanıldı [32].

2. Sonuçlar ve Tartışma

2.1. LP'lerin (Boş Lipozomlar), ILP'lerin (CD Olmayan47-Hedefli İmiquimod-Kapsüllenmiş Lipozomlar), CLP'lerin (CD47 Hedefli Lipozomlar) ve CILP'lerin (Imiquimod'a Eşleşmiş Fc-CV1 (TLR7 agonisti)-Yüklü Lipozomlar) karakterizasyonu

CILP'ler, etanol enjeksiyonu ve amonyum sülfat gradyan yöntemiyle başarıyla hazırlandı. Şekil 1A, CILP'lerin sentez sürecini göstermektedir. Bir TEM analizi, CILP'lerin küresel ve tek biçimli olduğunu gösterdi (Şekil 1B). Ayrıca DLS sonucu, dört lipozomun parçacık boyutunun tek modlu dağılım olduğunu ortaya çıkardı (Şekil 1C). Bağlanma hızı (BR), Şekil 1D, E'de gösterilen SDS-PAGE ile doğrulandı. Şekil 1D, Fc-CV1'in moleküler ağırlığını ve diyalize edilmiş ve önceden diyaliz edilmiş CILP'lerin göreceli bant parlaklığını gösterir. BR'nin, Image J'nin elektroforetik bantların tarama dansitometrisi (Şekil 1E) aracılığıyla %67,13 ± 37,10 olduğu hesaplandı ve CD47-tümör hücrelerini hedefleme olanağı sağladı.

Şekil 1. (A) CILP'lerin sentezinin şematik gösterimi. (B) CILP'lerin TEM görüntüsü

İmikimodun kapsülleme verimliliğini (EE) tespit etmek için HPLC kullanıldı (Ek Şekil S1). Ek Şekil S1A'da gösterildiği gibi, serbest imikimod önemli bir tek tepe noktası gösterirken, CLP'ler aynı test koşulları altında hiçbir tepe noktası göstermedi (Ek Şekil S1B). Bu nedenle CILP'leri doğrudan test koşulları altında tespit etmek mümkündür. Beklendiği gibi, CILP'lerin diyaliz öncesi ve sonrası tespit değerleri sırasıyla toplam ilaç içeriği ve lipozomlardaki ilaç içeriği olarak kabul edildi (Ek Şekil S1C, D). İmikimodun EE'si %85,44 ± 4,11 olarak hesaplandı. Bildirilen pasif yüklemeli ilaç dağıtım sistemiyle karşılaştırıldığında [33-35], bu çalışma daha yüksek kapsülleme verimliliği ve daha uygun bir hazırlama süreci elde etti.

DLS, LP'lerin çaplarının 111,567 ± 0,655 nm olduğunu gösterirken, CLP'ler, ILP'ler ve CILP'ler 117,467 ± 0,34{{10} ile biraz daha büyük bir boyut gösterdi. } nm, 120,233 ± 0,776 nm ve 13{{30}},033 ± 0,974 nm, sırasıyla (Tablo 1). Bu lipozomların boyutundaki değişiklikler, Fc-CV1 ve imikuimodun modifikasyonuna bağlanabilir. PDI 0,1'e yakındı (Tablo 1), bu ilaç dağıtım araçlarının dağılımlarının oldukça homojen olduğunu gösteriyordu. Ek olarak LP'lerin, CLP'lerin, ILP'lerin ve CILP'lerin zeta potansiyeli değerleri sırasıyla −2,231 ± 0,167 mV, −2,492 ± 0,033 mV, −2,383 ± 0,070 mV ve −2,075 ± 0,070 mV olarak ölçüldü (Tablo 1) , yüzeye konjuge Fc-CV1 ve kapsüllenmiş imikuimodun lipozomların yükü üzerinde çok az etkiye sahip olduğunu öne sürüyor.

Tablo 1. Sırasıyla LP'lerin, CLP'lerin, ILP'lerin ve CILP'lerin çapları, zeta potansiyeli, PDI ve EE'si.

2.2. İn Vitro Hücre Alım Verimliliği

CILP'lerin hücre alım verimliliği, Yüksek İçerikli Görüntüleme Sistemi kullanılarak CT26.WT hücreleri tarafından alınan Cy5'in floresans yoğunluğu aracılığıyla değerlendirildi. Şekil 2'de gösterildiği gibi, serbest Cy5 ve ILP-Cy5 gruplarıyla karşılaştırıldığında CILP'ler-Cy5 grupları, 30 dakikalık inkübasyondan sonra daha güçlü bir hücre alım kapasitesi sergiledi. Bu sonuçlar, Fc-CV1'in, Fc-CV1 reseptörüne spesifik afinite nedeniyle imikimod yüklü lipozomların hücre içi dağıtım kabiliyetini arttırdığını ve bunun da daha güçlü bir anti-tümör etkisine yol açtığını ortaya çıkardı.

