Mitokondriyal Proteinler, Hipoksik İskemik Ensefalopati Sıçan Modelinde Fiziksel Egzersizin Hafızayı, Öğrenmeyi ve Motor Aktiviteyi İyileştirme Mekanizmasını Ortaya Çıkarıyor Bölüm 3
Apr 07, 2024
4. Malzemeler ve Yöntemler
4.1. Hayvanlar ve Deney Grupları
Bu çalışma için 36 adet Sprague-Dawley sıçanı kullanıldı. Hayvanlar, 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüleriyle 22 ± 1◦C'de tutuldu ve yiyecek ve suya serbestçe erişebildiler. Deneysel prosedürler, Zhengzhou Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Araştırması Etik Kurumsal Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirildi.
Karanlık döngü, insanların gece uyuduğu dönemi ifade eder ve hafızayla yakından ilişkilidir. Çoğu insan için iyi bir gece uykusu fiziksel sağlığı ve beyin fonksiyonlarını iyileştirir. Uyku aynı zamanda beynin hafıza süreciyle de ilişkilidir.
Uyuduğumuzda vücudumuz, hızlı göz hareketi (REM) uykusu ve hızlı göz hareketi olmayan (NREM) uyku dahil olmak üzere farklı uyku aşamalarına girer. Bu aşamalar beynin bilgi entegrasyonunu ve hafıza konsolidasyonunu düzenlemede önemli bir rol oynar.
Çoğu insan uykunun konsantrasyon ve hafıza üzerindeki olumlu etkilerini yaşar. Araştırmalar, uykunun anılarımızı pekiştirmemize ve güçlendirmemize, hatta öğrenme yeteneğimizi geliştirmemize yardımcı olabileceğini gösteriyor. Uyku sırasında beyin yeni bilgileri mevcut bilgilerle bütünleştirir, böylece hafızayı saklama ve kullanma yeteneğini geliştirir.
Tersine, yeterli uyku eksikliği hafıza kaybına ve öğrenme güçlüklerine yol açabilir. Uzun süreli uykusuzluk, vücutta ve beyinde çeşitli sorunlara yol açarak günlük yaşamı ve çalışılabilirliği etkileyebilir. Bu nedenle, doğru bir uyku stratejisi ve makul bir yaşam tarzı, iyi hafızayı korumak için çok önemlidir.
Genel olarak karanlık döngüler ile hafıza arasında bir bağlantı var. Yeterli uyku, beyindeki bilgi entegrasyonunu ve hafıza konsolidasyonunu destekleyebilir; uzun süreli uyku bozuklukları ise beyin fonksiyonlarını ve hafızayı etkileyebilir. Bu nedenle günlük hayatımızda uyku kalitesine dikkat etmeli ve sağlıklı bir yaşam tarzı sürdürmeli, hafızamızı ve öğrenme yeteneklerimizi etkili bir şekilde desteklemeli ve geliştirmeliyiz. Belleği geliştirmemiz gerektiği görülebilir ve Cistanche Deserticola hafızayı önemli ölçüde geliştirebilir, çünkü Cistanche Deserticola aynı zamanda asetilkolin ve büyüme faktörlerinin seviyelerini arttırmak gibi nörotransmitterlerin dengesini de düzenleyebilir. Bu maddeler hafıza ve öğrenme için çok önemlidir. Ek olarak, Cistanche Deserticola kan akışını iyileştirebilir ve oksijen dağıtımını destekleyebilir, bu da beynin yeterli besin ve enerji almasını sağlayarak beyin canlılığını ve dayanıklılığını artırır.
Belleği geliştirmenin 10 yolunu bilin'e tıklayın
Deneyler sırasında hayvan sayısını azaltmak ve hayvanların acısını en aza indirmek için her türlü çaba gösterildi. Hayvanlar rastgele dört gruba ayrıldı (Şekil 8). (1) HIE, NT (egzersiz eğitimi olmayan hipoksi-iskemik ensefalopati grubu), doğum sonrası 7. günde yavrulara izofluran ile anestezi uygulanarak hipoksik-iskemik ensefalopati için modellenen hayvanlardan oluşmuştur (%5 indüksiyon, %1,5 bakım).
