Soyut

Amaçİlaca dirençli osteosarkom taşıyan çıplak farelerde Cistanche feniletanol glikozitlerinin (CPhG'ler) doğuştan bağışıklık fonksiyonu, tümör büyümesi ve tümör hücresi apoptozu üzerindeki mekanizmasını araştırmak.Yöntemlerİnsan osteosarkomu MG-63 ilaca dirençli hücre çizgisi, gradyan konsantrasyon yöntemiyle oluşturuldu ve ilaca dirençli osteosarkomun çıplak bir fare modeli oluşturuldu (toplam 36 fare, grup başına 6). Model grubuna sondayla normal salin verildi; metotreksat (MTX) grubuna her üç günde bir intraperitoneal MTX (20 mg/kg) enjeksiyonu uygulandı; kombinasyon grubuna her üç günde bir intraperitoneal MTX enjeksiyonu ve günlük orta dozda CPhG'lerin (250 mg/kg) sonda ile verilmesi uygulandı; yüksek, orta ve düşük dozlu CPhG gruplarına sırasıyla yüksek (500 mg/kg), orta (250 mg/kg) ve düşük (125 mg/kg) dozlarda günlük sondayla CPhG verildi. Çıplak farelerde tümör boyutu değişiklikleri gözlemlendi, zaman içindeki ortalama tümör hacminin eğrileri çizildi ve tümör inhibisyon oranı hesaplandı; çıplak farelerde serum IL-2 ve TNF- seviyeleri ELISA ile tespit edildi; tümör hücresi apoptozu akış sitometrisi ile ölçüldü; Apoptozla ilişkili proteinler Bcl-2, Bax'ın ekspresyonunu ve tümör dokularında p-AKT, p-mTOR, p-PI3K ekspresyonunu tespit etmek için Western blot kullanıldı.SonuçlarModel grupla karşılaştırıldığında tüm tedavi gruplarında tümör hacmi ve ağırlığı önemli ölçüde azaldı (P < 0,001); model grubu ve MTX grubuyla karşılaştırıldığında, tüm CPhG gruplarının ve kombinasyon grubunun çıplak farelerinde serum IL-2 ve TNF- seviyeleri önemli ölçüde arttı (P < 0.01); model grubuyla karşılaştırıldığında, tüm tedavi gruplarında Bax ekspresyonu önemli ölçüde yukarı regüle edildi (P < 0.001) ve yüksek ve orta doz CPhG gruplarında ve kombinasyon grubunda Bcl-2 ekspresyonu önemli ölçüde aşağı regüle edildi (P < 0.001); model grubu ve MTX grubuyla karşılaştırıldığında, tüm CPhG gruplarının ve kombinasyon grubunun çıplak farelerinde tümör apoptoz oranı önemli ölçüde artarken, p-AKT, p-mTOR ve p-PI3K seviyeleri önemli ölçüde azaldı (P <0.05).ÇözümCPhG'ler, ilaca dirençli osteosarkom taşıyan çıplak farelerde bağışıklık fonksiyonunu önemli ölçüde iyileştirebilir ve PI3K/AKT/mTOR sinyal yolunu ve Bax ve Bcl-2 apoptotik proteinlerin ekspresyonunu düzenleyerek tümör hücresi apoptozunu destekleyebilir, böylece tümör büyümesini etkili bir şekilde inhibe edebilir.

Anahtar kelimelerosteosarkom;Cistanche feniletanol glikozitler; MG-63; tümör hücreleri; apoptoz; etki mekanizması; PI3K/AKT/mTOR sinyal yolu

 

CISTANCHE TUBULOSA'NIN FAYDALARI

 

 

 

 

 

 

Osteosarkom (OS)son derece yüksek sakatlık ve ölüm oranlarının eşlik ettiği, adölesan primer malign kemik tümörleri arasında en yüksek insidansa sahip, oldukça malign bir primer kemik tümörüdür. Şu anda, yüksek doz metotreksat (MTX) tek başına veya ameliyat sonrası diğer kemoterapötik ajanlarla kombine edilerek OS hastalarının hayatta kalma oranını etkili bir şekilde artırabilir [1]. Ancak bazı OS hastaları ilaç direnci nedeniyle kemoterapiye duyarsızdır ve bu da tümörün ilerlemesine yol açar. Ek olarak, tümör hastalarındaki T lenfosit alt grupları sıklıkla bağışıklık dengesizliği durumundadır ve kemoterapi, kısa vadede bağışıklık bozukluklarını ve bağışıklık baskılanmasını daha da kötüleştirebilir [2]. Çalışmalar, insan bağışıklık tepkilerinin arttırılmasının, OS'nin biyolojik özellikleri açısından OS hastalarının prognozunu iyileştirebileceğini göstermiştir [3]. Kemoterapi direnci, OS hastalarında tedavi başarısızlığına yol açan en yaygın ve tedavi edilemez sorunlardan biridir ve immünsüpresyon da hızlı tümör ilerlemesine neden olan anahtar faktörlerden biridir [4].

