Şekil 4. CD44'e bağlanmada oligosakkaritlerin ve HA'nın rekabet gücü. (A) Azaltılmasıoligosakaritlerin etkisiCD44 antijenitesi üzerine. Rekombinant sıçan CD44'ü (20 ng/mL), 1{{10}} dakika boyunca FC, FOS veya GOS ile veya bunlar olmadan karıştırıldı ve ardından CD44 ELISA kiti kullanılarak analiz edildi. Sonuçlar ortalama ± SD (n=4) olarak ifade edilir. *, p < 0,05, kontrol grubuna göre. (B) oligosakaritlerin CD44 ve fosforile edilmiş JNK ekspresyonu üzerindeki inhibitör etkilerine müdahale eder. NRK-52E hücreleri, 30 dakika süreyle 0,1 mg/mL HA ile ön işleme tabi tutuldu, ardından 30 dakika süreyle 0,1 mg/mL FC, FOS veya GOS uygulandı ve son olarak hipoksik kültüre tabi tutuldu. Protein ekspresyonu Western blot ile analiz edildi. Protein bantlarındaki göreceli artışlar da çubuk grafik formunda sunulmaktadır. Sonuçlar ortalama ± SD (n=4) olarak ifade edilir.

CISTANCHE'İN ÇALIŞMASI İÇİN YENİ BİR BİTKİ MİSİNİZ?

3.5. Oligosakkaritler Erken Aşama AKI ile Farelerde Böbrek Fonksiyonunu İyileştirir ve Enflamasyonu Azaltır

Oligosakaritlerin etkisini değerlendirmek için IRI'li bir AKI fare modeli oluşturuldu.böbrek fonksiyonuVeiltihaplanma.Böbrek fonksiyonutarafından izlendiserum kreatinin tespiti. Fareler beslendioligosakkaritleryalnızca AKI'nin başlangıç ​​aşamasında, yani IRI ameliyatından 1 gün öncesinden 2 gün sonrasına kadar. Bu süreden sonra serum kreatinin AKI farelerinde önemli ölçüde arttı, ancak oligosakaritle tedavi edilen AKI farelerinde artmadı; bu, oligosakaritlerin böbrek fonksiyonunu iyileştirdiğini gösterir (Şekil 5A). Daha sonra AKI farelerinin iltihaplanmasını değerlendirmek için serum sitokin seviyeleri izlendi. Serum MCP-1, IL-1 ve TNF-, AKI farelerinde önemli ölçüde arttı (Şekil 5B-D), ancak üç oligosakkaridin tümü tarafından azaltıldı. Nötrofil işaretçisi Ly6G'nin IHC analizi, AKI farelerinin böbreklerinde nötrofil infiltrasyonunu gösterdi, ancak normal farelerde ve oligosakaritle tedavi edilen AKI farelerinde (Şekil 6A) görülmedi. Makrofaj işaretçisi F4/80'in IHC analizi, AKI farelerinin böbreklerinde makrofaj istilasını ortaya çıkardı, ancak normal farelerde ve oligosakaritlerle tedavi edilen AKI farelerinde görülmedi (Şekil 6B). Normal fareler ve oligosakaritlerle beslenen AKI fareleriyle karşılaştırıldığında, AKI farelerinin böbrek tübülleri yüksek TNF ekspresyonu gösterdi (Şekil 6C). Bu sonuçlar FC, FOS ve GOS'un erken evre AKI'li farelerde böbrek iltihabını azalttığını göstermektedir.

Şekil 5. Erken aşamada AKI farelerinde oligosakaritlerin serum kreatinin ve sitokinler üzerindeki etkisinin azaltılması. Serum kreatinin (A), MCP-1 (B), IL-1 (C) ve TNF- (D)'yi ölçmek için IRI ameliyatından 2 gün sonra her fareden kan toplandı. Sonuçlar ortalama ± SD (n=8) olarak ifade edilir.

