Parikalsitol, Böbrek Perisitlerinde Hipoksiye Bağlı ve TGF'ye Bağlı Yaralanmayı İyileştirir- 1-

İletişim:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Jeong-Hoon Lim , Ju-min York, Se-Hyun Oh, Soo-Jee Jeon, Hee-Won Noh, Hee-Yeon Jung, Ji-Young Choi, Jang-Hee Cho, Chan-Duck Kim, Yong-Lim Kim, ve Sun-Hee Park *

Dahili Tıp Anabilim Dalı, Tıp Fakültesi, Kyungpook Ulusal Üniversitesi, Kyungpook Ulusal Üniversite Hastanesi, Daegu 41944, Kore; jh-lim@knu.ac.kr (J.-HL); jumin18@naver.com (J.-MY);

ttily@nate.com (S.-HO); hot716@naver.com (S.-JJ); hwn1104@gmail.com (HWN); hy-jung@knu.ac.kr (H.-YJ); jyss1002@hanmail.net (J.-YC); jh-cho@knu.ac.kr (J.-HC); drcdkim@mail.knu.ac.kr (C.-DK); ylkim@knu.ac.kr (Y.-LK)

* Yazışma: sh-park@knu.ac.kr; Tel.: artı 82-53-200-5547; Faks: artı 82-53-426-9464

Özet: Son zamanlarda böbrek perisitlerinin böbrek fibrozisindeki rolü araştırılmaktadır. Bu çalışma, parikalsitolün böbrek perisitlerinde hipoksi ile indüklenen ve TGF- 1- ile indüklenen hasar üzerindeki etkisini değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Primer kültürlenmiş perisitler, yaralanmayı indüklemeden önce 90 dakika boyunca parikalsitol (20 ng/mL) ile ön işleme tabi tutuldu ve daha sonra TGF- 1(5 ng/mL) veya hipoksiye (yüzde 1 O2 ve yüzde 5 CO2) maruz bırakıldılar. .TGF- 1 -SMA ve diğer fibrozis belirteçlerini artırdı, ancak perisitlerde PDGFR ekspresyonunu azalttı, buna karşın parikalsitol değişiklikleri tersine çevirdi. Parikalsitol, perisitlerin TGF- 1-indüklediği hücre göçünü inhibe etti. Hipoksi, TGF- 1, -SMA ve diğer fibrozis belirteçlerini artırdı, ancak perisitte PDGFR ekspresyonunu azalttı, oysa parikalsitol bunları tersine çevirdi. Hipoksi, HF-1o ve prolil hidroksilaz 3 ve glikoz taşıyıcı-1 dahil olmak üzere aşağı akış moleküllerini aktive ederken, parikalsitol HIF-1 -bağımlı moleküllerin ve TGF- 1/Smad'ın aktivasyonunu zayıflattı. hipoksik perisitlerde sinyal yolları. HIF-1a'nın gen susturulması, hipoksi ile indüklenen TGF- 1, -SMA yukarı regülasyonunu ve PDGFR aşağı regülasyonunu ortadan kaldırdı. Parikalsitolün fibroz belirteçlerinin HIF-1 -bağımlı değişiklikleri üzerindeki etkisi, HIF'nin gen susturulmasından sonra önemli değildi-1. Ek olarak hipoksi, perisitlerdeki oksidatif stresi şiddetlendirirken, parikalsitol, HIF-1 -bağımsız bir şekilde antioksidan enzimleri artırarak oksidatif stresi tersine çevirdi. Sonuç olarak, parikalsitol, TGF- 1-uyarılmış perisitlerde perisitin miyofibroblasta fenotip değişikliklerini iyileştirdi. Ek olarak parikalsitol, hipoksiye maruz kalan perisitlerde hem HIF'ye bağımlı hem de bağımsız bir şekilde fibroz belirteçlerinin ekspresyonunu iyileştirdi.

Anahtar Kelimeler: hipoksi; pariksitol; perisit; perisitten miyofibroblasta geçiş; TGF- 1; D vitamini agonisti