Fosfatidilinositol 3-kinaz (PI3K)/protein kinaz B (AKT)/rapamisinin memeli hedefi (mTOR) sinyal yolunun, insan kanserlerindeki en önemli onkojenik yollardan biri olduğu kabul edilir. Bu yol OS'de sıklıkla aşırı aktif hale gelir; bu da OS hücre proliferasyonunu, istilasını, metastazı ve anjiyogenezi tetikleyebilir, apoptozu inhibe edebilir ve ayrıca OS'nin kemoterapötik ilaçlara karşı direncine yol açabilir [5]. Çalışmalar, Cistanche feniletanol glikozitlerinin (CPhG'ler) ana bileşeni olduğunu doğruladı.Cistanche Deserticolahepatoma taşıyan farelerde bağışıklık fonksiyonunu geliştirebilir ve tümör büyümesini engelleyebilir [6].in vitroçalışmalar, CPhG'lerin HepG2 hepatoma hücrelerinin proliferasyonunu önemli ölçüde inhibe edebildiğini ve apoptozunu indükleyebildiğini göstermiştir [7]. Hücre apoptozunun indüklenmesi, mevcut antitümör ilaçlarının ana mekanizmasıdır ve aynı zamanda son yıllarda OS tedavisinde bir araştırma sıcak noktasıdır. Çıplak fareler anatomi, fizyoloji ve biyoloji açısından insanlarla pek çok benzerliğe sahiptir ve nakledilen tümörler için yüksek kabul edilebilirliğe sahiptir, bu da belirli heterolog tümör hücrelerinin ksenotransplantasyonuna izin verir, dolayısıyla tümör modellerinin oluşturulmasında yaygın olarak kullanılır [8-9]. Bu çalışma, ilaca dirençli osteosarkomun çıplak bir fare modelini oluşturmayı, CPhG'lerin bu modelde bağışıklık fonksiyonu ve PI3K/AKT/mTOR yolu üzerindeki etkilerini ve bunun yanı sıra tümör büyümesi ve farmakolojik mekanizma üzerindeki inhibitör etkisini gözlemlemeyi ve böylece klinik tedavi fikirlerinin genişletilmesi ve OS ile ilgili temel araştırmaların yapılması için referanslar sağlamayı amaçlamaktadır.

 

CISTANCHE TUBULOSA'NIN KEMİK BÜYÜMESİ İÇİN FAYDALARI

 

SATILIK CISTANCHE

Wecistanche Destek Hizmeti-Çin'deki en büyük cistanche ihracatçısı:
E-posta:wallence.suen@wecistanche.com
WhatsApp/Tel:+86 15292862950

 

 

1 Malzemeler ve Yöntemler

1.1 Deney Hayvanları

Otuz altı SPF dereceli çıplak fare (6-8 haftalık, 19-25 g ağırlığında), 202367524 numaralı hayvan sertifikasıyla Changzhou Cavens Laboratory Animal Co., Ltd.'den satın alındı. Bu deney, Kuzeybatı Minzu Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Etik Komitesi (Xbmu-3m-202306) tarafından onaylandı.

1.2 Hücre Hattı

MG-63 hücre, Şanghay'daki Çin Bilimler Akademisi'nin Hücre Bankası'ndan satın alındı.

1.3 İlaçlar ve Reaktifler

Fetal sığır serumu, yüksek glikozlu DMEM ortamı, %0,25 Tripsin-EDTA, MTX (Dalian Meilun Bioteknoloji Co., Ltd., parti numaraları sırasıyla PWL001, MA0212, MA0233-1, MB1156-1); CPhG'ler (Shaanxi Senyuan Bioteknoloji Co., Ltd., parti numarası SY20231212605); anti-p-mTOR antikoru, anti-p-PI3K antikoru, anti-p-AKT antikoru, anti-Bcl-2 antikoru, anti-Bax antikoru (sırasıyla Hangzhou Huaan Bioteknoloji Co., Ltd., parti numaraları HA600094, HA721673, ET1607-73, ET1702-53, ET1603-34); TNF- ve IL-2 için ELISA kitleri (Hangzhou Lianke Bioteknoloji Co., Ltd., parti numaraları sırasıyla EK282, EK202).

1.4 Aletler

CT14RD masaüstü yüksek hızlı soğutmalı santrifüj (Shanghai Tianmei Biochemical Instrument Co., Ltd.); SW-CJ-1FD temiz tezgah (Suzhou Purification Co., Ltd.); CO-5AC hücre inkübatörü (Sanyo, Japonya); AE31 floresans ters mikroskop (Xiamen Motic Industrial Group Co., Ltd.); RT-6100 mikroplaka okuyucu (Shenzhen Rayto Life Sciences Co., Ltd.); PowerPoc jel elektroforez sistemi, ChemiDoc™ jel görüntüleme analizörü (Bio-Rad, ABD).

 

1.5 Deneysel Yöntemler

1.5.1 İnsan osteosarkomu MG-63 ilaca dirençli hücre hattının (MG-63/MTX) oluşturulması

MG-63 hücre, %80 hücre birleşimiyle logaritmik büyüme aşamasına kadar kültürlendi. 100 ng/mL MTX içeren önceden hazırlanmış hücre kültürü ortamı eklendi ve ortam 48 saat sonra değiştirildi. Hücreler yeniden %80 birleşme noktasına ulaştığında, aynı konsantrasyonda MTX içeren ortam ilave edildi. Yukarıdaki adımlar, MG-63 osteosarkom hücrelerinin 100 ng/mL MTX içeren ortamda stabil bir şekilde büyümesini sağlamak için tekrarlandı. Daha sonra ortamdaki MTX konsantrasyonu aynı yöntemle sırasıyla 200 ng/mL, 500 ng/mL, 1000 ng/mL, 2000 ng/mL, 5000 ng/mL ve 10000 ng/mL kullanılarak kademeli olarak artırıldı. 5 aylık kültürden sonra, sonraki deneyler için 10000 ng/mL MTX içinde stabil şekilde büyüyen osteosarkom ilaca dirençli hücre çizgisi (MG-63/MTX) seçildi.

