Cistanche Deserticola'dan Düşük Moleküler Ağırlıklı Sakaritler Tarafından Makrofaj Aktivasyonu

İletişim: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com

［Özetract

Düşük moleküler ağırlıklı sakkaritlerin immün aktivasyon etkisini ve mekanizmasını araştırmak.cistanche çöl çiçeği(LMSC) fare periton makrofajları üzerinde, RAW264. 7 hücre. RAW264. 7 hücre normal kontrol grubu, LPS pozitif kontrol grubu ve LMSC tedavi gruplarına ayrıldı. RAW264. 7 hücre, 3.91 ila 62.5 g.L － 1 arasında çeşitli LMSC konsantrasyonları ile muamele edildi. Makrofajların fagositik aktivitesini saptamak için nötr kırmızı tahlil kullanıldı. NO kiti ve makrofaj aktivasyonu ile ilişkili protein ekspresyon seviyeleri (TNF- , IL-6, IKK , p-IKK , IκB , p-IκB , NF-κB ve p-NF-κB) kullanılarak NO salınımı tespit edildi. Western blot ile tespit edildi. Sonuçlar, LMSC'nin makrofajlar üzerinde bir aktivasyon etkisine sahip olduğunu gösterdi; RAW264'te NO salınımını önemli ölçüde artırabilir. 7 hücre ve TNF- ve IL-6 sitokinlerinin ekspresyonunu teşvik eder. Ayrıca, LMSC, IKK , IκB ve NF-KB p65'in fosforilasyonunu önemli ölçüde arttırdı. Ayrıca, LMSC'deki ana bileşenlerden biri olan mannitol, makrofajların fagositik aktivitesini önemli ölçüde arttırdı. Bu sonuçlar, LMSC'nin NF-κB sinyal yolunu yukarı doğru düzenleyerek makrofajları aktive edebileceğini ve mannitolün LMSC．'deki ana aktif bileşenlerden biri olabileceğini gösterdi.

［Anahtar Kelimeler］ Düşük moleküler ağırlıklı sakkaritler; Cistanche Deserticola; bağışıklık aktivasyonu; makrofaj; inflamatuar faktör; NF-KB

Cistanche Deserticola YC Macinsine ait bir bitkidir.cistanche çöl çiçeğiYC Ma. Etli sapı ilaç olarak kullanılabilir. Böbrek yangını besleme, özü ve kanı besleme ve bağırsakları nemlendirme işlevlerine sahiptir. "Çöl ginsengi" olarak bilinir. Cistanche'nin kimyasal bileşenleri feniletanoid glikozitler, iridoid glikozitler, şekerler, lignanlar ve diğer birçok türü içerir. Modern farmakolojik çalışmalar, Cistanche'nin nöroproteksiyon, anti-tümör, bağışıklık düzenleme, anti-inflamatuar ve antioksidan gibi birçok biyolojik aktiviteye sahip olduğunu bulmuştur [1]. Çalışmalar, Cistanche ve polisakkaritlerin kaynatılmasının, makrofajların [2-3] fagositik kabiliyetini ve salgılama fonksiyonunu önemli ölçüde iyileştirebileceğini göstermiştir. Bununla birlikte, düşük moleküler ağırlıklı karbonhidratlarının aktivite araştırması hakkında bir rapor bulunmamaktadır. Bu nedenle, bu çalışmada RAW264'ün in vitro kültür sistemi kullanılmıştır. Cistanche düşük moleküler ağırlıklı karbonhidratların immünomodülatör aktivitesini ve ilgili mekanizmalarını keşfetmek için 7 fare peritoneal makrofaj. Bu araştırma, kapsamlı bir anlayış için daha fazla deneysel kanıt sağlayabilir.Cistanche'nin immünomodülatör etkisigelecekte, klinik uygulamasını daha da yönlendirmek için.

