Zeytin Yaprakları (Olea Europaea L) Yüklü Lipid Nanopartikülleri: Box-Behnken İstatistiksel Tasarım ile İşleme Parametrelerinin Optimizasyonu, In-vitro Karakterizasyon ve Anti-oksidan ve Anti-mikrobiyal Aktivitenin Değerlendirilmesi

Lütfen iletişime geçinoscar.xiao@wecistanche.comdaha fazla bilgi için

Soyut:Bu çalışma, doğal bir polifenol olan oleuropein gibi birçok antioksidan ve antimikrobiyal ajan içeren zeytin saçağı özü tozunun (OLP) katı lipid nanopartiküllerinin (SLN'ler) hazırlanmasını ve değerlendirilmesini amaçlamıştır. OLP ile ilgili en önemli sorun, çevresel koşullardan kaynaklanan istikrarsızlık ve dolayısıyla biyoaktiviteden ödün verilmesiydi. Bu sorunun üstesinden gelmek için, SLN'ler ilacı korumak ve antioksidan ve antimikrobiyal aktivitesini geliştirmek için sıcak homojen ve ardından sonikasyon tekniği ile tasarlanmıştır. SLNS'nin geliştirilmesi ve stabilizasyonu için compritol 888ATO gibi lipidler ve tween 80 gibi yüzey aktif maddeler kullanıldı ve optimizasyon Box-Behnken istatistiksel tasarımı (3x3) ile yapıldı. Optimize edilmiş parti (F9) partikül boyutu, tutma verimliliği, PDI ve zeta potansiyeli 277,46 nm, yüzde 80,48 ,0,275. ve sırasıyla -23.18 mV. Optimize edilmiş formülasyon (F9), birinci dereceden salım kinetiği（R²=0.9984） ile 24 saate kadar sürekli salım modeli sergiledi ve ilaç salım mekanizmasının Fickian difüzyon tipi (n=0) olduğu bulundu .441). Stabilite çalışması üzerine, SLNs formülasyonunun stabil olduğu bulundu. Optimize edilmiş formülasyon üzerinde anti-oksidasyon ve anti-mikrobiyal çalışmalar yapıldı ve bulgular, SLN'lerin Gram-pozitif(Staphylococcus aureus) ve Gram-negatif(Pseudomonas aeruginosa)bakterilere karşı gelişmiş bir radikal temizleme aktivitesi ve anti-mikrobiyal aktivite gösterdiğini ortaya koydu. Son olarak, geliştirilen SLN'lerin OLP'yi koruyabildiği ve verilmesi için uygun olduğu sonucuna varılmıştır.

Anahtar Kelimeler:Olea europaea, oleuropein,katı lipid nanoparçacıkları, zeytin yaprağı özü,antioksidan aktivite, Antimikrobiyal etkinlik

Daha fazla bilgi için lütfen buraya tıklayın

1. Giriş

Dicotyledons Oleaceae familyası, zeytin ağaçları da dahil olmak üzere yaklaşık 30 cins yaprak döken bitkiden oluşur ve yaklaşık 600 türü vardır. Oleaceae üyeleri, Asya'nın topikal ve ılıman nedenlerinde iyi yetişir. Zeytin ağacı (Olea europaea) yağının meyve, yaprak gibi farklı kısımlarından elde edilen yağın düzenli tüketilmesi halinde sağlığa birçok faydası bulunmaktadır. Geleneksel olarak, çeşitli ateş türlerini ve vücutla ilgili diğer sorunları tedavi etmek için bir halk ilacı olarak kullanılmıştır2).

Zeytin yaprağı özütü, anti-hipertansif, hipoglisemik, antimikrobiyal, hipoürisemik vb. gibi çeşitli terapötik aktiviteler sergiledi. HIV-I enfeksiyonuna karşı anti-viral aktivite gösterildi ve rapor edildi. Ek olarak, zeytin bitkisinden elde edilen oleuropein (tipik bir sekoiridoid), hipokolesterolemik ve hipoglisemik aktivite ile güçlü antioksidan ve ayrıca anti-inflamatuar aktivite sergiledi. Oleuropein'in bozunma ürünü yani. hidroksitirosol ayrıca, potansiyel serbest radikal süpürme eylemi5 ile birlikte yukarıda belirtilen tüm aktiviteleri sergiledi.biyoflavonoidlerZeytin bitkisi ile ilgili tüm bu tedavi edici faaliyetler onu sağlık alanında önemli bir katkı sağlar· 4).

