MTHFD2 Etkileyici ve Düzenleyici T Hücresi Kaderi ve İşlevini Kontrol Eden Bir Metabolik Kontrol Noktasıdır

Grafik soyut

Yazarlar:

Ayaka Sugiura, Gabriela Andrejeva, Kelsey Voss, ..., Ashutosh K. Mangalam, Joshua D. Rabinowitz, Jeffrey C. Rathmell

Yazışma:

jeff.rathmell@vumc.org

Kısaca :

Hızlı T hücre proliferasyonunu desteklemek için nükleotid sentezi gereklidir. Sugiura et al. de novo purin metabolizması sinyallerinin T hücre farklılaşmasını ve işlevini yönlendirdiğini ve MTHFD2'yi enflamatuar hastalıklar için metabolik bir kontrol noktası ve terapötik hedef olarak tanımladığını gösterir.

Öne Çıkanlar

• MTHFD2, aktifleştirilmiş CD4 T hücrelerinin de novo purin sentezini sürdürmesi için kritik öneme sahiptir.

• Yetersiz MTHFD2, Th17 hücrelerinde Treg hücre benzeri fenotipleri ve metabolizmayı destekler d MTHFD2'nin inhibisyonu, mTORC1 sinyalini baskılar ve histon metilasyonunu değiştirir

• MTHFD2, in vivo olarak inflamasyona ve otoimmüniteye karşı koruma sağlamak için hedeflenebilir

MTHFD2, efektör ve düzenleyici T hücresi kaderini ve işlevini kontrol eden bir metabolik kontrol noktasıdır.

Ayaka Sugiura,¹Gabriela Andrejeva,¹Kelsey Voss,¹Darren R.Heintzman,¹Xincheng Xu,⁵Matthew Z.Madden,¹Xiang Ye,¹Katherine L. Beier,¹Nowrin U.Chowdhury,²Melisa M. Kurt,²Arissa C.Genç,¹Dalton L. Greenwood,¹Allison E.Sewell,¹Shailesh K. Shahi,³Samantha N.Freedman,³Alanna M. Cameron,⁴Patrik Foerch,⁴Tim Bourne,⁴Juan C. Garcia-Canaveras,⁵John Karijolich,¹Şafak C. Newcomb,²Ashutosh K. Mangalam,³Joshua D. Rabinowitz,⁵ve Jeffrey C.Rathmell^1,6,*

¹Vanderbilt İmmünobiyoloji Merkezi, Patoloji, Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü, Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi, Nashville, TN 37232, ABD

²Tıp Departmanı, Hematoloji ve Onkoloji Anabilim Dalı, Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi, Nashville, TN 37232, ABD

³Patoloji Bölümü, Iowa Üniversitesi, Iowa City, IA 52242, ABD

⁴Sitryx Therapeutics Limited, Magdalen Centre, Oxford Bilim Parkı, Oxford, Birleşik Krallık

⁵Kimya Bölümü, Ludwig Kanser Araştırma Enstitüsü Princeton Şubesi, Lewis-Sigler Bütünleştirici Genomik Enstitüsü, Princeton Üniversitesi, Princeton, NJ 08544, USA6Lider iletişim

*Yazışma: jeff.rathmell@vumc.org

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2021.10.011

ÖZET

Antijenik stimülasyon, artan biyosentetik, biyoenerjetik ve sinyal taleplerini karşılamak için T hücresi metabolik yeniden programlamasını destekler. Tek karbonlu (1C) metabolizma enzimi metilentetrahidrofolat dehidrojenaz 2'nin (MTHFD2), proliferasyon ve enflamatuar sitokin üretimini teşvik etmek için aktif T hücrelerinde de novo purin sentezini ve sinyalleşmesini düzenlediğini gösterdik. Patojenik T yardımcı -17 (Th17) hücrelerinde, MTHFD2, uygunsuz baskılama kapasitesi kazancı ile birlikte FoxP3 transkripsiyon faktörü anormal yukarı regülasyonunu önledi. MTHFD2 eksikliği ayrıca düzenleyici T (Treg) hücre farklılaşmasını da destekledi. Mekanik olarak, MTHFD2 inhibisyonu, pürin havuzlarının tükenmesine, pürin biyosentetik ara ürünlerinin birikmesine ve besin sensörü mTORC1 sinyalinin azalmasına yol açtı. MTHFD2, Th17 hücrelerinde DNA ve histon metilasyonunu düzenlemek için de kritikti. Önemli olarak, MTHFD2 eksikliği, çoklu in vivo inflamatuar hastalık modellerinde hastalık şiddetini azalttı. Bu nedenle MTHFD2, pürin metabolizmasını patojenik efektör hücre sinyallemesi ile entegre etmek için bir metabolik kontrol noktasıdır ve 1C metabolizma yollarında potansiyel bir terapötik hedeftir.

GİRİİŞ

Adaptif immün yanıtın etkin mobilizasyonu, hızlı hücre büyümesi ve proliferasyonundan geçmek için CD4 artı T hücrelerinin güçlü aktivasyonunu gerektirir. Bu, besin sensörü mTORC1 tarafından yürütülen, katabolik bir dinlenme durumundan artan biyosentetik, biyoenerjetik ve sinyal talepleri olan bir anabolik büyüme durumuna kadar metabolik yeniden programlamayı içerir. Sitokin ortamına bağlı olarak, CD4 artı T hücreleri, efektör işlevlerini sürdüren farklı metabolik programlara sahip düzenleyici alt kümelerin yanı sıra efektöre farklılaşır (Bantug ve diğerleri, 2018; Buck ve diğerleri, 2015). Bu alt kümelerin dengesi, inflamatuar ve otoimmün hastalıkları önlerken normal bağışıklık için kritik öneme sahiptir. Örneğin, multipl skleroz (MS), artan interlökin-17 (IL- 17) üreten T yardımcı-17 (Th17) hücreleri ve azalmış veya etkisiz baskılayıcı düzenleyici T (Treg) hücreleri ile karakterize edilir. (Dendrou ve diğerleri, 2015). Bu T hücre alt kümelerinin spesifik metabolik programlarını hedeflemek, immünoterapiye alternatif bir yaklaşım sunar.

Hücre metabolizmasına dayalı tedavi, 1948'de anti folat kemoterapötik ajanların akut lenfoblastik lösemili çocuklarda etkili olduğu gösterildiğinde başladı (Farber ve diğerleri, 1948). Folat, pürin biyosentezi, metil donörlerinin üretimi ve hücresel redoks dengesinin korunması için tek karbonlu (1C) metabolizmasına katkıda bulunur (Ducker ve Rabinowitz, 2017; Yang ve Vousden, 2016). O zamandan beri metotreksat (MTX), fluorourasil (5-FU) ve merkaptopurin (6-MP) dahil olmak üzere birçok ilaç bu yolu hedeflemek için geliştirilmiştir. Kanser hücreleri ve aktive edilmiş T hücreleri de dahil olmak üzere hızla çoğalan hücreler, DNA ve RNA'yı sentezlemek için bu yollara bağımlılıkları paylaşır. MTX, romatoid artrit (RA) gibi otoimmün hastalıkları tedavi etmek için yaygın olarak kullanılmaya devam etmektedir (Brown ve ark., 2016). Bununla birlikte, hedeflenen enzimlerin geniş ekspresyonu nedeniyle, bu terapötik ajanlar, yaygın ve potansiyel olarak ciddi yan etkilerle ilişkilidir. İlgili hücre popülasyonlarında seçici olarak önemli olan metabolik enzim hedeflerinin belirlenmesi, daha güvenli ve daha etkili immünoterapilerin geliştirilmesine yol açabilir.

1C metabolizması, tek karbon birimlerinin transferi ile folat ve metiyonin döngülerini içerir. Serin, eşlik eden glisin üretimi ile tetrahidrofolatı (THF) 5,10-metilenTHF'ye aktive etmek için bir 1C donörü görevi görür. 5,10-metilenTHF daha sonra pürin öncüsü 10- formilTHF'yi oluşturmak için NAD(P) kullanılarak oksitlenebilir. Alternatif olarak, 10-formilTHF, ATP'ye bağlı bir şekilde format ve THF'den sentezlenebilir. Sitosolik yolda, 10-fomilTHF üretimine metilenTHF dehidrojenaz 1 (MTHFD1) aracılık eder. MTHFD1 kaybı, hücreleri sitozolik 10-formilTHF'ye aç bırakır, purin biyosentetik kapasitesini azaltır ve MTHFD1'deki mutasyonlar ciddi kombine immün yetmezliğe (SCID) neden olur (Field ve diğerleri, 2015). Mitokondriyal yol, mitokondriyal MTHFD2 ve MTHFD1-benzerine (MTHFD1L) dayanır.

Şekil 1. 1C metabolizması ve MTHFD2, aktive edilmiş CD4'te yukarı doğru düzenlenir^artıT hücreleri ve EAE bağlamında

(A) İn vitro farklılaştırılmış CD4'te nükleotid metabolizması türlerinde değişiklik^artıKütle spektrometrisi ile ölçülen saf hücrelerle karşılaştırıldığında T hücresi alt kümeleri (n=3 biyolojik kopya).

(B) İn vivo akciğer iltihabı modelinde hedeflenen CRISPR taraması için iş akışı.

(C) Birincil CD4'te 1C metabolizması hedefli in vivo CRISPR taramasından gRNA bolluğundaki değişiklik^artıT hücreleri (MAGeCK tarafından gerçekleştirilen istatistiksel analiz, n=3 biyolojik kopya).

(D) T hücresi gelişimi ve aktivasyonu sırasında (C)'de tanımlanan genlerin mRNA ekspresyonu (ImmGen RNA-seq veri tarayıcısından alınan veriler).

(E) Saf ve aktif CD4'te (C)'de tanımlanan genlerin protein ekspresyonu^artıT hücreleri (Immunological Proteome Resource [ImmPRes]'den alınan veriler).

(F) (C)'de tanımlanan genlerin, sağlıklı kontrol bireylerine göre belirtilen inflamatuar bozuklukları olan bireylerin tam kanında mRNA ekspresyonu (Aune ve ark., 2017). MTX tedavisi altında RA-MTX, RA; SLE, sistemik lupus eritematozus; MS-Tx naif, tedavi naif MS tanı anında; MS yerleşik, MS tedavi altında ve hastalık remisyonunda; n=3–8 bağışçı.

(G) 2003 (üst; ölçek çubuğu, 100 mm) ve 4003 (alt; ölçek çubuğu, 50 mm) büyütmede semptomatik EAE ile farelerin omuriliğinin kauda ekina segmentinde CD3 ve MTHFD2 boyamasını gösteren IHC (veriler temsilidir) iki bağımsız deney).

(H ve I) Bağıl (H) ortalama floresan yoğunluğu (MFI) ve (I) CD4'te MTHFD2'nin mRNA ifadesi^artıSemptomatik EAE ve kontrol farelerinin dalağı olan farelerin dalağından ve omuriliğinden alınan T hücreleri (ortalama ± SD, tek yönlü ANOVA, veriler toplam 6 biyolojik kopya ile iki bağımsız deneyi temsil etmektedir).

(J) Farklılaşmamış CD4'te MTHFD2 mRNA ifadesi^artıAnti-CD3 ve anti-CD28 antikorları ile aktivasyondan 0, 5 ve 24 saat sonra T hücreleri (ortalama ± SD, tek yönlü ANOVA, n=3 biyolojik kopya).

(K) CD4 artı T hücre alt kümelerinde aktivasyondan sonra 5 gün boyunca nispi MTHFD2 MFI, dinlenme hücrelerine normalleştirildi (ortalama ± SD, n=3 biyolojik kopya). Ayrıca bkz. Şekil S1. İstatistiksel olarak anlamlı sonuçlar etiketlenmiştir (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" yüzde="">

MTHFD2, tüm tümörlerde en yüksek oranda indüklenen ve aşırı eksprese edilen genlerden biridir (Nilsson ve diğerleri, 2014). Embriyogenez sırasında geniş ölçüde yukarı regüle edilmesine rağmen, MTHFD2'nin çoğu yetişkin dokusunda çok az veya hiç ekspresyonu yoktur (Nilsson ve diğerleri, 2014). Anti-kanser tedavisinde (Zhu ve Leung, 2020), MTHFD2 inhibisyonu oksidatif stresin artmasına (Ju ve diğerleri, 2019; Wan ve diğerleri, 2020), glisin bağımlılığına (Koufaris ve diğerleri, 2016) ve yetersizliğe yol açabilir. pürin sentezi (Ben-Sahra ve diğerleri, 2016; Pikman ve diğerleri, 2016). MTHFD2 eksikliği ayrıca, guanin tükenmesi ve ardından mTORC1-aktive eden GTPaz Rheb'in inhibisyonu dahil olmak üzere birçok mekanizma yoluyla mTORC1 aktivitesini baskılayabilir (Emmanuel ve diğerleri, 2017). MTHFD2 eksikliği ayrıca, AMP ile aktive olan protein kinazı (AMPK) aktive edebilen adenosin monofosfat (AMP) analoğu 5-aminoimidazol karboksamid ribonükleotid (AICAR) (Ducker ve diğerleri, 2016) dahil olmak üzere purin sentez yolu ara ürünlerinin birikmesine neden olur. mTORC1'i inhibe etmek için (Su ve diğerleri, 2019).