Sol ortak karotid arter daha sonra kalıcı olarak bağlandı ve yavrular, 30 dakika boyunca sıcak bir iyileşme yatağına yerleştirildi, ardından 90 dakika boyunca %92 N2 ve %8 O2'den oluşan hipoksik gaz karışımının sürekli akışının olduğu hipoksik bir odaya aktarıldılar ve daha sonra 10.haftaya kadar yüzme egzersizine tabi tutulmadan kafeslere geri döndüler. (2) HIE, T (egzersiz eğitimi almış hipoksi-iskemi ensefalopati grubu), (1)'deki gibi hipoksik-iskemik ensefalopati için modellenen ve yaşamın 6. haftasına kadar kafeslere geri döndürülen ve daha sonra 90 dakikalık egzersize tabi tutulan hayvanlardan oluşuyordu. 4 hafta boyunca haftada 2 gün dinlenme ve 5 gün boyunca günlük yüzme egzersizi, (3) SHAM, NT (kontrol grubu), herhangi bir tedaviye tabi tutulmayan ancak doğum sonrası 1. günden 10. haftaya kadar kafeslerde normal bir yaşam süren hayvanları içermektedir. egzersiz eğitimi ve (4) SHAM, T, herhangi bir tedaviye tabi tutulmayan ancak doğum sonrası 1. günden 6 haftaya kadar kafeslerde normal bir yaşam süren ve ardından 4 hafta boyunca yüzme egzersizine tabi tutulan hayvanlardan oluşuyordu.
Daha sonra farklı gruplardan hayvan beyinleri toplandı ve western blotlama (hipokampus ve serebral korteks) ve immünofloresan (motor korteks) için hazırlandı.
4.2. Egzersiz Paradigması
Hayvanlar, istenildiği kadar yiyecek ve suyla barındırıldı ve 12-aydınlık/karanlık döngüsünde tutuldu. Bunlar iki gruba ayrıldı: hareketsiz hayvanlar (HIE, NT ve SHAM, NT) ve egzersiz yapan hayvanlar (HIE, T ve SHAM, T). Egzersiz yapan hayvanlara postnatal 6. haftadan sonra 4 hafta boyunca yüzme egzersizi eğitimi verildi; haftada 5 gün, 2 gün dinlenme ile yüzme egzersizine tabi tutuldular. Her bir yüzme seansı 90 dakika sürdü. Hayvanların tank tabanına değmemesi için havuz 50 cm derinliğe kadar dolduruldu.
Hayvanlar herhangi bir ekstra yük olmaksızın serbestçe yüzmelerine izin verildi ve yüzme sırasında nazikçe uyarıldılar. Fareler egzersiz sonrası dikkatlice kurutuldu ve kafeslere geri konuldu.
4.3. Vertica! Kutup Motoru Testi
Her gruptaki hayvanlar, yatay konumda tutulan, kumaş bantla kaplı bir direğin (3.0 cm çapında ve 150 cm uzunluğunda) üzerine yüzleri yukarı bakacak şekilde teker teker yerleştirildi, ardından yavaş yavaş yukarıya kaldırıldı. dikey pozisyonda tutularak sıçanın direk üzerinde kaldığı süre maksimum 2 dakika (120 sn) olarak kaydedildi. Bu testte motor koordinasyonu ve dengede eksiklik olan hayvan direkten düşer.
