Nlrc3 Nakavt Fareler, HTNV Enfeksiyonundan Sonra Renal Patolojik Değişiklikler Gösterdi

İletişim:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hantaan virüsü (HTNV) insanları enfekte eder ve hemorajik ateşe neden olur.böbreksendrom(HFRS). HFRS'nin iyi karakterize edilmiş hayvan modellerinin geliştirilmesi, aşı adaylarının ve terapötik ajanların test edilmesini hızlandırabilir ve HFRS'nin patogenezini incelemek için yararlı bir araç sağlayabilir. NLRC3'ün birden fazla immün düzenleyici rolü olduğundan, yeni bir HFRS modeli oluşturmak için Nlrc3−/− farelerin HTNV enfeksiyonuna duyarlılığını araştırdık. Nlrc3−/− farelerde kilo kaybı gelişti,böbrek kanaması,ve HTNV enfeksiyonundan sonra tübül genişlemesi, insan HFRS'nin birçok klinik semptomunu özetler. Ayrıca, enfekte Nlrc3−/− fareleri, serum, dalak ve böbrekte vahşi tip C57BL/6 (WT) farelerinden daha yüksek viral yükler gösterdi ve bunlardan bazıları, WT farelerinden daha fazla hematolojik bozukluk ve çoklu organlarda önemli patolojik değişiklikler gösterdi. Sonuçlarımız, HTNV ile enfekte olmuş Nlrc3−/− farelerin HFRS'li hastalara benzeyen klinik semptomlar ve patolojik değişiklikler geliştirebileceğini belirleyerek, aday aşıların ve terapötiklerin patogenezi ve test edilmesi için yeni bir model önermektedir.

Anahtar Kelimeler:HFRS, HTNV, NLRC3, böbrek kanaması, böbrek tübül genişlemesi

GİRİİŞ

Hemorajik ateşböbreksendromu (HFRS), hantavirüslerin kemirgenlerden insanlara zoonotik geçişinden sonra akut interstisyel nefropati sunar. Hastalık esas olarak Asya ve Avrupa'da görülmektedir (1, 2). HFRS'ye neden olan en yaygın patojenler, her biri farklı HFRS şiddetine neden olan Dobrava virüsü (DOBV), Puumala virüsü (PUUV), Seul virüsü (SEOV) ve Hantaan virüsüdür (HTNV). Hantavirüs enfeksiyonunun başlıca Andes virüsü (ANDV) ve Sin Nombre virüsü (SNV) tarafından hantavirüs pulmoner sendromuna (HPS) neden olduğu Kuzey ve Güney Amerika'da hastalık özellikleri farklıdır (3).

HFRS, yüksek ateş, hipotansiyon,böbrek yetmezliği ve kanama(4). Beş klinik aşamaya ayrılabilir: ateşli, hipotansif şok, oligürik, idrar söktürücü ve iyileşme. HFRS'ye yol açan akut bir HTNV enfeksiyonu epizoduna sıklıkla trombositopeni, lökositoz, anemi, yüksek serum kreatinin ve karaciğer enzimleri eşlik eder (5). Bu klinik semptom ve bulgular kısmen, HTNV'nin esas olarak böbreğe saldırması ve inflamatuar hücrelerin infiltrasyonunu içeren akut tübülointerstisyel nefrit ile karakterize edilen böbrek hasarını indüklemesi ile açıklanabilir (6), sonuç olarak diğer birçok organı etkiler (7)

Kemirgenler, hastalığa neden olmadan hayvanları kalıcı olarak enfekte eden Hantavirüslerin doğal rezervuarlarıdır (8). Tükürük, idrar ve dışkı gibi dışkıları, kontamine dışkının küçük parçacıklı aerosollerini soluyan insanları enfekte edebilen potansiyel kirleticiler haline gelir. Hantavirüsler genellikle yetişkin BALB/c ve C57BL/6 farelerinde asemptomatik enfeksiyona neden olurken (9), emziren ve yeni doğan farelerde ölümcül nörolojik hastalık veya kalıcı enfeksiyona neden olur (10, 11). Deneysel olarak PUUV ile enfekte sinomolgus makaklarında (Macaca fascicularis) nefropatik anormallikler gösterilmiş olsa da, bu hayvanlar hafif bir HFRS vakasına benzer şekilde sadece hafif proteinüri, immün hücre infiltrasyonu ve tübüler hasar böbrekleri göstermiştir (12). Ek olarak, burun yoluyla HTNV ile enfekte olan hamsterlar, sporadik viremi ancak akciğerlerde, beyinde ve böbreklerde yüksek seviyelerde viral genom kopyaları ile karakterize kalıcı asemptomatik enfeksiyona yol açmıştır. Kas enjeksiyonu yoluyla yüksek doz HTNV ile enfekte edilen gelincikler, vücut ağırlığında kademeli bir azalma (zaman içinde yüzde 5-12) gösterdi, ancak bozulmadıböbrek fonksiyonları,viremi yokluğu ve organlara virüs bulaşma eksikliği. Marmosetlerde, HTNV'nin intramüsküler enjeksiyonu, yüksek derecede serokonversiyona ve nötralize edici antikor üretimine yol açtı; tutarlı bir şekilde, bu hayvanlarda böbrek hasarı, viremi veya organlara virüs geçişi olmamıştır (13).