1C metabolizması çoklu besin girdilerini entegre ettiğinden ve terapötik olarak izlenebilir olduğundan, 1Cmetabolizmanın CD4'teki rolünü inceledik.^artıT efektör (Teff) ve Treg hücre alt kümeleri. Primer murin T hücrelerinde tarafsız in vivo CRISPR-Cas9-tabanlı hedefli tarama yoluyla, MTHFD2'yi inflamatuar bozukluğu olan bireylerde de sürekli olarak yukarı regüle edilen bir isabet olarak tanımladık. Özellikle, MTHFD2 eksikliği Teff hücre proliferasyonunu ve fonksiyonunu bozmuştur. MTHFD2 eksikliği ayrıca Treg hücre farklılaşmasını teşvik ederken Th17 hücrelerinde anormal FoxP3 ekspresyonunu ve baskılayıcı aktiviteyi de teşvik etti. Bu etkiler AICAR birikimi, azaltılmış pürin konsantrasyonları, mTORC1 sinyallemesinin aşağı regülasyonu, artan mitokondriyal metabolizma ve değiştirilmiş DNA ve histon metilasyonu ile ilişkilendirildi. İn vivo olarak, MTHFD2'yi hedefleme, çoklu enflamatuar hastalık modellerine karşı korunmuştur. Bu veriler, MTHFD2'nin Th17 ve Treg hücrelerinde metabolik bir kontrol noktası olarak hizmet ettiğini ve bu enzimin anti-inflamatuar immünoterapi için bir hedef olarak potansiyelini vurguladığını göstermektedir.

SONUÇLAR

1C metabolizması ve pürin sentezi CD4'te diferansiyel olarak aktiftir^artıT hücre alt kümeleri

Nükleotid sentezinin CD4'te farklılık gösterebileceğini varsaydık.^artıT hücre alt kümeleri. CD4^artıT hücreleri in vitro olarak Th1, Th17 ve Treg hücrelerine farklılaştırıldı ve kütle spektrometrisi için 72 saat sonra toplandı. Nükleotid tür miktarları, naif hücrelere kıyasla genellikle tüm alt kümelerde yükselmiştir (Şekil 1A). Özellikle, pürin sentezi ara ürünleri, Th17 hücrelerinde en yüksek glisinamid ribonükleotit (GAR), 1-(fosforibosil) imidazol karboksamid (SAICAR) ve AICAR birikimi ile diferansiyel olarak boldu (Şekil S1A).

CD4'ün bağımlılığını test etmek için^artı1C metabolizmasındaki enzimler üzerindeki T hücreleri, birincil CD4'te in vivo CRISPR-Cas9-tabanlı bir tarama gerçekleştirdik^artıT hücreleri (Şekil 1B). Bir pozitif kontrol ve hedeflemeyen negatif kontroller (NTC'ler) olarak tüberoskleroz kompleksi 2 (TSC2) ile birlikte 1C metabolizmasındaki enzimleri hedeflemek için özel bir kılavuz RNA (gRNA) kütüphanesi oluşturulmuştur. CD4^artıOvalbümin (OVA)-spesifik T hücre reseptörü (TCR) transgenik OT-II Cas9 çift transgenik farelerden izole edilen T hücreleri, bu kütüphane ile transdükte edildi ve intravenöz olarak Rag1'e aktarıldı.^{__ /__}ev sahibi. Fareler daha sonra akciğer iltihabını indüklemek için intranazal OVA ile immünize edildi. Bu farelerin akciğerlerinden geri kazanılan T hücreleri dizildi ve girdi frekanslarına göre gRNA'ların zenginleşmesi veya tükenmesi belirlendi. TSC2 gRNA, bu proteinin T hücrelerindeki inhibitör rolünü destekleyerek zenginleştirildi. Buna karşılık, PPAT, AHCY, MAT2A ve MTHFD1 gRNA'ları önemli ölçüde tükendi ve GART, DHFR, DNMT1, MTRR, MTR, SHMT2 ve MTHFD2 gRNA'ları daha az azaldı, bu da bu genlerin T hücre çoğalmasına ve inflamatuar fonksiyona katkıda bulunduğunu gösteriyor. in vivo (Şekil 1C ve S1B).

Daha sonra ekrandan tanımlanan genlerin ekspresyon profilini inceledik. Tümü gelişmekte olan timositlerde koordineli olarak yukarı regüle edilmiş olsa da, MTHFD2 mRNA ve protein en güçlü şekilde uyarılmış periferik T hücrelerinde indüklenmiştir (Şekil 1D ve 1E). Ayrıca, çeşitli inflamatuar ve otoimmün hastalıkları olan bireylerin tam kanından alınan ayrı olarak yayınlanan bir RNA dizilimi (RNA-seq) veri setinde (Aune ve diğerleri, 2017), MTHFD2, ülseratif kolit, Crohn hastalığı dahil olmak üzere birçok koşulda tutarlı bir şekilde aşırı eksprese edildi. , çölyak hastalığı, RA, sistemik lupus eritematozus (SLE), sedef hastalığı, psoriatik artrit, Sjögren sendromu ve MS (Şekil 1F). Özellikle, yakın zamanda MS tanısı konan bireyler, sağlıklı donörlere veya hastalık remisyonu ile tedavi gören MS'li bireylere göre MTHFD2 ekspresyonunu önemli ölçüde yükseltmiştir (Şekil S1C). Böylece, CD4^artıT hücresi proliferasyonu ve hayatta kalması, belirli 1C metabolizma genlerine bağlıdır ve bu genlerin ekspresyonu, patolojik inflamasyon ortamının yanı sıra T hücresi gelişimi, aktivasyonu ve farklılaşması aşamaları boyunca farklılık gösterir.

Şekil 2. MTHFD2 eksikliği CD4'ü bozar^artıT hücre çoğalması ve işlevi

(A–D) CD4'te (A) CellTrace Violet (CTV) seyreltme, (B) canlılık, (C) CD25 ekspresyonu ve (D) TF ekspresyonu ile ölçülen çoğalma^artıAktivasyondan sonra 72 saat boyunca MTHFD2i ile tedavi edilen T hücresi alt kümeleri (ortalama ± SD, tek yönlü ANOVA, veriler toplam 9 biyolojik kopya ile üç bağımsız deneyi temsil etmektedir).

MTHFD2, CNS'ye sızan CD4'te yüksek oranda düzenlenir^artıDeneysel otoimmün ensefalomiyelitte (EAE) ve aktifleştirilmiş CD4'te T hücreleri^artıin vitro T hücreleri

MTHFD2'nin düzenlenmesi, CD4 artı T hücrelerinde iyi tanımlanmamıştır. İn vivo olarak inflamatuar lezyonlarda MTHFD2 ekspresyonunu ölçmek için CD4^artıMiyelin spesifik TCR transgenik 2D2 farelerinden alınan T hücreleri aktive edildi ve adaptif olarak Rag1'e aktarıldı^{__ /__}EAE'yi uyarmak için fareler. Fareler arka bacak felci sergilemeye başladıktan sonra, omuriliğin kauda ekina segmenti immünohistokimya (IHC) ile analiz edildi. 2D2 T hücreleri alan fareler, MTHFD2 ve CD3'ün zenginleştiğini gösterdi^artıkontrolde bulunmayan hücreler (Şekil 1G). CD4 olup olmadığını doğrudan belirlemek için^artıT hücreleri, iltihaplı lezyonlarda MTHFD2'yi yukarı regüle etti, bir miyelin oligodendrosit glikoproteinine (MOG) ve boğmaca toksini (PTX) ile indüklenen EAE modeline tabi tutulan farelerin dalağından ve omuriliğinden T hücreleri, analiz için toplandı. CNS sızan CD4^artıT hücreleri, eşleşen splenik CD4 ile karşılaştırıldığında MTHFD2'yi aşırı eksprese etti^artıAkış sitometrisi (Şekil 1H) ve qRT-PCR (Şekil 1I) ile ölçüldüğü gibi kontrol ve EAE farelerinden alınan T hücreleri. CD4'te MTHFD2 ifadesinin kinetiği^artıDaha sonra in vitro T hücreleri ölçüldü. MTHFD2 mRNA'nın güçlü yukarı regülasyonu, 5 saatlik stimülasyondan sonra tespit edildi ve 24 saat azalmaya başladı (Şekil 1J), oysa farklılaşmış CD4^artıT hücresi alt kümeleri, aktivasyondan 48 saat sonra MTHFD2 proteininin en yüksek ifadesini elde etti (Şekil 1K). Bu veriler, MTHFD2'nin CD4'te yukarı doğru düzenlendiğini göstermektedir.^artıİn vitro ve in vivo enflamasyon bölgesinde aktivasyonu olan T hücreleri.

CD4^artıT hücresi alt kümeleri, aktivasyon, çoğalma, hayatta kalma ve sitokin üretimi için farklı şekilde MTHFD2 gerektirir

Daha sonra MTHFD2'nin CD4 artı T hücre alt kümesi aktivasyonu, farklılaşması, çoğalması ve işlevindeki rolünü test ettik. CD4^artıT hücreleri, optimal Th1, Th17 ve Treg hücre farklılaşması ve araç veya bir MTHFD2 inhibitörü (MTHFD2i; DS18561882) için sitokinlerin varlığında in vitro olarak aktive edildi (Kawai ve diğerleri, 2019). 72 saat sonra, tüm alt kümeler çoğalmayı (Şekil 2A) ve canlı döngü hücrelerinin sayısını (Şekil S2A ve S2B) azalttı. Th1 ve Th17 hücrelerinde canlılık azaldı (Şekil 2B) ve CD25 ekspresyonu ile ölçüldüğü gibi aktivasyon tüm alt kümelerde azaldı (Şekil 2C). Soy ile karakterize edilen transkripsiyon faktörü (TF) ekspresyonu, Th1 hücrelerinde (T-bet) azalmıştır.^artı) ancak Th17 hücrelerinde değişmedi (ROR t^artı) ve Treg hücrelerinde minimal olarak değişti (FoxP3^artı) (Şekil 1D). Teff hücre fonksiyonunu ölçmek için hücreler 12-miristat 13-asetat (PMA) ve iyonomisin ile yeniden uyarıldı. Önemli ölçüde daha az Thl hücresi interferon-g (IFNg) ifade etti ve daha az Th17 hücresi, MTHFD2i varlığında farklılaştığında IL-17 ifade etti (Şekil 2E). Bu, başlangıçtaki aktivasyonun bozulmasından kaynaklanmıyordu, çünkü bu fenotipler, ilaca maruz kalma aktivasyondan 24 saat sonraya kadar ertelendiğinde korundu, ancak bu ayarda çizgi yaşı karakterize eden TF ifadesi değişmedi (Şekil S2C-S2F). MTHFD2 bu nedenle maksimum CD4 için gereklidir^artıT hücre aktivasyonu, proliferasyonu, hayatta kalma ve sitokin üretimi.

