Murin Aplastik Anemisinde Angelica Sinensis Polisakkarit ile Mitokondriyal Membran Stabilizasyonu

İletişim: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com

Soyut

Murin aplastik anemi (AA)ICR farelerinde Angelica Sinensis polisakkarit (ASP) ile mitokondriyal membran stabilizasyonunun mekanizmasını araştırmak için rastgele kontrollere ayrıldı. AA ve ASP ile tedavi edilen gruplar AA grubu fareler, 60Co Y ve intraperitoneal siklofosfamid ve kloramfenikol enjeksiyonları ile tedavi edildi. Kontrol hayvanları, kurşun koruyucu ışınlama ve tuzlu su enjeksiyonu ile tedavi edildi. Tedavi edilen AA fareleri, 2 hafta boyunca ASP ile beslendi. Kemik iliğinin mitokondriyal ultra yapısı, transmisyon elektron mikroskobu ile gözlemlendi ve kemik iliği çekirdekli hücrelerin (BMNC) transmembran potansiyeli, floresan spektrofotometrisi ile incelendi. Besiyerinin Cox ve MDH içerikleri de üç grupta incelendi, Kemik iliğindeki BMNC'nin mitokondriyal sayısı ve transmembran potansiyeli, AA grubunda kontrol grubuna kıyasla azaldı, ancak ASP ile tedavi edilen grupta diğerlerine kıyasla arttı. AA grubu. ASP ile tedavi edilen grupta tam mitokondriyal bölünme önemli ölçüde gecikti(P< 0.05)="" as="" compared="" to="" the="" aa="" group.="" we="" conclude="" that="" asp="" might="" improve="" mitochondrial="" membrane="" stabilization,="" and="" suppress="" the="" downregulation="" of="" transmembrane="" potential="" and="" apoptosis="" of="" bmnc="" in="">

Anahtar Kelimeler: aplastik anemi, Angelica Sinensis polisakkarit, mitokondri, membran potansiyeli, ICR fareleri

cistanche özü: kemik oluşumunu artırır ve kemik yoğunluğunu artırır

Arka fon

Aplastik anemi (AA), kemik iliği ve ilişkili kan kök hücrelerinin hasar gördüğü ve kırmızı kan hücreleri, beyaz kan hücreleri ve trombosit eksikliğine neden olduğu bir kan hastalığıdır. Bu eksiklikler ayrı ayrı sırasıyla anemi, lökopeni ve trombositopeni olarak bilinir ve topluca pansitopeni olarak bilinir. Kimyasallara, ilaçlara, radyasyona, radyoaktif maddelere, radyasyon üreten cihazlara, enfeksiyona maruz kalma. bağışıklık hastalığı, kalıtım (vakaların yüzde 50'sinde) ve bilinmeyen etiyoloji de AA gelişimine yol açabilir.

Mitokondri, besin moleküllerinden (substratlardan) sistematik olarak enerji çekerek adenozin trifosfat (ATP) ürettikleri için "hücrenin güç santralleri" olarak kabul edilir[1]. Ayrıca mtDNA, koruyucu histonlardan ve etkin bir DNA onarım sisteminden yoksun olduğu için yüksek mutasyon oranıyla kopyalanır. mtDNA'daki mutasyonlar, edinilmiş sideroblastik anemi, miyelodisplastik sendromlar ve edinilmiş AA [2-4] gibi hematolojik hastalıklarla ilişkilidir. Önceki çalışmamız 5], mutasyonların neden olduğu mitokondriyal solunum zincirinin işlevsel bozulmasının, AA hastalarında hematopoietik başarısızlıkta rol oynayabileceğini gösterdi. Son dönem hücre ölümünün (apoptotik, nekrotik, otofajik veya mitotik) morfolojik özelliklerinden bağımsız olarak, mitokondriyal membran geçirgenliği (MMP) sıklıkla hayatta kalma ve ölüm arasındaki belirleyici olaydır [6]

Geleneksel Çin tıbbına göre, Angelica Sinensis kanı birleştirmeye ve dolaşımını artırmaya yardımcı olur [7]. Son çalışmalar, Angelica Sinensis özlerinin anti-oksidatif ve nöroprotektif etkilere sahip olduğunu göstermiştir [8,9]. Bununla birlikte, ASP'nin anti-oksidatif işlevi belirsizliğini koruyor. Bu çalışma, mitokondriyal lizis zaman eğrisini ve ASP'nin AA'da mitokondriyal membran stabilize edici etkisini kullanarak erken hücre hasarını inceledi.