Bu projede yazarlar, Zeytin yaprağı ekstraktının anti-mikrobiyal ve antioksidan özellikleri ile ilgilenmektedir. Zeytin özütünün anti-mikrobiyal aktivitesi, p-hidroksibenzoik asit, siklotrisiloksan heksametil, Siklopentasiloksan oktametil ve Siklopentasiloksan desmetil, vanillik, kafeik, protokateşik, siringik, gallik asit vb.'den kaynaklanır. Oleuropein, kersetin ve tirosol gibi diğer bileşenler oleanolik asit ayrıca anti-mikrobiyal aktiviteden sorumludur. Tüm bu maddelerin antimikrobiyal potansiyeli, daha önce birkaç araştırmacı tarafından bakteri, maya, mantar, virüs, retrovirüs ve diğer parazitlere karşı rapor edilmiştir2).

Cistanche yaşlanmayı geciktirebilir

Meyve ve yaprak gibi doğal antioksidan kaynaklarının diyetle alınması büyük ilgi görmüş ve insan sağlığı üzerinde olumlu etki göstermiştir. Birçok epidemiyolojik çalışmanın sonuçları, polifenolden zengin gıda alımının koroner arter hastalığı (KKH) insidansını azalttığını ortaya koymuştur. MI(miyokard enfarktüsü), IS(iskemik inme), vb. gibi KKH ateroskleroz ile ilişkilidir". Son çalışmalar, oksidatif hasarın aterosklerozun ilerlemesi için önemli bir etiyolojik faktör olduğunu araştırdı, Özellikle oksidatif stres teorisine göre, Düşük yoğunluklu lipoproteinin (LDL) oksidatif modifikasyonunun ateroskleroz gelişiminde anahtar rol oynadığı düşünülmektedir.Bu nedenle, böyle bir işlemin inhibisyonu önemli bir terapötik yaklaşım olarak kabul edilir.Oleuropein (hidroksitirosol, tirozol) gibi çeşitli önemli bileşenler , verbascoside(ac-toeside veya Kalinin olarak da bilinir), ligstroside,apigenin-7-glucoside, di-cosmetic-7-glucoside, luteolin, catechin, vb zeytinin yaprakları için elde edilmiştir ve antioksidan özelliği gösterir. Daha önce bildirildiği gibi aktivite Hidroksitirosol, patentli antioksidan özelliklere sahip olan başlıca zeytin yaprağı oleuropeinidir).

Bu aktivitenin yanı sıra, zeytin yaprağı özütü, anti-inflamatuar",12), anti-kanser8.14), anti-viral5), hipoglisemikl4), hipolipidemik17, anti-trombosit agregasyonu gibi diğer farmakolojik aktiviteler sergiledi. Güvenlik Ajansı) ve EMA (Avrupa İlaç Ajansı), zeytin yaprağı ekstraktlarının terapötik uygulanabilirliği konusunda değerlendirmelerini yaptı.Ana uygulanabilirliğin yanı sıra, zeytin yaprağı ekstraksiyon ürünleri, atmosferik koşullarda (sıcaklık, ışık ve oksijen) kararsızlık problemlerinden muzdariptir. biyolojik koşulların yanı sıra zayıf biyoaktivite sergilemiştir20,21).cistanche satın alStabiliteyi arttırmak için, zeytin yaprağı ekstraktının çeşitli aktivitelerini keşfetmek için çeşitli nano bazlı formülasyonlar geliştirilmiştir. Bu formülasyonlar arasında nano-emülsiyon (W/O ve çoklu tipler)2), inklüzyon kompleksleri, sprey kuru ürünler?4), elektrostatik ekstrüzyon25, bipolar kompleksler), nano-lipozomlar20, Nano-emülsiyon, mikro -kapsülleme, PLA nanoparçacıkları2 ve NLC'ler0. Düşük verim değeri, zaman alıcı prosedür, tehlikeye atılmış yakalama verimliliği, artık çözücü kontaminasyonu ve yüksek parçacık boyutu gibi bu formülasyonlarla ilgili çeşitli problemler vardır. Böylece, bu dezavantajları düzenlemek için lipit nanoparçacıkları ortaya çıktı. Lipid nanoparçacıkları, özellikle katı lipid nanoparçacıkları (SLN'ler), daha iyi yakalama verimliliği, kontrollü parçacık boyutu, biyouyumluluk, biyolojik olarak parçalanabilirlik ve hazırlama kolaylığı gibi birçok avantaj sunar. Ayrıca, SLN'lerin hazırlanması için kullanılan lipidler, hapsolmuş ilaç ile birlikte anti-inflamatuar aktivite üzerinde bir miktar sinerjistik etkiye sahiptir. Bugüne kadar, anti-mikrobiyal ve antioksidan özelliklerini araştırmak ve ayrıca zeytin yaprağı ekstresi ürününün stabilitesini geliştirmek için katı lipid nanoparçacıklarına (SLN'ler) dayalı hiçbir formülasyon geliştirilmemiştir.