Şekil 2. Serbest Cy5, ILPs-Cy5 ve CILPs-Cy5 (kırmızı) ile 0.5 saat kuluçkalandıktan ve DAPI (mavi) ile boyandıktan sonra CT26.WT hücrelerinin görüntüleri. Ölçek çubuğu: 50 µm. (n{{10}}). * p < 0,05; **** p < 0,0001

2.3. Lipozomların Salınım Eğrileri

Serbest imikimodun, ILP'lerin ve CILP'lerin ilaç salım eğrileri, simüle edilmiş bir in vivo ortamda ölçüldü. Şekil 3, serbest imikuimodun 1 saat sonra tamamen salındığını gösterirken ILP'ler ve CILP'ler ile kapsüllenen imikuimodun salım oranının (RR) 12 saatte yalnızca %54,75 ± 4,08 ve %39,70 ± 0,05 olduğunu gösterir. , sırasıyla. Ayrıca ILP'lerde ve CILP'lerde imikimodun yavaş salınımı, lipozomların kontrollü ilaç salma özelliği ile kapatılabilir. ILP'ler ve CILP'lerdeki imikuimodun RR'si 96 saatte anlamlı bir fark göstermedi; bu, "yerleştirme sonrası"nın lipozomların membran stabilitesi üzerinde ihmal edilebilir bir etki sergilediğini gösterir.

şekil 3. PBS'de 37 ◦C'de serbest imiquimod, ILP'ler ve CILP'lerin imiquimod salınım eğrileri. Veriler ortalama ± standart sapma (n=3) olarak sunulmuştur. * p < 0.05, ** p < 0,01

2.4. Sitotoksisite Çalışması

CILP'lerin in vitro sitotoksisitesini incelemek için CT26.WT hücreleri üzerinde CCK{{0}} tahlili yapıldı. Şekil 4'te gösterildiği gibi, düşük konsantrasyonlardaki (0,1-1 µg/mL) CILP'ler sitotoksisite sergilememiştir; bu da aşılama tedavisinin güvenliği ile tutarlıdır. Hücre canlılığı, muhtemelen imikimodun indüklediği ROS ve endoplazmik retikulum aracılı immünojenik hücre ölümü nedeniyle, 5 µg/mL imikimod tedavisinden sonra hafifçe azaldı [36]. Ayrıca CILP'ler, kontrol gruplarına kıyasla hücre canlılığında önemli bir azalmaya yol açar ve bu, imiquimod ve Fc-CV1'in sinerjistik etkisine atfedilir.

Şekil 4. Fc-CV1, imiquimod, CLP'ler, ILP'ler ve CILP'ler ile 24 saat boyunca tedavi edilen hücrelerin canlılığı. Fc-CV1 ve imikimodun konsantrasyonunun her ikisi de 0–10 µg/mL idi. * p < 0,05, ** p < 0,01, ns=anlamlı fark yok

2.5. Biyodağılım Çalışması

Farklı formülasyonların tümörlerde ve ana organlarda dağılımı ve birikmesi, terapötik etkiyi doğrudan etkiler. İntravenöz uygulamayı takiben floresans sinyalleri, 24 saat sonra tümörler ve ana organlardaki farklı formülasyonların dağılımını ve birikimini değerlendirmek için yakın kızılötesi bir canlı deney sistemi kullanılarak izlendi. Şekil 5'te gösterildiği gibi, ILPs-Cy5 ve CILPs-Cy5'in toplam floresans yoğunluğu, serbest Cy5'ten daha yüksekti; bu, lipozomların in vivo olarak uzun dolaşım özelliğine sahip olduğunu gösterir. Ek olarak CILPs-Cy5 tedavi grubunun floresans yoğunluğu, tümör dokusunda en yüksek seviyedeydi; bu, Fc-CV1 ligandlarının tümör hedefleme etkisine atfedilebilir ve dolayısıyla anti-tümör etkisini arttırabilir. Çarpıcı bir şekilde, karaciğer ve dalakların floresans yoğunluğu diğer organlardan daha güçlüydü; bu muhtemelen karaciğer ve böbrekteki retiküloendotelyal sistem (RES) tarafından lipozomların fagositozundan kaynaklanmaktadır [37].

Şekil 5. İntravenöz uygulamadan 24 saat sonra tümörlerde ve ana organlarda Cy5-floresansının dağılımı. Veriler ortalama ± standart sapma (n=3) olarak gösterilmiştir. **** p < 0.0001

2.6. In Vivo Tümör İnhibisyonu Çalışması

Terapötik program (Şekil 6A) ve farklı preparatların etkileri Şekil 6'da gösterilmektedir. PBS ve LP gruplarıyla karşılaştırıldığında diğer tedavi grupları belirli tümör baskılayıcı etkiler sergiledi. Özellikle, CILP'lerle tedaviden sonra tümör hacmi minimum düzeydeydi, bu da CILP'lerin mükemmel bir tümör baskılayıcı etkiye sahip olduğunu gösteriyor (Şekil 6B).

Şekil 6. (A) CT26.WT tümör modelinde anti-kolon kanseri tedavisinin şematik gösterimi. (B) Tedavi süresi boyunca tümör hacminin büyüme eğrileri. (C) 17. günde farklı tedavi gruplarından toplanan tümörün göreceli tümör fotoğrafları ve (D) ağırlığı. (E) 0 gün ile karşılaştırıldığında vücut ağırlığının göreceli vücut ağırlığı oranı. Veriler ortalama ± standart sapma (n=5) olarak sunulmuştur. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001.