cistanche takviyesi kemik yoğunluğunu artırır ve kemik oluşumunu artırır

Malzemeler ve yöntemler

Hayvanların gruplandırılması

6-8 haftalık, 18-22 g ağırlığındaki sağlıklı ICR erkek fareler, Shandong Üniversitesi (Çin) Deney Hayvanları Merkezi tarafından sağlandı. Hayvanlar, yiyecek ve suya ücretsiz erişimi olan sıcak ve sessiz bir ortamda barındırıldı. ve deneylere başlamadan önce bir hafta boyunca iklime alıştırıldı.

Fareler rastgele üç gruba ayrıldı: sırasıyla normal grup, AA grubu ve tedavi edilen grup. Aplastik anemi modeli daha önce tarif edildiği gibi oluşturuldu [10].

Kısaca, fareler 2.0Gy 60Coy ile ışınlandı ve ardından sonraki üç gün boyunca günlük 40 mg/kg/gün siklofosfamid ve 50 mg/kg/gün kloramfenikol intraperitoneal enjeksiyonları ile tedavi edildi. Tedavi edilen grup intragastrik olarak ASP (Çin Tıp Sözlüğüne göre 200 mg/kg/gün) ile beslendi. Kontrol grubu ve AA grubu fareler, fizyolojik tuzlu su (10 ml/kg/gün) destekli diyetle intragastrik olarak beslendi. Ayrıca, tüm fareler, çalışma sırasında standart bir diyet aldı. ASP veya fizyolojik tuzlu su ile 2 hafta tedaviden sonra, fareler servikal dislokasyon ile öldürüldü.

hematolojik muayene

Üç gruptan kuyruk kanı örnekleri sırasıyla birinci ve on dördüncü günlerde toplandı. Periferik kan örneklerinde WBC ve trombosit sayımı yapıldı ve Hb seviyeleri belirlendi. Deneylerin tamamlanmasının ardından, fareler öldürüldü ve kemik iliği çekirdekli hücrelerin (BMNC'ler) farklı sayımı için femur yaymaları hazırlandı (Şekil 1).

transmisyon elektron mikroskobu

Femur iliği bulaşmış ve ultra ince kesitler halinde dilimlenmiştir. Femur iliğindeki hematopoietik hücrelerin mitokondrileri, 50 görüş alanı altında transmisyon elektron mikroskobu (JEM-2000EX, Japonya) ile analiz edildi ve sayıldı.

Mitokondriyal lizis zaman eğrisi

Mitokondri, üreticinin mitokondri izolasyon kiti (Pierce Biotechnology Inc., ABD) protokolüne göre murin BMNC'lerinden ekstre edildi. Monoamin oksidaz (MAO) konsantrasyonu, mitokondri konsantrasyonunu belirtir ve farklı zaman noktalarında (30 dakika aralıklarla) 12 saat içinde 20 serum kültüründen 200 U/ml mitokondriyal süspansiyonlar kullanılarak belirlendi. Ortamdaki sitokrom oksidaz (Cox) ve malat dehidrojenaz (MDH) içerikleri de belirlendi. Mitokondriyal membranın tepe zaman analizi ve matrikse özgü enzim konsantrasyonu-zaman eğrileri, mitokondriyal membran lizizinin derecesini gösterdi.

Mitokondriyal membran potansiyeli

MAO veya ASP ile ön inkübasyondan sonra, üç gruptan izole edilen mitokondri 0.5 ml fosfat tamponlu salin (Wuhan Boster Biotechnology, Ltd., China） ve 10 ul rodamin 123 çalışma solüsyonu) içinde yeniden süspanse edildi( Sigma-Aldrich, USA) ilave edildi ve 15 dakika boyunca yüzde 5 CO2 içinde 37 derece C'de inkübe edildi Mitokondriyal membran potansiyeli, 490 nm'lik bir uyarma dalga boyu ve 520 nm'lik bir emisyon dalga boyu kullanılarak akış sitometrisi ile analiz edildi.