Cistanche Deserticola'nın birçok etkisi var, daha fazlasını öğrenmek için buraya tıklayın

1. Malzemeler

RAW264. Çin Tıp Bilimleri Akademisi Hücre Merkezinden 7 hücre satın alındı; fetal sığır serumu (FBS), PAN Biotech, Almanya'dan satın alındı; antibiyotikler ve DMEM ortamı Zhongke Machen Technology Co., Ltd'den satın alındı. Escherichia coli'den Lipopolisakkarit O55:B5 (LPS), Sigma Company, ABD'den satın alındı. Nanjing Jiancheng Biyomühendislik Enstitüsü'nden bir Nitrik oksit (NO) kiti satın alındı. ECL kemilüminesans kiti Thermo Fisher, ABD'den satın alındı; antikor, Cell Signaling Technology, ABD'den satın alındı; Cistanche cistanche toplam glikozitler, cistanche düşük moleküler ağırlıklı şekerler ve cistanche polisakaritler araştırma grubumuz tarafından kendi kendine yapılmıştır. Cistanche toplam glikozitlerin kütle oranı yüzde 78.76 idi. Düşük moleküler ağırlıklı şekerlerin kütle fraksiyonucistanche çöl çiçeği58'dir. Yüzde 00 ve kütle kesricistanche çöl çiçeğipolisakkaritler yüzde 65.24. Tanon-5200Çok jel görüntüleme bölme sistemi, Shanghai Tianneng Technology Co., Ltd.'den satın alındı; Sunrise-Basic mikroplaka okuyucusu TECAN firmasından satın alınmıştır.

2. Yöntem

2. 1 Makrofajların fagositik aktivitesini ölçmek için nötr kırmızı yöntem

Logaritmik büyüme aşamasında fare periton makrofajlarını alın, tripsinizasyondan sonra hücreleri sayın, hücre sayısını 5 × 104 hücre/mL'ye ayarlayın ve bunları bir 96-kuyu hücre kültürü plakasında, 100 μL/kuyuda aşılayın , 37 derecede Yüzde 5 CO2 koşulları altında Kültürlenmiş, hücreler duvara yapıştıktan sonra kültür süpernatantını atın, DMEM ortamını (yüzde 10 FBS artı yüzde 1 P/S), LPS (1 mg·L － 1) ve Cistanche ekleyin cistanche sırasıyla Toplam glikozitler,cistanchetoplam polisakaritler ve Cistanche cistanche düşük moleküler ağırlıklı şekerler (sırasıyla 3.91 ~ 62.5 g·L -1, uygulamadan önce bir filtre membranı ile süzüldü) kültürlendi. 48 saat kültürlendikten sonra, her kuyuya 100 μL yüzde 0.075 nötr kırmızı fizyolojik tuzlu su solüsyonu ekleyin, 4 saat kültürlemeye devam edin, süpernatantı aspire edin, 3 kez PBS ile yıkayın, hücre lizatı (glasiyal asetik asit) ekleyin. -etanol 1:1) 100 μL, 4 derecede 2 saat yerleştirin ve hücreler parçalandıktan sonra absorbansı (A540 nm) ölçün.

2. 2 Hücre süpernatantında NO salım miktarının tespiti

RAW264'ü aşılayın. Bir 48-kuyu plakasındaki 7 hücre (1 x 105 hücre/mL, 500 μL/kuyu), gece boyunca inkübasyondan sonra hücre kültürü ortamını aspire edin, DMEM ortamı ekleyin (yüzde 10 FBS artı yüzde 1 P/S), 500 μL LPS (1 mg·L -1) ve Cistanche cistanche toplam glikozitler, toplam polisakaritler ve düşük moleküler ağırlıklı şekerler (sırasıyla 3,91 ~ 62,5 g·L -1). 24 saatlik indüksiyon kültüründen sonra süpernatan toplandı. NO kiti ile her grubun hücre süpernatanındaki NO konsantrasyonunu belirleyin, talimatları izleyin ve son olarak bir mikroplaka okuyucu ile absorbansı (A570 nm) tespit edin.

2. 3. Batı lekesi

RAW264'ü aşılayın. Bir 6-kuyu plakasında 7 hücre, gece boyunca inkübasyondan sonra hücre kültürü ortamını aspire edin, DMEM ortamı (yüzde 10 FBS artı yüzde 1 P/S), LPS (1 mg·L － 1) ekleyin vecistanchetoplam Polisakaritler ve düşük moleküler ağırlıklı şekerlerin (3.91 ~ 62.5 g·L -1) her biri 2 mL idi ve 24 saatlik indüksiyon kültüründen sonra süpernatan atıldı. Hücreler iki kez PBS ile yıkandı ve atıldı. Tripsinizasyondan sonra hücreler pipetlenir. Santrifüjleyin, süpernatantı çıkarın, 100 μL NP40 Lizis Tamponu ekleyin ve 40 dakika boyunca buz üzerinde parçalayın. Santrifüjden sonra süpernatant alındı ​​ve protein konsantrasyonu BCA yöntemiyle belirlendi ve her bir histonun protein konsantrasyonu eşit olarak ayarlandı. Aynı miktarda protein numunesi alın ve bunları sabit basınç altında yüzde 12'lik SDS-PAGE'de ayırın. Ardından, 1 saat boyunca 350 mA sabit akımla membranı aktarmak için Bio-Rad transfer elektroforez tankını kullanın ve proteini PVDF membranına aktarın (PVDF membranının ön işlemi: metanol içinde ıslatın ve transfer tamponu ile dengeleyin). Oda sıcaklığında 1 saat süreyle yüzde 5 yağsız sütle (yüzde 0.1 Tween-20 içeren TBST ile yapılandırılmış) bloke edildikten sonra, zar 3 kez TBST ile yıkandı ve zar, protein birincil antikor seyreltici içinde 4°C'de inkübe edildi. gecede derece. Membran gün aşırı 3 kez TBST ile yıkandı ve ilgili seyreltici ilave edilerek 1 saat inkübe edildi. Zar, TBST ile 3 kez yıkandı ve şeritler, bir ECL kemilüminesans geliştiricisi ile geliştirildi.