Deneyin sonunda fareler kurban edildi ve farklı preparatların terapötik etkinliğini belirlemek için tümörleri çıkarıldı, fotoğrafları çekildi ve tartıldı. Şekil 6C, D'de gösterildiği gibi, CILP'lerin tedavi grubu diğer gruplarla karşılaştırıldığında en küçük ve en hafif tümörlere sahipti; bu da CILP'lerin en büyük tümör baskılayıcı etkilere sahip olduğunu gösteriyor. Tablo 2, CILP'lerin tümör büyümesi inhibisyon oranının %84,35 olarak hesaplandığını göstermektedir. Ek olarak, %84,35'lik tümör baskılama oranı, CLP'ler ve ILP'ler gruplarına göre önemli ölçüde daha yüksekti ve bu, "beni yeme" ekseninin bloke edilmesinin ve bağışıklık tepkisinin aktivasyonunun sinerjistik bir etkisinin olduğu anlamına geliyor . İn vitro eşdeğer preparasyon (2,5-5 µg/mL) ile karşılaştırıldığında, daha yüksek inhibisyon oranı, formülasyonla aktive edilen bağışıklık tepkisi ile yakından ilişkiliydi ve in vitro olarak mevcut olmayan immün kaçış mekanizmasını in vivo olarak bloke etti.

Tablo 2. Çeşitli tedavi gruplarının tümör ağırlığı ve tümör büyümesinin inhibisyonuna (TGI) ilişkin veriler.

2.7. CILP'ler T Hücresi İnfiltrasyonunu ve IFN Salgısını Arttırdı

Tümörlerin bağışıklık hücresi ortamını araştırmak için CILP'ler tarafından indüklenen bağışıklık hücresi, anti-tümör tahlilinin sonunda immünohistokimyasal olarak analiz edildi. CILP gruplarının tümör bölümlerinde CD4+ ve CD8+ T hücreleri arttı (Şekil 7). Fc-CV1 ve imikimod tedavisinin birlikte verilmesi, önemli miktarda CD4+ ve CD8+ T hücresi infiltrasyonuyla sonuçlandı. Ek olarak, CILP tedavisi gören tümörlerde önemli bir IFN salgısı vardı; bunun nedeni, CILP'lerin Toll benzeri reseptör 7'yi tetiklemesi ve bağışıklık tepkisini aktive etmesiydi.

Şekil 7. Fare tümör dokularının immünohistokimyası; pozitif hücreler kahverengiye boyanır. Ölçek çubuğu, 50 µm (n=5).

2.8. CILP'lerin Biyogüvenlik Değerlendirmesi

CILP'lerin aracılık ettiği tedavinin biyogüvenliği de terapötik değerlendirmeye erişim açısından önemli bir endeksti. İn vivo tümör inhibisyonu çalışması sırasında CILP'ler, tedavi süresi boyunca önemli bir kilo kaybına neden olmadı (Şekil 6D). Karaciğer ve böbreğin biyokimyasal parametrelerinin tümü, farelerin standart referans aralığına göre normal aralıktaydı (Tablo 3) ve organ histolojisi, CILP'lerin mükemmel biyogüvenliğe sahip olduğunu gösteren hiçbir önemli değişiklik göstermedi (Şekil 8). Bu bulgular, CILP'lerin kanser tedavisinde güvenli ve etkili bir immünoterapötik ajan olarak potansiyelinin değerlendirilmesinde çok önemlidir.

Tablo 3. Karaciğer ve böbreğin biyokimyasal parametreleri

Şekil 8. Ana organların H&E (hematoksilen ve eozin) boyaması. Ölçek çubuğu, 50 µm (n=3)

3. Malzemeler ve Yöntemler

3.1. Malzemeler

Imiquimod, MedChem Express'ten (Şangay, Çin) satın alındı. Fc-CV1, Eyalet Anahtar Antikor İlaçları ve Hedefli Tedavi Laboratuvarı tarafından sağlandı. Kolesterol, hidrojene lesitin (HSPC), DSPE-PEG2000, DSPE-PEG2000-NHS ve DSPE-PEGCy5, Xi'an Ruixi Biological Technology Co., Ltd.'den (Xi'an, Çin) satın alınmıştır. 40,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), Keygen Biotech'ten (Nanjing, Çin) elde edildi. Amonyum sülfat Sinopharm'dan (Şanghay, Çin) elde edildi. Metanol (kromatografik derece) ve asetonitril (kromatografik derece), Aladdin Reagent Company'den (Şanghay, Çin) satın alındı. Diğer reaktiflerin tümü yerli analitik sınıftadır. Fare kolon kanseri hücre dizisi CT26. WT, Çin Bilim Akademisi Hücre Bankası tarafından sağlandı. Hücreler, %5 CO2 ve %95 havada %10 FBS (Thermo Fisher Scientific, New York, NY, ABD) içeren RPMI 1640 ortamında bir hücre inkübatöründe büyütüldü. 4-6 haftalık dişi BALB/c fareleri, Pengyue Laboratory Animal Breeding Co., Ltd. (Jinan, Çin) tarafından sağlandı.

3.2. Boş Lipozomların Hazırlanması

İlk olarak, 13,455 mg HSPC, 4,3595 mg DSPE-PEG2000 ve 4,7095 mg kolesterol hassas bir şekilde tartıldı ve 0,1 mL etanol (HSPC: DSPE-PEG2000:kolesterol=55.5:) içerisinde çözüldü. 5,05:39,3 molar oran). İkinci olarak, etanol çözeltisi önceden ısıtılmış amonyum sülfat çözeltisine (250 mM, 1 mL, 65 ◦C) bir şırınga aracılığıyla hızlı bir şekilde enjekte edildi ve ardından manyetik karıştırma ile 65 ◦C'de 30 dakika boyunca inkübe edildi. Daha sonra hazırlanan çözelti, polikarbonat membranlardan (Avanti, Alabaster, AL, ABD) art arda ekstrüde edildi; boyut sırasıyla 200 nm, 100 nm ve 50 nm idi. Son olarak ortaya çıkan çözelti, 22,5 mg/mL lipid konsantrasyonuna sahip boş lipozomlardı (LP'ler).