istatistiksel analiz

İstatistiksel analiz SPSS 19.0 yazılımı kullanılarak yapıldı. Veriler, ortalamalar ve standart sapmalar olarak ifade edilir. Farklı grupları karşılaştırmak için öğrenci t testi kullanıldı. P < 0.05="" istatistiksel="" olarak="" anlamlı="" kabul="">

cistanche otu: daha iyi kemik kalitesi için

Sonuçlar

Periferik kan ve BMC sayımları

Tam otomatik bir kan hücresi analizörü kullanılarak, AA farelerinde periferik kan hücrelerinin ve BMC'lerin sayısının önemli ölçüde azaldığı bulundu(P<0.05), indicating="" that="" the="" aa="" mouse="" model="" was="" successfully="" established="" (table="">

Aplastik anemi farelerinde mitokondriyal ultrastrüktür

AA farelerinin kemik iliğinin transmisyon elektron mikroskobu, tedavi edilen grupta (Tablo 2 ve Şekil 1) mitokondriyal ultrastrüktürün ASP ile önemli ölçüde iyileştiğini gösterdi, bu da ASP'nin AA farelerinde mitokondriyi stabilize ettiğini gösterir. Kontrol grubunun mitokondri boyutu ve şekli normaldi. Tersine. AA grubunun mitokondrileri, cristae'nin bozulması veya kaybolmasıyla birlikte genişlemiş küresel yapılara sahipti (Şekil 1A-C).

Aplastik anemi farelerinde mitokondriyal membran potansiyeli (MMP)

Transmisyon elektron mikroskobu mitokondriyal hasarı ortaya çıkardığından, bir floresan spektrofotometre kullanarak üç grup arasında Rh 123'ün floresansındaki nispi farklılıkları ölçerek AA farelerinde ASP'nin MMP üzerindeki etkisini belirledik.

Sonuçlar, AA grubundaki (19.6±3.03) kemik iliği hücrelerinin Rh 123 floresansının kontrol grubundan (31.7±2.59, P) daha düşük olduğunu gösterdi.<0.0). however,="" the="" rh="" 123="" fluorescence="" of="" the="" asp-treated="" aa="" group="" was="" higher="" than="" that="" in="" the="" aa="" group=""><0.0i)(table 2="" and="" figure="" 2),="" indicating="" that="" asp="" facilitated="" the="" recovery="" of="" the="" mmp="" in="" aa="">

Erken hücre hasarı mitokondriyal lizis zaman eğrisi

Kontrol grubunda, mitokondriyal in vitro kültür Cox ve MDH'nin içeriğinin zirveye ulaşması 3.5 saat sürmüştür. Kültürdeki MAO içeriği zamanla önemli ölçüde değişmedi, ancak COX ve MDH içeriği zamanla kademeli olarak arttı, bir zirveye ulaştı ve ardından kademeli olarak azaldı. Böylece, hücreler tarafından salınan tam mitokondriyal içeriğin bölünme zirvesine ulaşması yaklaşık 3.5 saat sürdü.

AA grubundaki COX ve MDH zirveleri sırasıyla 1.5 saatte, 1.375U/, 36.732U/l'de ortaya çıktı. Tedavi edilen gruptaki COX ve MDH zirveleri, sırasıyla 5.5 saat,6.5 saat,1.341U/l,33.994U/'de ortaya çıktı. İstatistiksel analiz için her zaman noktasında iki veri seti kullanıldı. 1.5 saatte, AA grubundaki COX ve MDH seviyeleri, tedavi edilen gruptan önemli ölçüde yüksekti (P ​​< 0.05).="" bu="" nedenle,="" serumdaki="" tam="" mitokondriyal="" bölünme,="" asp="" ilavesinden="" sonra="" (p="">< 0.05),="" zirvede="" hafif="" bir="" düşüşle="" (şekil="" 3)="" önemli="" ölçüde="">

Tartışma

Aplastik anemi (AA), periferik pansitopeni ve kemik iliği hipoplazisi ile karakterize bir kemik iliği yetmezliği sendromudur. MtDNA'nın mutasyonları ve kararsızlığı çeşitli hastalıklarda gösterilmiştir. Mitokondriyal disfonksiyon ve mitokondri sayısındaki azalma, mtDNA'nın azalmasına neden olabilir, hematopoietik bölmede kazanılmış mtDNA delesyonlarının şiddetli pansitopeni ve retikülositopenide meydana geldiği bulunmuştur [11]. Önceki araştırmamıza [5] dayanarak, ASP'nin AA farelerinin mitokondriyal membranını stabilize edip edemediğini inceledik.