 

 

1.5.2 İlaca dirençli osteosarkom taşıyan çıplak fare modelinin oluşturulması

Literatürden yararlanılarak osteosarkom hayvan modeli oluşturulmuştur [10]. MG-63/MTX hücreleri, 4x10⁶/100 μL'lik bir hücre süspansiyonu içerisine hazırlandı ve tümör oluşumunu gözlemlemek için çıplak farelerin koltuk altı bölgesine deri altından 100 μL enjekte edildi.

1.5.3 Hayvanların gruplandırılması ve müdahale

Tümör taşıyan çıplak fareler rastgele olarak model grubuna, MTX grubuna, MTX ile CPhG'ler (MTX-CPhG'ler) grubu, yüksek doz CPhG'ler (CPhGs-H) grubu, orta doz CPhG'ler (CPhGs-M) grubu ve düşük doz CPhG'ler (CPhGs-L) grubuna bölündü; her grupta 6 fare vardı. Modellemeden sonra 6. günde sondayla beslenmeye başlandı. Model grubundaki farelere günlük olarak sondayla 10 μL/g normal salin verildi; MTX grubuna üç günde bir 20 mg/kg MTX intraperitoneal enjeksiyonu uygulandı; MTX-CPhG grubu, her üç günde bir intraperitoneal 20 mg/kg MTX enjeksiyonu ile birlikte günlük 250 mg/kg CPhG sondayla aldı; CPhGs-H grubuna günlük olarak 500 mg/kg CPhG'ler verildi; CPhGs-M grubuna günlük olarak 250 mg/kg CPhG'ler verildi; CPhGs-L grubu günlük olarak 125 mg/kg CPhG'leri sondayla aldı. Tüm çıplak fareler 15 gün boyunca sürekli olarak tedavi edildi.

1.5.4 İlaca dirençli osteosarkom taşıyan çıplak farelerde tümör hacminin ve ağırlığının ölçümü

Her gruptaki çıplak farelerin tümör hacmi gözlemlendi ve kaydedildi ve tümör büyüme eğrileri çizildi. Son uygulamadan yirmi dört saat sonra fareler servikal dislokasyonla öldürüldü, tümörler parçalara ayrıldı ve tartıldı ve tümör inhibisyon oranı hesaplandı. Formüller aşağıdaki gibidir: Tümör hacmi=1/2 (uzun tümör çapı × kısa tümör çapı²) Tümör inhibisyon oranı=[(model grubun ortalama tümör ağırlığı - tedavi grubunun ortalama tümör ağırlığı)/model grubun ortalama tümör ağırlığı] × %100

1.5.5 ELISA ile serum IL-2 ve TNF- seviyelerinin tespiti

Her gruptaki çıplak farelerden serum çıkarıldı ve IL-2 ve TNF-'nin serum seviyeleri, üreticinin talimatlarına göre ELISA ile tespit edildi.

1.5.6 Akış sitometrisi ile tümör hücresi apoptozunun tespiti

Her gruptan tümör dokuları kıyıldı, öğütüldü, filtrelendi, santrifüj edildi ve kırmızı kan hücreleri, santrifüj tüplerinde tek hücreli süspansiyonlar hazırlamak için parçalandı. Hücre konsantrasyonu 1x10⁶/mL'ye ayarlandı, hücreler 100 μL Bağlama Tamponu içinde yeniden süspanse edildi, 5 μL AV-FITC ve PI eklendi, 15 dakika karanlıkta inkübe edildi, santrifüjlendi, yeniden süspanse edildi ve 400 μL Bağlama Tamponu eklendi. Karıştırma sonrasında numuneler akış sitometrisi ile tespit edildi.

1.5.7 p-AKT, p-mTOR, p-PI3K ve apoptotik proteinler Bcl-2, Bax'ın Western blot ile tespiti

Her gruptan tümör dokuları kıyıldı ve bir homojenleştiriciye yerleştirildi, protein lizis tamponu ile parçalandı ve homojenleştirildi. Lizis sonrasında süpernatan, 12000 r/dakikada santrifüjleme yoluyla toplandı. Protein ayrımı için elektroforetik jel hazırlandı, ardından membran transferi ve bloklama yapıldı. Membranlar primer antikorlarla 4 derecede gece boyunca inkübe edildi, yıkandı ve sekonder antikorlarla oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildi. Bir çalkalayıcı üzerinde TBST tamponu ile yıkandıktan sonra geliştirme için ECL ışıldayan solüsyonu ilave edildi. Sabitlemenin ardından jel görüntü analizi yapıldı ve protein bandı gri değerleri Image J yazılımı kullanılarak analiz edildi.

1.6 İstatistiksel Analiz

İstatistiksel analiz GraphPad Prism 7 ve SPSS 25.0 yazılımı kullanılarak yapıldı. Ölçüm verileri ortalama ± standart sapma (x ± s) olarak ifade edildi. Normal dağılıma ve homojen varyansa sahip gruplar arasındaki karşılaştırmalarda tek yönlü ANOVA, normal dağılıma uymayan veriler için ise parametrik olmayan test kullanıldı. Tümör inhibisyon oranını analiz etmek için eşleştirilmiş t testi kullanıldı. P<0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

 

 

Şekil 1. MG-63 ve MG-63/MTX hücrelerinin morfolojik karşılaştırması (×200)

2 Sonuçlar

2.1 Osteosarkom MG-63 ilaca dirençli hücre dizisi (MG-63/MTX)

Orijinal MG-63 hücreleri orta büyüklükte, çoğunlukla iğ şeklinde, bazen düzensiz, büyük çekirdeklere ve berrak nükleollere sahip, yapışık bir şekilde büyüdü (Şekil 1-A). MG-63/MTX hücreleri uzamış, iğsi veya düzensizdi ve bariz psödopodi vardı (Şekil 1-B).