cistanche deneyimi böbrek fonksiyonu için çok iyidir

1. Giriş

Renal interstisyel fibrozfarklı türdeki böbrek yaralanmalarının yaygın bir patolojik sonucudur ve transforme edici büyüme faktörü (TGF)- 1 böbrek fibrozunu indükleyen ana katkıdır. Hipoksinin böbrekteki çeşitli hücre popülasyonlarını etkilerken böbrek fonksiyonunun ilerleyici kaybıyla da ilişkili olduğu bilinmektedir. Hasarlı tübüler epitel hücrelerinden ve infiltre inflamatuar hücrelerden gelen çeşitli hümoral faktörler, perisitler gibi interstisyel yerleşik hücrelerin miyofibroblastlara dönüşümünü tetikler. Genetik soy izleme tekniği, perisitlerin böbrek fibrozundaki miyofibroblastların kaynağı olduğunu göstermiştir [1]. Progresif tubulointerstisyel fibrozis, fibrozu kötüleştiren böbrek hipoksisine neden olarak bir kısır döngü oluşturur [2]. Hipoksiye maruz kalan hücreler, oksijen homeostazını ve hücre metabolizmasını düzenleyerek hipoksik koşullara uyum sağlamak için gereken ana transkripsiyon faktörü olan hipoksi ile indüklenebilir faktörü (HIF)-1a'yı yukarı doğru düzenler. HIF-1'ın çeşitli böbrek hücrelerinde farklı roller oynadığı bilinmektedir [3]. HIF-1, TGF- 1-bağımlı yolu aktive ederek ve epitelyalden mezenkimal geçişe aracılık ederek kronik böbrek hastalığı (CKD) progresyonu ve böbrek fibrozu ile ilişkilidir [4].

Kapiller yatak ve postkapiller venüllerdeki endotel hücrelerini çevreleyen dallı mezenkimal hücreler olan perisitler, anjiyogenez sürecinde hemostatik fonksiyonlara sahiptir ve vazomotor tonus regülasyonunda görev alırlar. Ayrıca perisitler, vasküler veya fibrojenik hastalıkların başlaması ve ilerlemesinde anahtar role sahiptir. Biriken kanıtlar, böbrek kan akışını, mikrodamar stabilitesini ve endotelyal sağkalımı düzenleme gibi böbrek perisitlerinin işlevini ve ayrıca böbrek hasarlarında (örneğin, akut böbrek hasarı [AKI] ve KBH) önemli bir role sahip olduğunu ortaya koymuştur [2,5, 6].

Enflamatuvar uyarının beyin perisitlerinde [7] CYP2R1 (D vitamini 25-hidroksilaz) ve D vitamini reseptörlerinin (VDR) ekspresyonunu indüklediğini gösteren önceki bir çalışma, bizi VDR aktivatörlerinin hastalığın hafifletilmesiyle ilişkili olabileceği hipotezine götürdü. böbrekte perisit hasarı.

Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, parikalsitolün hipoksi ile indüklenen ve TGF- 1- ile indüklenen yaralanma üzerindeki etkilerini değerlendirmektir.böbrek perisitleri.

2. Sonuçlar

2.1. Parikalsitolün TGF- 1-İndüklenmiş Perisit-Myofibroblast Geçişi Üzerindeki Koruyucu Etkileri

TGF{{0}} stimülasyonu, alfa düz kas aktin ( -SMA), fibronektin, vimentin ve matris metalloproteinaz-9 (MMP-9) gibi profibrotik belirteçlerin mRNA ekspresyonunu arttırdı. doza bağlı bir şekilde (Ek Şekil S1). Parikalsitolün perisitlerde TGF- 1-indüklenen fibroz üzerindeki etkisini değerlendirmek için parikalsitol ön tedavisinden sonra TGF- 1 maruziyeti yapıldı. Mezenkimal belirteçler, gerçek zamanlı PCR kullanılarak ölçüldü; -SMA, fibronektin ve vimentin mRNA ifadeleri, TGF- 1 stimülasyonundan sonra önemli ölçüde arttı (tümü p < 0.{{20}}5)="" (şekil="" 1a–c).="" parikalsitol="" ile="" birlikte="" tedavi,="" -sma,="" fibronektin="" ve="" vimentin="" ifadeleri="" gibi="" mezenkimal="" belirteçlerin="" yukarı="" regülasyonunu="" zayıflattı="" (tümü="" p="">< 0.05).="" hücre="" dışı="" matrisin="" (ecm)="" bozulmasında="" rol="" oynayan="" mmp-9'nin="" mrna="" ifadesi="" de="" artarken,="" parikalsitol="" birlikte="" tedavisi="" mmp-9="" ifadesini="" (p="">< 0.05)="" azalttı="" (şekil="" 1d="" ).="" bir="" perisit="" belirteci="" olarak,="" trombosit="" kaynaklı="" büyüme="" faktörü="" reseptörü="" beta="" (pdgfr="" )="" mrna="" seviyesi,="" tgf-="" 1="" stimülasyonundan="" sonra="" azaldı="" ve="" parikalsitol,="" pdgfr="" ekspresyonunu="" hem="" kontrol="" hem="" de="" tgf-="" 1-a="" maruz="" kalan="" gruplara="" (her="" ikisi="" de)="" kıyasla="" artırdı.="" p="">< 0.05)="" (şekil="" 1e).="" tgf-="" 1="" stimülasyonundan="" sonra="" -sma'nın="" protein="" ekspresyonu="" artmış="" ve="" pdgfr="" azalmıştır="" (her="" ikisi="" de="" p="">< 0.05)="" (şekil="" 1f,1g),="" oysa="" parikalsitol="" ile="" birlikte="" tedavi,="" hem="" -sma="" hem="" de="" pdgfr="" protein="" seviyelerindeki="" değişiklikleri="" tersine="" çevirmiştir="" (her="" ikisi="" de="" p="">< 0.05).="" bu="" sonuçlar,="" tgf-="" 1="" maruziyetinin="" perisitten="" miyofibroblast="" geçişine="" (pmt)="" neden="" olduğunu="" ve="" parikalsitol="">