Bu farmakolojik etkileri genetik olarak doğrulamak için bir Mthfd2 ürettik.^fl/flfare suşu ve koşullu genetik silme elde etmek için onu Cd4- cre transgenik fareler ile çaprazladı. Beklendiği gibi, aktifleştirilmiş CD4^artıMthfd2'den T hücreleri^fl/flCD4-cre artı (CD4^ΔMthfd2) fareler, Mthfd2 hücrelerine kıyasla daha düşük MTHFD2 ekspresyonuna sahipti^fl/flCD4-kre^artı(vahşi tip [WT]) çöp arkadaşları (Şekil 2F). Başlangıçta, CD4DMthfd2 farelerinde biraz daha az CD4 vardı^artıWT ile karşılaştırıldığında dalaktaki T hücreleri (Şekil 2G). In vitro aktivasyon ve farklılaşma, hücre sayıları ve CD4'ün canlılığı üzerine^ΔMthfd2Th17 hücreleri ve daha az ölçüde Treg hücreleri önemli ölçüde daha düşüktü (Şekil 2H). Ek olarak, Th17 ve Treg hücrelerinde CD25 ekspresyonu azaldı ve Th1 hücrelerinde daha düşük bir eğilim gösterdi (Şekil 2I). Son olarak, CD4^ΔMthfd2Th1 ve Th17 hücreleri, sırasıyla T-bet ve ROR t'nin daha düşük ekspresyonuna sahipti. Ancak Treg hücrelerinde FoxP3 değişmedi (Şekil 2J). TF ifadesindeki değişikliklere rağmen, farklılaşan Teff hücreleri normal miktarlarda sitokin üretti (Şekil 2K). Farmakolojik ve genetik yaklaşımlar arasındaki sonuçlardaki farklılıklar, gelişim sırasında enzim fonksiyon kaybının zamanlaması ve tamlığına ve potansiyel telafi edici mekanizmalara bağlanabilir.

MTHFD2i, Th17 hücrelerinde FoxP3 ekspresyonunu indükler ve Treg hücre farklılaşmasını arttırır

Teff hücrelerinin MTHFD2'ye bağımlılığı göz önüne alındığında, FoxP3 ve Treg hücrelerinin MTHFD2i düzenlemesini test ettik. Özellikle, MTHFD2i tedavisine bağlı FoxP3'ün Th1'de ve daha belirgin olarak Th17 hücrelerinde doza bağlı bir şekilde anormal yukarı regülasyonu (Şekil 3A). Bu, tedavi aktivasyondan 24 saat sonraya ertelendiğinde de meydana geldi (Şekil 3B). CD4DMthfd2 Th17 hücrelerinde de benzer bir eğilim gözlendi (Şekil 3C). Bu FoxP3 yukarı regülasyonu işlevseldi çünkü MTHFD2i ile tedavi edilen Th17 hücreleri, CD8 ile birlikte kültürlendiğinde baskılayıcı kapasite kazandı.^artıT hücreleri (Şekil 3D). MTHFD2i böylece Th17 hücrelerinde FoxP3 ve Treg hücre benzeri fenotipleri destekleyebilir. MTHFD2i ayrıca indüklenmiş Treg hücrelerinin farklılaşmasını da arttırdı. Treg hücreleri, MTHFD2i varlığında bir dizi dönüştürücü büyüme faktörü b (TGF-b) konsantrasyonu ile farklılaştırıldı. En yüksek hariç test edilen her konsantrasyonda, FoxP3 ifadesi MTHFD2i tedavisi ile arttı (Şekil 3E ve 3F). Bu fenotip, gecikmiş MTHFD2i tedavisi ile de korunmuştur (Şekil 3G).

Şekil 3. MTHFD2 eksikliği FoxP3 ekspresyonunu indükler ve oksidatif fosforilasyona doğru bir kaymayı teşvik eder

(A) Aktivasyondan 72 saat sonra MTHFD2i ile muamele edilmiş Th1 ve Th17 hücrelerinde FoxP3 ekspresyonu (ortalama ± SD, tek yönlü ANOVA, veriler toplam 9 biyolojik kopya ile üç bağımsız deneyi temsil etmektedir).

(B) Th1 ve Th17 hücrelerinde FoxP3 ekspresyonu, 24 saat boyunca aktive edildi ve daha sonra 48 saat boyunca araç veya 500 nM MTHFD2i ile işlendi (ortalama ± SD, eşleştirilmemiş t testi, veriler, toplam 9 biyolojik kopya ile üç bağımsız deneyi temsil etmektedir).

(C) Aktivasyondan 72 saat sonra WT ve CD4DMthfd2 yavrularından Th1 ve Th17 hücrelerinde FoxP3 ekspresyonu (ortalama ± SD, eşleştirilmemiş t testi, veriler toplam 9 biyolojik kopya ile üç bağımsız deneyi temsil etmektedir).

(D) MTHFD2i ile muamele edilmiş Th17 hücrelerinin anormal bastırma kapasitesini ölçen bastırma tahlili. Ön işleme tabi tutulmuş Th17 hücreleri, anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları (ortalama ± SD, tek yönlü ANOVA, n=3 biyolojik kopya) ile aktivasyon üzerine proliferasyonu ölçmek için CTV lekeli CD8 artı T hücreleri ile birlikte kültürlendi. .

(E) Bir dizi TGF-b konsantrasyonu ile farklılaştırılmış ve MTHFD2i ile muamele edilmiş Treg hücrelerinde FoxP3 ekspresyonu (ortalama ± SD, eşleştirilmemiş t testi, veriler toplam 9 biyolojik kopya ile üç bağımsız deneyi temsil etmektedir).

(F) (E)'de tablolanan veriler için akış sitometrisi grafikleri.

(G) Treg hücrelerinde FoxP3 ekspresyonu, 24 saat boyunca düşük konsantrasyonlarda TGF-b ile aktive edilmiş ve farklılaştırılmış ve daha sonra 48 saat boyunca MTHFD2i ile muamele edilmiştir (ortalama ± SD, eşleştirilmemiş t testi, veriler toplam 9 biyolojik kopya ile üç bağımsız deneyi temsil etmektedir) ).

(H) MTHFD2i ile muamele edilmiş Th17 ve Treg hücreleri üzerinde gerçekleştirilen Seahorse XF Hücre Mito stres testi (ortalama ± SD, n=3 biyolojik kopya).(I) Bazal ECAR, bazal OCR, maks OCR ve bazal OCR/ECAR (H) cinsinden ölçülen oran (ortalama ± SD, eşleştirilmemiş t testi, veriler toplam 6 biyolojik kopya ile iki bağımsız deneyi temsil etmektedir).İstatistiksel olarak anlamlı sonuçlar etiketlenmiştir (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p yüzde 0,001).

Treg hücreleri, Th17 hücrelerinden daha büyük bir mitokondriyal metabolizmaya sahiptir (Michalek ve diğerleri, 2011). MTHFD2i tedavisinin metabolik sonuçlarını belirlemek için Th17 ve Treg hücreleri, hücre dışı akış analizleriyle değerlendirildi. MTHFD2i, mitokondriyal solunuma doğru bir kaymayı belirtmek için Th17 hücrelerinin bazal ve maksimum oksijen tüketim oranını (OCR) arttırdı (Şekil 3H). Tersine, Th17 ve Treg hücreleri, MTHFD2i tedavisi ile azaltılmış bir bazal hücre dışı asitleşme oranına (ECAR) sahipti, bu da glikolizin azaldığını gösteriyor (Şekil 3I). OCR'nin ECAR'a bazal oranı, MTHFD2i metabolik programı glikolizden oksidatif fosforilasyona kaydırdığı için Th17 ve Treg hücrelerinde önemli ölçüde arttı. Bu veriler, MTHFD2i'nin, Th17 hücrelerinde ve düşük TGF-b koşulları altında farklılaşan Treg hücrelerinde FoxP3 ekspresyonunu arttırdığını ve Th17 hücrelerini daha Treg hücre benzeri bir metabolizmaya kaydırdığını göstermektedir.

İnsan CD4 artı T hücrelerinde MTHFD2 eksikliği, FOXP3 ekspresyonunu arttırırken ve mTORC1 aktivitesini azaltırken Th17 hücre proliferasyonunu ve canlılığını azaltır

Yukarıdaki bulguların insan hücrelerine çevrilebilirliğini test etmek için CD4^artıSağlıklı donörlerin periferik kanından izole edilen T hücreleri, in vitro olarak Th1, Th17 ve Treg hücrelerine farklılaştırıldı ve aktivasyon zamanından itibaren araç veya MTHFD2i ile tedavi edildi. MTHFD2i ile tedavi edilen Th17 ve Treg hücrelerinde proliferasyon önemli ölçüde azaldı (Şekil 4A) ve Th17 hücreleri de artmış apoptoz sergiledi (Şekil 4B). Th17 hücrelerinde azalan proliferasyon, küçük enterferans yapan RNA (siRNA) (Şekil 4C ve S2G) kullanılarak genetik bir yaklaşımla özetlenmiştir. Murin hücrelerine benzer şekilde, FOXP3 ekspresyonu, MTHFD2i ile tedavi edilen insan Th17 hücrelerinde daha yüksekti ve MTHFD2i ile tedavi edilen insan Treg hücrelerinde daha yüksek eğilim gösterdi (Şekil 4D ve S2H). mTORC1-AMPK ekseninin Th17 ve Treg hücre farklılaşması için kritik olduğu göz önüne alındığında, mTORC1 hedef ribozomal protein S6'nın (fosfo-S6) fosforilasyonu da ölçüldü. Bu, MTHFD2i veya siMTHFD2 ile Th17 hücrelerinde mTORC1 aktivitesinin azaldığını gösterdi (Şekil 4E). Böylece, Th17 ve Treg hücrelerinde proliferatif kapasite kaybı ve FOXP3 ekspresyonunun indüklenmesi, birincil insan CD4'ünde özetlenebilir.^artıT hücreleri.

Şekil 4. MTHFD2 eksikliği proliferasyonu bozar ve insan Th17 hücrelerinde FOXP3 ekspresyonunu indükler

(A) Anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları ile aktivasyondan sonra 72 saat boyunca araç veya 2 mM MTHFD2i ile tedavi edilen insan CD4 artı T hücresi alt kümelerinde CTV seyreltmesi ile ölçülen çoğalma (eşleştirilmiş t testi, veriler 5 ile üç bağımsız deneyi temsil etmektedir). –6 sağlıklı donör).

(B) 72 saat boyunca MTHFD2i ile tedavi edilen insan CD4 artı T hücrelerinde Annexin V ile ölçülen apoptoz (eşleştirilmiş t testi, veriler 5-6 sağlıklı donörle yapılan üç bağımsız deneyi temsil etmektedir).

(C) NTC veya siMTHFD2 ile transdüksiyona tabi tutulan insan CD4 artı T hücrelerinde Ki-67 ifadesi (eşleştirilmiş t testi, veriler 4 sağlıklı hasta donörü ile üç bağımsız deneyi temsil etmektedir).

(D) 72 saat boyunca MTHFD2i ile tedavi edilen insan CD4 artı T hücrelerinde FOXP3 ekspresyonu (eşleştirilmiş t testi, veriler 6-10 sağlıklı donör ile üç bağımsız deneyi temsil etmektedir).

(E) 72 saat boyunca MTHFD2i ile tedavi edilen veya siMTHFD2 ile transdüksiyona tabi tutulan insan CD4 artı T hücrelerinde fosfo-S6 ekspresyonundaki değişiklik (ortalama ± SD, bir numune t testi, 4-6 sağlıklı donörle üç bağımsız deneyi temsil eden veriler). İstatistiksel olarak anlamlı sonuçlar etiketlenmiştir (* p < 0.{{10}}}5,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" yüzde="">

T hücreleri, MTHFD2 enzimatik işlevine güvenir ve fenotipler ürün tarafından kurtarılabilir.

MTHFD2, pürin sentezi için mitokondriyal format havuzunun bakımı için gereklidir (Ma ve diğerleri, 2017), ancak enzimatik olmayan roller de oynayabilir. Temel enzimatik aktiviteyi destekleyen MTHFD2i tedavisi, CD4 artı T hücre alt kümelerinde ortamdan formatın telafi edici alımına yol açtı (Şekil 5A). Format sentezi için kullanılan 1C birimi, serinin glisine dönüştürülmesiyle sağlanır ve hücre içi serin toplanırken, glisin tüm alt kümelerde MTHFD2i tedavisi ile tükenir (Şekil 5B). Metionin konsantrasyonları da biraz arttı, bu da metionin döngüsünün inhibisyonunu düşündürdü. Beklendiği gibi, serin-glisin dönüştürme aşamasının MTHFD2'nin yukarı akışında olduğu göz önüne alındığında, bu değişiklikler ortamdaki formatın sağlanmasıyla kurtarılmadı.

Şekil 5. T hücre alt kümeleri üzerindeki MTHFD2i etkileri, eksojen format tarafından kurtarılır

(A) Aktivasyondan sonra 72 saat boyunca araç veya 500 nM MTHFD2i ile tedavi edilen CD4 artı T hücre alt gruplarında 1H-manyetik rezonans spektroskopisi (MRS) ile ölçülen format alımı (ortalama ± SD, eşleştirilmemiş t testi, veriler iki bağımsız deneyi temsil etmektedir) 6 toplam biyolojik kopya ile).