3.6. Oligosakaritler AKI Sonrası Böbrek İyileşmesini Destekler

IRI ameliyatından sonraki yedinci günde AKI farelerinin serum kreatinin düzeyi azaldı ancak yine de normal farelerinkinden yüksekti (Şekil 7A). Oligosakkaritler ile tedavi edilen ve edilmeyen AKI fareleri arasında serum kreatinin açısından anlamlı bir fark gözlenmedi. Bununla birlikte, bir AKI işaretçisi AKI olan serum NGAL düzeyi, AKI farelerinde normal farelere ve oligosakaritle tedavi edilen AKI farelerine göre hala daha yüksekti (Şekil 7B). Bu bulgu, AKI'nin erken evresinde oligosakkaritlerin beslenmesinin AKI sonrası böbrek hasarını azaltabileceğini göstermektedir. Fare böbrek korteksinin PAS boyaması, IRI ameliyatından 7 gün sonra gerçekleştirildi. AKI fareleri, tübüler dilatasyon ve tübüler nekroz nedeniyle intralüminal hücre döküntüsü ile ciddi tübüler yaralanma sergiledi ve oligosakkaritler ile tedavi edilen AKI fareleri, yalnızca küçük tübüler yaralanma gösterdi (Şekil 7C). Bu nedenle, AKI'nin erken aşamasında FC, FOS veya GOS alımı, AKI farelerinde böbrek dokularının ve böbrek fonksiyonunun iyileşmesine yardımcı olur.

Şekil 6. Erken evre AKI'li farelerde oligosakaritlerin böbrek iltihabı üzerindeki önleyici etkisi. IRI ameliyatından 2 gün sonra her farenin böbrekleri, IHC boyaması için toplandı. (A) Ly6G IHC boyaması. Beyaz ok Ly6G pozitif boyanan nötrofilleri gösterir. (B) F4/80 IHC boyaması. Beyaz ok F4/80 pozitif boyanan makrofajları gösterir. (C) TNF-IHC boyama

4. Tartışma

İskemi AKI'nin ana nedenlerinden biridir. Burada, oligosakaritlerin AKI üzerindeki etkisini ve bunların altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için hipoksik bir hücre modeli ve IRI'li bir AKI fare modeli oluşturuldu. Hipoksi, JNK inhibitörü SP600125 tarafından inhibe edilen NRK-52E hücrelerinde MCP-1, IL-1 ve TNF- ekspresyonunu tetikledi. CD44 siRNA transfeksiyonu, JNK'nin hipoksi kaynaklı aktivasyonunu bloke etti. Bu sonuçlar hipoksinin CD44'ü yukarı regüle ettiğini, CD44'ün de JNK'yi aktive ettiğini ve böylece renal tübüler hücrelerdeki sitokinleri düzenlediğini göstermektedir. FC, FOS ve GOS, CD44 antijenitesini azalttı ve renal tübüler hücrelerin CD44'ünün HA ligandı ile rekabet etti. Bu bulgu, üç oligosakkaridin, hipoksi kaynaklı CD44 yukarı regülasyonunu, JNK aktivasyonunu ve renal tübüler hücrelerde sitokin ekspresyonunu baskılamak için CD44 ile doğrudan etkileşime girebileceğini ima eder. Her ne kadar p38, inflamatuar tepkiler sırasında TNF ve IL-1 için bir başka önemli MAP kinazı olsa da [21], fosforile edilmiş p38, hipoksik NRK{18}}E hücrelerinde yukarı regüle edilmedi. Bu nedenle p38, renal tübüler hücrelerde sitokin ekspresyonunda ve oligosakaritlerin renal tübüler hücrelerin inflamatuar yanıtları üzerindeki inhibisyon etkisinde yer almaz. FC ve GOS, hipoksik hücrelerde p38 fosforilasyonunu yukarı regüle etti; bu da onların p ile ilişkili inflamatuar tepkiler üzerindeki potansiyel etkilerini gösterdi. Hayvan çalışmalarında FC, FOS ve GOS, erken evre AKI'li farelerde serum MCP-1 ve IL-1 artışını inhibe etti ve böbrek dokularında TNF- ekspresyonunu azalttı. Sitokinler lökosit alımının anahtar efektörleridir. FC, FOS ve GOS, erken evre AKI'li farelerin böbreklerinde nötrofil infiltrasyonunu ve makrofaj istilasını azalttı. Ameliyattan 7 gün sonra ABH'de erken dönemde inflamasyonun ve nötrofil infiltrasyonunun azalması, ileri evrede iyileşme açısından faydalıdır. Bu çalışma ilk kez AKI'nin erken evresinde FC, FOS veya GOS tüketiminin böbrek iltihabını engelleyerek iyileşmeyi destekleyebileceğini ortaya koymaktadır.

