Antioksidan Enzimler, Glutatyon Peroksidaz, Tiyol Peroksidaz ve Katalazın Melanin Renk Giderici Aktivitesi

İletişim:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Gyeongchan Jeon¹· Çinhan Kim²· İngiltere Min Cho²· Ee Taek Hwang³· Hyung Seo Hwang⁴· Jiho Min¹

Soyut

Melanin cilt rengini belirleyen en önemli faktördür. Güzellik için ciltte halihazırda üretilen melanin bileşiklerini ayrıştırmak için birçok araştırma çabası yürütülmektedir. Bu araştırma, üç antioksidan enzim olan Glutatyon peroksidaz (GPX), Tiol peroksidaz (TPX) ve Katalaz'ın lizozomal fraksiyondaki melanin rengini azaltma üzerindeki etkilerini araştırdı. Melanin çözeltisi, enzimler ve hidrojen peroksit ile işlendi, ardından 48 saat reaksiyona girdi. GPX ve TPX, melanini renksizleştirdi ve aralarında GPX daha verimliydi, ancak Katalaz etkili değildi. GPX ayrıca B16F10 melanom hücrelerinde melanin üretimini de inhibe etti. Hemen hemen tüm mikroorganizmalarda bulunan GPX, reaktif oksijen türleri ile hücresel savunma mekanizmasında önemli rol oynar. Ek olarak, sitotoksik değildi ama melanin rengini renksizleştirmede önemli ölçüde etkiliydi. Bu nedenle biyolojik ve mikrobiyolojik alanda cilt beyazlatma kozmetiklerinde kullanım olasılığı yüksektir.

Anahtar Kelimeler Melanin · Glutatyon peroksidaz (GPX) · Tiol peroksidaz (TPX) · Katalaz · B16F10 · Lizozom

Cistanche, cilt beyazlatıcı bir bileşendir.

giriiş

Temiz bir yüz, modern insanlar için güzelliğin temel unsurlarından biridir, özellikle Asyalılar beyaz ten konusunda heveslidir. Melanin bileşiği cilt rengini belirlemede en önemli faktördür. Siyah veya kahverengi renge sahip eumelaninden ve pembeden kırmızıya bir renk tonuna neden olan feomelanin'den ayırt edilir [1]. Melanin bileşiği, epidermisin bazal tabakasında bulunan melanosit hücrelerinde tirozin oksidasyonu ile sentezlenir; ve bu pigmentin ciltteki ana rolü, zararlı ultraviyole radyasyonu bloke ederek dermisi korumaktır [2, 3]. Bununla birlikte, ciltte çok fazla melanin bileşiği varsa, cildi koyu ve kirli hale getirir ve melazma gibi hiperpigmentasyona neden olabilir [4].

Bu sorunları çözen cilt bakım kozmetiği ile ilgili birçok çalışma yapılmıştır, ancak şu anda geliştirilen cilt beyazlatıcı kozmetiklerin çoğu, tirozin oksidasyonunu bloke etme veya UV ışını yükseltme gibi çeşitli mekanizmalar yoluyla melanin sentezini engelleme işlevine sahiptir. melanin sentezi [5]. Bu ürünlerin etkili olması uzun zaman alır ve hiperpigmentasyon gibi spesifik semptomlar için etkili değildir [6]. Halihazırda, halihazırda yapılmış olan tipik bir melanin uzaklaştırma yöntemi lazer tedavisidir [7]. Bu tür prosedürler olmadan bu sorunları çözebilecek materyaller geliştirilirse biyolojik ve kozmetik alanda büyük fayda sağlayacaktır.

Önceki araştırmalarda, halihazırda üretilmiş olan melanin bileşiklerinin rengini açmanın bir yolunu bulmaya çalıştık. Lizozom ve melanin korelasyonu ile ilgili araştırma raporları var. Farklılaşmış keratinositlerin, hücresel organellerin miktarını kontrol eden veya peroksizom gibi kusurlu organelleri ortadan kaldıran temel otofaji fonksiyonlarının türüne göre özellikle dışsal melanozomları parçalaması çok olasıdır [8]. Sitoplazmadan lizozomlara giden otofajik yol, insan epidermalkeratinositlerindeki melanozomların parçalanmasında önemli bir rol oynar [9]. Bu veriler, lizozomal spesifik enzimlerin melanin bozulmasına katkıda bulunduğuna dair kanıt sağlar. Daha önce, lizozomal fraksiyonda enzimin melanin renk azaltma aktivitesini bulduk, peroksizomlar ve lizozomlardaki atık materyali ve hücresel artıkları parçalamak için hidrolizatlar içeren bir kompleks [10, 11]. Bu makale, melanin rengini azaltmak için seçilen üç enzim olan Glutatyon peroksidaz, Tiyol peroksidaz, Katalaz'ın lizozomal fraksiyondaki etkilerini inceledi. Bu peroksidazlar, reaktif oksijen türlerinin (ROS) neden olduğu hücre hasarına karşı savunma yapar ve tüm ökaryotlarda bulunur [12].