(B) Kitle spektrometrisi ile ölçülen araçla karşılaştırıldığında, 4-6 saat boyunca 500 nM MTHFD2i veya 500 nM MTHFD2i artı 1 mM format ile muamele edilmiş CD4 artı T hücrelerinde serin, glisin ve metionin konsantrasyonlarındaki değişiklik (ortalama ± SD, n { {8}} biyolojik kopyalar).

(C) Aktivasyondan sonra 72 saat boyunca 1 mM format veya 60 mM adenin ve guanin pürin çözeltisi ile kurtarılan MTHFD2i ile muamele edilmiş CD4 artı T hücrelerinde canlı hücre sayısı, canlılık ve CD25 ekspresyonu (ortalama ± SD, tek yönlü ANOVA, veriler toplam 9 biyolojik kopya ile üç bağımsız deneyin temsilcisi).

(D) Aktivasyondan sonra 72 saat boyunca format veya pürinlerle kurtarılan WT veya CD4DMthfd2 yavrularından CD4 artı T hücrelerinde canlı hücre sayısı, canlılık ve CD25 ekspresyonu (ortalama ± SD, tek yönlü ANOVA, n=3 biyolojik kopya ).

Daha sonra, formatın veya bir adenin ve guanin pürin solüsyonunun eklenmesinin eksik enzimatik fonksiyonu kurtarıp kurtaramayacağını ve MTHFD2 eksikliğinin aşağı yönlü etkilerini tersine çevirebileceğini test ettik. Gerçekten de, 1 mM format, MTHFD2i ile tedavi edilen hücrelerde proliferasyonu, canlılığı ve aktivasyonu restore etti (Şekil 5C). Purin takviyesi, tüm alt kümelerde proliferasyonu ve Th1 ve Th17 hücrelerinde aktivasyonu kurtardı, ancak tüm alt kümelerde canlılığı ve Treg hücrelerinde aktivasyonu kurtarmadı. Format ayrıca CD4'te çoğalmayı, canlılığı ve aktivasyonu kurtardı^ΔMthfd2T hücreleri (Şekil 5D). MTHFD2i ile muamele edilmiş Th1 ve Th17 hücrelerinde bozulmuş sitokin üretimi, format veya pürin ilavesiyle araç miktarlarına tersine çevrildi (Şekil 5E). Özellikle, Th17 hücrelerinde FoxP3'ün anormal yukarı regülasyonu, formatlama değil, pürin ilavesiyle kurtarıldı, oysa format ve pürin ilavesi, düşük TGF-b konsantrasyonları ile farklılaşan Treg hücrelerinde FoxP3 ekspresyonunu taban çizgisine indirdi (Şekil 5F). MTHFD2i fenotipleri, mitokondriyal formatın veya purin havuzlarının MTHFD2 bakımına bağlı gibi görünmektedir.

MTHFD2, CD4'te mTORC1 aktivitesini ve DNA ve histon metilasyonunu düzenler^artıT hücreleri

Ölümsüzleştirilmiş kanser hücrelerinde, MTHFD2 eksikliği, 10-formilTHF aracılı formilasyon adımlarının yukarı akışında olan GAR, SAICAR ve AICAR pürin sentezi ara ürünlerinin birikmesine yol açabilir (Ducker ve diğerleri, 2016). CD4^artıT hücresi alt kümeleri, 4-6 saat MTHFD2i'ye maruz kalmadan önce 72 saat kültürlendi. Bu kısa zaman dilimi, telafi edici değişiklikler de dahil olmak üzere herhangi bir ikincil etkiden kaçınmak için seçilmiştir. Geçici MTHFD2i tedavisi, tüm alt kümelerde GAR, SAICAR ve AICAR birikmesine neden oldu (Şekil 6A). Bu etki, MTHFD2'nin enzimatik rolünü destekleyen 1 mM formatın eklenmesiyle tamamen kurtarıldı. Guanin dahil nükleotidler ve nükleobazlar da MTHFD2i tarafından tüketildi ve Th17 ve Treg hücrelerinde format tarafından kurtarıldı (Şekil 6B).

Şekil 6. MTHFD2i, mTORC1 aktivitesini azaltan ve değişen DNA ve histon metilasyonunu azaltan purin sentezi ara ürünlerinin birikmesiyle sonuçlanır.

(A) Kitle spektrometrisi ile ölçülen, araca göre 4-6 saat boyunca 500 nM MTHFD2i veya 500 nM MTHFD2i artı 1 mM format ile muamele edilmiş CD4 artı T hücrelerindeki GAR, SAICAR ve AICAR konsantrasyonlarındaki değişiklik (ortalama ± SD, bir- ANOVA yolu, n=3 biyolojik kopya).

(B) Kütle spektrometrisi (n=3 biyolojik kopya) ile ölçülen, araca göre formatlı veya formatsız MTHFD2i ile tedavi edilen Th17 ve Treg hücrelerindeki nükleotid metabolizma türlerindeki değişim.

(C) CD4 artı T hücrelerinde fosfo-S6, S6, Rheb, fosfo-ACC, ACC, HIF-1a ve b-aktin immünoblotu, aktivasyondan sonra 72 saat boyunca formatlı veya formatsız MTHFD2i ile tedavi edildi (veriler n=3 biyolojik kopya ile üç bağımsız deneyin temsilcisi).

(D) Kütle spektrometrisi (ortalama ± SD, tek yönlü ANOVA, n=3 biyolojik kopya) ile ölçülen, araca göre formatlı veya formatsız MTHFD2i ile tedavi edilen Th17 hücrelerinde TCA döngüsü metabolitlerindeki değişiklik.

(E) CUT&RUN ile ölçülen, MTHFD2i ile tedavi edilen Treg hücreleri ve Th17'deki UCSC bilinen genlerinin promotörleri çevresindeki ±10-kb bölgelerinde H3K27me3'ün IgG kontrol oranına ısı haritaları (3 biyolojik kopyadan toplanan veriler).

(F) Araç veya 500 nM MTHFD2i ile tedavi edilen Th1 ve Th17 hücrelerinde ve WT veya CD4DMthfd2 yavrularından nTreg hücrelerinde CpG bölgesi tarafından Foxp3 lokusunun medyan DNA metilasyon frekansının ısı haritası (Mood's testi, n=3 biyolojik kopya).

(G) (F)'nin proksimal promotör, distal promotör ve TSDR (eşleştirilmiş t testi) ile tablolanması. Ayrıca bkz. Şekil S3 ve S4. İstatistiksel olarak anlamlı sonuçlar etiketlenmiştir (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" yüzde="">

AICAR ve nükleotitler, mTORC1-AMPK ekseninin yerleşik düzenleyicileridir (Emmanuel ve diğerleri, 2017; Kim ve diğerleri, 2016). Gerçekten de, fosfo-S6 ekspresyonu, tüm alt kümelerde MTHFD2i tedavisi ile azaldı ve format ilavesiyle tamamen restore edildi (Şekil 6C ve S3A). mTORC1'in zorunlu bir aktivatörü olan GTP bağlayıcı protein Rheb, hücre içi guanin mevcudiyetine duyarlı olabilir (Emmanuel ve diğerleri, 2017) ve Rheb ifadesi MTHFD2i tedavisi ile nemlendirildi (Şekil 6C ve S3B). AICAR, bir adenosin analoğu ve AMPK aktivatörüdür (Rae ve Mairs, 2019; Su ve diğerleri, 2019). Bununla birlikte, aktivasyondan 72 saat sonra, AMPK veya hedeflerinin fosforilasyonu, asetil-koenzim A(CoA) karboksilaz (fosfo-ACC) ve Unc-51-benzeri otofaji aktive edici kinaz (fosfo-ULK1), MTHFD2i tedavisi ile değişmedi (Şekil 6C, S3C ve S3D). mTORC1 aktivitesi, Th17'yi teşvik eder ve kısmen HIF-1a'ya bağlı glikolitik metabolizmanın indüklenmesi yoluyla Treg hücre farklılaşmasını azaltır (Shi ve diğerleri, 2011). Bununla uyumlu olarak, MTHFD2i ile tedavi edilen ve CD4DMthfd2 Th17 hücrelerinde HIF-1a ifadesi azalmıştır (Şekil 6C, S3E ve S3F). mTORC1 aktivitesindeki bu değişiklikler, yeniden uyarma ile ve yeniden uyarılma olmadan Nur77 ifadesi ile ölçüldüğü gibi, TCR sinyallemesindeki herhangi bir eksiklik ile ilişkili değildi (Şekil S3G). Th17 hücre gelişimi için kritik olan sinyal dönüştürücü ve transkripsiyon 3 (STAT3) aktivitesinin aktivatörü, MTHFD2i tedavisi ile değişmedi veya mütevazı bir şekilde arttı (Şekil S3H). Azalan mTORC1 aktivitesi ve MTHFD2i tedavisi ile glikolizden oksidatif fosforilasyona geçiş, trikarboksilik asit (TCA) döngüsü metabolitlerinin nispi bolluğunda değişiklikler önerdi. Süksinat ve fumarat konsantrasyonları, MTHFD2i tarafından önemli ölçüde azaltıldı, ancak format tarafından kurtarıldı (Şekil 6D).

TCA metabolitleri, DNA ve histon demetilazların bilinen inhibitörleridir (Su ve diğerleri, 2016) ve süksinat ve fumarat havuzlarının tükenmesi, hipometillenmiş bir durumu destekleyebilir. Genom boyunca H3K27 tri-metilasyonu (H3K27me3), CUT&RUN (hedefler altında bölünme ve nükleaz kullanılarak salıverme) dizilimi ile ölçülmüştür (Skene ve Henikoff, 2017). Gerçekten de, MTHFD2i ile tedavi edilen Th17 hücreleri, araçla karşılaştırıldığında H3K27me3'ü azaltmıştır (Şekil 6E ve S4A). Foxp3 lokusunda DNA metilasyonu ayrıca diferansiyel metilasyonun MTHFD2i kaynaklı FoxP3 yukarı regülasyonuna katkıda bulunup bulunmadığını belirlemek için bisülfat dizilimi ile ölçülmüştür. Araç ve MTHFD2i koşulları arasında metilasyon frekansında birkaç CpG lokusu farklılık gösterse de, Treg hücreye özgü demetillenmiş bölgede (TSDR) fark edilebilir bir model yoktu. WT ve CD4DMthfd2 farelerinden (Şekil 6F) izole edilen nTreg hücreleri (CD4 artı CD25 artı) arasında da hiçbir fark yoktu, ancak her zenginleştirilmiş popülasyonun saflığı düşüktü (Şekil S4B). Bununla birlikte, MTHFD2i ile tedavi edilen Th17 hücrelerinde Foxp3 proksimal promotör bölgesi üzerinde DNA metilasyon frekansında, araçla karşılaştırıldığında (Şekil 6G), MTHFD2i ile transkripsiyonun olası bir artışını gösteren önemli bir düşüş vardı.

Hücre içi format havuzunu korumaya ek olarak, MTHFD2 aktivitesi, NAD'nin dönüşümü yoluyla hücresel redoks dengesine katkıda bulunur.^artıNADH ve NADP'ye^artıNADPH (Shin ve diğerleri, 2017) ve transsülfürasyon yolunun ve ardından glutatyon sentezinin desteklenmesi. MTHFD2i ile tedavi edilen Th17 hücreleri, NAD konsantrasyonlarını azalttı^artı, NADH, NADP^artıve formatla kurtarılan NADPH (Şekil S4C). Ancak, NAD^artı/NADH ve NADP^artı/NADPH oranları koşullara göre değişmedi. Bu, hücresel reaktif oksijen türlerinde (ROS) ve mitokondriyal süperoksitte (Şekil S4D) değişiklik olmamasıyla birleştiğinde, redoks durumundaki değişikliklerin MTHFD2i fenotipine önemli bir katkıda bulunma olasılığının düşük olduğunu göstermektedir.

MTHFD2 eksikliği in vivo olarak çoklu inflamatuar hastalıkların şiddetini azaltır

Terapötik bir hedef olarak MTHFD2'nin etkinliği daha sonra bir in vivo T hücresine bağlı gecikmeli tip aşırı duyarlılık (DTH) modelinde test edildi. Fareler immünize edildi ve lokal inflamasyonu indüklemek için anahtar deliği limpet hemosiyanin (KLH) ile kulağa tehdit edildi ve oral araç veya MTHFD2i ile tedavi edildi. Hayvanlar ağırlıklarını korudukları için tedavi açık bir toksisite göstermedi (Şekil S5A). Önemli olarak, kontrol DTH farelerinde kulak kalınlığı ve ağırlığı arttı, ancak inhibitörle tedavi edilen hayvanlarda değil, bu da MTHFD2i tedavisi üzerine iltihaplanmadan korumayı gösterir (Şekil 7A, 7B ve S5B). KLH'ye özgü immünoglobulin G (IgG) de en yüksek inhibitör dozunda azaltılarak B hücre fonksiyonuna uzanan potansiyel etkileri gösterir (Şekil 7C).