4.4. Morris Su Labirenti Testi (MWM)
Sıçanlar (10 haftalık), 4 haftalık egzersiz eğitimi protokolünden (SHAM, 'T ve HlE, T) sonra MWM'ye tabi tutuldu. Tüm su labirenti verileri Panjab SMART video izleme sistemi (Panlab Howo Bioteknoloji (Shanghai) Co., Ltd.) (Şangay, Çin) kullanılarak kaydedildi. MWM, 132]'de anlatıldığı gibi kullanıldı. Kısaca fareler, gizli bir platforma ulaşmak ve sudan kaçmak için yüzme havuzunun kenarlarına yerleştirilen görsel ipuçlarını kullandı. Öğrenme 7 gün boyunca değerlendirildi. Öğrenme değerlendirmesinden önce, sıçanlar temiz su ve görünür bir platform içeren havuza yerleştirildi. Eğitim sırasında farelere göreve alışmaları için deneme yüzme egzersizleri verildi.
Öğrenme aşamasında, kolay video takibi için farelere siyah boya sürüldü ve platform suya batırıldı. Her sıçan, farklı başlangıç noktalarından (çeyrekler) dört denemeye tabi tutuldu. Gecikme veya platforma ulaşmak için gereken süre Panlab SMART Video Takip Sistemi tarafından her gün kayıt altına alındı. Deneyin son gününde, platform çıkarıldı ve her bir sıçan suya yeniden yerleştirildi, hayvanların daha önce platformu içeren çeyrekteki (hedef çeyreklik) gizli platformun alanını geçme sayısı kaydedildi.
4.5. Western Blotlama
Protein seviyesi deneyi için her gruptan rastgele altı sıçan seçildi. Proteinler hipokampus ve korteksten ekstrakte edildi ve RIPA reaktifinde (CW2333S, CoWin Biosciences, Cambridge, MA, ABD) homojenleştirildi ve sitoplazmik ve nükleer proteinlere ayrıldı. Protein konsantrasyonları bisinkoninikasit tahlili (BCA) (CW0014S, CoWin Biosciences, Cambridge, MA, ABD) kullanılarak belirlendi ve toplam 20 g protein, evrensel SDS-PAGE jelleri (CFAS AnyKD PAGE) # PE008 üzerinde elektroforez ile ayrıldı, Zhonghui Hecai Bio-pharmaceutical Technology Co., Ltd., Shaanxi, Çin.
Proteinler daha sonra poliviniliden florür membranlara (PVDF)(R1CB12934, Merck Millipore Ltd., (Burlington, MA, ABD) aktarıldı. Zarlar, %5 sığır serum albümini (BSA) (#A8020, Solarbio Life Sciences) ile 2 saat boyunca bloke edildi. , Pekin, Çin) oda sıcaklığında bekletildi ve Cell Signaling Technology'den (Danvers, MA, ABD) temin edilen aşağıdaki birincil antikorlarla inkübe edildi: AIF (D39D2, 1:1000), Sitokrom C (136F3, 1:1000), bölünmüş kaspaz{{ 13}} (Asp175, 1:1000), Smac/Diablo (D553R, 1:1000) ve OPA1 (D7C1A,1:1000).
Servicebio, Wuhan, Çin'den GAPDH (GB11002, 1:2000) ve Proteintech'ten H3 (17168-1-AP, 1:1000) gece boyunca 4 °C'de ve ardından Proteintect'ten HRP-konjuge ikincil antikor SA00001-2 (1:5000) oda sıcaklığında 2 saat inkübasyon. Protein bantları, Affinity Biosciences'tan geliştirilmiş bir kemilüminesans kiti #KF005 ile görselleştirildi ve Bio-Image Analiz sistemi (Zhengzhou Üniversitesi, Zhengzhou, Çin) ile görüntülendi. Protein bant yoğunluklarının dahili referanslar olarak GAPDH (sitoplazmikproteinler) ve H3'e (nükleer proteinler) oranları ImageJ kullanılarak belirlendi.