Kusurlarına rağmen, Hantavirüs patogenezini incelemek için sıçan ve fare kullanan hayvan modelleri yaygın olarak kullanıldı (14). Yoshimatsu et al. SCID farelerinin HTNV ile enfeksiyonunun pulmoner ödem ile ölümcül zayıflama hastalığına neden olduğunu gösterdi (15, 16) ve nötrofillerin tükenmesinin pulmoner ödem gelişimini önlediğini, ancak HFRS'nin karakteristik hemorajik lezyonlarının bulunmadığını gösterdi (15). Shimizu et al. HFRS hastalarından izole edilen HTNV'nin 6-haftalık dişi BALB/c farelerini intravenöz olarak enfekte edebileceğini, 6-9 gün boyunca viremiye neden olabileceğini ve geçici kilo kaybı, saç kırışıkları, böbrek eksüdasyonu gibi hastalık belirtileri gösterdiğini buldu (17 ). Aynı fare modelinde, fareler arasındaki sınırda makroskopik kanama vardı.böbrek korteksive medulla, ancak gözlenen histopatolojik değişikliklerin böbrek fonksiyonlarında azalma ile ilişkili olup olmadığı incelenmemişti. İnsanlaştırılmış farelerde, HTNV enfeksiyonu kilo kaybına, aktivitede azalmaya, kürkün kabarmasına ve akciğerin viral enfeksiyon için ana hedef organ olduğu anlaşılan akciğer hasarına yol açar (18). Bu nedenle, HFRS'nin çoğu hastalık özelliğini yakalayan uygun bir HTNV enfeksiyonu hayvan modeline hala ihtiyaç duyulmaktadır.

cistanche incelemeleriiçinböbrek tübül genişlemesi

NLR'ler, hücre içi doğuştan gelen bağışıklık reseptörlerinin en belirgin ailesidir ve doğuştan gelen bağışıklığın düzenlenmesinde farklı işlevlere hizmet eder. En iyi bilinen NLR'ler (örneğin, NLRP3), inflamatuar ve immün aktivasyonda pozitif düzenleyici fonksiyon sergilemesine rağmen, NLR'lerin sıra dışı bir alt grubu olan, inhibitör NLR'ler olarak tanımlanan, inflamatuar yanıtlarda inhibe edici fonksiyon sergiler. NLR aracılı doğuştan gelen bağışıklık bastırma mekanizmasını anlamak için, NLRC3 ve NLRX1 gibi inhibitör NLR'ler için ligandlar incelenmiştir (19). NLRC3, interferon genleri (STING) aktivasyonunun sekestre edilmesi ve zayıflatılması yoluyla tip I interferon (IFN-I) yanıtını zayıflatan bir negatif düzenleyicidir (19). NLRX1, mitokondriyal biyoloji ve immünolojik yanıt arasında merkezi bir homeostatik kapı bekçisi olarak, hem patojen kaynaklı hem de başka türlü çok çeşitli hastalıklarda yer almıştır (20). HTNV hastalığı, iltihaplanma ve bağışıklık aktivasyonunda çok fazla düzensizlik gösterdiğinden, hastalığın moleküler mekanizmalarını araştırmak için Nlrc3-/- farelerini seçtik.

Bu çalışma, Nlrc3−/− fare modelinin trombositopeni ile karakterize HFRS'li hastalarda gözlenen sistematik yaralanmaya benzediğini göstermiştir.renal tübül genişlemesi ve kanama.Viral yük analizi, Nlrc3−/− farelerinin serum, dalak ve böbrek dahil olmak üzere birçok dokuda daha yüksek viral yükler sunduğunu ortaya çıkardı. Çalışmalarımız, aday aşıları ve terapötikleri değerlendirmek için yararlı olan HTNV enfeksiyonu için bir fare modeli oluşturur.

YÖNTEMLER

VVirüs Stokları

HTNV suşu {{0}}, Changshou Hang (Çin Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezi) tarafından bağışlandı ve daha sonra laboratuvarımızda korunup genişletildi. Virüs yayılımı için Vero E6 hücreleri kullanıldı ve bulaşıcı titreler, immünofloresan deneyleri (IFA'lar) ile yüzde 50 doku kültürü bulaşıcı dozu (TCID50) kullanılarak nicelendirildi. TCID50 ve Plak oluşturan birimler (PSU'lar) arasındaki dönüşüm, aşağıdaki hesaplamaya dayalıdır: 1 PFUs ≈0,7×TCID50 (21).

Nlrc3 Nakavt Fare Modeli nesli

Yabani tip C57BL/6J fareler ve Nlrc3 nakavt (Nlrc3−/−) fare modelleri, Shanghai Model Organisms Center, Inc (Shanghai, China) tarafından tasarlanmış ve geliştirilmiştir. Nlrc3−/− fare elde etmek için Cas9 mRNA ve sgRNA'lar in vitro transkripsiyonla hazırlandı. Nlrc3 geninin 2-3 eksonlarını silmeyi hedefleyen iki sgRNA: 5'- GTTGGTCTAATAAGCATCCTGGG {{10}}', 5'- TCCCATGAAACCATGTCCAGAAGG -3'. C57BL/6J farelerinin zigotları alındı ​​ve In vitro olarak kopyalanmış Cas9 mRNA ve sgRNA'lar enjekte edildi ve yalancı gebe alıcılara transfer edildi. Elde edilen F0 farelerinin genotipi, PCR ve primer çiftleri kullanılarak sekanslama ile tanımlandı ve doğrulandı: F-5'- GTGATGTCTGCTTACC CCGTCTCC -3'; R-5'- GCCTGTGCCGCCTCTCA -3'. C57BL/6J fareleri ile çaprazlama yapılarak, F1 heterozigoz Nlrc3 nakavt fareleri elde etmek için pozitif F0 fareleri seçildi. PCR ve sıralama analizi, elde edilen F1 farelerini doğruladı. Heterozigot Nlrc3−/− farelerini elde etmek için dişi ve erkek F1 heterozigot fareleri rastgele çaprazlandı. Tüm çalışmalar için 6-8 haftalık fareler kullanıldı.