Şekil 7. MTHFD2'yi in vivo hedeflemek, DTH, EAE ve IBD modellerinde hastalık şiddetini azaltır

(A ve B) Kulak (A) bağıl kalınlığı ve (B) biyopsi ağırlığı, CFA bağışıklamalı KLH'den 10 gün sonra ve DTH'yi (tek yönlü ANOVA) indüklemek için KLH tehdidinden 3 gün sonra. Fareler günde iki kez oral 0, 100 veya 300 mg/kg MTHFD2i ile tedavi edildi (ortalama ± SEM, n=8 biyolojik kopya).

(C) KLH ile indüklenen DTH'nin 10. gününde KLH'ye özgü IgG konsantrasyonları (ortalama ± SEM, Kruskal-Wallis testi, n=8 biyolojik kopya).

(D) EAE'yi indüklemek için CFA ve PTX ile MOG ile aşılanmış WT ve CD4DMthfd2 yavrularında zaman içindeki ortalama klinik puan (ortalama ± SEM, çoklu Mann-Whitney testleri, veriler, her biri 5 biyolojik kopyaya sahip iki bağımsız deneyi temsil etmektedir).

(E) En yüksek hastalık şiddetinde EAE farelerinin omuriliğinde CD4 artı T hücrelerinin hücre sayısı ve sıklığı (ortalama ± SEM, eşleştirilmemiş t testi, veriler toplam 9 biyolojik kopya ile iki bağımsız deneyi temsil etmektedir).

(F) EAE farelerinin omuriliğinden alınan CD4 artı T hücrelerinde CD25 ve CD44 ifadesi (ortalama ± SEM, eşleştirilmemiş t testi, n=4 biyolojik kopya).

(G ve H) Hücre sayısı (G) T-bet artı , RORgt artı , FoxP3 artı , FoxP3 artı /T-bahis artı oranı, FoxP3 artı /RORgt artı oranı ve (H) IL-17 artı , IFNg plus ve IL-17 artı IFNg artı CD4 artı EAE farelerinin omuriliğinden alınan T hücreleri (ortalama ± SEM, eşleştirilmemiş t testi, veriler toplam 9 biyolojik kopya ile iki bağımsız deneyi temsil etmektedir).

(I) Bağışıklama yapılmamış bir WT faresinin omuriliğinde miyelin için H&E, anti-CD3 IHC ve Luxol Fast Blue (LFB) boyaması ve pik hastalıkta EAE'li WT ve CD4DMthfd2 yavruları (2003 büyütme, 5 biyolojik kopyayı temsil eder) ).

(J) Rag1'in zamanla vücut ağırlığındaki değişim^__/__farelere, IBD kolitini indüklemek için WT veya CD4DMthfd2 saf CD4 artı T hücreleri enjekte edildi (ortalama ± SEM, çoklu t testleri, n=8 biyolojik kopya).

(K ve L) IBD farelerinin MLN'lerinden alınan (K) toplam CD4 artı T hücrelerinin ve (L) T-bet plus , RORgt plus , ve FoxP3 artı CD4 artı T hücrelerinin hücre sayısı (ortalama ± SEM, eşleştirilmemiş t testi n { {4}} biyolojik kopyalar). Ayrıca bkz. Şekil S5 ve S6. İstatistiksel olarak anlamlı sonuçlar etiketlenmiştir (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" yüzde="">

Benzer şekilde, ikili MTHFD1/2 inhibitörü LY345899 (Gustafsson ve diğerleri, 2017), bir EAE modelinde hastalığı iyileştirmede etkiliydi. EAE, MOG ve PTX ile indüklendi ve fareler, günlük olarak intraperitoneal (ip) DMSO veya LY345899 enjeksiyonu ile tedavi edildi. İnhibitör tedavisi, araçla karşılaştırıldığında hastalık şiddetini ve kümülatif klinik skoru önemli ölçüde azalttı (Şekil S5C ve S5D). Fareler 26. günde feda edildi ve omuriliğe sızan hücreler bağışıklık profili oluşturmak için toplandı. Özellikle, önemli ölçüde daha az CD45^artı, CD4^artıve CD8^artıhücreler, LY345899-tedavi edilmiş farelerin omuriliğine sızdı (Şekil S5E–S5G). ROR t frekansında değişiklik olmadı^artıveya FoxP3^artısızan CD4 arasındaki hücreler^artıT hücreleri (Şekil S5H). Bununla birlikte, IFNg artı IL-17 artı hücrelerin sıklığında bir azalma ve IL-17 artı hücrelerde bir artış (Şekil S5I), daha az patojenik bir fenotipe olası bir geçişi düşündürdü.

MTHFD2'ye T hücresinin içsel bağımlılığını in vivo olarak doğrudan test etmek için, WT ve CD4DMthfd2 yavruları üç farklı modele tabi tutuldu: EAE, inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) ve alerjik hava yolu hastalığı. EAE tekrar MOG ve PTX ile indüklendi ve inhibitör deneyine benzer şekilde, CD4DMthfd2 fareleri 26 gün boyunca hastalık şiddetini önemli ölçüde azalttı (Şekil 7D). T hücre fenotiplemesi için indüksiyondan sonra 15. günde pik hastalıkta ayrı bir kohort ötenazi yapıldı (Şekil S6A ve S6B). CD4 olmasına rağmen^artıveya CD8^artıDalakta T hücre sayıları değişmedi (Şekil S6C), omuriliğe CD4 artı T hücre infiltrasyonu önemli ölçüde azaldı (Şekil 7E). CD4DMthfd2 farelerinde omuriliğe sızan CD4 artı T hücreleri, WT ile benzer CD25 ekspresyonuna sahipti, ancak kısmen bozulmuş aktivasyona işaret eden CD44 ekspresyonunu azalttı (Şekil 7F). T-bet sayıları^artı, ROR t plus ve FoxP3 plus hücreleri (Şekil 7G), ayrıca IL-17 plus ve IFNg plus hücreleri (Şekil 7H), WT'ye göre CD4DMthfd2 farelerinin omuriliğinde de azalmıştır. Özellikle, FoxP3 plus ila T-bet plus ve RORgt plus hücrelerinin oranları, CD4DMthfd2 farelerinde pik hastalıkta WT ile karşılaştırıldığında yükselmiş ve MTHFD2 eksikliği ile artan FoxP3 ekspresyonunun in vitro bulgularını yansıtmıştır (Şekil 7G). Sızan hücreler arasında TF eksprese eden hücrelerin sıklığı genel olarak daha yüksek bir eğilim gösterse de, sitokin ekspresyonunun frekansı değişmedi (Şekil S6D ve S6E). EAE ve WT ve CD4 içermeyen kontrol farelerinin omuriliğinin histolojisi^ΔMthfd2EAE'li fareler, Luxol Fast Blue boyama ile gösterildiği gibi, WT farelerinde omurilikte artan hücresellik ve CD3 pozitifliği gösterdi ve bu demiyelinizasyon ile ilişkilendirildi (Şekil 7I). Bu değişiklikler EAE olmayan kontrolde ve CD4'te yoktu.^ΔMthfd2fareler.

MTHFD2'nin rolü daha sonra IBD ve alerjik hava yolu hastalığı modellerinde test edildi. WT ve CD4DMthfd2 saf CD4 artı T hücreleri, IBD'yi başlatmak için Rag1 / alıcılara aktarıldı. WT hücreleri alan fareler, IBD ilerledikçe kilo vermeye başlasa da, CD4DMthfd2 T hücrelerinin alıcıları kilo almaya devam etti (Şekil 7J). Dalaklarda (Şekil S6F) ve kolonu boşaltan mezenterik lenf düğümlerinde (MLN'ler) önemli ölçüde daha az sayıda ve sıklıkta CD4DMthfd2 T hücresi bulundu (Şekil 7K ve S6G). T-bet plus , ROR t plus ve FoxP3 plus CD4DMthfd2 T hücrelerinin sayıları da MLN'lerde azaldı, ancak FoxP3 plus hücrelerinin sıklığı arttı (Şekil 7L ve S6H). Ancak, bu geç aşama zaman noktasında MLN'lerde FoxP3/T-bet ve FoxP3/RORgt hücre sayısı oranlarında hiçbir fark yoktu (Şekil S6I). MTHFD2'nin in vivo hava yolu iltihabı CRISPR ekranında (Şekil 1C) mütevazı bir vuruş olarak bulgularına benzer şekilde, Alternaria'nın neden olduğu alerjik hava yolu hastalığına maruz kalan CD4DMthfd2 fareleri, bronşioalveolar lavaj sıvısında (BALF) nötrofil bolluğunda azalma eğilimine sahipti, ancak hiçbir BALF lenfosit, eozinofil ve makrofaj sayılarında değişiklikler gözlendi (Şekil S7A).

Son olarak, MTHFD2i'nin etkisi genel bağışıklık aktivitesi üzerinde test edildi. OVA'ya özgü OT-II CD45.2^artıCD4^artıT hücreleri benimseyerek CD45.1'e aktarıldı^artıfareler, daha sonra tam Freund adjuvanı (CFA) içeren bir OVA emülsiyonu ile deri altından immünize edildi ve günlük olarak oral araç veya MTHFD2i ile tedavi edildi. Vücut ağırlığı her koşulda değişmedi (Şekil S7B). Aktarılan OT-II CD45.2'nin genişletilmesi^artıhücreler, bağışıklaştırılmış MTHFD2i ile tedavi edilen farelerde biraz gecikti, ancak 7. günde araç sayılarına ulaştı (Şekil S7C–S7E). Bununla birlikte, LN'lerin boşaltılmasında IFNg artı hücrelerin sıklığı azaldı (Şekil S7F). Bu veriler, in vivo MTHFD2i tedavisinin, azaltılmış enflamatuar sitokin üretimine rağmen, akut stimülasyonun ardından antijene özgü T hücre genişlemesine izin verdiğini göstermektedir.

TARTIŞMA

T hücresi aktivasyonu, farklılaşması ve işlevi, hücrelerin artan enerji, biyosentetik yapı taşları ve sinyal molekülleri taleplerini karşılamak için uygun metabolik yeniden programlamayı gerektirir. Bu çalışmada, birincil CD4 artı T hücrelerinde 1C metabolizmasının işlevini araştırdık. İn vivo birincil T hücresi CRISPR tabanlı tarama ve gen ekspresyon verilerinin bir kombinasyonu kullanılarak MTHFD2, anti-inflamatuar tedaviler için potansiyel bir hedef olarak tanımlandı. MTHFD2 inhibisyonu veya eksikliği genellikle CD4 artı T hücre proliferasyonunun azalmasına yol açtı. Özellikle, bu, FoxP3 ekspresyonunun indüklenmesi ve Th17 hücrelerinde baskılayıcı fonksiyonun yanı sıra gelişmiş Treg hücre farklılaşması ile ilişkilendirildi. Bu veriler, MTHFD2'nin Th17-Treg hücre ekseninde metabolik bir kontrol noktası olarak işlev görebileceğini ve MTHFD2i tedavisinin patojenik bir fenotipten daha anti-inflamatuar bir fenotipe doğru dengeyi diktiğini göstermektedir. Gerçekten de, MTHFD2 inhibisyonu veya genetik eksiklik, çoklu in vivo otoimmünite ve aşırı duyarlılık modellerinde hastalık şiddetini iyileştirdi.