3.3. CD47 Hedefli İmikimod Kapsüllenmiş Lipozomların Hazırlanması

İlk olarak DSPE-PEG2000-NHS, ddH2O (60 ◦C) içinde çözüldü ve daha sonra Fc-CV1 ile karıştırıldı ve oda sıcaklığında 5 saat boyunca çalkalama masasında inkübe edildi (Fc-CV1:DSPEPEG2000- NHS=12:1 molar oran). Fc-CV1 ile DSPE-PEG2000-NHS arasındaki bağlantının kimyasal reaksiyon mekanizması, NHS esterinin Fc-CV1 üzerindeki birincil aminle reaksiyona girmesini ve bir sofra amin bağı konjugatı oluşturmasını içeriyordu. Hazırlanan çözelti LP'lerle orantılı olarak karıştırıldı ve Fc-CV1'in "post yerleştirme" olarak adlandırılan lipozomlara yerleştirilmesi için 60 °C'de 1 saat süreyle inkübe edildi [38]. Karışım oranları, 22,5 mg lipozom başına 2,25 mg Fc-CV1'in modifiye edildiği şeklindeydi. Daha sonra CD47 hedefli lipozomlar (CLP'ler) elde edildi.

Daha sonra, CLP'ler bir diyaliz torbasına (300 kDa) yerleştirildi ve dış sulu fazdaki amonyum sülfat ve kalıntı Fc-CV1'i çıkarmak için HEPES'e (10 mM, pH=7.4) karşı 1 saat süreyle diyaliz edildi. Diyalize alınan CLP'ler, oda sıcaklığında 24 saat boyunca 1 mg ila 7 µmol toplam fosfolipid oranında imikimod çözeltisi (5 mg/mL) ile inkübe edildi ve daha sonra kapsüllenmemiş imikuimod'u ortadan kaldırmak için PBS'ye (300 kDa) karşı üç kez diyaliz edildi; amonyum sülfat gradyan tekniği [39]. Daha sonra CILP'ler elde edildi. Ek olarak, CD47-olmayan hedefli imikimod kapsüllü lipozomlar (ILP'ler) hazırlandı. CLP'ler ve ILP'ler, CILP'lerin kontrolü olarak kabul edildi.

3.4. Karakterizasyon

Bu lipozomların morfolojisi bir transmisyon elektron mikroskobu (TEM, Joel, Tokyo, Japonya) ile fotoğraflandı. Bu lipozomların boyutu, zeta potansiyeli ve polimer dağılım indeksi (PDI), Malvern's Zeta sizer ZSE (Malvern, UK) kullanılarak dinamik ışık saçılımı (DLS) ve elektroforetik ışık saçılımı (ELS) ile belirlendi. Lipozomlara yerleştirilen Fc-CV1'in bağlanma oranı (BR), %15 sodyum lauril sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve Image J yazılımı (Bethesda, MD, ABD) ile ölçüldü. İmikimodun kapsülleme verimliliği (EE), yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC, Thermo Fisher Scientific, New York, NY, ABD) ile tespit edildi.

Cistanche tubulosa'nın faydaları-Antitümör

3.5. İn Vitro Hücre Alımı Çalışması

Bu lipozomların in vitro hücre alımı, CT26'daki Cy5'in kümülatif floresans yoğunluğu ile belirlendi. WT hücreleri. DSPE-PEG-Cy5, sırasıyla CILP'ler ve ILP'ler (DSPE-PEG-Cy5: CILP'ler veya ILP'ler=1:5 kütle oranı) ile 60 ◦C'de 1 saat boyunca inkübe edildi ve ardından floresan lipozomlar CILPs-Cy5 ve ILPs-Cy5 olarak adlandırılanlar elde edildi. CT26.WT hücreleri 96-kuyu plakalarına ekildi ve rastgele üç gruba bölündü (1 x 104 hücre/oyuk, n=3). Hücre birleşmesi %50-70'e ulaştıktan sonra, her grup sırasıyla serbest Cy5, ILPs-Cy5 ve CILPs-Cy5 ile 37 oC'de 30 dakika boyunca inkübe edildi; burada Cy5'in son konsantrasyonları 1 µg/mL idi. 0,1 mL RPMI 1640 ortamı. Daha sonra hücreler, iki kez PBS ile yıkandıktan sonra 15 dakika boyunca %4 paraformaldehit ile immobilize edildi ve daha sonra iki kez PBS ile yıkandıktan sonra 10 μL DAPI (1 μg/μL) ile 10 dakika boyunca boyandı. Son olarak, her hücre grubunun alımı, PBS ile iki kez yıkandıktan sonra Yüksek İçerikli Görüntüleme Sistemi (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, ABD) tarafından kaydedildi.