Bu nedenle, araştırma çalışması "Zeytin yaprağı (Olea europaea L.) ekstrakt tozu (OLP) için katı lipid nanopartiküllerinin (SLN'ler) geliştirilmesini amaçlamıştır. Aktif ilkeler, etanol kullanılarak zeytin yapraklarının ekstraksiyonu ile ayrılmıştır. Çözücü, kuru toz ürünü elde etmek için kurutularak uzaklaştırıldı Zeytin yaprağı ekstrakt gücü (OLP) SLN'lere(OLP-SLN'ler) dahil edildi ve Box-Behnken kullanılarak uzman tasarım yazılımı(Model 8.0.7.1) ile optimizasyon yapıldı. İlaç (OLP)/lipid oranı, yüzey aktif madde konsantrasyonu (yüzde , Tween 80) ve homojenizasyon hızı (rpm) gibi üç faktör bağımsız parametreler olarak alındı ​​ve partikül boyutu, tutma verimliliği ve polidispersite indeksi (PDI) gibi faktörler bağımlı parametreler olarak seçilmiştir.Optimize edilmiş formülasyon, morfolojik çalışma, DSC çalışması, in vitro salım çalışması ve stabilite çalışması için değerlendirilmiştir.Son olarak, anti-mikrobiyal ve anti-oksidan potansiyelini kontrol etmek için antimikrobiyal ve anti-oksidasyon aktiviteleri değerlendirilmiştir. gelişmiş S LNs formülasyonu.

2 Malzemeler ve Yöntemler

Zeytin yaprağı yerel bahçeden elde edildi. Taze yapraklar kurutuldu ve ekstraksiyon için toz haline getirildi. Değerli ATO5, compritol 888 ATO gibi çeşitli lipidler Gattefosse'den (Almanya) temin edildi. Gliseril monostearat (GMS), palmitik asit, stearik asit tween 80, vb. Central Drug house ltd'den (Yeni Delhi, Hindistan) satın alındı.2, 2-Difenil-1-Pikril hidroksil-hidrat serbest radikalleri (DPPH) ) Merck'ten (Darmstadt, Almanya) temin edilmiştir. Askorbik asit, potasyum dihidrojen fosfat, amonyum asetat, metanol, sodyum hidroksit, poloksamer 188, etanol, nutrient agar ve diyaliz torbası (M.Wt cut off 12,000 kD) Sigma Aldrich(St Louis, AMERİKA BİRLEŞİK DEVLETLERİ). Çalışma için kullanılan diğer tüm kimyasallar analitik derecelidir.

2.1 Fenolik bileşenlerin ekstraksiyonu

Taze zeytin yaprakları kurutuldu ve ekstraksiyon için toz haline getirildi. Aktif maddeler solvent (etanol: su, 4:1 v/v) yardımıyla güçten ekstrakte edildi. Ekstraksiyon şişesine yeterli miktarda toz (250 mg) alındı ​​ve çözücüye (1000 mL)etanol:su, 4:1 v/) eklendi ve karışım 24 saat boyunca sürekli olarak çalkalandı. Bu aşamadan sonra, fiziksel karışım süzüldü ve çözücü, tozu elde etmek için 40 derecede kuruyana kadar buharlaştırıldı).