1C metabolizması serin-glisin metabolizması, folat döngüsü ve metionin döngüsünden oluşur ve de novo purin sentezi, metil donör üretimi ve redoks regülasyonu dahil olmak üzere çeşitli süreçlerin merkezinde yer alır (Yang ve Vousden, 2016). 1C metabolizması, TCR stimülasyonu ile sağlam bir şekilde birleşir (Tan ve diğerleri, 2017) ve T hücresi genişlemesini desteklemek için gereklidir (Ma ve diğerleri, 2017). Folat döngüsü, sitozolik ve mitokondriyal bileşenlere ayrılmıştır. Sitozolde MTHFD1, 5,10-metilenTHF, 10-formilTHF ve formatı birbirine dönüştürür. Mitokondride aynı reaksiyonlar MTHFD2 ve MTHFD1L tarafından gerçekleştirilir. Ortaya çıkan bu ara maddeler, de novo purin sentezinde formilasyon adımlarını desteklemek için kullanılır. MTHFD1 ve MTHFD2 ayrıca redoks durumunu NAD(H) ve NADP(H) üretimi yoluyla modüle edebilir (Ducker ve Rabinowitz, 2017). Bazı hücre tipleri, mitokondriyal yol disfonksiyonu ayarları altında sitozolik kaynağa geçişte esneklik gösterse de (Ducker ve diğerleri, 2016), T hücrelerinin 1C birimleri ve indirgeyici türler sağlamak için ağırlıklı olarak mitokondriyal yola bağlı olduğu öne sürülmüştür (Ron- Harel ve diğerleri, 2016). T hücrelerinin de serin alımına dayandığı gösterilmiştir ve in vivo bağışıklık tepkileri, diyetteki serin miktarları ile modüle edilebilir. Serin açlığının etkilerine, bozulmamış kurtarma yollarının varlığında bile pürin biyosentezinin sınırlandırılması aracılık eder ve glisin ve formatın sağlanmasıyla atlanabilir (Ma ve diğerleri, 2017). Verilerimiz bu bulgulara katkıda bulunur ve MTHFD2'yi CD4'ü etkileyen kritik bir düzenleyici olarak gösterir.^artıT hücre proliferasyonu ve farklılaşması.

ekanikosit

1C metabolizması hücre metabolizmasında geniş bir rol oynamasına rağmen, bazı fonksiyonların T hücre alt kümelerini seçmek için farklı olduğunu bulduk. Tüm insan ve fare T hücreleri, MTHFD2 eksikliği ile daha az ölçüde çoğaldı, bu da MTHFD2'nin T hücresi büyümesini ve bölünmesini desteklemek için ortak bir işlevi olduğunu gösterir. Ancak MTHFD2 eksikliğinin T hücre farklılaşması ve efektör işlevi üzerindeki etkileri, test edilen her alt kümede farklılık göstermiştir. Thl hücreleri, azaltılmış T-bet indüksiyonu ve azalmış sitokin üretimi ile bozulmuş farklılaşma gösterdi. Th17 hücreleri ayrıca farklılaşmayı değiştirmiş ve sitokin üretimini azaltmıştır. ROR t değiştirilmemiş olmasına rağmen, MTHFD2-eksik Th17 hücreleri, Treg hücresi TF FoxP3'ü yukarı regüle etti ve aktive edilmiş CD8 artı T hücrelerinin proliferasyonunu baskılama yeteneği kazandı. Treg hücreleri, düşük TGF-b koşulları altında gelişmiş farklılaşma sergiledi. Bu alt kümelerin her birinin farklı metabolik gereksinimlere sahip olabileceği artık iyi bilinmektedir (Bantug ve diğerleri, 2018; Buck ve diğerleri, 2015). Verilerimiz, MTHFD2'nin, Treg hücresi kaderini ve işlevini teşvik ederken Teff hücreleri için seçici olarak gerekli olduğunu göstermektedir. Bu sonuçların, Treg hücre farklılaşmasını veya Th17'nin Treg hücrelerine transdiferansiasyonunu doğrudan teşvik etmek için mütevazı etkilere sahipken, Teff hücre farklılaşmasını bozan veya değiştiren GLUT1, GLS veya ASCT2 eksikliklerinden farklı olması dikkat çekicidir (Johnson ve diğerleri, 2018; Macintyre ve diğerleri). ., 2014; Nakaya ve diğerleri, 2014).

MTHFD2 eksikliğinin etkileri format veya pürin nükleobazları ile kurtarıldığından, bu farklı T hücresi kaderleri MTHFD2'nin enzimatik aktivitesine bağlı görünmektedir. MTHFD2 eksikliği ile değiştirilmiş redoks dengesinin anlamlı bir etkisi bulamamamıza rağmen, değişmiş de novo purin sentezi kritik görünmektedir. MTHFD2i tedavisi, purin sentezi ara ürünleri GAR, SAICAR ve AICAR'ın birikmesini indüklerken, özellikle guanin olmak üzere pürin konsantrasyonlarının azalmasına yol açtı. Bu ara maddeler, daha fazla biyosentez için formilasyon gerektirir ve MTHFD2- türevli metabolit formatı ortama eklendiğinde etkiler kurtarıldı ve MTHFD2i için hedefli bir biyokimyasal mekanizma desteklendi. DNA ve RNA sentezini desteklemek için de novo nükleotid sentezi, T hücresi proliferasyonu için gereklidir (Que' me' neur ve diğerleri, 2003, 2004). Bu nedenle, MTHFD2i'nin T hücresi genişlemesini bozduğu mekanizmanın bir bileşeni, yetersiz nükleotid üretimi gibi görünmektedir.

flavonoid

Yeterli nükleotidlerin sentezlenmemesi, efektör T hücrelerini çoklu mekanizmalar yoluyla baskılayabilir. AMPK ve mTORC1, Teff ve Treg hücrelerinde genellikle zıt rollere sahip metabolik yeniden programlamanın ana itici güçleridir (Bantug ve diğerleri, 2018; Buck ve diğerleri, 2015). T hücrelerinde MTHFD2i tedavisinin, bir adenosin analoğu ve AMPK aktivatörü olarak dikkate değer bir metabolit olan AICAR'ın akut birikimine yol açtığını gösterdik (Rae ve Mairs, 2019; Su ve diğerleri, 2019). Ancak, seçilen zaman noktalarında AMPK etkinliğinin arttığına dair bir kanıt yoktu. Bu, AMPK'nin ek düzenlemesini yansıtabilir, ancak AICAR'ın AMPK'den bağımsız etkileri de olabilir (Dembitz ve diğerleri, 2019). mTORC1 ayrıca pürin konsantrasyonlarına karşı da duyarlıdır çünkü azalmış guanin mevcudiyeti mTORC1 aktivatörü Rheb'nin aktivitesini baskılar (Emmanuel ve diğerleri, 2017; Hoxhaj ve diğerleri, 2017). AICAR birikimi ve mTORC1 aktivitesinde azalma, bu nedenle, MTHFD2i ile muamele edilmiş Th1 ve Th17 hücrelerinin bozulmuş oluşumuna ve gelişmiş Treg hücrelerinin oluşumuna katkıda bulunabilir. mTORC1 sinyalinin baskılanması, metabolik programdaki glikolizden mitokondriyal solunuma geçişe ve MTHFD2i ile tedavi edilen Th17 hücrelerinde TCA metabolit bolluğunun değişmesine de katkıda bulunabilir. mTORC1 yolu, anabolik metabolizmayı teşvik etmede merkezi bir rol oynar ve sırayla MTHFD2 ekspresyonunu indükleyebilen TF ATF4'ün birikmesini sağlayabilir (Ben-Sahra ve diğerleri, 2016).

Metabolik akış, epigenetik düzenlemeye bağlıdır, çünkü metabolitler, protein ve DNA metilasyonu için evrensel metil donörü S-adenosil metionin (SAM) üretmek için 1C metabolizması dahil olmak üzere birçok epigenetik modifikasyona katkıda bulunur (Sharma ve Rando, 2017). Bununla birlikte, aktive edilmiş T hücrelerinde karbon izleme deneyleri, glikozdan türetilen ve eksojen serinden türetilen 1C birimlerinin, metiyonin döngüsüne ve metilasyona anlamlı bir şekilde katkıda bulunmadığını göstermektedir (Ma ve diğerleri, 2017). Metabolik akış, alfa-ketoglutarat, fumarat ve süksinat dahil olmak üzere TCA metabolitlerinin bolluğundaki değişiklikler yoluyla metilasyon modellerini de etkileyebilir. Spesifik olarak fumarat ve süksinat, DNA ve histon demetilazları inhibe eder (Su ve diğerleri, 2016). MTHFD2i ile muamele edilmiş Th17 hücrelerinde bu metabolitlerin tükenmesi ile uyumlu olarak, H3K27me3 genom boyunca büyük ölçüde azaldı ve DNA metilasyonu, transdiferansiasyon fenotipine katkıda bulunabilecek Foxp3 proksimal promotöründe spesifik olarak azaldı. Th17 hücre farklılaşma fenotipi, format takviyesi ile kurtarılmadı; bu, diğer nükleotit konsantrasyon algılama mekanizmalarının aktivitesi gibi ek yolların muhtemelen FoxP3 düzenlemesine katkıda bulunduğunu gösterir.

Acteoside (Verbascoside)

MTHFD2'nin ayrıca bu enzimin proinflamatuar etkilerine katkıda bulunabilecek enzimatik olmayan roller oynadığı da bildirilmiştir. Kanser hücrelerinde MTHFD2, hücre döngüsü ilerlemesini teşvik etmek için DNA replikasyon bölgeleriyle birlikte lokalize olan nükleer fonksiyonlara sahip olabilir (Gustafsson Sheppard ve diğerleri, 2015). Murin kök hücrelerinde, MTHFD2'nin genomik stabiliteyi korumak için DNA onarımını modüle ettiği gösterilmiştir (Yue ve diğerleri, 2020). Renal hücreli karsinomda, MTHFD2'nin mRNA metilasyonu yoluyla metabolik yeniden programlama için çok önemli olduğu bulunmuştur (Green ve diğerleri, 2019). MTHFD2 için bu roller, bulgularımız ile birbirini dışlamasa da, formatın T hücrelerinde MTHFD2 eksikliğinin birçok fenotipini kurtarma yeteneği, MTHFD2 enzimatik aktivitesinin T hücresi proliferasyonu ve kaderinin birincil itici gücü olduğunu göstermektedir.

MTHFD2, kanser karşıtı ortamlarda büyük ölçüde bir ilaç hedefi olarak kabul edilmiştir. Aynı zamanda umut verici bir anti-inflamatuar hedef olabilir ve çoğu yetişkin dokusunda düşük ekspresyon göz önüne alındığında, şu anda mevcut olan anti-folatlara kıyasla daha az yan etki sunabilir. Örneğin, MTX'in bir hedefi olan DHFR, yetişkin dokularında geniş ölçüde eksprese edilir (Nilsson ve diğerleri, 2014). Bu nedenle MTX, gastrointestinal toksisite dahil olmak üzere çeşitli yan etkilerle ilişkilendirilebilir. Ayrıca, MTX'in etki mekanizması, kapsamlı geçmişine rağmen yeterince anlaşılmamıştır (Cronstein ve Aune, 2020). MTHFD2'nin yüksek düzeyde düzenlenmiş ekspresyonu ve sitozolik MTHFD1 yolu ile fazlalık potansiyeli, spesifik hücre popülasyonlarının MTHFD2'ye seçici bağımlılığı ile sonuçlanabilir. Bulgularımız MTHFD2'yi CD4'te kritik bir metabolik kontrol noktası olarak tanımlıyor^artıT hücreleri. Kanser hücresi biyolojisi ile hızla çoğalan T hücrelerinin biyolojisi arasında geniş bir örtüşme olmasına rağmen, CD4 artı T hücre alt kümelerinin, hücre farklılaşması ve fonksiyonunun modülasyonu yoluyla ek bir duyarlılık sergilediğini bulduk. Kanser tedavilerinde MTHFD2'yi hedeflemenin, anti-tümör bağışıklığını kısıtlayabilmesi muhtemeldir. Bununla birlikte, Th17 hücre aracılı inflamasyonun hastalığa katkıda bulunduğu kolorektal karsinom gibi ayarlar MTHFD2is için çok uygun olabilir. MTHFD2is'e T hücresi duyarlılığı, CD4 ayarlarında etkili bir immünoterapi şekli olabilir^artıT hücre güdümlü inflamasyon kanserin ötesindedir ve şu anda mevcut terapötik ajanlardan daha az yan etkiye yol açar.