Reaktif oksijen türleri (ROS), hücrelerdeki normal oksijen metabolizmasının doğal bir yan ürünü olarak oluşur ve çevresel stresle arttırılabilir. Yüksek düzeyde üretilen ROS, hücrelere zarar verebilir. ROSon'un hücre üzerindeki zararlı etkileri şunlardır [12, 13]: DNA veya RNA'nın zarar görmesi, lipitlerdeki çoklu doymamış yağ asitlerinin oksidasyonu, proteinlerdeki amino asitlerin oksidasyonu ve kofaktörlerin oksidasyonu ile spesifik enzimlerin oksidatif deaktivasyonu. Hücreler nötralize olur. ROS, bu tür doku hasarını önlemek için bir antioksidasyon sistemi ile. Bu sistemde, metabolizma tarafından üretilen süperoksideanyon oldukça yıkıcıdır; Süperoksit dismutaz (SOD) tarafından hidrojen peroksite dönüştürülmesine rağmen, hidrojen peroksit hala reaktiftir. Hidrojen peroksit, Katalaz tarafından H2O'ya dönüştürülür ve GPX'in katalizi ile Glutatyon'dan Glutatyon disülfid (GSSG) üretiminde tüketilir. TPX, GPX'e benzer şekilde çalışır [13].

Bu çalışma, üç antioksidan enzim olan GPX, TPX ve Katalaz'ın melanin renk giderici etkisini araştırdı. Sonuç olarak GPX ve TPX, melanin rengini azaltmada etkiliydi. Bunlar arasında, GPX, melanin renk giderici aktivitenin optimum konsantrasyonunda sitotoksisiteye sahip değildi ve melanin sentezini etkili bir şekilde inhibe etti. Bu nedenle, GPX'in sadece antioksidan aktivite değil, lizozomal fraksiyonun melanin renk giderme mekanizmasında önemli bir rol oynadığına dair kanıt sağlar ve tek bir enzim olarak yeni bir beyazlatıcı kozmetik ajan potansiyeli sunar.

Malzemeler ve yöntemler

Peroksidazlar ve Peroksidaz Aktivite Deneyi

Üç peroksidazın (Glutatyon Peroksidaz, Tiyol Peroksidaz ve Katalaz) konsantrasyonu, Bioassay Systems'den satın alınan test kiti (Peroxidase test kiti, D2PD-100, QuantiChromTM) ile belirlendi. Glutatyon peroksidaz 2(GPX2, NBP1-78,824, Novus) ve Tiol peroksidaz (TPX,NBP1-78,805, Novus) Novus'tan satın alındı ​​ve Catalase (9001-05-2, Sigma-Aldrich) ) Sigma-Aldrich'ten satın alındı.

Bu tahlil kiti, H2O2 ve peroksidaz sırasında resorufin oluşturan bir elektron verici boya kullanır. Test oda sıcaklığında (RT) yapıldı ve rengin yoğunluğu 570 nm'de ölçüldü. Peroksidazlar, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yüzde 0,6 hidrojen peroksit ile elektron verici boya ile reaksiyona sokuldu. Reaksiyondan sonra stop reaktifi eklendi ve numunenin absorbansı mikroplaka spektrofotometrisi ile ölçüldü. Aktivite şu şekilde hesaplandı:

Peroksidaz aktivitesi=ÖRNEK −RBLANK × [Resorufin](𝜇M) × Reaksiyon Hacmi(𝜇L)RRESORUFİN −RH2 O t(dk) Numune Hacmi(𝜇L)

(U/L). Bir birim (U) enzim, tahlil koşulları altında dakikada 1 µmol resorufin oluşumunu katalize edecektir. Burada RSAMPLE, RBLANK, RRESORUFIN ve RH2O sırasıyla Numune, Boş Numune, Resorufin ve Suyun absorbansıdır; ve n, numune seyreltme faktörüdür. Bu tahlil için [Resorufin] 50 uM'dir. Reaksiyon Hacmi 100μL'dir ve bu çalışmadaki Numune Hacmi 10 μL'dir.