2.2 Her grubun farelerinde tümör büyümesinin karşılaştırılması

Sondayla beslenmenin 6. gününden itibaren tedavi gruplarındaki tümör hacmi, model grubundakilerden önemli ölçüde daha küçüktü. Sondayla beslenmenin 21. gününde, her gruptaki 3 çıplak fareden alınan tümörler karşılaştırıldı (Şekil 2-A). Tüm tedavi gruplarındaki tümör hacmi, model grubundakilerden daha küçüktü (P < 0.001). CPhGs-H, CPhGs-M, CPhGs-L ve MTX-CPhG gruplarındaki tümör hacmi MTX grubundakilerden daha küçüktü (P < 0.001). CPhG grupları arasında artan ilaç konsantrasyonuyla birlikte tümör hacmi giderek azaldı ve model grubuna göre fark daha anlamlı hale geldi (Şekil 2-B). Sonuçlar, CPhG'lerin ilaca dirençli tümör taşıyan farelerde tümör büyümesini önemli ölçüde inhibe edebildiğini ve inhibitör etkinin CPhG konsantrasyonuyla pozitif korelasyon gösterdiğini gösterdi.

Model grubuyla karşılaştırıldığında MTX, CPhGs-H, CPhGs-M, CPhGs-L ve MTX-CPhGs gruplarındaki ortalama tümör ağırlığı önemli ölçüde azaldı (P < 0.001). MTX grubuyla karşılaştırıldığında, CPhGs-H, CPhGs-M, CPhGs-L ve MTX-CPhGs gruplarında tümör inhibisyon oranı anlamlı derecede arttı ve CPhGs-H, CPhGs-M ve CPhGs-L gruplarında tümör inhibisyon oranı artan ilaç konsantrasyonuyla birlikte doza bağlı olarak arttı (Tablo 1).

2.3 İlaca dirençli tümör taşıyan çıplak farelerde CPhG'lerin serum IL-2 ve TNF- düzeyleri üzerindeki etkileri

Model grupla karşılaştırıldığında, MTX grubundaki serum TNF- düzeyi önemli ölçüde arttı (P < 0.05) ve MTX-CPhG grubundaki serum TNF- ve IL-2 düzeyleri önemli ölçüde arttı (P < 0.01). Ayrıca CPhGs-H, CPhGs-M ve CPhGs-L gruplarındaki serum TNF- düzeyleri model gruba göre anlamlı derecede yüksekti (P ​​< 0.001), CPhGs-M grubunda serum IL-2 düzeyi arttı (P < 0.01) ve CPhGs-H ve CPhGs-L gruplarında serum IL-2 düzeyleri daha anlamlı arttı (P < 0.001). MTX grubuyla karşılaştırıldığında, CPhGs-H, CPhGs-M, CPhGs-L ve MTX-CPhGs gruplarında serum TNF- ve IL-2 seviyeleri önemli ölçüde arttı (P < 0,001) (Tablo 2). Bu, CPhG'lerin, TNF- ve IL-2 ekspresyonunu düzenleyerek ilaca dirençli OS tümörü taşıyan farelerde doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonunu geliştirebileceğini göstermektedir.

 

Şekil 2. Müdahale sonrasında çıplak farelerdeki tümör hacimlerinin her gruptaki tümörlerle karşılaştırılması (x ± s, n=3, mm3)

Not: Model grubu; MTX grubu; CPhGs-L grubu; düşük doz Cistanche Deserticola feniletanol toplam glikozitler grubu; CPhGs-M grubu; orta dozda Cistanche Deserticola feniletanol toplam glikozitler grubu; CPhGs-H grubu; yüksek dozda Cistanche Deserticola feniletanol toplam glikozitler grubu; MTX-CPhG grubu; Model grubuyla karşılaştırıldığında, ***P<0.001; compared with the MTX group, ###P<0.001

Tablo 1. Tümör taşıyan çıplak farelerde Cistanche feniletanoid glikozitlerin tümör ağırlığı üzerindeki etkisi (n=3)

Grup	Ortalama tümör ağırlığı (g)	İnhibisyon oranı (%)
Modeli	0.79 ± 0.04	-
MTX	0.49 ± 0.03	35.73 ± 4.61
CPhG'ler-L	0.33 ± 0.01	58.55 ± 4.02
CPhG'ler-M	0.31 ± 0.02	60.50 ± 0.98
CPhG'ler – H	0.28 ± 0.01	64.58 ± 1.77
MTX-CPhG'ler	0.18 ± 0.01	75.77 ± 1.78

*Not: "Model" grubunun kaynak tabloda rapor edilen herhangi bir engelleme oranı yoktur (uzun çizgi olarak gösterilir). İsterseniz önem işaretlerini de ekleyebilirim (örneğin, *, ##, vb.) tam olarak şekildeki gibi dipnot olarak.

2.4 İlaca dirençli tümör taşıyan çıplak farelerde CPhG'lerin tümör hücresi apoptozu üzerindeki etkileri

Model grubuyla karşılaştırıldığında, MTX ve CPhGs-L gruplarında tümör apoptoz oranı önemli ölçüde arttı (P <0.05) ve CPhGs-H, CPhGs-M ve MTX-CPhG gruplarında daha anlamlı arttı (P <0.001). MTX grubuyla karşılaştırıldığında CPhGs-H, CPhGs-M ve MTX-CPhGs gruplarında tümör apoptoz oranı arttı (P < 0,001) (Şekil 3, Tablo 3). Yukarıdaki sonuçlar, CPhG'lerin ilaca dirençli tümör taşıyan çıplak farelerde tümör hücresi apoptozunu destekleyebildiğini göstermektedir.