2.2 SLN'lerin hazırlanması ve optimizasyonu: Ön

tarama çalışması ve formülasyon değişkenlerinin ön optimizasyonu Uygun lipid, yüzey aktif madde, homojenizasyon hızı ve süresi, sonikasyon süresi vb. seçimi için ön çalışmalar yapılmıştır. Uygun lipidin seçimi, lipid içindeki ilaç çözünürlüğüne bağlıdır ve sürfaktan seçimi, lipidin sürfaktan içindeki çözünürlüğüne bağlıdır.

İlgili lipid (100 mg), şişe içinde erime noktalarının üzerinde (yaklaşık 10 derece yukarıda) eritildi, ardından sürekli çalkalama ile ilaç (OLP) dahil edildi. Açık soluk rengin görünümü bitiş noktasını gösterir. Uygun yüzey aktif maddelerin seçimi için benzer deneyler yapıldı.

2.3 Deneysel tasarım

Bu çalışmada, optimizasyon amacıyla üç faktörlü ve üç seviyeli uzman tasarım yazılımının BBD'si uygulanmıştır. Çalışmada, bir ilacın lipide oranı(A,1:3-1:6), yüzey aktif madde konsantrasyonu(B, yüzde ,1.5-4,yüzde 0,5) ve homojenizasyon hızı(C) gibi üç faktör kullanılmıştır. ,rpm,3000-6000 rpm, iki saat için) bağımsız parametreler olarak ve par-başlık boyutu(nm,Y1), tuzak verimliliği(yüzde ,Y2) ve PDI (Y3) bağımlı parametreler olarak alınmıştır. Bu tasarımı uygulamanın amacı, yukarıda bahsedilen üç bağımsız parametreyi optimize etmek ve optimum parçacık boyutu, maksimum tutma verimliliği ve mümkün olan en az PDI elde etmekti. Veriler, BBD15 için uzman tasarım yazılımına yerleştirildi. Benzer bir bileşime sahip 5 grupla (beş merkez noktası) toplam 17 grup üretildi (Tablo 1). İkinci mertebeden polinom denklemi, çeşitli bağımsız parametrelerin partikül boyutu, yakalama verimliliği ve ayrıca PDI üzerindeki etkisini göstermek için kullanıldı.

2.4 SLN'lerin Geliştirilmesi

OLP yüklü SLN'ler, sıcak homojenizasyon ve ardından sonikasyon yöntemiyle hazırlandı. Farklı OLP yüklü SLN gruplarının bileşimi Tablo 1'de verilmiştir. Her şeyden önce, lipid (compritol 888 ATO) erime noktasının 10 derece civarında eritildi ve istenen miktarda OLP eklendi (1:{{6}). }:6 ilaç/lipid oranı). Bu arada gerekli miktarda (yüzde 1.5-4.5) yüzey aktif madde deiyonize su içinde çözündürüldü ve bu fazın sıcaklığı, lipid fazınınkiyle aynı tutuldu. Sulu faz daha sonra yavaş yavaş lipid fazına dahil edildi ve SLN dağılımını elde etmek için değişken bir hız halkasında (rpm, 3000-6000 rpm, iki saat) sıcak homojenizasyona tabi tutuldu. Elde edilen emülsiyonun

soğutulur ve daha sonra son SLN dağılımını elde etmek için bir sonikatör (Prob tipi, Vibra-Cell'VCX 130; Sonics, CT, ABD) yardımıyla yüzde 100 genlikte 10 dakika sonikasyona tabi tutulur. Dispersiyon, bir cam şişede toplandı ve daha fazla çalışma için bir buzdolabında saklandı. Benzer şekilde, boş SLN'ler API(ilaç) olmadan geliştirildi.