Glutatyon Peroksidaz (GPX), Tiol Peroksidaz (TPX) ve Katalaz ile Melanin Renk Giderme

Melanin solüsyonu, tirozinin hidrojen peroksit ile oksidasyonu ile hazırlanmış {{0}}.1 mM PBS (Fosfat tamponlu salin, pH: 7.0) ve melanin tozu (Sentetik, Sigma) içerir. Melanin içerikleri, 450 nm'de absorbans ile ölçülmüştür. Melanin konsantrasyonunu belirlemek için, otantik bir sentetik melanin standardından standart bir eğri hazırlandı (R2=0.999, veriler gösterilmemiştir).

Melanin renk giderimini doğrulamak için, 1 mM hidrojen peroksit ile (50 ila 1000) μU/L Peroksidazlar (GPX,TPX, Katalaz) içeren 100 ppm melaninsolüsyon RT'de reaksiyona sokuldu ve her gün ölçüldü. Melanin renk giderme değeri, reaksiyondan sonra melanin konsantrasyonunun başlangıç ​​değerinden çıkarılmasıyla belirlendi.

Cistanche, melanin sentezini inhibe eder.

Hücre kültürü

B16F10 fare melanom hücreleri (KCLB 80008) Korean Cell Line Bank'tan (KCLB, Seul, Kore) satın alındı. Hücreler, 4500 mg/L glukoz, 4 mM l-glutamin, 1 mM sodyum piruvat içeren Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) içinde kültürlendi ve buna yüzde 10 fetal sığır serumu (FBS), 20 mM HEPES, yüzde 1 penisilin, ve hücreler, 37 derecede yüzde 5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir koşulda inkübe edildi. Ortam her 2 günde bir değiştirildi (d) ve hücreler tripsin/EDTA solüsyonu kullanılarak toplandı.

Hücre Canlılığı Testi (MTT Testi)

Glutatyon peroksidazın B16F10 melanom hücresi üzerindeki toksik etkisi, bir numunenin yapışık hücrenin canlılığı üzerindeki etkisini belirlemek için kullanılan genel bir yöntem olan MTT tahlili ile doğrulandı. Bu tahlil, mitokondriyal tarafından formazana indirgenebilen 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolyum bromür (MTT) kullanır. canlı hücredeki enzim. 3 x 103 hücre, bir 96-kuyu plakasında oyuk başına ekildi ve 24 saat inkübe edildi. Daha sonra her kuyucuğa bir numune eklendi ve 72 saat inkübe edildi. Bundan sonra ortam, 0,5 mg/mL MTT içeren bir ortamla değiştirildi ve 2 saat inkübe edildi. Daha sonra, MTT boya reaktifi çıkarıldı ve oluşturulan formazan, 30 dakika boyunca DMSO ile çözündürüldü. Son olarak, formazan konsantrasyonları mikroplaka spektrofotometrisi kullanılarak 570 nm'de ölçüldü. Hücre canlılığı şu şekilde hesaplandı: hücre canlılığı( yüzde )=(Örnek − Ablank)/(Akontrol − Ablank)*100.

hintçe cistanche

Melanin İçeriği Testi

3 x 105 B16F10 hücreleri, bir 6-kuyu plakasında oyuk başına ekildi ve yapışması için 24 saat inkübe edildi. Her kuyunun ortamı, çeşitli konsantrasyonlarda enzim ve 10 nM -MSH içeren biri ile değiştirildi, ardından 72 saat inkübe edildi. Bundan sonra, oyukların tümü DPBS tamponu ile yıkandı ve yüzde 0.5 tripsin/EDTA solüsyonu kullanılarak hasat edildi. Santrifüj yoluyla elde edilen hücre peletleri, yüzde 10 DMSO içeren 200 μL 1 N NaOH ile 80 derecede 1 saat boyunca parçalandı. Son olarak, parçalanan melanin içeriği, 450 nm'de absorbans ile ölçülmüştür. Enzimin melanin üretimi inhibisyon etkinliği, 100 mg/mL arbutin kullanılarak pozitif kontrol ile karşılaştırılarak belirlendi.

Sonuçlar

Glutatyon Peroksidaz (GPX), Tiol Peroksidaz (TPX) ve Katalazın Peroksidaz Aktivitesi

Bu çalışma, melanin bileşiklerinin renksizleştirilmesi için lizozomal fraksiyon tedavisi uygulamasının in vitro ve in vivo olarak genişletilmiş araştırmasıdır. Daha önceki bir çalışmada, Hela hücreleri, S. cerevisiae, tavuk yumurtasından izole edilen lizozomal fraksiyonun melanin rengini azaltma etkisine sahip olduğunu veMelanin renk giderme etkinliği, lizozomlar ve peroksizomlar dahil olmak üzere lizozomal fraksiyonun zara bağlı olmayan mikrozomal fraksiyonunun peroksidaz aktivitesi ile ilişkilendirildi. Peroksidazların melanin renk azaltma etkisini doğrulamak için, Glutatyon peroksidaz (GPX), Tiol peroksidaz (TPX) ve Katalaz olmak üzere üç peroksidaz seçildi. Bu enzimler, hücrelerde reaktif oksijen türlerinin neden olduğu oksidatif stresin azaltılmasında önemli bir rol oynar [14].