Hayvan Enfeksiyonu ve Örneklerin Hazırlanması

50 ul ortam içinde toplam 5 × 105 PFU HTNV intraperitoneal yoldan aşılandı. Kontrol gruplarındaki fareler, aynı miktarlarda PBS aldı. Yirmi ila yirmi beş Nlrc3−/− veya WT faresi kullanıldı. Her fare türü, enfeksiyondan 0, 3, 6, 9 ve 12 gün sonra örnekleme için beş gruba ayrıldı. Vücut ağırlıkları ve anal sıcaklıklar günlük olarak kaydedildi. Her zaman noktasında, her iki gruptan dört ila beş hayvana test için ötenazi uygulandı. Virolojik analiz için kalp, karaciğer, dalak, akciğer, böbrek ve beyinden taze doku örnekleri alındı ​​ve hemen -80 derecede donduruldu. Fareler, soğuk PBS ile perfüze edildi ve organlar, histolojik ve immünohistokimyasal analiz için 4 saat boyunca yüzde 4 paraformaldehit içinde sabitlendi. Viral yük testi ve rutin kan incelemesi için kan örneği alındı ​​ve biyokimya analizi için serum izole edildi.

Sitokin Testi

Her fareden toplam 25 mL serum, LEGENDplex™ Fare Anti-Virüs Yanıt Paneli (13-plex) (BioLegend) ile 13 farklı sitokin için üreticinin talimatlarına göre test edildi. Tespit için FACS Calibur sitometresi (Becton Dickinson Biosciences, CA) kullanıldı. Veriler LEGENDplex v8.0 tarafından analiz edildi. Yazılım.

Gerçek Zamanlı RT-PCR Testi

Her fareden alınan doku örnekleri tartıldı ve PBS'ye daldırıldı ve Frekans 30/s ve Süre 5 dakika kullanılarak otomatik bir homojenleştirici-TissueLyser II (QIAGEN, Almanya) ile homojenleştirildi. Toplam RNA ekstraksiyonu için 200 mL doku homojenatı 500 mL TRIzol reaktifine aktarıldı, ardından kloroform ekstraksiyonu ve izopropanol çökeltildi. 140 mL serum numunesi, QIAamp Viral RNA Mini kiti (Qiagen, UK) kullanılarak RNA ekstraksiyonu için taşıyıcı RNA (Qiagen, UK) içeren 560 mL AVL tamponuna aktarıldı. Son olarak, RNA, RNaz içermeyen suda yeniden çözündürüldü. Her numuneden viral RNA'nın saptanması için bir HTNV'ye özgü gerçek zamanlı RT-PCR tahlili yapıldı. HTNV s segmentini spesifik olarak hedefleyen primer dizileri şu şekilde benimsenmiştir: F-5'- GATCAGTCACAGTCTAGTCA- 3' ve R-5'- TGATTCTTCCACCATTTTGT-3'. qRT-PCR testi için One-Step TB Green PrimeScript™ RT-PCR Kit II (Perfect Real Time) (Takara, Japonya) kullanıldı. Son ana karışım (20 mL) 2 mL RNA, 5,6 mL RNase Free dH2O, 0,8 mL iletme ve Ters primer (10 mM), 0,8 mL PrimScript 1 Adım Enzim Karışımı 2 ve 10 mL 2×Bir Adımdan oluşuyordu. TB Yeşil RT-PCR Tamponu 4. Kullanılan döngü koşulları, 5 dakika için 42 derece, 10 saniye için 95 derece, ardından 0 saniye için 95 derece, 15 saniye için 65 derece ve 0 saniye için 95 derece 40 döngü idi. Reaksiyonlar, LightCycler platformunda (Roche Diagnostics, ABD) çalıştırıldı ve analiz edildi.

Viral Yükün Mutlak Kantifikasyonu

RNA standardı olarak viral RNA oligonükleotitleri, test (22) tarafından hedeflenen 562 baz HTNV RNA içeren MAXIscript Kiti (Thermo Scientific, UK) kullanılarak DNA'dan in vitro transkripsiyon yoluyla elde edildi ve daha sonra bir ultramikro mikroplaka spektrofotometresi ( BioTek Epoch, USA), standart RNA stokunun konsantrasyonu 800 ng/mL idi. Her numunedeki viral yükü değerlendirmek için standart RNA, reaksiyon başına 1010 kopya ile 103 kopya arasında değişen 10-kat seri seyreltme ile hazırlandı. Standart RNA'mız, reaksiyon başına 1010 kopya ila 101 kopya arasında bir algılama sınırına sahiptir ve bu nedenle, bu test için algılama eşiğini reaksiyon başına 100 genom kopyası olarak belirledik. Çalışma içi analizde, -3.6624'lük bir eğim, 41.68 döngülük bir Y-kesişim noktası ve 0.9996'lık bir R2 değeri ile standart eğriler oluşturulmuştur.