2.5 CPhG'lerin ilaca dirençli tümör taşıyan çıplak farelerin tümör dokularında p-AKT, p-mTOR ve p-PI3K ekspresyonu üzerindeki etkileri

Model grupla karşılaştırıldığında, MTX grubundaki ilaca dirençli çıplak farelerin tümör dokularında p-AKT ekspresyonu önemli ölçüde azaldı (P < 0.001). MTX-CPhG'ler, CPhGs-H ve CPhGs-M gruplarındaki çıplak farelerin tümör dokularındaki p-AKT, p-mTOR ve p-PI3K ekspresyon seviyeleri önemli ölçüde azaldı (P <0.001), CPhGs-L grubunda p-AKT ekspresyonu azaldı (P <0.01) ve p-mTOR ve p-PI3K ekspresyonu daha anlamlı şekilde azaldı (P <0.001). MTX grubu ile karşılaştırıldığında, MTX-CPhGs ve CPhGs-H gruplarındaki çıplak farelerin tümör dokularındaki p-AKT, p-mTOR ve p-PI3K ekspresyon seviyeleri de önemli ölçüde azaldı (P < 0.001), CPhGs-M grubunda p-AKT ekspresyonu biraz azaldı (P < 0.05), p-mTOR ve p-PI3K ekspresyonu daha anlamlı azaldı (P < 0.001), CPhGs-L grubunda p-AKT ifadesi azaldı (P <0,01) ve p-mTOR ve p-PI3K ifadesi daha anlamlı şekilde azaldı (P <0,001) (Şekil 4-A ila 4-D).

 

Tablo 2. Her gruptaki serum TNF- ve IL-2 ifade seviyeleri (n=3)

Grup	TNF- (pg/mL)	IL-2 (pg/mL)
Modeli	79.90 ± 3.60	28.36 ± 2.35
MTX	93.71 ± 2.86*	28.87 ± 1.60
MTX-CPhG'ler	118.00 ± 3.78***###	40.92 ± 1.54***###
CPhG'ler – H	122.76 ± 2.97***###	45.03 ± 4.95***###
CPhG'ler-M	117.52 ± 3.60***###	41.44 ± 3.87***###
CPhG'ler-L	124.19 ± 8.37***###	44.77 ± 2.31***###

 

Notlar (şekilde gösterildiği gibi):Model=model grubu; MTX=metotreksat grubu; CPhGs–L/M/H=düşük/orta/yüksek doz Cistanche feniletanoid glikozitler grubu; MTX–CPhG'ler=kombinasyon grubu. Önem ve Model: * P<0.05P<0.05P<0.05, ** P<0.01P<0.01P<0.01, *** P<0.001P<0.001P<0.001. Significance vs. MTX: ### P<0.001P<0.001P<0.001.

2.6 İlaca dirençli tümör taşıyan çıplak farelerin tümör dokularında CPhG'lerin Bcl-2 ve Bax ekspresyonu üzerindeki etkileri

Model grupla karşılaştırıldığında, tüm tedavi gruplarında ilaca dirençli tüysüz farelerin tümör dokularında Bax ekspresyonu önemli ölçüde arttı (P < 0.001), MTX grubunda Bcl-2 ekspresyonu arttı (P < 0.05) ve MTX-CPhG'ler, CPhGs-H ve CPhGs-M gruplarında Bcl-2 ekspresyonu önemli ölçüde azaldı (P < 0.001). MTX grubuyla karşılaştırıldığında, CPhGs-H, CPhGs-M, CPhGs-L ve MTX-CPhGs gruplarının tümör dokularında Bcl-2 ekspresyonu önemli ölçüde azaldı (P < 0,001), CPhGs-H ve CPhGs-M gruplarında Bax ekspresyonu önemli ölçüde arttı (P < 0,001) (Şekil 4-A, 4-E, 4-F). Ayrıca CPhG'lerin, Bcl-2 ve Bax ekspresyonunu düzenleyerek ilaca dirençli tümör taşıyan çıplak farelerde tümör hücresi apoptozunu destekleyebileceğini gösterir.

 

 

3 Tartışma

OS hastalarında kemoterapi direnci ve immünsüpresyon, OS'nin klinik tedavisinde darboğazlardır. Şu anda antitümör ilaçlarının ana mekanizması, kemoterapinin etkinliğini doğrudan yansıtan tümör hücresi apoptozunu teşvik etmektir; Öte yandan vücut bağışıklığı, hastaların kemoterapötik ilaçları tolere edebilmesi için güçlü bir garantidir. Bu nedenle, ilaca dirençli OS hücrelerinin apoptozunun etkili bir şekilde nasıl teşvik edileceğini ve kemoterapinin neden olduğu bağışıklık bozukluğunu nasıl azaltacağını araştırmak çok önemlidir.

Şekil 3. Her fare grubundaki tümör doku hücrelerinin apoptoz oranı (n=3, %)

Not: A. Model grubu; B. Metotreksat (MTX) grubu; C. Cistanche Deserticola feniletanol toplam glikozitler (MTX-CPhG'ler) grubu ile birleştirilmiş metotreksat; D. Yüksek doz Cistanche Deserticola feniletanol toplam glikozitler (CPhGs-H) grubu; E. Orta dozda Cistanche Deserticola feniletanol toplam glikozitler (CPhGs-M) grubu; F. Düşük doz Cistanche Deserticola feniletanol toplam glikozitler (CPhGs-L) grubu.