Bu enzimlerin aktivitesi, test kiti (Peroxidase test kiti, D2PD-100, QuantiChrom™) ile belirlendi. Bu yöntem, peroksidaz reaksiyonu sırasında pembe bir renk oluşturan elektron verici boyanın oksidasyonuna dayanıyordu [15]. Peroksidaz aktivitesi, aşağıdaki birimler kullanılarak ifade edildi: 1 Birim=1 U =, tahlil koşulları altında dakikada 1 umol resorufin oluşumu. Tablo 1, üç peroksidazın, GPX, TPX ve Katalazın aktivitesini ve konsantrasyonunu özetlemektedir.

Glutatyon Peroksidaz (GPX), Tiol Peroksidaz (TPX) ve Katalazın Melanin Renk Giderme Aktivitesi

Peroksidazların melanin renk giderme etkisini doğrulamak için 100 ppm melanin çözeltisi, 1 mM hidrojen peroksit ve her peroksidazın (50 ila 1000) µU/L konsantrasyonu ile işlendi. Numuneler, 2 gün boyunca oda sıcaklığında reaksiyona sokuldu, ardından başlangıç ​​konsantrasyonu ile karşılaştırıldı. Şekil 1, 48 saat sonra melanin düşüşünü göstermektedir. Şekil 1, TPX ve GPX'in melanin renk giderme aktivitesine sahip olduğuna dair kanıtları göstermektedir. Katalaz, melanin rengini azaltma üzerinde hiçbir etkiye sahip değildi (Şekil 1a). TPX, melanin bileşiklerinin rengini gidermede etkiliydi ve verimlilik, 1 uU/mL'lik bir konsantrasyonda işlendiğinde en iyi oldu (Şekil 1b). GPX ayrıca 0.2 uU/mL konsantrasyonda en iyi olan ve daha yüksek konsantrasyonlarda kademeli olarak azalan bir melanin renk azaltma aktivitesine sahipti (Şekil 1c). Bu değer, yalnızca hidrojen peroksit ile tedavi edilen kontrole kıyasla yüzde 175 oranında geliştirilmiş melanin renk azalmasını temsil eder. GPX, TPX'e kıyasla konsantrasyon ve peroksidaz aktivitesi açısından daha verimliydi. 0.2 µU/mL GPX ve 1 mM hidrojen peroksit tedavisimelanin çözeltisi, 4 gün boyunca 100 ppm melaninin yüzde 13'ünü renksizleştirdi (Şek.2). Bununla birlikte, ne GPX ne de TPX, hidrojen peroksit yokluğunda herhangi bir renk azaltma etkisi göstermedi (veriler gösterilmemiştir).

Tablo1 Glutatyon Peroksidaz 2, Tiol Peroksidaz ve Katalaz enzimlerinin spesifik verileri

Glutatyon Peroksidaz (GPX) ve H2O2on B16F10 Hücre Canlılığının Etkisi

GPX'in B16F10 melanom hücrelerinin canlılığı üzerindeki etkisi, melanin sentezi inhibisyon testinden önce MTT testi ile doğrulandı. Tedavi edilecek uygun hidrojen peroksit konsantrasyonunu bulmak için Sitotoksisite, farklı konsantrasyonlarda 72 saat hidrojen peroksit ile muamele edilerek değerlendirildi. 0.1 mM'lik konsantrasyon altında, H2O2'nin hücrelere 72 saat boyunca hücre toksisitesi olmadı, 1 mM'nin üzerindeki konsantrasyonlarda ise büyük toksisite gözlemlendi. (Şekil 3a). GPX'in hücre sağkalımı üzerindeki etkisi daha sonra sitotoksik olmayan 0.1 mM hidrojen peroksit varlığında değerlendirildi. GPX'in, melaninde renklendirme çalışmalarında etkili olan 0,5 μU/mL'lik konsantrasyonun altındaki B16F10 hücrelerine sitotoksisitesi yoktu (Şekil 3b).

1Yalnızca hidrojen peroksit tedavisine kıyasla göreceli melanin rengi azalması.