4.6. İmmünfloresan
Beyin dokusunun {{0}}μm'lik koronal dilimleri, immünofloresan için dondurucu bir mikrotom (Leica, Almanya) kullanılarak elde edildi. Slaytlar, oda sıcaklığında %10 fetal sığır serumu (#A8020, Solarbio Life Sciences, Pekin, Çin) ve %0,3 Triton ×-100,Amresco 0694, Biosharp, Estonya içeren PBS ile 2 saat süreyle bloke edildi ve ardından Cell Signaling Technology'den (Danvers, MA, ABD) birincil antikorlarla inkübe edilmiştir: anti-AIF, D39D2 (1:400 seyreltme), anti-Sitokrom C, 136F3 (1:200 seyreltme), anti-bölünmüş kaspaz-3 , Asp175 (1:400 seyreltme), anti-Smac/Diablo, D553R (1:200 seyreltme) ve anti-OPA1, D7C1A (1:400 seyreltme) gece boyunca 4°C'de.
Daha sonra slaytlar, her biri 10 dakika süreyle PBS'de 3 kez yıkandı ve ardından ikincil antikorlarla (ab150077, Abcam, Cambridge Biomedical Campus, Cambridge, UK) 2 saat boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edildi. DAPI,#C0065, Solarbio Life'tan Sciences, Pekin, Çin (1:100PBS) 5 dakika süreyle eklendi ve döküldü, her biri 5 dakika süren 3 kez PBS içinde yıkandı, kurutuldu, söndürme önleyici madde eklendi (#P0126, Beyotime Bioteknoloji, Şanghay, Çin), cam slaytlar slaytlara sabitlendi ve numuneler 2 saat boyunca -20 ◦C'de saklandı ve mikroskobik görüntüleme için alındı. Doku görüntüleri, konfokal bir floresan mikroskobu (Ni-U942877, Nikon, Tokyo, Japonya) kullanılarak elde edildi ve görüntüleri temsil eden görüntüler motor korteksteki proteinler daha sonra [33]'te anlatıldığı gibi FIJI-ImageJ kullanılarak ölçüldü.
4.7. İstatistiksel analiz
Tüm analizler için Windows için GraphPad Prism sürüm 8.0.0 (GraphPad Yazılımı, San Diego, CA, ABD) kullanıldı. İstatistiksel anlamlılığı ölçmek için sırasıyla tek yönlü ANOVA ve ardından Dunnett'in post hoc testleri kullanıldı. Sonuçlar ortalama ± SEM olarak sunuldu ve p < 0.05, istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
5. Sonuçlar
Bu çalışma, yüzme egzersizinin, Cyto.C/cleaved kaspaz-3 ve AIF sinyal yolları yoluyla mitokondriyal apoptozu baskılayarak HIE ile ilişkili motor aktiviteyi, hafızayı ve öğrenmeyi iyileştirdiğini göstermektedir. Ek olarak yüzme egzersizi müdahalesinin, HIE'li sıçanlarda Smac/Diablo ve OPA1'in tersine çevrilmesiyle gösterildiği gibi mitokondriyal krista ve membran potansiyelini stabilize ettiği gösterilmiştir. Sonuç olarak bu, HIE'yi ve bunun sonucunda ortaya çıkan açıkları etkili bir şekilde yönetmek için kullanılabilecek daha fazla moleküler yolu deşifre etmeye yönelik ek araştırmalar için çekici ve geçerli bir temeldir. Bununla birlikte, bu çalışma, mitokondride neden olan yapısal ve işlevsel eksikliklerin tersine çevrilmesinde egzersizin rolünü başarılı bir şekilde ortaya koymuştur. HIE, mitokondriyal kristaların nasıl stabilize edildiğini belirlemek için mümkün olan tüm yöntemleri tüketmedi; Bu, bu konuyla ilgili gelecekteki araştırmalar için kritik öneme sahiptir.
Yazar Katkıları: Kavramsallaştırma, FG, FP, YW ve CC; veri iyileştirme, FG, FP, YW,HL ve JF; biçimsel analiz, FG, HL ve CC; finansman edinimi, CC; soruşturma, FG,FP, YW, HL ve JF; metodoloji, FG, FP, YW ve CC; proje yönetimi, FG, YW ve CC; kaynaklar, CC; yazılım, FG, FP, JF ve CC; denetim, CC; doğrulama, FG, FP,YW, HL ve CC; görselleştirme, FG, FP, YW, HL ve JF; yazma – orijinal taslak, FG ve YW; yazma – inceleme ve düzenleme FG ve HL Tüm yazarlar makalenin yayınlanmış versiyonunu okudu ve kabul etti.