Western Blot ile Protein Düzeylerinin Analizi

Doku lizatları, fare doku örneklerinden hazırlandı. Protein konsantrasyonunu saptamak için bisinkoninik asit (BCA) protein tahlil kiti (Thermo Scientific, UK) kullanıldı. Protein analizi için, her numuneden 30 mg toplam protein SDS-poliakrilamid jele yüklendi ve NC membranlarına aktarıldı. Ardından, 2 saat oda sıcaklığında bloke etmek için yüzde 5 yağsız süt solüsyonu kullanıldı. Daha sonra HTNV-NP'ye karşı 1:1000 oranında seyreltilmiş 1A8 monoklonal antikoru (laboratuvarımız tarafından hazırlanmış ve saflaştırılmıştır) (23, 24) eklenmiş ve 4 derecede gece boyunca inkübe edilmiştir. Son olarak, membranlar ikincil antikorlar, HRP-konjuge Tavşan anti-fare IgG veya HRP-konjuge Fare anti-tavşan IgG ile oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edildi. HRP'nin kemilüminesan substratı daha sonra proteinleri saptamak için ilave edildi. Protein bant yoğunluğunun dansitometrik analizi, Image J yazılımı (NIH, ABD) kullanılarak yapıldı. b-aktin, normalizasyon için bir yükleme kontrolü olarak kullanıldı.

İmmünohistokimya tahlili

Doku örnekleri parafine gömüldü ve immünohistokimya boyaması için 4 mm'ye dilimlendi. Kesitler deparafinizasyona, rehidrasyona ve endojen peroksidazların inaktivasyonuna tabi tutulur. Kesitler, sitrat tamponu (PH=6) içinde 95 derecede 10 dakika antijen alımına tabi tutuldu. Daha sonra oda sıcaklığında 40 dakika blokaj için yüzde 5 normal keçi serumu kullanıldı. mAb 1A8, HTNV NP antijeni için birincil antikor olarak kullanıldı ve gece boyunca 4 derecede doku kesitleri ile inkübe edildi. Bunu, 1 saat boyunca 37 derecede FITC anti-fare IgG (Invitrogen) ve ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca DAPI ile boyama takip etti. Görüntü alımı için 3DHISTECH (Macaristan) ve veri analizi için CaseViewer2.4 kullanıldı.

Histoloji İncelemesi

Hücre ve doku morfolojisini korumak amacıyla, histopatolojik analiz için doku örneklerini sabitlemek için yüzde 4 nötr tamponlu formalin kullanıldı. Bu dokular 5 mm'lik kesitler halinde işlendi ve ardından hematoksilen ve eozin (H&E) ile boyandı. Son olarak, kesitler ışık mikroskobu ile incelendi ve görüntüler 3DHISTECH (Macaristan) tarafından yakalandı ve CaseViewer2.4 ile analiz edildi. Lezyonların derecesi önceden ayarlanmış bir 4-derece sistemi kullanılarak görsel olarak puanlandı: normal sınırlar içinde 0, minimum 1, hafif 2, orta 3, şiddetli 4.

Hayvan Konu ÇalışmalarıTüm hayvan deneyleri, Dördüncü Askeri Tıp Üniversitesi Hayvan Merkezi Laboratuvar Deneyleri Komitesi tarafından onaylandı. (No.20210403).

İstatistikVeriler, GraphPad Prism 9 yazılımı kullanılarak analiz edildi. Aksi belirtilmedikçe, tüm veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunuldu. Şekil açıklamalarında belirtildiği gibi t testleri veya Tek Yönlü ANOVA kullanıldı. 0.05'ten küçük bir P değeri anlamlı kabul edildi.

SONUÇLAR

HTNV ile İntraperitoneal Enfeksiyon Sonrası Nlrc3−/− Farelerin Çeşitli Organlarında Viral Yükün Saptanması

Nlrc3−/− farelerinin HTNV enfeksiyonuna duyarlılığını karakterize etmek için, bir grup Nlrc3−/− faresi, kontrol olarak WT fareleri kullanılarak fare başına 5x105 PFU HTNV ile intraperitoneal olarak enfekte edildi. Tüm hayvanlar, klinik semptomlar, sıcaklık ve vücut ağırlığı değişiklikleri için günlük olarak izlendi. Fareler, çeşitli laboratuvar parametrelerini, viral yükleri ve patolojiyi analiz etmek için enfeksiyondan 3, 6, 9 ve 12 gün sonra (dpi) öldürüldü. Nlrc3−/− fareleri 4 dpi'de kilo vermeye başladı ve 6 dpi'ye kadar, başlangıç ​​vücut ağırlığının > yüzde 5'i kilo kaybı kaydedildi. Buna karşılık, WT fareleri kilo kaybı göstermedi (Şekil 1A). Her iki grupta da ateş kaydedilmedi (Şekil 1B). Viral yüklemeli farelerde HTNV'nin yayılmasını ve replikasyonunu değerlendirmek için, viral RNA kopya sayılarının mutlak ölçümü için serum ve ana organlar (kalp, karaciğer, dalak, akciğer, böbrek ve beyin dahil) toplandı. Sonuçlar, her iki grupta da 3 dpi'de viremi oluştuğunu gösterdi (Nlrc3−/− fareler: mL başına 943 ± 140 kopya eşdeğeri; WT fareler: mL başına 803 ± 277 kopya). Özellikle, WT farelerinin serum viral yükleri 3 dpi'de zirve yaptı ve bundan sonra hızla azaldı, oysa Nlrc3 - / - farelerde viral yük 6 dpi'ye kadar bir orta seviyeyi korudu ve daha sonra kademeli olarak düşük 9 dpi seviyesine düştü (Şekil 1C). Ek olarak, kandaki viral replikasyonu belirlemek için enfeksiyon sonrası 0, 3, 6 ve 9. günlerde HTNV ile enfekte olmuş farelerin tam kanını topladık. Sonuçlar, viral yükün 3 dpi'de arttığını ve ardından kan hücrelerinde viral replikasyonu düşündürecek şekilde azaldığını gösterdi. Ek Şekil 1'de gösterildiği gibi, Nlrc3-/- farelerindeki viral kopya sayısı, WT farelerindekinden daha yüksekti (Nlrc3-/- fareler: mL başına 5752 ± 502 kopya; WT fareleri: 3589 ± 869 kopya/mL) 3 dpi'de. Ayrıca, Nlrc3−/− farelerinin dalaklarında (mg başına 3033 ± 175 kopya eşdeğeri), 6 dpi'de WT farelerine (mg başına 1520 ± 425 kopya) göre 2-kat daha yüksek viral yükler tespit edildi; aynı model böbreklerde 9 dpi'de gözlendi (Nlrc3−/− fareler: mg başına 500 ± 87 kopya eşdeğeri; WT fareleri: mg başına 270 ± 40 kopya) (Şekil 1C). Genel olarak, Nlrc3−/− farelerinde WT farelerinden daha mütevazı yüksek viral yükler tespit edildi.