PMT'yi iyileştirir.

2.2. TGF'de Parikalsitol Zayıflatılmış Smad2 Fosforilasyonu- 1-Perisitlerde İndüklenen Fibrozis

Parikalsitol tedavisinin TGF- 1- ile indüklenen PMT'de Smad-bağımlı yol üzerindeki etkisinin mekanizmasını araştırdık. Smad2 ve Smad3 yolaklarının protein ifadeleri western blot analizi ile ölçüldü (Şekil 2). p-Smad2 seviyesi ve p-Smad2'nin Smad2'ye oranı, TGF{{10}} maruziyetinden sonra önemli ölçüde arttı ve bu artış par1ikalsitol ile birlikte tedaviden sonra hafifletildi (Şekil 2B). TGF- 1 maruziyetinden sonra p-Smad3 seviyesi ve p-Smad3'ün Smad3'e oranı da arttı (her ikisi de p < 0.05),="" ancak="" parikalsitol="" birlikte="" tedavisi="" p="" seviyelerini="" değiştirmedi.="" -smad3="" ve="" p-smad3'ün="" smad3'e="" oranı="" (her="" ikisi="" de="" p=""> 0.05) (Şekil 2C).

2.3. Parikalsitol TGF'yi Azalttı- 1-Perisitlerin Göç Etmesini Tetikledi

TGF- 1'nin perisit migrasyonunu indükleyip indüklemediğini belirlemek ve migrasyonda parikalsitolün rolünü değerlendirmek için, parikalsitol ile birlikte veya onsuz TGF- 1 stimülasyonundan sonra perisit migrasyonunu inceledik. TGF- 1, çizik hücre göçü tahlilinde kontrol perisitlerine kıyasla yara kapanmasını önemli ölçüde hızlandırırken, TGF- 1 ve parikalsitolün birlikte tedavisi, perisitlerin çizik yara kapanmasını geciktirdi (Şekil 3A–C).

Şekil 1. Parikalsitolün TGF- 1- ile indüklenen fibrozis üzerindeki etkisi. (A–C) TGF- 1 profibrotik mezenkimal belirteçlerin, -SMA, fibronektin ve vimentinin mRNA ekspresyonunu arttırdı ve parikalsitol, perisitlerdeki fibrotik belirteçleri azalttı. (D) MMP-9 mRNA ifadesi, TGF- 1 stimülasyonundan sonra arttı ve parikalsitol, MMP-9 ifadesini zayıflattı. (E) PDGFR mRNA (perisit işaretleyici) ifadesi, TGF- 1 tedavisinden sonra azaldı ve parikalsitol, PDGFR ifadesini arttırdı. (F,G) TGF- 1 stimülasyonundan sonra -SMA'nın protein ekspresyonu azaldı ve PDGFR arttı. Parikalsitol ile birlikte tedavi, -SMA ve PDGFR protein seviyelerindeki değişiklikleri tersine çevirdi. Veriler standart hatalar olarak sunulmuştur. her grup için n=4. * p < 0.05="" kontrole="" karşı;="" **="" p="">< 0.01'e="" karşı="" kontrol;="" ***="" p="">< 0.001="" kontrole="" karşı;="" #="" p="">< 0.05="" ve="" tgf-="" 1="" tedavi="" grubu;="" ##="" p="">< 0.01="" ve="" tgf-="" 1="" tedavi="" grubu.="" kısaltmalar:="" -sma,="" alfa="" düz="" kas="" aktin;="" mmp-9,="" matris="" metalloproteinaz-9;="" pdgfr,="" trombosit="" kaynaklı="" büyüme="" faktörü="" reseptörü="">