Tablo 3. Her gruptaki tümör doku hücrelerinin apoptoz oranı (n=3)

Grup	Apoptoz oranı (%)
Modeli	14.47 ± 1.10
MTX	19.77 ± 1.32*
MTX-CPhG'ler	29.21 ± 0.77***###
CPhG'ler – H	31.66 ± 1.93***###
CPhG'ler-M	30.13 ± 2.16***###
CPhG'ler-L	22.49 ± 3.02**

Notlar (şekilde gösterildiği gibi):Model=model grubu; MTX=metotreksat grubu; CPhGs–L/M/H=düşük/orta/yüksek doz Cistanche feniletanoid glikozitler grubu; MTX–CPhG'ler=kombinasyon grubu. Önem ve Model: * P<0.05P<0.05P<0.05, ** P<0.01P<0.01P<0.01, *** P<0.001P<0.001P<0.001. Significance vs. MTX: ### P<0.001P<0.001P<0.001.

 

 

Cistanche Deserticolaböbreği ısıtma ve özü yenileme, bağırsakları nemlendirme, oksidasyonu önleme ve bağışıklığı iyileştirme gibi farmakolojik etkilere sahiptir. Zhang ve diğerleri. [11] 1988'de sulu ekstreninCistanche Deserticolafarelerde bağışıklık fonksiyonunu iyileştirebilir ve timus gibi bağışıklık organlarının gelişimini uyarabilir. Sonrakiin vivoçalışmalar ayrıca şunu bulduCistanchepolisakkaritlerin akciğer kanserine ve sarkoma karşı etkileri vardı [12]. Çalışmalar, CPhG'lerin ana bileşeni olduğunu göstermiştir.Cistanche Deserticolaanti-oksidasyon, anti-aging, nöroproteksiyon, bağışıklık güçlendirme, karaciğer koruması ve spermatojenik bozuklukların tedavisi gibi farmakolojik etkilere sahiptir [13] ve ayrıca karaciğer kanseri, akciğer kanseri, meme kanseri ve yumurtalık kanseri dahil olmak üzere çeşitli malign tümörler üzerinde antitümör ve bağışıklık arttırıcı etkiler gösterir [14]. Önceki çalışmamız şunu bulduCistanche Deserticolailaca dirençli OS hücrelerinin apoptozunu teşvik edebilirin vitroMRP1 ve mutant P53 proteinlerinin ekspresyonunu azaltarak [15]. Bu çalışma, tedavi gruplarındaki tümör hacmi ve ağırlığının model gruba göre daha küçük olduğunu ve farklı CPhG konsantrasyon grupları ile MTX-CPhG grubundaki tümör hacminin de MTX grubundakilerden daha küçük olduğunu ve tümör inhibisyon oranının arttığını buldu. Bu, CPhG'lerin ilaca dirençli OS tümör taşıyan farelerde tümör büyümesini önemli ölçüde inhibe edebildiğini ve inhibitör etkinin, temel olarak Hou ve arkadaşlarının çalışmasıyla tutarlı olan CPhG konsantrasyonuyla pozitif korelasyon gösterdiğini gösterir. [16], H22 hepatoma taşıyan farelerde CPhG'lerin deri altı nakledilen tümörler üzerindeki inhibitör etkisi üzerine.

Bağışıklık fonksiyonu, tümör oluşumu ve gelişimi ile yakından ilişkilidir. IL-2, bağışıklık sisteminde, T hücresi çoğalmasını ve farklılaşmasını teşvik ederek vücut bağışıklık fonksiyonunu geliştirebilen ve antitümör aktivitesine sahip bağışıklık hücreleri üretebilen bir tür hücre büyüme faktörüdür [17]. TNF-, tümör hücresi apoptozunu indüklemek, konakçının bağışıklık fonksiyonunu arttırmak, tümör vasküler endotelyal hücreleri üzerinde etki yapmak, vasküler geçirgenliği arttırmak, programlanmış ölümü indüklemek ve ardından tümör kanaması ve nekrozuna neden olmak için reseptörlere bağlanarak antitümör etkileri gösterir [18]. Her grubun farelerinde serum IL-2 ve TNF- ekspresyonunun analizi, farklı CPhG konsantrasyon gruplarındaki ve MTX-CPhG grubundaki tümör taşıyan model farelerde serum TNF- ve IL-2 ekspresyon seviyelerinin önemli ölçüde arttığını gösterdi. Bu, CPhG'lerin, TNF- ve IL-2 ekspresyonunu düzenleyerek ilaca dirençli OS tümörü taşıyan farelerde bağışıklık fonksiyonunu geliştirebileceğini, ilaca dirençli osteosarkom hücrelerinin proliferasyonunu inhibe edebileceğini ve dolayısıyla antitümör etkileri gösterebileceğini düşündürmektedir.

 

Şekil 4. Çıplak fare tümör dokusundaki p-mTOR, p-PI3K, p-AKT, Bcl-2 ve Bax proteinlerinin elektroforez sonuç diyagramı (x ± s, n=3, mm3)

Not: Model, model grubu; MTX, metotreksat grubu; MTX-CPhG'ler, Cistanche Deserticola feniletanol toplam glikozitler grubuyla birleştirilmiş metotreksat; CPhGs-L, düşük doz Cistanche Deserticola feniletanol toplam glikozitler grubu; CPhGs-M, orta dozda Cistanche Deserticola feniletanol toplam glikozitler grubu; CPhGs-H, yüksek doz Cistanche Deserticola feniletanol toplam glikozitler grubu; A. p-mTOR, p-PI3K, p-AKT, Bcl-2 ve Bax proteinlerinin Western Blot sonuçları; B. p-mTOR; C. p-PI3K; D.p-AKT; E. Bcl-2; F.Bax; Model grubuyla karşılaştırıldığında * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001; MTX grubuyla karşılaştırıldığında # P < 0,05, ## P < 0,01, ### P < 0,001.