Daha sonra, HTNV nükleoprotein (NP) seviyelerini inceledik. Şekil 2A, C'de gösterildiği gibi, Nlrc3−/− fareleri, dalak ve böbrekte WT farelerinden daha yüksek viral antijen seviyeleri sundu. Böbrek ve dalaktaki viral antijenlerin istatistiksel analizi, sırasıyla Şekil 2B, D'de gösterilmiştir. Nlrc3−/− farelerin kalbinde, karaciğerinde, akciğerinde ve beyninde düşük viral antijen seviyeleri tespit edildi (Ek Şekil 2). Nlrc3 - / - farelerin kalbindeki, akciğerindeki ve beynindeki viral NP protein seviyeleri, protein seviyesinde WT farelerinden daha düşüktü (Ek Şekil 2B, F, H), ancak hem kalp hem de beyin arasında istatistiksel anlamlılıklar mRNA'da gösterildi. ve protein seviyeleri (Ek Şekil 2A, E, I). Bu bulgu, aktif viral

HTNV enfeksiyonundan sonra Nlrc3−/− farelerinin kanında, dalağında ve böbreğinde replikasyon meydana geldi. Son olarak, dalak ve böbrekte HTNV NP'nin ekspresyon seviyelerini saptamak için immünofloresan kullandık. HTNV NP FL floresan yoğunluğu böbrekte daha yüksektiböbrekNlrc3−/− farelerin tübülleri (Şekil 2E) ve dalak kırmızısı hamuru (Şekil 2F), 6 dpi ve 9 dpi'de WT farelerine göre. Birlikte, bu sonuçlar, Nlrc3−/− farelerinin HTNV'nin intraperitoneal enfeksiyonuna daha duyarlı olduğunu gösterir.

HTNV Enfeksiyonundan Sonra Nlrc3−/− Farelerin Rutin Kan Testleri

HFRS patolojisinin, immün kompleksler, kompleman aktivasyonu, T hücre yanıtı (24-26) ve HTNV ile indüklenen sitokin üretimi (26, 27) dahil olmak üzere büyük ölçüde immün aracılı olduğu ve çoklu organ hasarına neden olduğu yaygın olarak kabul edilmiştir. Ayrıca trombositopeni, viral hemorajik ateş (VHF) virüsleri ile enfekte olanlarda yaygın bir klinik özelliktir. Bu nedenle, ilk önce Nlrc3−/− ve WT farelerinden toplanan tam kan kullanılarak 3, 6, 9 ve 12 dpi'de bir hematoloji testi gerçekleştirdik. Sonuçlar, WT farelerinde PLT sayımlarının 3dpi'de azaldığını ve daha sonra yavaş yavaş iyileştiğini gösterdi, ancak Nlrc3−/− farelerde 9 dpi'de en düşük değere ulaşana kadar azalmaya devam etti, 9 dpi'de WT'dekinden önemli ölçüde daha düşük (P<0.05) (figure="" 3a).="" the="" decrease="" of="" wbc="" counts="" was="" observed="" on="" 3="" dpi="" and="" then="" gradually="" recovered="" to="" normal="" levels="" in="" both="" mouse="" strains="" (figure="" 3b).="" to="" further="" dissect="" the="" subset="" changes="" in="" wbcs,="" we="" analyzed="" on="" 0,="" 3,="" 6="" dpi="" the="" number="" of="" monocytes,="" neutrophils,="" lymphocytes,="" and="" t="" cells="" by="" routine="" blood="" tests="" combined="" with="" fellow="" cytometry="" assay.="" the="" number="" of="">

6 dpi'de Nlrc3−/− farelerde önemli ölçüde arttı, ancak WT farelerinde değil (Şekil 3C). Her iki fare türündeki nötrofiller hafifçe azaldı ancak 6 dpi'de ortalama seviyeye geri döndü (Şekil 3D). Lenfosit sayısı 3 dpi'de önemli ölçüde azalırken, WT farelerinde 6 dpi'de yükselmeye başlarken, Nlrc3−/− farelerde lenfosit sayısı 6 dpi'de düşük seviyede kaldı (Şekil 3E). Periferik kanda CD3 artı CD4 artı T hücrelerinin CD3 artı CD8 artı T hücrelerine oranı, diğer sitometri ile belirlendi ve HFRS hastalarında sıklıkla gözlenen değişikliklerle tutarlı olarak 3 dpi'de arttığı ve daha sonra 6 dpi'de hızla tersine döndüğü bulundu (Şekil 3F), CD4 artı T hücrelerinin önemli ölçüde azaldığı ve CD8 artı T hücrelerinin değişmeden kaldığı veya tersine çevrilmiş bir CD4/CD8 oranıyla sonuçlanacak şekilde kompansatuar olarak genişlediği. Bu bulgular, HTNV'nin Nlrc3−/− farelere intraperitoneal olarak aşılanmasının, bir dereceye kadar, HTNV ile enfekte olmuş hastaların trombositopeni ve ters CD4/CD8 T hücre oranı gibi ana klinik özelliklerini indüklediğini ileri sürdü.