Şekil 2. TGF- 1-'e maruz kalan perisitlerde Smad2 ve Smad3'ün ifadesi. (A,B) TGF- 1 perisitlerde hem p-Smad2 düzeyini hem de p-Smad2'nin Smad2'ye oranını önemli ölçüde artırdı ve parikalsitol tedavisi sonrası azaldı. (A,C) Üstelik TGF{{10}} hem p-Smad3 seviyesini hem de p-Smad3'ün Smad3'e oranını önemli ölçüde artırdı ve parikalsitol tedavisinden sonra değişmedi. Veriler standart hatalar olarak sunulmuştur. her grup için n=4. * p < 0.05="" kontrole="" karşı;="" **="" p="">< 0.01="" ve="" kontrol;="" ***="" p="">< 0.001="" vs.="" kontrol;#="" ​​p="">< 0.05="" vs.="" tgf-="" 1="" tedavi="" grubu.="">

C, kontrol grubu; P, parikalsitol tedavi grubu; T, TGF- 1 tedavi grubu; T artı P, TGF- 1 ve parikalsitol birlikte tedavi grubu.

Şekil 3. Scratch ve transwell hücre göçü deneylerinde parikalsitolün perisitlerde TGF- 1- ile indüklenen göç üzerindeki etkisi. (A) TGF- 1 ve/veya parikalsitol ile 0, 24 ve 48. saatlerde çizilmiş hücre tek tabakalarının hafif mikrografları alındı. (B) Göreceli çizik hücre göçü, çizik hücre göçünden sonra her 4 saatte bir, 48 saate kadar Incucyte canlı görüntüleme platformu kullanılarak zaman içinde ölçülmüştür. (C) 48 saatte nispi çizik hücre göçü. her grup için n=4. (D) Göç etmiş perisitlerin temsili mikroskobik görüntüleri ({{10}}}%1,1 kristal menekşe ile boyanmış; orijinal büyütme, ×100). (E) Göreceli göç, göç eden perisitlerin sayısı karşılaştırılarak belirlendi ve bunlar her grupta rastgele seçilen 10 alanda sayıldı. grup başına n=4. Veriler standart hatalar olarak sunulmuştur. ** p < 0.01,="" kontrole="" karşı;="" ***="" p="">< 0.001="" vs.="" kontrol;##="" p="">< 0.01="" vs.="" tgf-="" 1="" tedavi="" grubu;###="" p="">< 0.001="" vs.="" tgf-="" 1="" tedavi="">

Ayrıca, parikalsitolün membrandan perisit göçü üzerindeki etkisini doğrulamak için transwell migrasyon tahlili yapıldı. TGF- 1, perisit hareketliliğini önemli ölçüde artırırken, parikalsitol ile birlikte tedavi, TGF- 1-'nin neden olduğu göç artışını azalttı (Şekil 3D,E). Genel olarak, parikalsitol tedavisi, TGF- 1 maruziyetinden sonra perisitteki göç değişikliklerini iyileştirdi.

2.4. Perisitlerde Hipoksiye Bağlı Fibrozis Üzerine Parikalsitolün Koruyucu Etkisi

Daha sonra, hipoksiye maruz kalan perisitlerde perisit ve fibroz ile ilgili belirteçlerin değişikliklerini araştırdık. Hem TGF- 1 gen ekspresyonu hem de protein seviyeleri, normoksik koşullar altında olanlara kıyasla hipoksik koşullar altında önemli ölçüde arttı (her ikisi de p < 0.05)="" (şekil="" 4a,g).="" hipoksiye="" maruz="" kalan="" perisitlerde="" parikalsitol="" tedavisi,="" parikalsitol="" tedavisi="" uygulanmamasına="" kıyasla="" hem="" yukarı="" regüle="" edilmiş="" tgf-="" 1="" genini="" hem="" de="" protein="" seviyelerini="" tersine="" çevirdi="" (her="" ikisi="" de="" p="">< 0.05).="" -sma,="" fibronektin="" ve="" vimentin="" ve="" mmp-9="" gibi="" mezenkimal="" belirteçler="" hipoksik="" perisitlerde="" (tümü="" p="">< 0.05)="" artmış="" bir="" mrna="" ekspresyonu="" gösterdi,="" oysa="" parikalsitol="" tedavisi="" tersine="" döndü="" yukarı="" regüle="" edilmiş="" -sma,="" fibronektin,="" vimentin="" ve="" mmp-9="" mrna="" ifadesi="" (tümü="" p="">< 0.05)="" (şekil="" 4b–e).="" parikalsitol="" tedavisi="" ayrıca="" hipoksik="" perisitlerde="" -sma'nın="" protein="" ekspresyonunu="" tersine="" çevirdi="" (p="">< 0.05)="" (şekil="" 4h).="" pdgfr'nin="" mrna="" ve="" protein="" ifadeleri="" hipoksiye="" maruz="" kalan="" perisitlerde="" azaldı="" ve="" parikalsitol,="" hem="" kontrol="" hem="" de="" hipoksik="" perisitlere="" kıyasla="" pdgfr="" mrna="" ve="" protein="" ifadelerini="" tersine="" çevirdi="" (tümü="" p="">< 0.05)="" (şekil="" 4f,i).="" bu="" sonuçlar,="" hipoksinin,="" tgf'de-="" 1="" bir="" artış="" ile="" ilişkili="" olan="" pmt'yi="" indüklediğini,="" buna="" karşın="" parikalsitolün="" hipoksi="" ile="" indüklenen="" pmt'yi="" aşağı="" regüle="" ettiğini="">