 

PI3K/AKT/mTOR sinyal yolundaki AKT fosforilasyonu, Bcl-2 ailesi, X'e bağlı apoptoz proteini inhibitörü (XIAP), fare çift dakika 2 (MDM-2) ve Bcl-2 ile ilişkili X proteini (Bax) gibi bir dizi apoptozla ilişkili faktörü doğrudan veya dolaylı olarak düzenleyebilir [19]. Anormal şekilde aktive olan PI3K/AKT/mTOR sinyal yolu, membran taşıyıcıları ABCB1 ve ABCC1'in ekspresyonunu yukarı doğru düzenleyebilir, böylece kemoterapi etkinliğini azaltabilir ve OS'nin kemoterapötik ilaçlara direncine aracılık edebilir [20]. Prosiyanidin B2, kersetin, luteolin ve benzeri çeşitli geleneksel Çin tıbbı monomerleri, PI3K/AKT/mTOR sinyal yolunu inhibe ederek OS hücresi apoptozunu destekleyebilir.Lactarius deliciosuspolisakkaritler [21]. Bu çalışma, MTX'in tek etkisi altında p-AKT protein ekspresyonunun önemli ölçüde azaldığını, p-mTOR ve p-PI3K protein ekspresyonunun ise anlamlı bir fark göstermediğini buldu; bu da MTX'in ilaca dirençli tümör taşıyan çıplak farelerin tümör dokularındaki PI3K/AKT/mTOR sinyal yolu üzerinde çok az etkiye sahip olduğunu gösterdi. Bununla birlikte, farklı CPhG konsantrasyon gruplarında ve MTX-CPhG grubundaki ilaca dirençli OS tümörü taşıyan çıplak farelerin tümör dokularında p-AKT, p-mTOR ve p-PI3K proteinlerinin ekspresyonu, model grubundakilerden daha düşüktü ve aynı zamanda MTX grubundakilerden önemli ölçüde daha düşüktü; bu, CPhG'lerin ilaca dirençli OS hücrelerinde PI3K/AKT/mTOR sinyal yolu üzerinde önemli bir inhibitör etkiye sahip olduğunu ortaya çıkardı. Tümör hücresi apoptozunun akış sitometrisi tespiti, her gruptaki tümör apoptoz oranının ilaç müdahalesinden sonra önemli ölçüde arttığını gösterdi. Bax ve Bcl-2 protein ekspresyonunun tespiti, farklı CPhG konsantrasyon gruplarında ve MTX-CPhG grubundaki ilaca dirençli OS tümör taşıyan çıplak farelerin tümör dokularında Bax ekspresyonunun önemli ölçüde arttığını, MTX-CPhG'ler, CPhGs-H ve CPhGs-M gruplarındaki model farelerin tümör dokularında Bcl-2 ekspresyonunun önemli ölçüde azaldığını gösterdi. Bu, belirli bir CPhG konsantrasyonunun ilaca dirençli OS hücrelerinin apoptozunu destekleyebileceğini göstermektedir.in vivoPI3K/AKT/mTOR sinyal yolunu inhibe ederek, Bcl-2 ifadesini aşağı düzenleyerek ve Bax ifadesini yukarı düzenleyerek.

Sonuç olarak, CPhG'ler ilaca dirençli OS hücrelerinin apoptozunu teşvik edebilir ve tümör büyümesini engelleyebilirin vivove mekanizması, PI3K/AKT/mTOR sinyal yolunun inhibe edilmesi ve Bcl-2 ve Bax ekspresyonunun düzenlenmesiyle sağlanabilir. Bu arada CPhG'ler, TNF- ve IL-2'nin ekspresyon seviyelerini yukarı doğru düzenleyerek ilaca dirençli OS tümörü taşıyan farelerde bağışıklık fonksiyonunu geliştirebilir, böylece sinerjistik antitümör etkileri ortaya çıkabilir. Ancak klinik uygulama potansiyelinin hala daha fazla araştırılması ve araştırılması gerekmektedir.

 