3.6. Imiquimod Sürüm Çalışması

Çeşitli ilaç yüklü lipozomların salım eğrileri, diyaliz yöntemi (300 kDa) kullanılarak yapıldı ve sonuçlar, serbest imikimod çözeltisiyle karşılaştırıldı. Kısaca, 0,6 mL ILP'ler, CILP'ler ve imikimod çözeltisi diyaliz torbalarına ayrı ayrı paketlendi ve ardından 500 mL PBS çözeltisine (pH=7,4, 37 ◦C) yerleştirildi. Önceden belirlenen zaman aralıklarında (0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48, 72 ve 96 saat) torbalardan eşit hacimde numuneler çıkarıldı ve salım hızı (RR) İmikimod miktarı aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplandı:

burada Sund ve Sd, sırasıyla çeşitli zamanlarda önceden diyaliz edilmiş ve diyaliz edilmiş preparasyonlarda imikuimodun HPLC zirve alanını temsil ediyordu (n=3).

3.7. CILP'lerin Sitotoksisitesi

CT{{0}.WT hücreleri bir 96-kuyu plakasına (1 x 104/kuyu, n=3) ekildi ve birleşme noktasına kadar 100 uL RPMI 1640 ortamında yetiştirildi yüzde 70'e yaklaştı. CILP'lerin sitotoksisitesini belirlemek için, RPMI 1640 ortamı her kuyudan çıkarıldı ve Fc-CV1 ve imikimod konsantrasyonları 0 ila 10 µg/mL arasında değişen karmaşık bir CILP ve RPMI 1640 ortamı çözeltisi ile değiştirildi. Hücreler 24 saat boyunca kompleks bir solüsyonla inkübe edildi. Ek olarak benzer konsantrasyonda Fc-CV1, CLP'ler, imikimod çözeltisi ve ILP'lerle tedavi edilen hücreler kontrol grupları olarak kabul edildi. Hayatta kalan hücreler, 24 saat sonra bir CCK-8 tahlili ile tespit edildi ve tedavi edilmeyen hücrelerin canlılığı %100 olarak kabul edildi.

3.8. Biyodağılım Çalışması

Dokuz Dişi BALB/c faresine deri altından CT26 enjekte edildi. Sağ kanattaki WT hücreleri (5 x 105) ve bu tümör taşıyan fareler rastgele üç gruba (n=3) bölündü. Tümör hacimleri kumpas kullanılarak ölçüldü ve aşağıdaki formülle hesaplandı:

Tümör hacmi 100 mm3'e ulaştığında, serbest Cy5, ILP-Cy5 ve CILPs-Cy5, 0,4 mg/kg Cy5 dozunda intravenöz olarak enjekte edildi. İntravenöz enjeksiyondan yirmi dört saat sonra tümör, kalp, karaciğer, dalak, akciğer ve böbrek çıkarıldı. Tümörlerin ve ana organların floresans sinyalleri IVIS optik görüntüleme sistemi (IVIS Lumina LT III, PerkinElmer, Waltham, MA, ABD) tarafından tespit edildi.

3.9. In Vivo Tümör İnhibisyonu Çalışması

Otuz beş dişi BALB/c faresi rastgele yedi gruba (n=5) ve 5 x 105 CT26'ya bölündü. WT hücreleri her farenin sağ yanına deri altından enjekte edildi. Fare tümör boyutu yaklaşık 100 mm3 olduğunda tedaviye başlandı. PBS, LP'ler, imikimod, Fc-CV1, ILP'ler, CLP'ler ve CILP'ler 0, 4, 8 ve 12. günlerde intravenöz olarak enjekte edildi. İmikimod dozu birinci ve ikinci enjeksiyonlarda 2,5 mg/kg ve 5 mg/kg idi. üçüncü ve dördüncü enjeksiyonlarda. Tüm enjeksiyonlarda Fc-CV1 dozu 5 mg/kg idi. Bu dozda vücuttaki ilaç konsantrasyonu 2,5-5 µg/mL idi ve bu, in vitro bir deneyde hücreler üzerinde sitotoksisiteye neden oldu. Tedavi süresince her gün tümör çapları ve vücut ağırlığı ölçüldü. 17. günde farelerin tümörleri çıkarıldı ve ağırlıkları ölçüldü. Tümör büyümesi inhibisyonu (TGI), aşağıdaki formüle göre hesaplandı:

3.10. İmmünohistokimya

Standart bir protokole göre tümör dokularında CD4, CD8 ve IFN'nin immünohistokimya boyaması yapıldı. Tümör dokularının kesitlerinin parafin bölümünün deparafinize edilmesi ve yeniden nemlendirilmesinden sonra, dokuyu kaplamak için daireye %3 BSA ilave edildi ve daha sonra oda sıcaklığında 30 dakika süreyle kapatıldı. Kesitler CD4, CD8 ve IFN antikorları (Servicebio, Wuhan, Çin) ile gece boyunca 4 °C'de boyandı ve ardından ikincil bir antikorla (HRP etiketli, Servicebio, Wuhan, Çin) oda sıcaklığında 50 dakika boyunca inkübe edildi. PBS ile iki yıkamadan sonra. Sonunda kesitler DAB kromojenik ajanı ile reaksiyona sokulduktan sonra mikroskop altında (Nikon, E100, Tokyo, Japonya) görüntülendi.

cistanche tubulosa-bağışıklık sistemini iyileştirir

3.11. CILP'lerin Biyogüvenlik Değerlendirmesi

Tümör inhibisyonu çalışmasının sonunda tüm tümörler toplandı ve bu tümörlerin ağırlığı ölçüldü. Farelerin kanında alanin transaminaz (ALT), aspartat transaminaz (AST), kreatinin (CREA) ve üre (UREA) dahil olmak üzere biyokimyasal parametreler tespit edildi. Taze tümör dokuları ve ana organlar %4 paraformaldehit ile sabitlendi ve bir gömme makinesi (Wuhan Junjie Electronics, JB-P5, Wuhan, Çin) kullanılarak parafine gömüldü. 5 µm kalınlığındaki doku dilimleri mikrotomdan (Leica Instrument, RM2016, Şanghay, Çin) kesildi ve ardından protokole göre hematoksilen ve eozin (H&E) ile boyandı. Daha sonra boyama dilimleri mikroskop altında gözlemlendi (Nikon, E100, Tokyo, Japonya).