Çalışmanın sınırlamaları

Bu çalışmada kullanılan MTHFD2i, MTHFD2 için 0.0063 mM ve MTHFD1 için 0.57 mM IC50 değerine sahiptir; bu nedenle, MTHFD2 ve MTHFD1 ikili inhibisyonunun küçük hedef dışı etkileri göz ardı edilemez. Th17 hücrelerindeki anormal FoxP3 yukarı regülasyonunun, format sağlanmasıyla kurtarılmadığı, ancak mTORC1 aktivitesinin olduğu göz önüne alındığında, bu fenotipin altında yatan mekanizma daha fazla araştırma gerektirmektedir. Ek olarak, tüm in vivo modeller, MTHFD2i tedavisi veya hastalık indükleme zamanından itibaren genetik ablasyon ile gerçekleştirilmiştir ve T hücre fenotiplemesi tek bir zaman noktasında gerçekleştirilmiştir. MTHFD2 eksikliğinin hastalık patogenezi üzerindeki etkisini daha iyi karakterize etmek için, CD4 artı T hücre alt kümelerinin in vivo olarak farklı şekilde etkilenip etkilenmediğini daha kesin olarak belirlemek için daha ileri çalışmalar T hücre popülasyonlarının seri karakterizasyonu ile zaman süreci deneylerini içermelidir. Son olarak, bu çalışmanın klinik uygulamalarla ilgisini artırmak için, hastalık başlangıcından sonra başlatılan MTHFD2i tedavisinin etkinliği test edilmelidir.

YILDIZ YÖNTEMLERİ

Ayrıntılı yöntemler bu belgenin çevrimiçi versiyonunda verilmiştir ve aşağıdakileri içerir:

• ANAHTAR KAYNAKLAR TABLOSU

• KAYNAK KULLANILABİLİRLİĞİ

• B Kurşun kontağı

• B Malzeme bulunabilirliği

• B Veri ve kod kullanılabilirliği

  
  

• DENEYSEL MODEL VE ​​KONU DETAYLARI

• B Fare B İnsan T hücreleri

• B Hücre Hatları

  
  

• YÖNTEM DETAYLARI

• B In vitro fare CD4^artıT hücre aktivasyonu ve farklılaşması

• B Th17 hücre baskılama testi

• B In vitro insan CD4^artıT hücre kültürü koşulları

• B CRISPR taraması B Kütle spektrometrisi metabolomikleri

• B Proton nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (1H-MRS)

• B İmmünoblotlama

• B CUT&RUN B EpigenDx Hedefli NextGen Bisülfit Dizilemesi

• B IHC ve akış sitometrisi için in vivo EAE modelleri

• B EAE modelinde in vivo LY345899 tedavisi

• B DTH modelinde in vivo DS18561882 tedavisi B WT ve CD4 ile in vivo IBD modeli^ΔMthfd2çöp arkadaşları

• B WT ve CD4 ile in vivo alerjik hava yolu hastalığı modeli^ΔMthfd2çöp arkadaşları

• B OVA bağışıklama modelinde in vivo DS18561882 tedavisi

  
  

• KANTİFİKASYON VE İSTATİSTİKSEL ANALİZ

TAMAMLAYICI BİLGİLER

Ek bilgiler çevrimiçi olarak https://doi.org/10.1016/j adresinde bulunabilir. bağışıklık.2021.10.011.

TEŞEKKÜRLER

Bu projeye katkıda bulundukları için Rathmell laboratuvarının üyelerine teşekkür ederiz. RNA-seq verileri sağladığı için Thomas Aune'e ve pMx-U6-gRNA-GFP yapısını sağladığı için J. Cools'a (VIB) teşekkür ederiz. MTHFD2 qPCR primerlerini tasarladığı için Max R. Van Belkum'a teşekkür ederiz. Raze Therapeutics, Inc.'den (Boston, MA) Nello Mainolfifi, Vipin Suri, Adam Friedman ve Mark Manfredi'ye, bulguları doğrulamak için kullanılan Raze 1459 bileşiğini sağladıkları için teşekkür ederiz (veriler gösterilmemiştir). BioRender ile diyagramlar oluşturuldu. Leica Bond RX için NCI/NIH Kanser Merkezi destek hibesi 5P30 CA68485-19 ve paylaşılan enstrümantasyon hibesi S10 OD023475-01A1 tarafından desteklenen Translasyonel Patoloji Paylaşılan Kaynağını kabul ediyoruz. Bu çalışma, Lupus Research Alliance için William E. Paul Seçkin Yenilikçi Ödülü (JCR'ye), R01s DK105550 (JCR'ye), HL136664 (JCR ve DCN'ye), CA217987 (JCR'ye), AI153167 (JCR'ye), AI137075 (AKM'ye), T32 DK101003 (KV) ve T32 GM007347 (AS'ye).

YAZAR KATKILARI

AS, GA ve JCR araştırmayı tasarladı. AS, GA, KV, DRH, XX, MZM, XY, KLB, NC, MMW, ACY, DLG, AES, SKS, SNF, AMC, PF, TB ve JCG-C. araştırmayı gerçekleştirdi. AS, GA, XY, JK, DCN, AKM, JDR ve JCR verileri analiz etti. AS ve JCR, makaleyi diğer yazarların katkılarıyla yazdı.

ÇIKAR BEYANI

JCR, Sitryx Therapeutics'in kurucusu, bilimsel danışma kurulu üyesi ve hissedarıdır; bilimsel danışma kurulu üyesi ve Caribou Biosciences hissedarı; NirogyTherapeutics'in bilimsel danışma kurulu üyesi; son 3 yıl içinde Merck, Pfizer ve Mitobridge'e danışmanlık yaptı; ve Incyte Corp., CalitheraBiosciences ve Tempest Therapeutics'ten araştırma desteği almıştır. JDR, Raze Therapeutics, Toran, Serien Therapeutics ve Farber Partners'ın kurucu ortağı ve hissedarı ve Agios Pharmaceuticals, Kadmon Pharmaceuticals, Bantam Pharmaceuticals, Colorado Research Partners, RafaelHoldings, the Barer Institute ve LEAF Pharmaceuticals; Pfizer ve Rafael'den danışmanlık ücretleri ve araştırma fonu aldı ve Princeton Üniversitesi'ne ait patentlerin mucidi. AMC, PF ve TB, Sitryx Therapeutics'in çalışanlarıdır.

KAPSAYICILIK VE ÇEŞİTLİLİK

İnsan dışı deneklerin seçiminde cinsiyet dengesini sağlamaya çalıştık. Bu makalenin yazarlarından biri veya daha fazlası, bilimde yeterince temsil edilmeyen bir etnik azınlık olarak kendini tanımlıyor. Bu çalışma için bilimsel olarak alakalı referanslara atıfta bulunurken, referans listemizde toplumsal cinsiyet dengesini teşvik etmek için de aktif olarak çalıştık. Bu makalenin yazar listesi, araştırmanın yürütüldüğü yerden veri toplama, tasarım, analiz ve/veya çalışmanın yorumlanmasına katılan katkıda bulunanları içerir.

REFERANSLAR

Anderson, GR, Winter, PS, Lin, KH, Nussbaum, DP, Çakır, M., Stein, EM, Soderquist, RS, Crawford, L., Leeds, JC, Newcomb, R., et al. (2017). KRAS Mutant Kanserlerinde Terapötik İşbirliği Manzarası, Tümör Evriminin Kontrol Edilmesine İlişkin İlkeleri Ortaya Çıkarıyor. Hücre Temsilcisi 20, 999–1015.

Aune, TM, Crooke, PS, 3rd, Patrick, AE, Tossberg, JT, Olsen, NJ ve Spurlock, CF, 3rd (2017). Otoimmünitede uzun kodlamayan RNA'ların ekspresyonu ve arttırıcı fonksiyon ve otoimmün hastalık riski genetik varyantlarına bağlantı. J. Otoimmün. 81, 99-109.

Bantug, GR, Galluzzi, L., Kroemer, G. ve Hess, C. (2018). Sağlık ve hastalıkta T hücre metabolizmasının spektrumu. Nat. Rev. İmmünol. 18, 19–34. Ben-Sahra, I., Hoxhaj, G., Ricoult, SJH, Asara, JM ve Manning, BD (2016). mTORC1, mitokondriyal tetrahidrofolat döngüsünün kontrolü yoluyla pürin sentezini indükler. Bilim 351, 728-733.

Brown, PM, Pratt, AG ve Isaacs, JD (2016). Romatoid artritte metotreksatın etki mekanizması ve biyobelirteçlerin araştırılması. Nat. Rev. Romatol. 12, 731-742.

Buck, MD, O'Sullivan, D. ve Pearce, EL (2015). T hücre metabolizması bağışıklığı harekete geçirir. J. Uzm. Med. 212, 1345-1360.

Cantor, JR, Abu-Remaileh, M., Kanarek, N., Freinkman, E., Gao, X., Louissaint, A., Jr., Lewis, CA ve Sabatini, DM (2017). Fizyolojik Ortam Hücresel Metabolizmayı Yeniden Bağlar ve Ürik Asidi UMP Sentezinin Endojen İnhibitörü Olarak Ortaya Çıkarır. Hücre 169, 258-272.e17.

Cronstein, BN ve Aune, TM (2020). Metotreksat ve inflamatuar artritte etki mekanizmaları. Nat. Rev. Romatol. 16, 145–154.

Dembitz, V., Tomic, B., Kodvanj, I., Simon, JA, Bedalov, A. ve Visnjic, D. (2019). Ribonükleozid AICar, pirimidin tükenmesi yoluyla ATR/Chk1'i aktive ederek miyeloid löseminin farklılaşmasını indükler. J. Biol. Kimya 294, 15257–15270.

Dendrou, CA, Fugger, L. ve Friese, MA (2015). Multipl sklerozun immünopatolojisi. Nat. Rev. İmmünol. 15, 545-558.

Ducker, GS ve Rabinowitz, JD (2017). Sağlık ve Hastalıkta Tek Karbon Metabolizması. Hücre Metab. 25, 27-42.

Ducker, GS, Chen, L., Morscher, RJ, Ghergurovich, JM, Esposito, M., Teng, X., Kang, Y. ve Rabinowitz, JD (2016). Sitosolik Bir Karbon Akının Tersine Dönmesi Mitokondriyal Folat Yolu Kaybını Dengeler. Hücre Metab. 23, 1140–1153.

Emmanuel, N., Ragunathan, S., Shan, Q., Wang, F., Giannakou, A., Huser, N., Jin, G., Myers, J., Abraham, RT ve Ünsal-Kacmaz, K (2017). Purin Nükleotid Kullanılabilirliği, Rheb GTPaz aracılığıyla mTORC1 Aktivitesini Düzenler. Hücre Temsilcisi 19, 2665–2680.

Farber, S., Diamond, LK, Mercer, RD, Sylvester, RF ve Wolff, JA (1948). Folik asit antagonisti 4-aminopteroil-glutamik asit tarafından üretilen çocuklarda akut lösemide geçici remisyonlar. N. İngilizce J. Med. 238, 787-793.

Field, MS, Kamynina, E., Watkins, D., Rosenblatt, DS ve Stover, PJ (2015). Şiddetli kombine immün yetmezliğin metabolik ve beslenme belirleyicilerine dair yeni görüşler. Nadir Dis. 3, e1112479.

Fuseini, H., Yung, JA, Cephus, JY, Zhang, J., Goleniewska, K., Polosukhin, VV, Peebles, RS, Jr. ve Newcomb, DC (2018). Testosteron Ev Tozu Akarının Neden Olduğu Tip 2 ve IL-17A Aracılı Hava Yolu Enflamasyonunu Azaltır. J. İmmünol. 201, 1843-1854.

Govindaraju, V., Young, K. ve Maudsley, AA (2000). Beyin metabolitleri için Proton NMR kimyasal kaymaları ve birleştirme sabitleri. NMR Biomed. 13, 129-153.

Green, NH, Galvan, DL, Badal, SS, Chang, BH, LeBleu, VS, Long, J., Jonasch, E. ve Danesh, FR (2019). MTHFD2, RNA metilasyonunu renal hücreli karsinomda metabolik yeniden programlamaya bağlar. Onkogen 38, 6211-6225.

Gustafsson, R., Jemth, A.-S., Gustafsson, NMS, F€ arnega˚rdh, K., Loseva, O., Wiita, E., Bonagas, N., Dahlund, L., Llona-Minguez, S., H€ aggblad, M., et al. (2017). Substrat Bazlı Bir İnhibitör ile Komplekste Ortaya Çıkan Kanser Hedefi MTHFD2'nin Kristal Yapısı. Kanser Araş. 77, 937-948.

Gustafsson Sheppard, N., Jarl, L., Mahadessian, D., Strittmatter, L., Schmidt, A., Madhusudan, N., Tegne´r, J., Lundberg, EK, Asplund, A., Jain, M . ve Nilsson, R. (2015). Folat-bağlı enzim MTHFD2 bir nükleer proteindir ve hücre proliferasyonunu destekler. bilim 5, 15029.