Enfekte Nlrc3−/− Farelerin Böbreğindeki Patolojik Değişiklikler, Belirgin Renal İnterstisyel Kanama ve Renal Tübül Dilatasyonu GösterirDaha sonra, HTNV ile enfekte olmuş farelerin patolojik değişiklikleri H&E boyaması ile değerlendirildi ve Ödem olarak kendini gösteren tüm enfekte Nlrc3-/− farelerin böbreklerinde var olduğu bulundu.böbrektübüler epitel hücreleri. 6 dpi'de hemorajik lezyonlar gözlendi.böbrekmedulla (Şekil 4A).Böbrek tübüdilatasyon 3 dpi kadar erken gözlendi, şiddeti 9 dpi'de zirve yaptı ve 12 dpi'ye kadar devam etti ve Nlrc3−/− farelerinde WT farelerinden daha belirgindir (Şekil 4B, C). Bu bulgular belirtilen

ile karakterize edilen akut nefropatiBöbrek tübülleridilatasyon verenal interstisyel kanamaHTNV ile enfekte Nlrc3-/- farelerde indüklendi. Karaciğer, dalak, akciğerdeki diğer patolojik değişikliklere gelince, bu iki fare grubu benzer sonuçlar gösterdi. Bunlar esas olarak dalakta ekstra medüller hematopoez, akciğerde alveolar duvar kalınlaşması ve karaciğer dejenerasyonunu içeriyordu (Ek Şekiller 3A-F). Yukarıdakilere dayanarak, HTNV enfeksiyonunun akut fazı sırasında Nlrc3−/− farelerin böbreğinde gözlemlenen patolojik özellikler, insan HFRS vakalarındaki klinik-patolojik değişikliklere çok benziyordu.

Buna dayanarak, böbrek fonksiyonel bozuklukları için farelerde ilgili kan ve idrar indekslerini daha da inceledik. Alanin aminotransferaz (ALT), kreatin kinaz MB fraksiyonu (CK-MB), üre ve ayrıca ürik asit (UA) değerlendirmesi için fare serumları toplandı. Şekil 4D'de gösterildiği gibi, kontrol WT fareleriyle karşılaştırıldığında, serum UA seviyesi Nlrc3−/− farelerde 3 dpi'de önemli ölçüde yükseldi, serum CK-MB Nlrc3−/− farelerde 9 dpi'de önemli ölçüde yükseldi, ancak serum seviyeleri ALT, UREA ve CREA'nın hiçbir yükselme göstermediği (Ek Tablo 1).

böbrekPUUV ile enfekte olmuş HFRS'ye katılım, geçici proteinüri, mikroskobik ancak nadiren görülebilen hematüri ve oligürik AKI'yi, ardından poliüri ve iyileşmeyi içerir. Bu hastalıkta proteinürinin tipik özelliği, hastalığın akut fazından sonra hızla azalmasıdır (6). Çeşitli etiyolojilere bağlı akut tubulointerstisyel nefritli hastaların büyük bir kohortunda, hastaların sadece dörtte birinde proteinüri bulunurken, tüm hastaların sadece yüzde 2'sinde nefrotik düzeyde proteinüri saptanmıştır (28). İdrarı 0, 3, 6 dpi'de topladık ve enfeksiyonun akut fazı olan 3 dpi'de idrar protein seviyelerinin arttığını bulduk. İdrar protein konsantrasyonu önemli ölçüde arttı ve ortalama değer, enfekte Nlrc3−/− farelerinde ve WT farelerinde 3 dpi'de 0.3 g/L'ye yakındı (Şekil 4E).

İnfiltre edilen inflamatuar hücreleri incelemek içinböbrekHTNV enfeksiyonundan sonra interstisyel, CD3, F4/80 ve CD11b ile immünohistokimya (IHC) boyaması yaptık. Sonuçlar, CD3 için pozitif olan bir grup bağışıklık hücresinin hücre içine sızdığını gösterdi.böbrekHTNV enfeksiyonundan sonra interstisyel (Şekil 5A) ve CD11b için pozitif miyeloid hücreler kortikal tubulointerstisyelde ortaya çıktı (Şekil 5B). Sızan CD3 artı T hücreleri ve CD11b artı miyeloid hücrelerin oranı, enfekte Nlrc3-/- farelerinde WT farelerine göre önemli ölçüde daha yüksektir, ancak F4/80 için pozitif makrofajlar renal korteks ve medullanın tamamına dağılmış ve anlamlı hiçbir şey göstermemiştir. Bu iki fare türü arasındaki fark (Şekil 5C).

HTNV Enfeksiyonu Nlrc3−/− Farelerde Güçlü Bir Sitokin Tepkisi İndükledi

Enflamatuvar sitokinlerin aşırı üretimi, HFRS'li hastalarda yaygın olarak rapor edilir ve sitokin düzensizliğinin hastalığın patogenezinde çok önemli bir rol oynayabileceği hipotezine yol açmıştır. Vaheri et al. (8) viral enfeksiyon gibi proinflamatuar sinyallere yanıt olarak makrofajlar, monositler ve lenfositler gibi çeşitli hücreler tarafından çoklu sitokinlerin üretildiğini buldu. Wang et al. TNF-a, IL-6, IFN-g, IL-8, IP-10 ve RANTES (ancak IL-4 değil) serum konsantrasyonlarının çok yükseldiğini bildirdi HFRS hastalarında (29) kontrollerle karşılaştırıldığında; ve en yüksek konsantrasyonların genellikle ateşli, hipotansif ve oligürik fazlarda, özellikle şiddetli ve kritik tip HFRS vakalarında bulunduğu. Yüksek plazma IL-6 seviyeleri şiddetliböbrekPUUV ile indüklenen HFRS'de başarısızlık ve trombositopeni ve hastalık şiddetinin bir belirteci olarak kullanılabilir.