2.5 OLP-SLN'lerin Karakterizasyonu

2.5.1 Partikül boyutu, PDI ve zeta potansiyelinin değerlendirilmesi

Bir zeta boyutlandırma makinesi (Malvern, nano ZS 90, Malvern Instruments, UK) kullanılarak Foton Korelasyon Spektroskopisi (PCS), çeşitli partilerin ortalama parçacık boyutunun ve polidispersite indeksinin (PDI) ölçümü için kullanıldı. Sıcaklık 25 derecede tutuldu ve saçılma açısı 90 dereceye ayarlandı.sardunyaOrijinal OLP-SLN dispersiyonunun seyreltilmesi için deiyonize su kullanıldı. Yüzey yükünü belirten zeta potansiyeli, yaklaşık 20 V/cm27 elektrik alan şiddeti ile aynı alet yardımıyla belirlendi.

2.5.2 Morfolojik çalışma

Hazırlanmış OLP yüklü SLN'lerin (optimize edilmiş toplu F9) morfolojisini ve şeklini incelemek için bakır ızgara kaplı karbon kullanan bir transmisyon elektron mikroskobu (TEM, Fei elektron optiği, Japonya) kullanıldı. OLP-SLN örneğini boyamak için fosfotungstik asit boyaması (yüzde 2 a/a, süre 20-30 saniye) ile negatif boyama yapıldı ve ardından oda sıcaklığında kurutuldu. Son olarak, numune TEM tarafından tespit edildi.

2.5.3 Tuzak verimliliğinin değerlendirilmesi

Yakalama verimliliği (EE), OLP-SLN dispersiyonunda bulunan hapsolmamış ilaç miktarının incelenmesiyle belirlendi. Bu amaçla santrifüj tekniği kullanıldı. Ölçülen miktarda (10 mL) OLP-SLN'ler bir santrifüj tüpüne alındı ​​ve bir soğutma santrifüjünün (Remi, Hindistan) yardımıyla 12000 rpm'de 15 dakika süreyle tortulaşmasına izin verildi. Yakalanmamış bir ilacın varlığı, 230 nm'de bir UV-görünür spektrofotometre (Model 1800, Shimadzu. Japonya) ile analiz edildi. Uyuşturucu tuzağı yüzdesi aşağıdaki formülle belirlendi(denklem 1):

2.5.4 Diferansiyel taramalı kalorimetri (DSC) çalışması

Bu çalışmanın amacı, saf OLP, compritol 888 ATO ve diferansiyel tarama kalorimetrisi (Mettler, Toledo, ABD) kullanılarak optimize edilmiş OLP-SLNs formülasyonu (F9) gibi çeşitli formülasyonların termal davranışını değerlendirmekti. Her numune bir alüminyum kap içinde paketlendi ve inert bir atmosferde (nitrojen) referans olarak boş bir sızdırmaz kap kullanılarak 20-350 derece (oran 10 derece/dk) sıcaklık aralığında tarandı. DSC eğrileri elde edildi ve yorumlandı. . 2.5.5 İlaç salım çalışması( yüzde )

Optimize edilmiş serinin (F9) ilaç salımı çalışması, diyaliz zarı kullanılarak Franz difüzyon hücresi tarafından yapıldı. Diyaliz membranının uygulanmasından önce, 0.35 yüzde a/h sodyum sülfit çözeltisinin 80 derecede 1-2 dakika muamele edilmesi ve ardından HSO({{) ile asitlendirilmesi ile geliştirilmiştir. 13}}.2 yüzde ,v/v) ve ardından 12 saat damıtılmış su içinde saklandı. Reseptör bölmesine salin fosfat tamponu (pH 7.4) dolduruldu ve donör bölmesine SLN dispersiyonu (F9,1 mL) alındı. Deney 37±0.5 derecede sürekli karıştırılarak (50 rpm) gerçekleştirilmiştir. Önceden belirlenmiş zaman aralıklarında reseptör bölmesinden alikotlar (1 mL) alınmış ve her numunede bulunan ilaç miktarı UV-görünür spektrofotometre ile o anda tespit edilmiştir. 230 nm. Optimize edilmiş SLN'lerden uygun salım kinetiği, salım verilerinin sıfıra yerleştirilmesiyle tespit edildi, ilk olarak Tablo 2'de verilen Higuchi modeli ve Korsmeyer-Peppas modeli ve R(Korelasyon katsayısı) değeri belirlendi. En yüksek R değerine sahip model, optimize edilmiş bir model olarak kabul edildi8).

Bu makale J. Oleo Sci'den alınmıştır. 70, (10) 1403-1416 (2021)