Şekil 4. Hipoksik perisitlerde parikalsitolün TGF- 1 ve fibroz belirteçleri üzerindeki etkisi. (A) Hipoksi, TGF- 1 mRNA ifadesini arttırırken, parikalsitol tedavisi TGF- 1 mRNA seviyesini azalttı. (B–D) Hipoksi, profibrotik mezenkimal belirteçlerin, -SMA, fibronektin ve vimentinin mRNA ekspresyonlarını arttırırken parikalsitol, perisitlerdeki fibrotik belirteçleri azalttı. (E) MMP-9 mRNA ifadesi hipoksik koşul altında arttı ve parikalsitol MMP-9 ifadesini zayıflattı. (F) Hipoksi, normoksik kontrole kıyasla PDGFR'nin mRNA ekspresyonunu azaltırken, parikalsitol, hipoksik perisite kıyasla PDGFR ekspresyonunu arttırdı. (G) Hipoksi, TGF- 1 protein seviyesini yükseltirken, parikalsitol tedavisi TGF- 1 protein seviyesini azalttı. (H, I) Parikalsitol tedavisi, hipoksik perisitlerde -SMA'nın protein ekspresyonunu tersine çevirdi. Hipoksiye maruz kalan perisitlerde PDGFR protein seviyesi azalmıştır ve parikalsitol ayrıca PDGFR protein ekspresyonunu tersine çevirmiştir. Veriler standart hatalar olarak sunulmuştur. grup başına n=4. * p < 0.05="" ve="" normoksi="" kontrolü;="" ***="" p="">< 0.001="" ve="" normoksi="" kontrolü;="" #="" p="">< 0.05="" ve="" hipoksi="" grubu;="" ##="" p="">< 0.01="" ve="" hipoksi="" grubu.="" kısaltmalar:="" -sma,="" alfa="" düz="" kas="" aktin;="" mmp-9,="" matris="" metalloproteinaz-9;="" pdgfr,="" trombosit="" kaynaklı="" büyüme="" faktörü="" reseptörü="">

2.5. Hipoksiye Maruz Kalmış Perisitlerde Parikalsitol Zayıflatılmış Smad2 Fosforilasyonu

Western blot analizi ile hipoksi sırasında perisitlerdeki Smad sinyal yolunun düzenlenmesini inceledik. p-Smad2 ekspresyonu ve p-Smad2'nin Smad2'ye oranı hipoksiye maruz kalan perisitlerde önemli ölçüde yukarı regüle olurken, parikalsitol hipoksiye maruz kalan perisitlerde Smad2 yolunun yukarı regülasyonunu tersine çevirdi (her ikisi de p < 0).{{="" 11}}5)="" (şekil="" 5a,="" b).="" ancak="" parikalsitol,="" hipoksik="" koşullar="" altında="" yukarı="" regüle="" edilmiş="" smad3="" sinyal="" yolunu="" değiştirmedi="" (p=""> 0.05) (Şekil 5A, C).

Şekil 5. Hipoksik perisitlerde Smad2 ve Smad3'ün ifadesi. (A,B) Hipoksiye maruz kalma, perisitlerde hem p-Smad2 düzeyini hem de p-Smad2'nin Smad2'ye oranını önemli ölçüde artırdı ve parikalsitol tedavisinden sonra azaldı. (A, C) Hipoksi hem p-Smad3 düzeyini hem de p-Smad3'ün Smad3'e oranını değiştirmedi ve parikalsitol tedavisinden sonra azalmadı. Veriler standart hatalar olarak sunulmuştur. grup başına n=4. * p < 0.05="" kontrole="" karşı;="" #="" p="">< 0.05="" ve="" hipoksi="" grubu.="" kısaltmalar:="" nc,="" normoxia="" kontrol="" grubu;="" n="" artı="" p,="" normoksi="" ve="" parikalsitol="" tedavi="" grubu;h,="" hipoksi="" grubu;="" h+p,="" hipoksi="" ve="" parikalsitol="" tedavi="">