Finansman: Bu çalışma, Henan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Departmanı Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Projesi (Hibe No. 212102310217) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Fonları (Hibe No. 81401015) tarafından desteklenmektedir.
Kurumsal İnceleme Kurulu Beyanı: Çalışma, Zhengzhou Üniversitesi Araştırma Hayvanlarının Bakımı Komitesi'nin yönergelerine göre yürütülmüştür; ZZUIRB2022-32.
Bilgilendirilmiş Onam Beyanı: Geçerli değil.
Veri Kullanılabilirliği Beyanı: Geçerli değil.
Çıkar Çatışmaları: Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Referanslar
1. Li, B.; Conception, K.; Meng, X.; Zhang, L. Perinatal hipoksik-iskemik beyin hasarında beyin-bağışıklık etkileşimleri. Prog. Neurobiol.2017, 159, 50–68. [ÇaprazRef]
2.Douglas-Escobar, M.; Weiss, MD Hipoksik-iskemik ensefalopati: Klinisyen için bir inceleme. JAMA Pediatr. 2015, 169, 397–403.[CrossRef] [PubMed]
3. Siyah, RE; Cousens, S.; Johnson, HL; Çim, J.; Rudan, I.; Bassani, D.; Jha, P.; Campbell, H.; Walker, CF; Cibulskis, R.; ve diğerleri. 2008'de çocuk ölümlerinin küresel, bölgesel ve ulusal nedenleri: Sistematik bir analiz. Lancet 2010, 375, 1969–1987. [ÇaprazRef]
4. Juul, SE; Ferriero, DM Yenidoğan Beyin Hasarında Farmakolojik Nöroprotektif Stratejiler. Klin. Perinatol. 2014, 41, 119–131.[CrossRef]
5.Zhu, C.; Rodriguez, JI; Aydınlatılmış.; Xu, Y.; Sun, Y. Perinatal hipoksik-iskemik beyin hasarında apoptoz indükleyici faktörün rolü. Sinirsel Yenilenme. Res. 2021, 16, 205–213. [CrossRef] [PubMed]
6. Şarkı, S.-H.; Jee, Y.-S.; Ko, İ.-G.; Lee, S.-W.; Sim, Y.-J.; Kim, D.-Y.; Lee, S.-J.; Cho, YS Koşu bandı egzersizi ve tekerlek egzersizi, beyin iltihabı sıçanlarında apoptotik nöronal hücre ölümünü baskılayarak motor fonksiyonunu iyileştirir. J. Egzersiz. Rehabilitasyon. 2018, 14, 911–919.[CrossRef]
7. Kelly, M.; Darrah, J. Serebral palsili çocuklar için su egzersizi. Dev. Med. Çocuk. Nörol. 2005, 47, 838–842. [ÇaprazRef]
8. Müller, P.; Duderstadt, Y.; Lessmann, V.; Müller, NG Laktat ve BDNF: Egzersize Bağlı Nöroplastisitenin Temel Aracıları?J. Klin. Med. 2020, 9, 1136. [CrossRef]
9. Intlekofer, KA; Cotman, CW Egzersiz, yaşlanma ve Alzheimer hastalığında hipokampal fonksiyonun azalmasına karşı koyar. Neurobiol.Dis. 2013; Basında. [ÇaprazRef]
10. Gerçek, C.; Ferreira, A.; Chaves-Kirsten, G.; Torrão, A.; Pires, R.; Britto, L. BDNF reseptör blokajı, Parkinson hastalığının sıçan modelinde egzersizin faydalı etkilerini engellemektedir. Sinirbilim 2013, 237, 118–129. [ÇaprazRef]
For more information:1950477648nn@gmail.com