3.12. İstatistiksel analiz

Tüm veriler ortalama ± SD olarak ifade edildi. Gruplar arasındaki anlamlılık düzeyi, Graphpad Prism 8.0.2 kullanılarak tek yönlü ANOVA ile test edildi. p < 0.05 anlamlı bir fark olarak tanımlandı.

3.13. Hayvan Etiği

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler ve tavsiyeler, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımına ilişkin ulusal yönergelere uygun olarak Liaocheng Üniversitesi Bilimsel Araştırma Etiği Özel Komitesi tarafından onaylandı (Onay Kodu: 2022111010; Onay Tarihi: 1 Kasım 2022).

cistanche bitkisi bağışıklık sistemini güçlendiriyor

4. Sonuçlar

Özetle, imikimod kapsüllü CD47-hedefli lipozomlar başarıyla geliştirildi ve in vitro sonuçlar, CILP'lerin daha iyi sürekli bir salınım ve spesifik hedefleme etkisine sahip olduğunu kanıtladı. İn vivo sonuçlar, preparatın tümör hücreleri tarafından etkili bir şekilde alınabildiğini ve bağışıklık tepkisi ve doğuştan gelen bağışıklık kontrol noktası blokajının ikili fonksiyonu nedeniyle mükemmel tümör tedavisi verimliliği ve biyogüvenlik sergilediğini gösterdi. Bu nedenle, Fc-CV1'e bağlanan imikimod kapsüllü lipozomlar, CD47 ekspresyonu tümör tedavisini iyileştirmek için umut verici yeni nanotıp gibi görünmektedir. Doğuştan gelen bağışıklığa dayalı immünoterapi, gelecekte ICB ile sinerjistik kombinasyonlar için tümör büyümesine karşı genel bir strateji olarak hizmet edebilir.

Referanslar

1. Sung, H.; Ferlay, J.; Siegel, RL; Laversanne, M.; Soerjomataram, I.; Cemal, A.; Bray, F. Küresel Kanser İstatistikleri 2020: 185 Ülkedeki 36 Kanser İçin Dünya Çapında Globocan İnsidans ve Ölüm Tahminleri. CA Kanser J. Kliniği. 2021, 71, 209–249. [CrossRef] [PubMed]

2. Carlson, RD; Flickinger, JC, Jr.; Snook, AE Toksinlerden Bahsediyor: Coley'lerden Modern Kanser İmmünoterapisine. Toksinler 2020, 12, 241. [CrossRef] [PubMed]

3. Barbari, C.; Fontaine, T.; Parajuli, P.; Lamichhane, N.; Jakubski, S.; Lamichhane, P.; Deshmukh, RR İmmünoterapiler ve İmmüno-Onkoloji için Kombinasyon Stratejileri. Uluslararası J. Mol. Bilim. 2020, 21, 5009. [CrossRef]

4. Hegde, PS; Chen, DS Kanser İmmünoterapisinde İlk 10 Zorluk. Bağışıklık 2020, 52, 17–35. [ÇaprazRef]

5. Jain, KK Kişiselleştirilmiş İmmüno-Onkoloji. Med. Prens. Pratik yapın. 2021, 30, 1–16. [ÇaprazRef]

6. Sanmamed, MF; Chen, L. Kanser İmmünoterapisinde Bir Paradigma Değişimi: Geliştirmeden Normalleşmeye. Hücre 2018, 175, 313–326. [ÇaprazRef]

7. Hüseyin, WM; Liu, TY; Skwarczynski, M.; Toth, I. Ücret Benzeri Reseptör Agonistleri: Bir Patent İncelemesi (2011–2013). Uzman Görüşü. Orada. Pat. 2014, 24, 453–470. [ÇaprazRef]

8. Chi, H.; Li, C.; Zhao, FS; Zhang, L.; Ng, TB; Jin, G.; Sha, O. Toll Benzeri Reseptör 7 Agonistlerinin Anti-Tümör Aktivitesi. Ön. Farmakol. 2017, 8, 304. [CrossRef] [PubMed]

9. Wang, Y.; Zhang, S.; Li, H.; Wang, H.; Zhang, T.; Hutchinson, MR; Yin, H.; Wang, X. Ücret Benzeri Reseptörlerin Küçük Molekül Modülatörleri. Acc. Kimya Res. 2020, 53, 1046–1055. [CrossRef] [PubMed]