Bugüne kadar oligosakarit takviyesinin AKI üzerindeki etkisi araştırılmamıştır. Birçok oligosakarit prebiyotik olarak kabul edilir ve uygun mikrobiyotanın büyümesini destekleyebilir [13,22]. İnsan sütü oligosakaritleri spesifik mikrobiyota oluşturarak bağışıklık sisteminin gelişimini ve fonksiyonunu düzenler [23,24]. Bağırsak mikrobiyotası AKI sonucunun önemli bir değiştiricisidir [20]. Teorik olarak oligosakkaritler bağırsak mikrobiyotasını düzenleyerek AKI şiddetini etkileyebilir. Bununla birlikte, oligosakaritlerle mikrobiyota oluşturulması ve mikrobiyotayla bağışıklık denetimi birkaç haftadan fazla zaman alacaktır. Mevcut hayvan çalışmasında fareler, IRI ameliyatından 1 gün öncesinden 2 gün sonrasına kadar oligosakaritlerle beslendi. Sonuçlar, IRI ameliyatından sonraki ikinci günde oligos charades'in AKI üzerindeki olumlu etkisini gösterdi. Dolayısıyla mevcut sistemde oligosakkaritlerin renal korunması mikrobiyotanın etkisinden kaynaklanmamaktadır. FC, FOS ve GOS dahil birçok oligosakarit vücut tarafından emilebilir, sistemik dolaşıma girebilir ve son olarak böbrekler tarafından elimine edilebilir [14-16,22,25]. Bu oligo sessiz karakterlerin, in vivo olarak renal tübüler hücreler üzerindeki CD44 ile etkileşime girme şansı vardır. Oligosakkaritler, CD44'ü etkileyerek, akut hasarda böbreğin bağışıklık tepkisini anında modüle edebilir, böylece iyileşmeyi hızlandırabilir. Ek olarak, insan sütü oligosakaritleri immün yanıtları lokal veya sistemik olarak doğrudan modüle eder [22,25]. Bu nedenle oligosakkaritlerin bağışıklık ve diğer fizyolojik sistemler üzerindeki etkisi, doğrudan etkilerine ve mikrobiyota değişikliklerine bağlanmaktadır.