2.6. HIF-1a-Bağımlı Bir Şekilde Parikalsitol Atenüe Hipoksiye Bağlı Perisit Yaralanması

Normoksik perisitlere kıyasla hipoksiye bağlı HIF-1 gen ekspresyonunun yukarı regülasyonunu indükledi ve parikalsitol birlikte tedavisi HIF-1 ifadesini zayıflattı (p < 0.05)="" (şekil="" 6a).="" prolil="" hidroksilaz="" 3="" (phd3)="" ve="" glukoz="" taşıyıcı-1="" (glut-1)="" gibi="" hif-1="" -bağımlı="" gen="" ifadeleri="" de="" hipoksik="" koşullar="" altında="" arttı,="" ancak="" parikalsitol="" ile="" birlikte="" tedaviden="" sonra="" azaldı="" (her="" ikisi="" de="" p="">< 0.05)="" (şekil="" 6b,="" c).="" bu="" sonuçlar,="" parikalsitolün="" hipoksi="" sırasında="" hif-1="" -bağımlı="" yolun="" aktivasyonunu="" aşağı="" regüle="" ettiğini="">

Şekil 6. Parikalsitolün hipoksi ile indüklenen HIF-1 aktivasyonu üzerindeki ve HIF-1 gen susturulmasından sonraki etkisi. (A–C) Parikalsitol, hipoksiye bağlı HIF-1 ve HIF-1 -bağımlı gen (PHD3 ve GLUT-1) ​​ifadelerini zayıflattı. (D) Perisitlerin HIF-1 siRNA (5{{20}} uM, 6 saat) ile transfeksiyonu, kontrol ve hedef olmayan siRNA gruplarıyla karşılaştırıldığında HIF-1 ifadesini önemli ölçüde inhibe etti . (E–G) TGF- 1, PHD3 ve GLUT-1 üzerindeki parikalsitol etkileri, HIF-1 gen susturulmasından sonra azaldı. (H, I) -SMA ve PDGFR üzerindeki parikalsitol etkileri, HIF'nin gen susturulmasından sonra azaldı-1. Veriler standart hatalar olarak sunulmuştur. grup başına n=4. ** p < 0.01="" ve="" normoksi="" kontrolü;="" ***="" p="">< 0.{{30}}01="" ve="" normoksi="" kontrolü;="" #="" p="">< 0.05="" ve="" hipoksi="" grubu;="" ##="" p="">< 0.01="" ve="" hipoksi="" grubu;="" ###="" p="">< 0,001="" ve="" hipoksi="" grubu;="" ve="" &="" p="">< 0.001,="" hedef="" olmayan="" sirna="" normoksi="" grubuna="" karşı;="" §="" p="">< 0.05,="" hedef="" olmayan="" sirna="" hipoksi="" kontrolüne="" karşı;="" †="" p="">< 0.05="" ve="" sihif-1="" hipoksi="" grubu.="" kısaltmalar:="" hif,="" hipoksi="" ile="" indüklenebilir="" faktör;="" phd3,="" prolil="" hidroksilaz="" 3;="" glut-1,="" glikoz="" taşıyıcısı-1;="" sirna,="" küçük="" enterferans="" yapan="" rna;="" h,="" hipoksi;="" -sma,="" alfa="" düz="" kas="" aktin;="" pdgfr,="" trombosit="" kaynaklı="" büyüme="" faktörü="" reseptörü="">

HIF-1'in perisitlerdeki hipoksik hasardaki rolünü ve parikalsitolün aktif bölgesini araştırmak için, küçük enterferans yapan (si)RNA'lar kullanarak HIF-1'nin gen susturmasının etkisini değerlendirdik. Şekil 6D, HIF-1'nin HIF-1 siRNA tarafından etkili inhibisyonunu göstermektedir. Hipoksiye maruz kalan perisitlerde HIF-1'nin gen susturulması ile TGF- 1 artmadı ve parikalsitol tedavisi, HIF'nin gen susturulmasından sonra TGF- 1 seviyelerini önemli ölçüde düşürmedi{{ 9}} (Şekil6G). Hipoksik koşullar altında, PHD3 ve GLUT-1 gibi HIF-1 -bağımlı gen ifadeleri de HIF'nin gen susturulmasından sonra artmadı-1. Parikalsitol tedavisi, PHD3'ün mRNA ifadesini daha da azalttı (Şekil 6E) ancak GLUT'un mRNA ifadesini değiştirmedi-1 (Şekil 6F). -SMA ve PDGFR'nin mRNA ifadesi de hipoksik perisitlerde HIF-1 siRNA ile tedaviden sonra parikalsitol tedavisi ile önemli ölçüde değişmedi (Şekil 6H, I).