Hoxhaj, G., Hughes-Hallett, J., Timson, RC, Ilagan, E., Yuan, M., Asara, JM, Ben-Sahra, I. ve Manning, BD (2017). mTORC1 Sinyal Ağı, Hücresel Pürin Nükleotid Düzeylerindeki Değişiklikleri Algılar. Hücre Temsilcisi 21, 1331-1346.

Johnson, MO, Wolf, MM, Madden, MZ, Andrejeva, G., Sugiura, A., Contreras, DC, Maseda, D., Liberti, MV, Paz, K., Kishton, RJ, et al. (2018). Glutaminaz-Bağımlı Metabolizma ile Th17 ve Th1 Hücre Farklılaşmasının Belirgin Düzenlemesi. Hücre 175, 1780–1795.e19.

Ju, H.-Q., Lu, Y.-X., Chen, D.-L., Zuo, Z.-X., Liu, Z.-X., Wu, Q.-N., Mo, H.-Y., Wang, Z.-X., Wang, D.-S., Pu, H.-Y., et al. (2019). Kolorektal Kanserde MTHFD2'nin İnhibisyonu ile Redoks Homeostazının Modülasyonu: Mekanizmalar ve Terapötik Etkiler. J. Natl. Kanser Enst. 111, 584-596.

Kawai, J., Toki, T., Ota, M., Inoue, H., Takata, Y., Asahi, T., Suzuki, M., Shimada, T., Ono, K., Suzuki, K., et al. (2019). Vivo Antitümör Aktivitesi Olan Güçlü, Seçici ve Ağızdan Mevcut MTHFD2 İnhibitörünün (DS18561882) Keşfi. J. Med. Kimya 62, 10204-10220.

Kim, J., Yang, G., Kim, Y., Kim, J. ve Ha, J. (2016). AMPK aktivatörleri: etki mekanizmaları ve fizyolojik aktiviteler. Tecrübe. Mol. Med. 48, e224.

Koufaris, C., Gallage, S., Yang, T., Lau, C.-H., Valbuena, GN ve Keun, HC (2016). MCF-7 Meme Kanseri Hücrelerinde MTHFD2'nin Bastırılması Glikolizi, Eksojen Glisin Bağımlılığını ve Folat Tükenmesine Duyarlılığı Artırır. J. Proteome Araş. 15, 2618–2625.

Li, W., Xu, H., Xiao, T., Cong, L., Love, MI, Zhang, F., Irizarry, RA, Liu, JS, Brown, M. ve Liu, XS (2014). MAGeCK, genom ölçeğindeki CRISPR/Cas9 nakavt ekranlarından temel genlerin sağlam bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Genom Biol. 15, 554.

Ma, EH, Bantug, G., Griss, T., Condotta, S., Johnson, RM, Samborska, B., Mainolfifi, N., Suri, V., Guak, H., Balmer, ML, et al. (2017). Serin, Efektör T Hücre Genişlemesi için Temel Bir Metabolittir. Hücre Metab. 25, 345-357.

Macintyre, AN, Gerriets, VA, Nichols, AG, Michalek, RD, Rudolph, MC, Deoliveira, D., Anderson, SM, Abel, DE, Chen, BJ, Hale, LP, et al. (2014). Glukoz Taşıyıcı Glut1, CD4 T Hücre Aktivasyonu ve Efektör Fonksiyonu için Seçici Olarak Esastır. Hücre Metab. 20, 61-72.

Michalek, RD, Gerriets, VA, Jacobs, SR, Macintyre, AN, MacIver, NJ, Mason, EF, Sullivan, SA, Nichols, AG ve Rathmell, JC (2011). Son teknoloji: farklı glikolitik ve lipid oksidatif metabolik programlar, efektör ve düzenleyici CD4 artı T hücre alt kümeleri için gereklidir. J. İmmünol. 186, 3299–3303.

Nakaya, M., Xiao, Y., Zhou, X., Chang, J.-H., Chang, M., Cheng, X., Blonska, M., Lin, X. ve Sun, S.-C . (2014). İnflamatuar T hücresi tepkileri, amino asit taşıyıcı ASCT2 glutamin alımını kolaylaştırmasına ve mTORC1 kinaz aktivasyonuna dayanır. Bağışıklık 40, 692-705.

Nilsson, R., Jain, M., Madhusudhan, N., Sheppard, NG, Strittmatter, L., Kampf, C., Huang, J., Asplund, A. ve Mootha, VK (2014). Metabolik enzim ekspresyonu, kanserde MTHFD2 ve mitokondriyal folat yolu için önemli bir rolü vurgular. Nat. Komün. 5, 3128.

Palmer, LD, Maloney, KN, Boyd, KL, Goleniewska, AK, Toki, S., Maxwell, CN, Chazin, WJ, Peebles, RS, Jr., Newcomb, DC ve Skaar, EP (2019). Doğal Bağışıklık Proteini S100A9, T-Yardımcı Hücre Tipi 2-aracılı Alerjik Hava Yolu Enflamasyonundan Korur. Ben. J. Solunum. Hücre Mol. Biol. 61, 459-468.

Pikman, Y., Puissant, A., Alexe, G., Furman, A., Chen, LM, Frumm, SM, Ross, L., Fenouille, N., Bassil, CF, Lewis, CA, et al. (2016). Akut miyeloid lösemide MTHFD2'yi hedefleme. J. Uzm. Med. 213, 1285-1306.

Que' me' neur, L., Gerland, L.-M., Flacher, M., Ffrench, M., Revillard, J.-P. ve Genestier, L. (2003). Pürin ve pirimidin nükleotitleri ile hücre döngüsü, proliferasyon ve primer T lenfositlerin hayatta kalmasının farklı kontrolü. J. İmmünol. 170, 4986-4995.

Que' me' neur, L., Beloeil, L., Michalet, M.-C., Angelov, G., Tomkowiak, M., Revillard, J.-P. ve Marvel, J. (2004). De novo nükleotid biyosentezinin kısıtlanması, klonal genişlemeye ve efektör ve bellek CD8 T hücrelerine farklılaşmaya müdahale eder. J. İmmünol. 173, 4945-4952.

Rae, C. ve Mairs, RJ (2019). AICAR tarafından AMPK aktivasyonu, prostat kanseri hücrelerini radyoterapiye duyarlı hale getirir. Oncotarget 10, 749–759.

Ron-Harel, N., Santos, D., Ghergurovich, JM, Sage, PT, Reddy, A., Lovitch, SB, Dephoure, N., Satterstrom, FK, Sheffer, M., Spinelli, JB, et al. (2016). Mitokondriyal Biyogenez ve Proteom Yeniden Modellenmesi, T Hücre Aktivasyonu için Tek Karbon Metabolizmasını Teşvik Ediyor. Hücre Metab. 24, 104-117.

Shahi, SK, Freedman, SN, Murra, AC, Zarei, K., Sompallae, R., Gibson Corley, KN, Karandikar, NJ, Murray, JA ve Mangalam, AK (2019). Prevotella histicola, Bir İnsan Bağırsak Komensal, Multipl Sklerozun Bir Hayvan Modelinde COPAXONE Kadar Güçlüdür. Ön. immünol. 10, 462.

Shalem, O., Sanjana, NE, Hartenian, E., Shi, X., Scott, DA, Mikkelson, T., Heckl, D., Ebert, BL, Root, DE, Doench, JG ve Zhang, F. (2014). İnsan hücrelerinde genom ölçekli CRISPR-Cas9 nakavt taraması. Bilim 343, 84-87.

Sharma, U. ve Rando, OJ (2017). Epigenomda Metabolik Girdiler. Hücre Metab. 25, 544-558.

Shi, LZ, Wang, R., Huang, G., Vogel, P., Neale, G., Green, DR ve Chi, H. (2011). HIF1alfa'ya bağımlı glikolitik yol, TH17 ve Treg hücrelerinin farklılaşması için bir metabolik kontrol noktası düzenler. J. Uzm. Med. 208, 1367-1376.

Shin, M., Momb, J. ve Appling, DR (2017). İnsan mitokondriyal MTHFD2, ikili bir redoks kofaktörüne özgü metilentetrahidrofolat dehidrojenaz/metiltetrahidrofolat siklohidrolazdır. Kanser Metab. 5, 11.

Skene, PJ ve Henikoff, S. (2017). DNA bağlanma bölgelerinin yüksek çözünürlüklü haritalanması için etkili bir hedeflenmiş nükleaz stratejisi. eLife 6, e21856.

Su, C.-C., Hsieh, K.-L., Liu, P.-L., Yeh, H.-C., Huang, S.-P., Fang, S.-H., Cheng, W.-C., Huang, K.-H., Chiu, F.-Y., Lin, I.-L., et al. (2019). AICAR, Apoptozu İndükler ve AMPK/mTOR'a Bağlı Bir Yol Yoluyla Prostat Kanseri Hücrelerinde Göç ve İstilayı Engeller. Int. J. Mol. bilim 20, 1647.

Su, X., Wellen, KE ve Rabinowitz, JD (2016). Metilasyon ve asetilasyonun metabolik kontrolü. Kör. Görüş. Kimya Biol. 30, 52-60.

Tan, H., Yang, K., Li, Y., Shaw, TI, Wang, Y., Blanco, DB, Wang, X., Cho, J.-H., Wang, H., Rankin, S. , et al. (2017). Bütünleştirici Proteomik ve Fosfoproteomik Profifiling, T Hücre Aktivasyonunun Altında yatan Dinamik Sinyal Ağlarını ve Biyoenerjetik Yolları Ortaya Çıkarıyor. Bağışıklık 46, 488-503.

Toffalini, F., Kallin, A., Vandenberghe, P., Pierre, P., Michaux, L., Cools, J. ve Demoulin, J.-B. (2009). Füzyon proteinleri TEL-PDGFR ve FIP1L1-PDGFR, çoğalma ve bozulmadan kaçar. Hematolojik 94, 1085-1093.

Wan, X., Wang, C., Huang, Z., Zhou, D., Xiang, S., Qi, Q., Chen, X., Arbely, E., Liu, C.-Y., Du, P. ve Yu, W. (2020). Cisplatin, kolorektal kanser hücresindeki hücresel redoks dengesini bozmak için SIRT3-deasetilasyonu MTHFD2'yi inhibe eder. Hücre Ölümü Dis. 11, 649.

Wang, L., Xing, X., Chen, L., Yang, L., Su, X., Rabitz, H., Lu, W. ve Rabinowitz, JD (2019). Hedeflenmemiş LC-MS Metabolomikleri için Tepe Açıklama ve Doğrulama Motoru. Anal. Kimya 91, 1838-1846.

Yang, M. ve Vousden, KH (2016). Kanserde serin ve tek karbon metabolizması. Nat. Rev. Kanser 16, 650-662.

Yue, L., Pei, Y., Zhong, L., Yang, H., Wang, Y., Zhang, W., Chen, N., Zhu, Q., Gao, J., Zhi, M., et al. (2020). Mthfd2, Fare Kök Hücrelerinin Pluripotensini Korumak için Mitokondriyal Fonksiyonu ve DNA Onarımını Modüle eder. Kök Hücre Raporları 15, 529–545.

Zhu, Z. ve Leung, GKK (2020). Metabolik Bir Enzimden Daha Fazlası: Antikanser Tedavisinde Yeni Bir Hedef Olarak MTHFD2? Ön. Onkol. 10, 658.

YILDIZ YÖNTEMLERİ

ANAHTAR KAYNAKLAR TABLOSU

KAYNAK KULLANILABİLİRLİĞİ

Müşteri adayı

Kaynaklar ve reaktifler için daha fazla bilgi ve talepler, Baş İrtibat Kişisi Dr. Jeffrey Rathmell (jeff.rathmell@vumc.org) tarafından uygun MTA'nın tamamlanması üzerine yönlendirilmeli ve yerine getirilecektir.

Malzeme bulunabilirliği

Bu çalışmada üretilen plazmitler ve fare hatları, talep üzerine uygun MTA'nın tamamlanmasının ardından kullanıma sunulacaktır.

Veri ve kod kullanılabilirliği

CUT&RUN sıralama verileri GEO'da depolanmıştır ve yayın tarihi itibariyle (GSE180356) kamuya açıktır. Bu yazıda bildirilen mikroskopi verileri ve orijinal western blot görüntüleri, talep üzerine lider irtibat kişisi tarafından paylaşılacaktır. Bu belgede rapor edilen verileri yeniden analiz etmek için gereken her türlü ek bilgi, talep üzerine lider irtibat kişisinden edinilebilir.

Dokunulmazlık için Cistanches için tıklayın