Sonuçlarımız, HTNV enfeksiyonunun CXCL-1, CCL-5, IL-6, IL-12, TNF-a ve IFN-g dahil olmak üzere yüksek sitokin üretimine yol açtığını gösterdi. Nlrc3−/− fareler ve bu sitokinlerin seviyeleri 6 veya 9 dpi'de zirve yaptı; karşılaştırmalı olarak, WT fareleri, enfeksiyon süreci boyunca daha zayıf sitokin tepkilerine sahipti (Şekil 6).

Sonuç olarak, bu çalışmada HTNV'nin intraperitoneal aşılanmasından sonra Nlrc3−/− farelerin kilo kaybı geliştirdiğini bulduk.böbrek kanamasıve tübül genişlemesi. Bu özellikler, HFRS'nin klinik semptomlarına daha önce yayınlanmış diğer hayvan modellerinden daha yakından benzemektedir. Ayrıca, Nlrc3−/− fareleri ayrıca serumda, dalakta ve böbrekte WT farelerinden daha yüksek bir viral yük gösterdi ve Nlrc3−/− fareleri hematolojik bozukluk ve çoklu organlarda önemli patolojik değişiklikler geliştirdi, böylece Nlrc3−/'nin HTNV enfeksiyonunu oluşturdu. - HFRS'leri incelemek için yeni bir model olarak fareler.

TARTIŞMA

Burada açıklanan HFRS fare modeli, HTNV ile enfekte Nlrc3−/− farelerinin, HFRS aşılarını ve terapötiklerini değerlendirmek için kullanılabilecek uygun bir küçük hayvan modelini temsil ettiğini göstermektedir. Nlrc3−/− fare modeli, insanlarda gözlenen, trombositopeni, lenfositopeni, yüksek serum AST seviyeleri (karaciğer disfonksiyonu), LDH, kreatin kinaz MB fraksiyonu ve UA ile karakterize sistematik yaralanmaya benzer.(Böbrek yetmezliği). Ayrıca, Nlrc3−/− farelerinde kilo kaybı ve belirginböbrek kanaması. Akciğer, dalak, karaciğer ve böbrekte hedef organlarda viral replikasyon ve histopatolojik değişiklikler tespit edildi. Ek olarak, Nlrc3−/− farelerinin kanında, dalağında ve böbreğinde biraz daha yüksek düzeyde viral RNA yükleri bulundu. Buna karşılık, WT fareleri kan, dalak ve böbrekte viral RNA tespit etmesine rağmen hafif histolojik değişiklikler geliştirdi.

Our findings are generally in agreement with what would be expected for HTNV infection-induced HFRS and signify an improvement over previously published animal models. It has been reported that hemorrhagic fever (HF) virus infection in animal models can lead to a spectrum of diseases from asymptomatic to mild and severe and often transient viremia. A transient weight loss usually manifests mild illness, but severe disease showed more significant weight loss (>yüzde 20 ) (30). Örneğin, burun yoluyla HTNV ile enfekte olan hamsterlar, sporadik viremi, ancak akciğerlerde, beyinde ve böbreklerde yüksek seviyelerde viral genom kopyaları ile karakterize, kalıcı bir asemptomatik enfeksiyona yol açmıştır. Kas enjeksiyonu yoluyla yüksek doz HTNV ile enfekte olan gelincikler, vücut ağırlığında kademeli bir azalma (zaman içinde yüzde 5-12) gösterdi, ancak bozulmadıböbrek fonksiyonları, viremi yokluğu ve organlara virüs bulaşma eksikliği. Marmosetlerde, HTNV'nin intramüsküler enjeksiyonu, yüksek derecede serokonversiyona ve nötralize edici antikor üretimine yol açtı; tutarlı bir şekilde, bu hayvanlarda böbrek hasarı, viremi veya organlara virüs geçişi olmamıştır (13).

Hematolojik değişikliklerin sadece tek bir zaman noktasında gözlemlendiği ve sitokin değişikliklerinin önemli olmadığı gözlemine gelince, bunların birden fazla organı etkileyen ve dolayısıyla sıklıkla sıklıkla görülen diğer birçok viral enfeksiyona benzeyen HTNV enfeksiyonunun doğası ile açıklanabileceğini düşünüyoruz. tek bir parametrenin sürekli değişikliklerini bulmak zor. Genel olarak, bulgularımız genel olarak alandaki mevcut bilgilerle uyumludur. Ayrıca, HTNV enfeksiyonuna daha duyarlı olan ve HFRS'nin patolojik değişikliklerine benzer birçok değişiklik gösteren Nlrc3−/− farelerinin keşfi, alana yeni bir katkıdır. İnsan vasküler endotel hücrelerinin hantavirüs için birincil hedef olduğu genel olarak kabul edilmektedir. , değişken derecelerde genel kılcal dilatasyon ve ödeme yol açar (31).