Angelica Sinensis polisakkarit-demir kompleksi (APIC) sadece DEA üzerinde üstün bir terapötik etkiye sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda kanın desteklenmesi ve kan dolaşımının desteklenmesi üzerinde de etkilidir [12]. ASP, annelerin oğlu Janus-kinazın (JAK) hücre dışı dekapentaplejik (SMAD) ve IDA sıçanlarında hepsidin ekspresyonunu aşağı regüle etmek için 1 sinyalle düzenlenmiş kinaz (ERK) yolaklarını önleyerek hepsidin aşırı ekspresyonunun neden olduğu hastalıkların tedavisinde yararlı olabilir [13 ]. Qin J, ASP'nin sıçan OA modelinde kondrositlerin proteoglikan (PG) sentezini in vivo ve IL-1B ile uyarılan kondrositleri in vitro olarak, agrekan ve PG sentezinde yer alan GT'lerin ekspresyonunu teşvik ederek iyileştirebileceğini buldu [14].

Çalışmamızda, AA fare modeli, asetil fenilhidrazin, X-ışınları ve siklofosfamidin bir kombinasyonu ile indüklendi. AA fareleri, periferik kan lökositleri, Hb ve trombositlerde istatistiksel olarak anlamlı azalmalar (Tablo 1) ve AA'nın klinik özellikleri olan humerus iliği hücrelerinde ve kemik iliğine bağlı progenitör hücrelerde ciddi azalmalar gösterdi. ASP ile tedavi edilen AA fareleri, AA grubuna kıyasla BM hücrelerinde ilerleyici bir artış gösterdi. Ek olarak, hematopoietik hücrelerdeki mitokondri sayısı da etkilenmiştir. ASP, tedavi edilen grupta AA grubuna kıyasla önemli ölçüde daha yüksek sayıda mitokondri ile sonuçlandı (Şekil 1). Bu sonuçlar, ASP'nin AA farelerinde kemik iliği çekirdekli hücre proliferasyonunu destekleyebileceğini, mitokondri sayısını artırabileceğini ve mitokondriyal membranı stabilize edebileceğini gösterdi.

Mitokondriyal hasar, mtDNA hasarı ve mtRNA transkript seviyelerinde, protein sentezinde ve mitokondriyal fonksiyonda azalma ile yansıtılır, bu da hücresel enerjinin azalmasına, hücre sinyalinin bozulmasına ve hücresel farklılaşma ve apoptoz ile etkileşime neden olabilir. Ayrıca, yetersiz mitokondriyal ATP üretimi kromozomal instabiliteyi teşvik edebilir[15]. mtDNA, beş mitokondriyal solunum kompleksinden dördünün bileşenlerini kodladığından, mtDNA'daki değişiklikler mitokondriyal hastalığa [16-18] neden olur. Mitokondriyal hastalığın dışında, mtDNA'daki mutasyonlar kanser ve diyabet ile bağlantılıdır. kardiyovasküler hastalıklar. nörodejeneratif bozukluklar, lösemi gibi hematolojik hastalıkların yanı sıra normal yaşlanma sürecidir [19]. Önemli olarak, mtDNA mutasyonları ve ayrıca mtDNA kopya sayısındaki azalma patojenik olabilir [20, 21]. AA gibi hematolojik hastalıkların önlenmesi ve tedavisine yönelik klinik müdahaleler için hedefler sağlayabildiğinden, mtDNA bütünlüğünün ve kopya sayısının korunması için hücresel mekanizmaları anlamak son derece önemlidir. Bu faktörler ayrıca hematopoietik kök hücrelerin kendi kendini yenilemesini ve farklılaşmasını etkileyecek olan enerji metabolizmasının azalmasına neden olabilir.

Bu çalışmanın bulguları, ASP'nin mitokondriyal üst yapıyı iyileştirebileceğini ve kemik iliği yetmezliğini tedavi etmek için transmembran potansiyelinin aşağı regülasyonunu ve miyeloid elementlerin apoptozunu baskılayabildiğini göstermektedir.

Cistanche ve cistanche özü: bebefit kemikler

Referanslar

1 Chinnery PF, Schon EA. Mitokondri. J Neurol Neurosurg Psikiyatrisi 2003, 74: 1188-1199.

2. Gattermann N. Hematopoetik sistemde mitokondriyal DNA mutasyonları. Lösemi 2004,18:18-22.

3. Gattermann N, Retzlaff S, Wang YL, et al. Edinilmiş idiyopatik sideroblastik anemisi olan iki hastada sitokrom c oksidazın alt birimi I'i etkileyen mitokondriyal DNA'nın heteroplasmik nokta mutasyonları. Kan 1997,90:4961-4972.