B16F10 Melanom Hücrelerinde Glutatyon Peroksidaz (GPX) ve H2O2on Melanin Sentezinin Etkisi

Melanin dekolorizasyonunda en etkili olan GPX'in mel-anositlerde melanin sentezi üzerindeki etkisini araştırdık. Şekil 4, 72 saat boyunca her numune ile tedavi edilen B16F10melanom hücrelerindeki melanin içeriğini göstermektedir. 0,05 μU/mL GPX ve 0,1 mM H2O2 ile tedavi, kontrole kıyasla yüzde 43 ile en fazla melanogenez inhibisyonunu indükledi (sadece -MSH ile tedavi). Bu, pozitif kontrolden (Arbutin ve -MSH ile tedavi) yüzde 153 daha yüksekti ve enzimsiz hidrojen peroksitten yüzde 22 daha yüksekti, GPX tedavisi ise hidrojen peroksit yokluğunda dramatik melanin azalması göstermedi. (veri gösterilemiyor). Sonuç olarak, GPX, melanin bileşiklerinin üretimini engelledi, ancak hücrelerdeki melanin sentezi, GPX tarafından hidrojen peroksitten daha fazla etkilendi.

Tartışma

Bu çalışmada, araştırmacılarımız hücrelerde oksidatif stresi azaltan antioksidan enzimler olan GPX, TPX ve Katalaz'ın optimal konsantrasyonu ve melanin bileşiklerinin renk giderimi üzerindeki etkisini bulmuşlardır. Sentezlenmiş melanin bileşikleri kullanılarak yapılan hücre dışı deneylerin bir sonucu olarak, GPX ve TPX, melanin renk giderici bir etkiye sahiptir, ancak Katalaz yoktur. Bazı mantarlarda lakkaz, lignin peroksidaz gibi lignin parçalayıcı enzimlerin hidrojen peroksit varlığında melanini parçalayabildiğine dair raporlar vardır [16-18]. Bu çalışma ile tüm ökaryotlarda bulunan antioksidanenzimlerin ve lignin bozucu enzimler değil, melanin renk giderici aktiviteye sahiptir. GPX ve TPX, hidrojen peroksit varlığında melanin rengini de azaltabilse de, bu enzimler, lizozomal fraksiyonun melanin renk giderme mekanizmasının ana bileşeni olarak hareket etme olasılığına sahiptir.

Melanin rengini in vitro azaltmada en etkili olan GPX, melanin sentezi üzerindeki etkisini belirlemek için B16F10 melanom hücreleri ile tedavi edildi. B16F10 melanom hücrelerinde, GPX, melanin bileşiklerinin renklerinin giderilmesinde etkili olan konsantrasyonlarda sitotoksik değildi ve birlikte işlenen hidrojen peroksit konsantrasyonu, toksisite olmaksızın 0.1 mM idi. Hidrojen peroksit tedavisi melanin sentezini büyük ölçüde engelledi ve GPX ile çalışırken ilacın konsantrasyon bağımlılığı yokken etkinlik daha iyiydi. Hidrojen peroksit enzimler tarafından hızla tüketildiğinden, tedavi edilecek enzim konsantrasyonu ne kadar yüksek olursa, melanin sentezinin hidrojenperoksit tarafından inhibisyonunun o kadar düşük olduğu şeklinde yorumlanabilir. GPX tedavisinin hidrojen peroksit yokluğunda dramatik melanin azalması göstermediği gerçeği de bu görüşü desteklemektedir (veriler gösterilmemiştir). Sonuç olarak, GPX, melanin bileşiklerinin üretimini engelledi, ancak hücrelerdeki melanin sentezi, GPX tarafından hidrojen peroksitten daha fazla etkilendi. Bu sonuçlar, antioksidan enzimlerin, melanozomları sindiren otofaji mekanizmalarında melanin bozulmasını indüklediğini göstermektedir.

cistanche tabletleri

Daha fazla bilgi için lütfen buraya tıklayın.

Çözüm

Çalışmamız, Glutatyon peroksidaz (GPX) ve Tiol peroksidazın (TPX) melanin renk bozulmasına katkıda bulunduğunu ve GPX'in melanin sentezini etkili bir şekilde inhibe ettiğini göstermektedir. Sonuçlar, antioksidan enzimlerin, melanozomları sindiren otofaji mekanizmalarında melanin bozulmasını indüklediği hipotezini desteklemektedir. Kesin bir sonuca varmak için deri hücreleri, keratinosit ve melanositlerde melanozom sindiriminin mekanizması üzerine çalışma yapılması gerekebilir.