Referanslar

1 Zhang C, Hu J, Zhu K, ve diğerleri. Diz çevresindeki yüksek dereceli osteosarkomda çimentolu megaprotezlerin hayatta kalması, komplikasyonları ve fonksiyonel sonuçları[J]. Int Orthop, 2018, 42(4):927-938. DOI:10.1007/s00264-018-3770-9.2 Liu Q, Xu R, Xu X ve diğerleri. Osteosarkom farelerinin[J] periferik kanındaki T lenfosit alt gruplarının özellikleri ve önemi. Transl Cancer Res, 2022, 11(6):1503-1509. DOI:10.21037/tcr22-264.3 Wu W, Jing DD, Cao L, vd. Osteosarkom[J] için immünoterapinin mevcut durumu ve umutları. Önleme ve Tedaviye Yönelik Kanser Araştırmaları, 2022, 49(7):721-726. DOI:10.3971/j.issn.1000-8578.2022.21.1281.4 Wang CZ, Liu YF, Zhang XQ ve diğerleri. Bağışıklık hücrelerinin[J] anti-tümör etkisini düzenleyen astragalosidⅣ mekanizması üzerine araştırma ilerlemesi. Çin Geleneksel Çin Tıbbı Arşivi, 2024, 42(11):145-149. DOI:10.13193/j.issn.1673-7717.2024.11.029.5 Zhang J, Yu XH, Yan YG ve diğerleri. Osteosarkomda PI3K/Akt sinyali[J]. Clin Chim Acta, 2015, 444:182-192. DOI:10.1016/j.cca.2014.12.041.6 Hu Q, You SP, Liu T, vd. Cistanche'nin[J] karaciğer kanserine karşı etkisi üzerine bir araştırma. Karsinojenez, Teratojenez ve Mutajenez, 2018, 30(3):194-199. DOI:10.3969/j.issn.1004-616x.2018.03.006.7 Qi XX, You SP, He ZX, vd. Cistache Deserticola feniletanol glikozitinin HepG2 hücrelerinin in vitro proliferasyonu ve apoptozu üzerindeki etkisi[J]. Sincan Tıp Üniversitesi Dergisi, 2021, 44(9):1041-1047. DOI:10.3639/j.issn.1009-5551.2021.09.012.8 Panaampon J, Sasamoto K, Kariya R, ve diğerleri. NK hücrelerinden yoksun çıplak farelerin oluşturulması ve bunların insan tümör ksenograftları[J] için uygulanması. Asya Pac J Kanser Önceki, 2021, 22(4):1069-1074. DOI:10.31557/APJCP.2021.22.4.1069.9 Yu CB, Sun P, Zhang XW ve diğerleri. Çıplak farelerde pankreas kanseri ksenograftının hayvan modeli çalışması[J]. Modern Biyotıpta İlerleme, 2012, 12(9):1648-1650. DOI:10.13241/j.cnki.pmb.2012.09.017.10 Xu XR, Wang N, Sun MM, ve diğerleri. Tek noktada akupunktur ile osteosarkom model farelerde farklı etkiler ve akupunktur noktalarının uyumluluğu[J]. Çin Geleneksel Çin Tıbbı ve Eczacılığı Dergisi, 2020, 35(5):2271-2276. DOI:10.13241/j.cnki.pmb.2012.09.017.11 Zhang HQ, Zhang AX, Du NS, ve diğerleri. Cistanche Deserticola'nın farelerin bağışıklık fonksiyonu üzerindeki etkileri[J]. Çin Entegre Geleneksel ve Batı Tıbbı Dergisi, 1988, (12):736-737, 710. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-ZZXJ198812019.htm.12 Zhang HQ, Xu AH, Li DD. Cistanche polisakkaritlerinin tümörler ve tümör taşıyan fareler üzerindeki farmakolojik etkileri[J]. Çin Entegre Geleneksel ve Batı Tıbbı Dergisi, 1997, (S1):155-156, 294. https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=mg_qcPBBapnmsDqon66yc8-zI2VqwJgixywPNSnAl0qboPnZqB4FNuT0bsHSSvs0Dn72KJt__SvxLZeQ8vJicy96v2o -S-Wcbp5ClislhRETaTYT6KGBMKP3_EreGXg3-BH52Itk0rqWiNksajNxzld06uvdfRzCDj-utLfgfANyySxJMHM-g==&uniplatform=NZKPT&language=CHS.13 Xue HY, Jiao CY, Yao J. Cistanches Herba[J] glikozitlerinin farmakolojik etkilerinin mevcut durumu. Çin Klinik Farmakoloji Dergisi, 2018, 34(4):486-488. DOI:10.13699/j.cnki.1001-6821.2018.04.026.14 Tang Y, Wu JQ. Cistanche Deserticola'dan (J) yoksun bırakılan feniletanoid glikozitlerin anti-tümör etkileri. Güncel Biyoteknoloji, 2023, 13(3):399-405. DOI:10.19586/j.2095-2341.2023.0040.15 Xu W, Ding JX, Xie XW ve diğerleri. Cistanche Deserticola'nın kemoterapiye dirençli osteosarkom hücreleri ve MRP1 ve P53[J] ekspresyonu üzerindeki etkisi. Li-shizhen Geleneksel Çin Tıbbı Dergisi, 2021, 32(3):551-554. DOI:10.3969/j.issn.1008-0805.2021.03.11.16 Hou XT, Liu T, Su DQ. Cistanche Deserticola'dan elde edilen feniletanol glikozitlerin H22 tümör taşıyan fareler üzerindeki anti-tümör etkisi[J]. Journal of Toxicology, 2021, 35(3):231-235, 240. DOI:10.16421/j.cnki.1002-3127.2021.03.010.17 Zhang XY, Wang D, Fu CX, ve diğerleri. Tümörlerin interlökin-2[J] ile tedavisine ilişkin araştırma ilerlemesi. Oncology Progress, 2024, 22(6):581-585, 618. DOI:10.11877/j.issn.1672-1535.2024.22.06.01.18 Gao SY, Li D. Tümör nekroz faktörü ve kanserde araştırma ilerlemeleri[J]. Çin Farmakolojik Bülteni, 2020, 36(9):1209-1213. DOI:10.3969/j.issn.1001-1978.2020.09.006.19 Zhou H, Hai GF, Zhang T, ve diğerleri. PI3K/AKT/mTOR yolunun ve kanser tedavisinde hedeflenen inhibitörlerinin araştırma ilerlemesi[J]. Çin İlaçları, 2023, 32(5):127-135. DOI:10.3969/j.issn.1006-4931.2023.05.030.20 Liu YJ, Cao YH, Kuang R. Tümör çoklu ilaç direnci mekanizmasının araştırılması ve geleneksel Çin tıbbı tarafından tersine çevrilmesi[J]. Çin Eczacılık Dergisi, 2024, 59(7):561-570. DOI:10.11669/cpj.2024.07.001.21 Yang HD, Li N, Xie XW ve diğerleri. PI3K/Akt/mTOR sinyal yolunu düzenleyerek osteosarkom tedavisinde Çin tıbbı monomerleri: bir inceleme[J]. Çin Deneysel Geleneksel Tıbbi Formüller Dergisi, 2023, 29(3):254-262. DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.20221527.