2. 4 veri analizi

Veriler x ± s olarak ifade edilir ve farkın önemi, tek yönlü varyans analizi için GraphPad Prism 6 istatistiksel yazılımı kullanılarak test edilir. P almak<0.01 as="" a="" very="" significant="" difference,="" and=""><0.05 as="" a="" significant="">

3. Sonuçlar

3. 1. Cistanche cistanche düşük moleküler ağırlıklı şekerler, toplam glikozitler ve toplam polisakkaritlerin RAW264'ün fagositik aktivitesi üzerindeki etkileri. 7 hücre

Cistanche'nin kimyasal bileşenleri üzerine yapılan araştırmalar şunu gösteriyor:cistancheesas olarak içerirfeniletanoid glikozitler, iridoid glikozitler ve karbonhidratlar. Bu deneyde, cistanche (fenetil alkol glikozitler ve iridoid glikozitler dahil), düşük moleküler şekerler ve şekerlerin toplam glikozitleri seçilir. Toplam polisakkaritlerin üç aktif bölgesi, RAW264'ün aktivasyonu üzerindeki etkileri açısından araştırıldı. 7 hücre. Hem Cistanche cistanche polisakkariti hem de cistanche düşük moleküler ağırlıklı şeker, RAW264'ün fagositik aktivitesini önemli ölçüde artırabilir. 7 hücre, ancak toplam glikozit uygulama grubunun fagositik aktivitesi önemli ölçüde değişmez. Ek olarak, pozitif kontrol ilacı LPS, RAW264'ün fagositik aktivitesini de önemli ölçüde iyileştirdi. Şekil 1'de gösterildiği gibi 7 hücre. Yukarıdaki sonuçlar, Cistanche'nin düşük moleküler ağırlıklı şekerlerinin ve polisakkaritlerinin RAW264'ü etkinleştirme etkisine sahip olabileceğini düşündürmektedir. 7 hücre.

3. 2. Cistanche toplam glikozitleri, düşük moleküler şekerler ve toplam polisakkaritlerin hücre süpernatanındaki nitrik oksit (NO) içeriği üzerindeki etkisi

Cistanche'nin üç aktif bölgesinin RAW264 üzerindeki aktivasyon etkisini daha fazla araştırmak için. 7 hücrede, farklı ilaçlarla uyarılan hücre süpernatanlarındaki NO içeriği belirlendi. Sonuçlar, LPS grubunda NO salınımının boş kontrol grubundakinden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu gösterdi (P<0.01); the="" release="" of="" no="" in="" the="" 5="" doses="" of="" low="" molecular="" sugar="" and="" polysaccharides="" in="" the="" cistanche="" cistanche="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" control="" group="" (p=""><0.01) ),="" and="" was="" dose-dependent;="" the="" total="" glycosides="" of="">cistancheönemli bir etkisi olmadı. Yukarıdaki sonuçlar, Cistanche'nin hem polisakkaritlerinin hem de düşük moleküler ağırlıklı şekerlerinin, RAW264'ten NO salınımını destekleyebileceğini göstermektedir. 7 hücre. Bunlar arasında, Cistanche'nin düşük moleküler ağırlıklı şekerlerinin etkisi, Şekil 2'de gösterildiği gibi özellikle önemlidir.