2.7. HIF-1a-Bağımsız Bir Şekilde Parikalsitol Zayıflatılmış Hipoksiye Bağlı Oksidatif Stres

Şekil 7 hipoksiye maruz kalan perisitlerde parikalsitolün oksidatif stres hasarı üzerindeki etkisini göstermektedir. Süperoksit dismutazlar (SOD'ler), katalaz ve glutatyon peroksidaz dahil olmak üzere antioksidan enzimlerin değişikliklerini hipoksik perisitlerde HIF'nin gen susturulması ile ve olmadan ölçtük-1. Hipoksiye maruz kalan perisitlerde, antioksidan enzim seviyeleri (SOD1, SOD2, katalaz ve glutatyon peroksidaz) azaldı, ancak parikalsitol tedavisinden sonra arttı (Şekil 7A-D). Perisitlerde HIF- 1 gen susturulmasından sonra, parikalsitol tedavisi hipoksik koşullar altında antioksidan enzimlerin (SOD1, SOD2, katalaz ve glutatyon peroksidaz) ekspresyonunu yükseltti (tümü p < 0.05)="" (şekil="" 7e–h).="" ayrıca,="" sonuçlar="" parikalsitolün="" hipoksik="" perisitlerde="" antioksidan="" etkileri="" olabileceğini="" ve="" bu="" etkilerin="" hif-1="" ifadesinden="" bağımsız="" olduğunu="">

Şekil 7. Parikalsitolün, HIF'nin gen susturulmasıyla veya onsuz hipoksik perisitlerdeki antioksidan enzimler üzerindeki etkisi-1 . (A–D) Oksidatif strese bağlı antioksidan enzimler (SOD1, SOD2, katalaz ve glutatyon peroksidaz) hipoksik perisitlerde önemli ölçüde azalırken, parikalsitol tedavisinden sonra antioksidan enzimler arttı. (E–H) HIF'nin gen susturulması ile hipoksik perisitlerde parikalsitol tedavisinden sonra antioksidan enzimler önemli ölçüde arttı-1 . Veriler standart hatalar olarak sunulmuştur. her grup için n=4. *** p < 0.{{10}}01="" ve="" normoksi="" kontrolü;="" #="" p="">< 0.05="" ve="" hipoksi="" grubu;="" ##="" p="">< 0.01="" ve="" hipoksi="" grubu;="" ###="" p="">< 0,001="" ve="" hipoksi="" grubu;="" †="" p="">< 0.05="" ve="" sihif-1="" hipoksi="" grubu;="" ††="" p="">< 0.01="" ve="" sihif-1="" hipoksi="" grubu.="" kısaltmalar:="" hif,="" hipoksi="" ile="" indüklenebilir="" faktör;="" sod,="" süperoksit="" dismutaz;="" sirna,="" küçük="" enterferans="" yapan="" rna;="" h,="">

3. Tartışma

Bu çalışma, perisitte hipoksi ile indüklenen ve TGF- 1- ile indüklenen hasara karşı parikalsitolün koruyucu etkisini göstermiştir. Böbrek fibrozu ve doku hipoksisi arasında bir karışma gözlemlenebilir ve bunlar sinerjistik olarak KBH ilerlemesini destekler [2]. Hem TGF- 1 stimülasyonu hem de hipoksiye maruz kalma PMT'yi indükler ve parikalsitol tedavisi hasarlı perisitlerdeki fibrotik değişiklikleri iyileştirir. Parikalsitolün antifibrotik etkisi, HIF-1 -bağımlı Smad2 sinyal yolu ve bunun aşağı regülasyonu ile ilişkilendirildi. Ayrıca parikalsitol, hipoksiye maruz kalan perisitlerde HIF-1 - bağımsız bir şekilde antioksidan etkilere sahipti ve bu da PMT'yi inhibe edebilir.

Parikalsitol, 19-nor-1,25-(OH)2-D2 vitamini, aktif bir D vitamini analoğudur ve seçici olarak VDR'yi etkinleştirir. Esas olarak sekonder hiperparatiroidizmi tedavi etmek için kullanılır ve ek antifibrotik ve antioksidan etkileri önceki çalışmalarda kanıtlanmıştır [8-10]. Seçici olmayan D vitamini aktivatörleri de anti-inflamasyon ve immünomodülasyon [11,12] gibi benzer faydalı etkiler gösterse de, serum kalsiyum ve fosfat seviyelerini artırma eğilimindedirler. Parikalsitol seçici bir VDR agonistidir ve elektrolit seviyelerini artırmadan kalsiyum homeostazı üzerinde faydalı etkileri vardır. Diyabetik nefropati, obstrüktif nefropati ve iskemik böbrek hasarı gibi deneysel çalışmalarda böbrek hastalıkları üzerinde birçok faydalı etki göstermiştir [13-15]. Perisitler, böbrekler de dahil olmak üzere tüm vaskülarize dokularda her yerde bulunur ve mikrovasküler yapının yapısal stabilizasyonu, kan akışı kontrolü, anjiyogenez ve yara iyileşmesi ile ilgili temel fonksiyonlara aracılık eder [5,6,16-18]. Hareketsiz perisitler, böbrek yaralanmaları veya hipoksik koşullarda artan TGF- 1 ve oksidatif stres gibi çeşitli faktörler tarafından aktive edilir ve değiştirilir [2,6,19]. Aktive perisitler peritübüler kapillerlerden ayrılır ve miyofibroblastlara dönüştürülür ve sonuç olarak böbrek fibrozisine neden olur [2]. Ayrıca, parikalsitolün perisitlerde hipoksi ile indüklenen ve TGF- 1- ile indüklenen fibrozis üzerinde CKD progresyonunun inhibisyonuna katkıda bulunabilecek koruyucu etkilerini gösterdik.