CD44 hücre yapışmasını teşvik eder ve birçok önemli fizyolojik olayda bir sinyal reseptörü olarak görev yapar [26]. CD44 ve hücre dışı matrisin önemli bir bileşeni olan ana ligandı HA'nın etkileşimi, hücre yapışmasını, çoğalmasını, göçünü ve bağışıklık tepkilerini artırabilir [27-29]. HA, CD44'e bağlanarak, aktin hücre iskeleti de dahil olmak üzere CD44'ün akış aşağı sinyal moleküllerini modüle ederek hücre içi sinyal olaylarını başlatır [30]; ezrin, radixin ve moesin proteinleri [31]; ankirin [32]; ve reseptör olmayan tirozin kinaz Src [33]. Bu aşağı akış sinyal molekülleri JNK aktivasyonuyla ilgilidir. Aktin hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesi, başta JNK olmak üzere çok sayıda sinyalleşme kademesini aktive eder [34,35]. Ezrin, B hücrelerinde JNK aktivasyonunu kolaylaştırmak için JNK sinyalleme bileşenlerine bağlanır [36]. Ankyrin ve Src ayrıca JNK aktivasyonunu indükler [37-39]. Bu nedenle CD44'ün sinyal iletimi JNK aktivasyonuyla ilişkilidir. HA'nın CD44'e bağlanmasının meme kanseri hücrelerinde JNK aktivasyonunu teşvik ettiği kanıtlanmıştır [19]. Bu çalışmada, oligos charades'in HA ve CD44 arasındaki etkileşime müdahale ederek aşağı yönde JNK sinyal iletimini ve dolayısıyla renal tübüler hücrelerin immün tepkisini inhibe ettiği bulunmuştur. Bu bulgulara dayanarak, oligosakkaritler, CD44 ile ilgili diğer fizyolojik tepkileri, özellikle de CD44 tarafından teşvik edilen kanser hücrelerinin çoğalmasını ve göçünü baskılama potansiyeli göstermektedir.

Şu anda piyasada mevcut olan oligosakkaritler temel olarak FOS, GOS, FC ve izomaltooligosakkaritleri içermektedir [40,41]. FOS, GOS ve FC kısmen vücut tarafından emilebilir, sistemik dolaşıma girebilir ve sebzeler, süt ve deniz yosunundan alınabilir [14-16,22,25]. Bu çalışmada bu üç anyonik oligosakkaridin AKI üzerindeki etkisi araştırıldı. Her ne kadar bu üç oligosakarit farklı monosakarit bileşimlerine sahip olsa da hipoksi altında renal tübüler hücreler üzerindeki etkileri, CD44, fosforile edilmiş JNK ve sitokinler üzerindeki inhibitör etki de dahil olmak üzere oldukça benzerdir. Ayrıca eklenen HA, üç oligosakkaridin hepsinin önleyici etkisine müdahale etti. Dolayısıyla bu üç oligosakkaritin renal tübüler hücreler üzerindeki mekanizması, monosakkarit tipine bakılmaksızın aynıdır. Bu mekanizma oligosakkaritler ve HA arasındaki yapısal benzerliklerle ilişkili olabilir. Bununla birlikte, üç oligosakkaritteki monosakkarit türleri mevcut sistemde hala biraz farklı etkilere neden olmaktadır. FC ve FOS, hipoksik renal tübüler hücrelerde JNK ekspresyonunu azalttı, ancak GOS sınırlı bir etki gösterdi. FOS'un CD44 antijenitesi üzerindeki etkisi FC ve GOS'unkinden daha zayıftı. Hipoksi kaynaklı CD44'ün engellenmesi için en etkili FOS dozu (0,5 mg/mL), FC ve GOS'unkinden (0,05 mg/mL) daha yüksekti. Bu sonuçlar FC ve GOS'un CD44 sinyal iletimi üzerindeki önleyici etkilerinin FOS'unkinden daha büyük olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, hayvan deneyleri, AKI'nin başlangıç ​​aşamasında üç oligosakkaridin yutulmasından kaynaklanan benzer böbrek koruyucu etkiler gösterdi. AKI farelerinde üç oligosakarit arasındaki renal koruyucu etkilerin karşılaştırılması zordur ve oligosakkaritlerin bağırsakta emilimini içerir. Oligosakaritlerin çoğu bağırsak bakterileri tarafından sindirilir ve yalnızca küçük bir kısmı emilebilir [42,43]. Bağırsaktaki sindirim etkinliği farklı oligosakaritlere göre değişir ve bu da emilim miktarlarını etkiler. Ayrıca oligosakkaritlerin uzunluğu da bağırsaktaki emilim etkinliğini etkiler. Bu çalışmada, en küçük ortalama polimerizasyon derecesine sahip FC, teorik olarak en büyük ortalama polimerizasyon derecesine sahip FOS'tan daha kolay emilecektir. Bununla birlikte, hayvan deneyleri, oligosakaritlerin (10 mg/kg/gün) bağırsak bakterileri tarafından sindirildikten sonra, AKI farelerinde böbrek koruyucu bir etki elde etmek için yeterli bir miktarın dolaşıma girebildiğini ortaya çıkardı.