3. 3. Cistanche cistanche düşük moleküler ağırlıklı şekerin, RAW264'te TNF- ve IL-6 proteininin ifadesi üzerindeki etkisi. 7 hücre

TNF-, RAW264'ün aktivasyon sürecinde ortaya çıkan önemli bir inflamatuar aracıdır. Diğer sitokinlerin (IL-6 gibi) sentezini ve salınımını teşvik edebilen 7 hücre. Sonuçlar, Cistanche cistanche'ın düşük moleküler ağırlıklı şekerinin uyarılmasından sonra TNF- ve IL-6 ifadesinin önemli ölçüde arttığını gösterdi, bu da Cistanche'nin düşük moleküler ağırlıklı şekerinin TNF ifadesini destekleyebileceğini düşündürdü. - ve RAW264'te IL-6. 7 hücre, böylece hücresel bağışıklığı aktive eder Fagositoz, bkz. Şekil 3.

3. 4. Cistanche cistanche düşük moleküler ağırlıklı şekerin IKK /IκB /NF-κB sinyal yolu üzerindeki düzenleyici etkisi

Cistanche cistanche düşük moleküler ağırlıklı şekerlerin RAW264'ü etkinleştirmedeki potansiyel mekanizmasını araştırmak için. 7 hücre, yazarlar, IKK /IκB /NF-κB klasik sinyal yolu üzerindeki düzenleyici etkilerini araştırdı. Cistanche cistanche düşük moleküler ağırlıklı şeker, NF-κB'nin fosforilasyonunu ve yukarı akış anahtar sinyal proteinleri IKK ve IκB'nin fosforilasyonunu önemli ölçüde artırabilir ve toplam IκB proteininin ekspresyonunu azaltabilir, bu da IKK / üzerinde aktive edici bir etkiye sahip olduğunu gösterir. IκB /NF-KB sinyal yolu. Pozitif kontrol ilacı LPS de benzer bir düzenleyici etkiye sahiptir. Özetle, Cistanche'nin düşük moleküler ağırlıklı şekerleri, IKK /IκB /NF-κB sinyal yolunu aktive edebilir, böylece TNF- ve IL-6 gibi sitokinlerin sentezine ve salınmasına neden olur ve son olarak immüniteye neden olur. RAW264'ün etkinleştirilmesi. 7 hücre, bkz. Şekil 4.

3. 5. Cistanche düşük moleküler ağırlıklı şekerlerde makrofaj aktive edici etkiye sahip aktif bileşenlerin taranması

Laboratuvarımız, içerdiği düşük moleküler şekerleri analiz etmiştir.cistancheerken aşamada ve esas olarak mannitol (yüzde 16,53), sakaroz (yüzde 8,34), fruktoz (yüzde 25,38) ve glikoz (yüzde 7,75) ve diğer bileşenleri içerdiğini buldu. Bu nedenle yazar, yukarıdaki bileşenlerin makrofajlar üzerindeki aktivasyon etkisini taramak için nötr kırmızı yöntemini kullandı. Mannitol, makrofajların fagositik aktivitesini doza bağlı bir şekilde önemli ölçüde artırabilirken, diğer bileşenlerin etkileri önemli değildir. Bu, mannitolün, Şekil 5'te gösterildiği gibi makrofajları aktive etmek için Cistanche cistanche'nin düşük moleküler ağırlıklı şekerlerindeki anahtar aktif bileşenlerden biri olabileceğini düşündürmektedir.

4. Tartışma

Lydanaceae familyasının parazitik bir bitkisi olan Cistanche cistanche'nin immünomodülatör etkileri olduğu bildirilmiştir, bu nedenle immünomodülatör maddeler içermesi gerekir. Bu deneyde yazar, fare peritoneal makrofajlarının farklı saflaştırılmış kısımlarında fagositik aktivitesini taradı.cistancheve Cistanche'nin düşük moleküler ağırlıklı şekerlerinin ve polisakkaritlerinin makrofaj aktivasyonunun etkisine sahip olduğunu, ancak Cistanche'nin toplam glikozitlerinin açık olmadığını buldu. Aynı zamanda yazar, düşük moleküler ağırlıklı şekerlerin makrofajları daha düşük konsantrasyonlarda aktive edebileceğini keşfetti, bu nedenle yazarlarcistanchesonraki araştırmaların odak noktası olarak düşük moleküler ağırlıklı şekerler.