10. Le Mercier, I.; Poujol, D.; Sanlaville, A.; Sisirak, V.; Gobert, M.; Durand, I.; Dubois, B.; Treilleux, I.; Marvel, J.; Vlach, J.; ve ark. İntratümöral Plazmasitoid Dendritik Hücreler Tarafından Tümör Promosyonu Tlr7 Ligand Tedavisi ile Tersine Döndürülür. Kanser Arş. 2013, 73, 4629–4640. [ÇaprazRef]

11. Ma, F.; Zhang, J.; Zhang, J.; Zhang, C. Tlr7 Agonistleri Imiquimod ve Gardiquimod, Farelerde Melanom için DC Tabanlı İmmünoterapiyi Geliştiriyor. Hücre. Mol. İmmünol. 2010, 7, 381–388. [ÇaprazRef]

12. Billan, S.; Kaidar-Şahıs, O.; Gil, Z. İmmünoterapi Çağında İlerleme Sonrası Tedavi. Lancet Oncol. 2020, 21, e463–e476. [CrossRef] [PubMed]

13. Darvin, P.; Toor, SM; Sasidharan Nair, V.; Elkord, E. Bağışıklık Kontrol Noktası İnhibitörleri: Son Gelişmeler ve Potansiyel Biyobelirteçler. Tecrübe. Mol. Med. 2018, 50, 1–11. [CrossRef] [PubMed]

14. Li, B.; Chan, HL; Chen, P. Bağışıklık Kontrol Noktası İnhibitörleri: Temel Bilgiler ve Zorluklar. Curr. Med. Kimya 2019, 26, 3009–3025. [CrossRef] [PubMed]

15. Jia, X.; Yan, B.; Tian, ​​X.; Liu, Q.; Jin, J.; Shi, J.; Hou, Y. Cd47/Sirpalpha Yolu, Kanserin Bağışıklıktan Kaçışına ve İmmünoterapiye Aracılık Ediyor. Uluslararası J. Biol. Bilim. 2021, 17, 3281–3287. [ÇaprazRef]

16. Swoboda, DM; Sallman, DA Miyeloid Malignitelerde Makrofaj Yönlendirmeli Kontrol Noktası İnhibitörlerinin Vaadi. En İyi Uygulama ve Araştırma. Klin. Hematol. 2020, 33, 101221.

17. Lentz, RW; Colton, MD; Mitra, SS; Messersmith, WA Doğuştan Bağışıklık Kontrol Noktası İnhibitörleri: Tıbbi Onkolojide Bir Sonraki Atılım mı? Mol. Kanser Ter. 2021, 20, 961–974. [ÇaprazRef]

18. Jiang, P.; Lagenaur, CF; Narayanan, V. İntegrinle İlişkili Protein, P84 Nöral Yapışma Molekülü için bir Liganddır. J. Biol. Kimya 1999, 274, 559–562. [ÇaprazRef]

19. Seiffert, M.; Cant, C.; Chen, Z.; Rappold, I.; Brugger, W.; Kanz, L.; Brown, EJ; Ullrich, A.; Buhring, HJ İnsan Sinyal Düzenleyici Proteini Normal Hücrelerde Eksprese Edilir, Ancak Lösemik Miyeloid Hücrelerin Alt Gruplarında Eksprese Edilmez ve Karşı Alıcı Cd47'yi İçeren Hücresel Yapışmaya Aracılık Eder. Kan 1999, 94, 3633–3643. [ÇaprazRef]

20. Matlung, HL; Szilagyi, K.; Barclay, NA; van den Berg, TK Kanserde Doğuştan Bağışıklık Kontrol Noktası Olarak Cd47-Sirpalpha Sinyal Ekseni. İmmünol. Rev. 2017, 276, 145–164. [CrossRef] [PubMed]

21. Oldenborg, Pensilvanya; Zheleznyak, A.; Fang, YF; Lagenaur, CF; Gresham, HD; Lindberg, FP Kırmızı Kan Hücreleri Üzerinde Benliğin Belirteci Olarak Cd47'nin Rolü. Bilim 2000, 288, 2051–2054. [ÇaprazRef]

22. Li, Z.; Li, Y.; Gao, J.; Fu, Y.; Hua, P.; Jing, Y.; Cai, M.; Wang, H.; Tong, T. Tümör Bağışıklık Kaçınmasında ve Doğuştan İmmünoterapide Cd47-Sirpalpha Bağışıklık Kontrol Noktasının Rolü. Hayat Bilimi 2021, 273, 119150. [CrossRef]

23. Hayat, SMG; Bianconi, V.; Pirro, M.; Caferi, MR; Hatamipour, M.; Sahebkar, A. Cd47: Bağışıklık Sistemindeki Rolü ve Kanser Tedavisine Uygulanması. Hücre. Onkol. 2020, 43, 19–30. [ÇaprazRef]

24. Huang, Y.; Mayıs.; Gao, P.; Yao, Z. Cd47'yi Hedeflemek: Kanser İmmünoterapisine İlişkin Güncel Çalışmaların Başarıları ve Kaygıları. J. Thorac. Dis. 2017, 9, E168–E174. [ÇaprazRef]

25.Zhang, W.; Huang, Q.; Xiao, W.; Zhao, Y.; Pi, J.; Xu, H.; Zhao, H.; Xu, J.; Evans, CE; Jin, H. Cd47/Sirpalpha Eksenini Hedefleyen Anti-Tümör Tedavilerindeki Gelişmeler. Ön. İmmünol. 2020, 11, 18. [CrossRef] [PubMed]