Viral antijenler, çeşitli dokuların kılcal endotelinde bulunabilir (Hantavirüsler, hücreleri vasküler geçirgenlik faktörü VEGF'ye duyarlı hale getirerek endotelyal hücre geçirgenliğini yönlendirirken, anjiyopoietin 1 ve sfingosin 1-fosfat, hantavirüse yönelik geçirgenliği engeller). Histolojik analiz, Nlrc3−/− farelerinin böbreğinin gözlemlendiğini gösterdiBöbrek tübülleri9 dpi'de dilatasyon, Nlrc3−/− fareler, WT farelerinden daha şiddetli patolojik değişikliklere sahiptir ve 12 dpi'de devam etmiştir. Nlrc3−/− farelerinde, böbrekte renal tübüler epitel hücre ödemi ve belirgin renal interstisyel kanama gözlendi. Ayrıca, dalağın kırmızı hamurunda belirgin ekstra-medüller hematopoez 6, 9 ve 12 dpi'de ve germinal merkez genişlemeleri ve 12 dpi'de artan sayıda çok çekirdekli dev hücreler gözlendi. Karaciğerler ayrıca 3, 6, 9 ve 12 dpi günlerde şiddetli hepatositik dejenerasyon ve dağınık nekroz gösterdi. 6 dpi'de akciğer iltihabı ve alveolar duvar kalınlaşması gözlendi. Bu bulgu, HTNV enfeksiyonunun, HTNV ile enfekte Nlrc3−/− farelerde karaciğer ve böbrek üzerinde önemli ve uzun vadeli bir etkisi olduğunu göstermektedir. Ayrıca, Nlrc3-/- fareler belirginböbrek tübül genişlemesi, interstisyel kanama ve HTNV enfeksiyonu sonrası böbrek fonksiyon bozukluğu. Serum UA seviyesi 3 dpi'de önemli ölçüde yükselmiştir, bu böbrek fonksiyon bozukluğunun açık bir göstergesidir. İdrar protein konsantrasyonu önemli ölçüde arttı ve ortalama değer, enfekte Nlrc3-/- farelerde 3 dpi'de 0.3 g/L'ye yakındı. Aynı UA artışı eğilimi, WT farelerinde gözlenmedi. Bu sonuçlar, modelimizin insan HTNV enfeksiyonunun daha patolojik özelliklerini özetlediğini göstermektedir.

N proteini (NP), hantavirüs ile enfekte hücrelerde bol miktarda üretilir ve enfeksiyondan 4 saat sonra erken saptanabilir (32). Bu özellikler, ELISA'nın son noktasının, viral partiküllerin sayısını ve viral enfeksiyonun ilerlemesini değerlendirmek için hantavirüs N proteini ve immünofloresan tahlillerini saptamak olmasının ana nedenini açıklar. Farklı yöntemler, elde edilen sonuçları ve ulaşılan sonuçları etkileyebilir. Viral protein ve viremi, viral enfeksiyonun iki farklı parametresidir ve her zaman eşzamanlı olarak değişmeyebilirler. Kantitatif gerçek zamanlı PCR'nin sonuçları, virüsün geçici bir replikasyon geçirmiş olabileceği dalakta 6 dpi'de NP seviyelerinde geçici bir yükselme meydana geldiğini ve ardından bunun temizlenmesini gösterdi. Beklendiği gibi, 3 dpi'de görülen zirve viremiden sonra viral protein birikimi gözlendi. Gerçekten de, dalak ve böbrekteki viral replikasyon, N protein sentezi eşliğinde 9 ve 12 dpi'de orta düzeyde tutuldu (9 dpi'de dalak: WT fareleri: mg başına 192 ± 128 kopya; Nlrc3−/− fareler: 431 ± mg başına 229 kopya; 12 dpi'de dalak: WT fareleri: mg başına 160 ± 85 kopya; Nlrc3−/− fareler: mg başına 226 ± 118 kopya). Bununla birlikte, protein seviyesindeki HTNV NP miktarı, 6. günde maksimuma ulaştı ve 9 ve 12 dpi boyunca yüksek kaldı. Viral RNA kopyalarının kinetiğindeki ve protein miktarındaki fark, farklı organlardaki farklı bozulmalarını yansıtıyor olabilir.

Hastalık modellerinde sitokinlerin rolü genellikle daha karmaşıktır. PUUV ile indüklenen HFRS'de, şiddetliböbrek yetmezliğive trombositopeni, yüksek plazma IL-6 seviyeleri ile ilişkilidir (33). Analizimiz, HTNV enfeksiyonunun CXCL-1, CCL-5, IL-6, IL-12, TNF-a ve IFN-g dahil olmak üzere yüksek sitokin üretimine yol açtığını gösterdi. Nlrc3−/− fareler, ancak WT farelerinde olduğu kadar değil. 9 dpi'de, Nlrc3−/− farelerinin dalaklarında ve böbreklerinde dikkate değer patolojik değişiklikler gösterdiğini ve bu sırada sağlam bir sitokin yanıtının eşlik ettiğini belirtmekte fayda var. Bu bulgular, yüksek düzeyde sitokinlerin hastalığın patogenezi ile ilişkili olabileceğini göstermektedir.

Özetle, burada bildirdiğimiz sonuçlar, intraperitoneal yoldan HTNV ile aşılandıktan sonra, Nlrc3−/− farelerinin kilo kaybı, trombositopeni, renal disfonksiyon ve kanama.Bunlar, HFRS'nin klinik semptomlarına daha önce yayınlanmış diğer hayvan modellerinden daha çok benzemektedir. Bu model, potansiyel aşıları ve terapötikleri değerlendirmek ve HFRS patogenezinin in vivo derinlemesine incelenmesi için kullanılabilir.