Yazarlar, düşük moleküler ağırlıklı cistanche şekerinin TNF- ve IL-6 sitokinlerinin ekspresyonu üzerindeki etkisini inceleyerek, düşük moleküler ağırlıklı cistanche şekerinin TNF- ve IL-6 ekspresyonunu önemli ölçüde arttırdığını buldular. ayrıca düşük moleküler ağırlıklı cistanche şekerinin fareler üzerinde bir etkisi olduğunu kanıtladı. Peritoneal makrofajların aktive edici bir etkisi vardır. Böylece yazar, potansiyel etki mekanizmasını daha da araştırdı. araştırma yap

Bakteriyel lipopolisakkaritin (LPS), JAK2/STAT3, NF-κB, p38/ERK ve MAPK [4-8] gibi sinyal yolları aracılığıyla fare makrofajlarının ve fare glial hücrelerinin aktivasyonunu indükleyebildiği gösterilmiştir. NF-κB yolu klasik bir yol olarak kabul edilir, dolayısıyla bu yoldaki sinyal proteinleri bu deneyde test edilmiştir. Sonuçlar, Cistanche'nin düşük moleküler ağırlıklı şekerlerinin, NF-κB'nin fosforilasyonunu ve anahtar yukarı akış sinyal proteinleri IKK ve IκB'nin fosforilasyonunu önemli ölçüde artırabildiğini gösterdi;cistancheIKK /IκB /NF-κB sinyal yolu yoluyla fare periton devlerini aktive edebilir. Faj hücreleri, inflamatuar sitokinleri serbest bırakır ve daha sonra hücresel bağışıklığın aktive edilmesinde rol oynar.

Laboratuvarın ilk aşamasında, düşük moleküler ağırlıklı şeker ekstraktının kimyasal bileşimi,cistanche çöl çiçeğisistematik olarak analiz edildi. Düşük moleküler ağırlıklı şekerlerin esas olarak mannitol, sakaroz, fruktoz ve glikoz gibi monomerler içerdiği bulunmuştur. Daha fazla araştırma, mannitolün makrofajların fagositik aktivitesini önemli ölçüde iyileştirebileceğini buldu. Bu nedenle, mannitolün, hücresel bir bağışıklık fonksiyonunu aktive eden düşük moleküler ağırlıklı şekerlerin önemli bir bileşeni olabileceği tahmin edilmektedir.

Özetle, bu çalışma Vitro kültür sistemindeki makrofajı kullandı ve düşük moleküler ağırlıklı şekerlerincistanchemakrofajlar üzerinde önemli bir aktive edici etkiye sahiptir ve fare peritoneal makrofajlarını NF-κB sinyal yolu yoluyla aktive edebilir ve daha sonra bir rol oynayabilir. Düşük moleküler ağırlıklı şekerlerdeki mannitol, makrofajların fagositik aktivitesini aktive etmede önemli bir rol oynayabilir.

Referanslar

[1] Tu Pengfei, Guo Yuhai. Çöl Cistanche ve ev sahibi Tamarix [M] yetiştirme teknikleri. Pekin: Science Press, 2015:31.

[2] Gao Xiaoxia, Chen Jun, Peng Yanli. Farmakolojik etkilerine dair bir araştırmaya genel bakışcistanche çöl çiçeğipolisakkarit [J]. Gıda ve İlaçlar, 2015, 17(2):136.

[3] Wang Xiangyan, Qi Yun, Cai Ruslan, et al. Cistanche Polisakkarit [J]'in makrofaj aktivasyonu. Çin Farmakolojik Bülteni, 2009, 25(6):787.

[4] Liu Zhongyuan, Li Yanping. Bakteriyel lipopolisakkaritin [J] biyolojik aktivitesi ve mekanizması. Medical Science Review, 2010, 16(2):166.

[5] Fu Zhihui, Xu Ling, Huang Jiao, et al. p38 /MAPK yolu üzerinden LPS ve NF-κB Aktivasyonu, RAW264'te HIF-1 ifadesini indükler. 7 hücre [J]. Chongqing Tıp Üniversitesi Dergisi, 2016, 41(10): 1033.

[6] Hao Yutong, Chen Chunhai, Yang Xuesen, et al. JAK2/STAT3 sinyal yolu, mikroglia［J］'nin lipo poli Şeker kaynaklı aktivasyonunda yer alır. Üçüncü Askeri Tıp Üniversitesi Dergisi, 2009, 31(12):1119.

[7] Song Xiaomin, Liao Lixi, Dong Xin, et al. Mulbascum glikozitleri, BV-2 mikroglia'nın lipopolisakarit kaynaklı iltihaplanmasını ve mekanizmasını [J] inhibe eder. Çin Geleneksel Çin Tıbbı Dergisi, 2016, 41(13): 2506.