26. Liu, X.; Pu, Y.; Cron, K.; Deng, L.; Kline, J.; Frazier, WA; Xu, H.; Peng, H.; Fu, YX; Xu, MM Cd47 Blokajı İmmünojenik Tümörlerin T Hücresi Aracılı Tahribatını Tetikler. Nat. Med. 2015, 21, 1209–1215. [CrossRef] [PubMed]

27. Weiskopf, K.; Halka, AM; Ho, CC; Volkmer, JP; Levin, AM; Volkmer, AK; Özkan, E.; Fernhoff, NB; van de Rijn, M.; Weissman, IL; ve ark. Antikanser Antikorlarına İmmünoterapötik Adjuvanlar Olarak Tasarlanmış Sirpalpha Varyantları. Bilim 2013, 341, 88–91. [ÇaprazRef]

28. Xiong, Z.; Ohlfest, JR Topikal Imiquimod, İntrakraniyal Tümörlere Karşı Terapötik ve İmmünomodülatör Etkilere Sahiptir. J. İmmunother. 2011, 34, 264–269. [ÇaprazRef]

29. Kamath, P.; Darwin, E.; Arora, H.; Nouri, K. İmiquimod Tedavisi Üzerine Bir İnceleme ve Bazal Hücreli Karsinomların Optimal Yönetimi Üzerine Tartışma. Klin. Uyuşturucu Araştırması 2018, 38, 883–899. [ÇaprazRef]

30. Liu, Y.; Castro Bravo, KM; Liu, J. Hedefli Lipozomal İlaç Dağıtımı: Nanobilim ve Biyofiziksel Bir Perspektif. Nano ölçekli yatay. 2021, 6, 78–94. [CrossRef] [PubMed]

31. Farjadian, F.; Ghasemi, A.; Gohari, O.; Roointan, A.; Karimi, M.; Hamblin, MR Nanofarmasötikler ve Şu anda Piyasada Bulunan Nanotıplar: Zorluklar ve Fırsatlar. Nanotıp 2019, 14, 93–126. [ÇaprazRef]

32. Zhou, X.; Jiao, L.; Qian, Y.; Dong, S.; Güneş, Y.; Zheng, W.; Zhao, W.; Zhai, W.; Qiu, L.; Wu, Y.; ve ark. Azelnidipinin Kanser İmmün Tedavisinde Cd47/Sirpalpha ve Tigit/Pvr Yollarını Hedefleyen İkili İnhibitör Olarak Yeniden Konumlandırılması. Biyomoleküller 2021, 11, 706. [CrossRef]

33. Ni, K.; Luo, T.; Culbert, A.; Kaufmann, M.; Jiang, X.; Lin, W. Nano Ölçekli Metal-Organik Çerçeve, Makrofajları Modüle Etmek ve Kanser İmmünoterapisini Düzenlemek için Tlr-7 Agonistlerini ve Anti-Cd47 Antikorlarını Birlikte Sağlıyor. J. Am. Kimya Sos. 2020, 142, 12579–12584. [ÇaprazRef]

34. Chen, Q.; Xu, L.; Liang, C.; Wang, C.; Peng, R.; Liu, Z. Etkili Kanser İmmünoterapisi için Kontrol Noktası Blokajıyla Birlikte İmmün Adjuvan Nanopartiküllerle Fototermal Terapi. Nat. İletişim 2016, 7, 13193. [CrossRef] [PubMed]

35. Wei, J.; Uzun, Y.; Guo, R.; Liu, X.; Tang, X.; Rao, J.; Yin, S.; Zhang, Z.; Li, M.; O, Q. Ortotopik ve Metastatik Meme Kanserinin Etkin Tedavisi için İmmün Kontrol Noktası Blokajlı Çok Fonksiyonlu Polimerik Misel Bazlı Kemo-İmmünoterapi. Acta Eczacılık. Günah. B 2019, 9, 819–831. [ÇaprazRef]

36. Huang, GB; Wang, ST; Chang, SH; Chuang, KC; Wang, HY; Kao, JK; Liang, SM; Wu, CY; Kao, SH; Chen, YJ; ve ark. Imiquimod, İmmünojenik Hücre Ölümünü İndükleyerek Antitümör Etkileri Gösterir ve Glikolitik İnhibitör 2-Deoksiglikoz ile Geliştirilir. J. Araştır. Dermatol. 2020, 140, 1771–1783.e6. [CrossRef] [PubMed]

37. Wang, B.; O, X.; Zhang, Z.; Zhao, Y.; Feng, W. Nanomateryallerin Vivo Metabolizması: Kan Dolaşımı ve Organ Temizleme. Acc. Kimya Res. 2013, 46, 761–769. [ÇaprazRef]

38. Akhtari, J.; Rezayat, SM; Teymouri, M.; Alavizadeh, SH; Gheybi, F.; Badiee, A.; Jaafari, Tubo Tümörleri Taşıyan Balb/C Fareleri Kullanılarak Lipozomal Doksorubisine Anti-Her2 Affibody Bağlantısının MR Hedefleme, Biyo Dağıtıcı ve Tümör Büyümesini Engelleyen Karakterizasyonu. Uluslararası J. Pharm. 2016, 505, 89–95. [ÇaprazRef]

39. Woodle, MC; Papahadjopoulos, D. Lipozom Hazırlanması ve Boyut Karakterizasyonu. Yöntemler Enzimol. 1989, 171, 193–217. [PubMed]