Özetle FC, FOS ve GOS, böbrek tübüler hücrelerinde hipoksinin neden olduğu CD44 yukarı regülasyonunu, JNK aktivasyonunu ve sitokin ekspresyonunu inhibe etmek için CD44 ile doğrudan etkileşime girer. AKI'nin erken evrelerinde FC, FOS ve GOS'un alınması böbrek iltihabını engelleyerek iyileşmeyi destekler. AKI, hastanelere ve yoğun bakım ünitelerine başvuran hastalarda aniden ortaya çıkmakta olup, bu durumu önleyecek veya iyileştirecek bir tedavi geliştirilmemiştir. Bu bulgulara dayanarak, oligosakaritlerin günlük alımı AKI şiddetini azaltabilir ve AKI hastalarında böbrek iyileşmesini destekleyebilir.

Referanslar

1. Makris, K.; Spanou, L. Akut Böbrek Hasarı: Tanımı, Patofizyolojisi ve Klinik Fenotipleri. Klin. Biyokimya. Rev. 2016, 37, 85–98. [PubMed]

2. Gümüş, SA; Harel, Z.; McArthur, E.; Nash, DM; Acedillo, R.; Kitchlu, A.; Garg, AX; Chertow, GM; Bell, CM; Wald, R. AKI ile Hastaneye Yatış Sonrası Ölüm Nedenleri. J. Am. Sos. Nefrol. 2018, 29, 1001–1010. [CrossRef] [PubMed]

3. Joannidis, M.; Druml, W.; Forni, LG; Groeneveld, ABJ; Onur, Başbakan; Hoste, E.; Ostermann, M.; Oudemans-van Straaten, HM; Schetz, M. Yoğun bakım ünitesinde akut böbrek hasarının önlenmesi ve böbrek fonksiyonunun korunması: Güncelleme 2017: Önleme Çalışma Grubunun uzman görüşü, AKI bölümü, Avrupa Yoğun Bakım Tıbbı Derneği. Yoğun Bakım Med. 2017, 43, 730–749. [CrossRef] [PubMed]

4. Bijuklic, K.; Jennings, P.; Kountchev, J.; Hasslacher, J.; Aydın, S.; Sturn, D.; Pfaller, W.; Patsch, JR; Joannidis, M. Renal interstisyel inflamasyonun bir modeli olarak lökositlerin endotel-epitel çift katmanı boyunca göçü. Am. J. Physiol. Fizyol. 2007, 293, C486–C492. [Çapraz Referans]

5. Bihorac, A.; Baslanti, TO; Cuenca, AG; Hobson, C.; Ang, D.; Efron, Pensilvanya; Maier, RV; Moore, FA; Moldawer, LL Akut böbrek hasarı travma sonrası erken sitokin değişiklikleriyle ilişkilidir. J. Travma Akut Bakım Cerrahisi. 2013, 74, 1005–1013. [Çapraz Referans]

6. Singbartl, K.; Formeck, C.; Kellum, JA AKI'de Böbrek-Bağışıklık Sistemi Karışma. Semin. Nefrol. 2019, 39, 96–106. [Çapraz Referans]

7. Murugan, R.; Wen, X.; Keener, C.; Pike, F.; Palevsky, Başbakan; Unruh, M.; Finkel, K.; Vijayan, A.; Yaşlı, M.; Chen, Y.-F.; ve ark. RRT Yoğunluğu, İnflamatuar Aracılar ve Sonuçlar Arasındaki İlişkiler. Klin. J. Am. Sos. Nefrol. 2015, 10, 926–933. [Çapraz Referans]