Kim HR, Shin MG, Kim MJ, et al. mitokondriyal

4. Aplastik anemili hastalardan alınan kemik iliği hücrelerinin DNA anormallikleri. Kore Med Sci 2008, 23:1062-1067. X Cui, JO Wang, ZG Cai, et al. Komple sıra

5. aplastik anemide mitokondriyal DNA ve telomer uzunluğunun analizi.Int J Mol Med 2014.34:1309-1314.

6. Chiu TL, Su CC. Tanshinone IA, reaktif oksijen türlerinin indüklenmesi ve mitokondriyal membran potansiyelinin azaltılması yoluyla insan akciğer kanseri A549 hücrelerinde apoptozu indükler. Uluslararası J Mol Med 2010,25:231-236.

7. Liu PJ. Hsieh WT. Huang SH, et al. Angelica Sinensis kaynaklı suda çözünür polisakkaritlerin akut kan kaybı olan fareler üzerindeki hematopoetik etkisi. Exp Hematol 2010, 38: 437-445.

8. Kuang X, Yao Y, Du JR, et al. ICR farelerinde ön beyin iskemik hasarına karşı Z-ligustilidin nöroprotektif rolü 8F. Brain Res 2006,1102:145-153.

9. Xin J.Zhang J. Yang Y, et al. Z-ligustilid bileşenini içeren Radi Angelica Sinensis, bilişsel bozukluktan iyileşmeye aracılık etmek için yetişkin nörogenezini destekler Curr Neurovasc Res 203, 10:{4}}.

10. Chen YF, Wu ZM, Xie C, ve diğerleri. Aplastik anemili farelerde kemik iliği stromal hücreleri tarafından salgılanan IL-6 ekspresyon seviyesi.ISRN Hematol 2013:986219.

11. Hatfill SJ, LaCock CJ, Laubscher R, et al. Radyasyona bağlı miyelodisplazi ve ikincil lösemi patogenezinde mitokondriyal DNA için Arole.Leuk Res 1993,17:907-913.

12. Wang PP, Zhang Y, Dai LQ, et al. Angelica Sinensis polisakkarit-demir kompleksinin sıçanlarda demir eksikliği anemisi üzerindeki etkisi. Chin J Integr Med 2007, 13:297-300.

13. Zhang Y, Cheng Y, Wang N, et al. JAK, SMAD ve ERK sinyal yollarının demir eksikliği anemisi olan sıçanlarda Angelica Sinensis'ten elde edilen polisakkaritler tarafından hepsidin baskılanması üzerindeki etkisi. Yemek Fonksiyonu2014.5: 1381-1388.

14. Qin J, Liu YS, Liu J, et al. Angelica Sinensis polisakkaritlerinin in vivo ve in vitro osteoartrit üzerindeki etkisi: proteoglikan sentezini teşvik etmek için olası bir mekanizma. Kanıta Dayalı Tamamlayıcı Alternatif Med 2013,79476.

15. Gattermann N. Hematopoetik sistemdeki mitokondriyal DNA mutasyonları. Lösemi 2004,18:18-22.

16. Holt IJ, Harding AE, Morgan-Hughes JA. Mitokondriyal miyopatili hastalarda kas mitokondriyal DNA'sının silinmesi. Doğa 1988, 331:717-719.

17. Lestienne P, Ponsot G Kearns-Sayre sendromu, kas mitokondriyal DNA delesyonu. Lancet 1988, 1:885.

18. Wallace DC, Singh G, Lott MT, et al. Leber'in kalıtsal optik nöropatisi ile ilişkili mitokondriyal DNA mutasyonu.Science 1988,242:1427-1430.

19. Wallace DC. Metabolik ve dejeneratif hastalıklar, yaşlanma ve kansere ilişkin mitokondriyal bir paradigma: evrimsel tıp için bir şafak. Annu Rev Genet 2005, 39: 359-407.

20. Clay Montier LL, Deng JJ, Bai Y. Sayı önemlidir: memeli mitokondriyal DNA kopya sayısının kontrolü. J Genet Genomics 2009,36:125-131.

21. Rötig A, Poulton J. İnsanlarda mitokondriyal DNA tükenmesinin genetik nedenleri. Biochim Biophys Acta 2009,1792:1103-1108.

cistanche özü: kemik oluşumunu artırır ve kemik yoğunluğunu artırır