Böbrek fibrozu, nedeni ne olursa olsun, KBH'nin yaygın bir patolojik özelliğidir ve uzun vadeli böbrek fonksiyonunu ve son dönem böbrek hastalığına (ESKD) ilerlemeyi öngören KBH'nin ayırt edici özelliğidir [2,20,21]. Bu çalışmada, TGF- 1 stimülasyonu, hipoksi ile indüklenen PMT ve parikalsitol tedavisi, TGF- 1/Smad sinyal yolunu inhibe ederek profibrotik süreci hafifletmiştir. -SMA'yı eksprese eden aktive mezenkimal hücreler olan böbrek miyofibroblastları, böbrek skarını oluşturan tubulointerstisyumda ECM'nin üretilmesi ve birikmesi yoluyla böbrek fibrozunda önemli bir rol oynar [6]. KBH ilerlemesini önlemek için antifibrotik tedavi ile ilgili olarak, araştırmacılar miyofibroblastların proliferasyonu ile ilişkili ana hedef hücreleri ve aracıları araştırmışlardır [22-24]. Ayrıca, miyofibroblastların kesin kökeni henüz belirlenmemiştir. Perisitler, yerleşik fibroblastlar, epitel hücreleri, endotel hücreleri ve stromal mezenkimal hücreler gibi çeşitli hücrelerden köken aldıkları bilinmektedir [25]. Ancak özellikle böbreklerde Humphreys ve ark. bu aktive mezenkimal fibroblastların çoğunun mikrovaskülatüre bağlı olduğunu ve perisitlerden kaynaklandığını bildirmiştir [19]. İlginç bir şekilde, parikalsitol bu çalışmada hem hipoksi ile indüklenen hem de TGF- 1- ile indüklenen perisit hasarında Smad2 sinyal yolunu sadece aşağı regüle etti, ancak Smad3 yolunu değil. Smad2 ve Smad3, amino asit dizilerinde yüzde 90 benzerlik paylaşır, ancak TGF- 1 sinyalini aktarmada farklı duyarlılığa sahiptirler [26]. Parikalsitolün Smad2 yolunu nasıl inhibe ettiğine dair kesin mekanizma bu çalışmada açıklanamasa da, Smad2 fosforilasyonunun inhibisyonu, böbrek perisitlerinde parikalsitolün antifibrotik etkisi için ana mekanizma olabilir.

Böbrekler, arteriyel-venöz oksijen şantı nedeniyle büyük miktarda kan akışına (insanlarda kalp debisinin yüzde 20'si) sahip olmasına rağmen fizyolojik olarak hipoksik organlardır [27-29]. Ayrıca, böbrek korteksine oksijen temini, böbrek perfüzyonunun durumuna bağlı olarak önemli ölçüde değişebilir [30]. Bunlar yetersiz oksijen kullanımı ve intrarenal oksijen seviyelerinde değişkenlik getirdiğinden, böbrekler hipoksik yaralanmalara karşı savunmasız olma eğilimindedir [30]. AKI'nin akut fazında renal tübüler epitel hücreleri ve vasküler endotel hücreleri hasar görür ve aktive olur. Bu, çeşitli sitokinlerin ve kemokinlerin upregülasyonu ile sonuçlanır, sonuç olarak inflamatuar kaskadlar başlatılır ve yaralanma şiddetlenir [31-33]. AKI'nin kronik fazında AKI, tübülointerstisyel fibrozu indükleyerek böbrek hipoksisini şiddetlendirir, çünkü ECM'nin aşırı birikimi peritübüler kapillerler ve tübüler epitel hücreleri arasındaki mesafeyi artırarak oksijen difüzyon verimliliğinde bir azalmaya neden olur [27]. Vasküler faktörlerin azalmış ekspresyonu ile perisit dekolmanı yoluyla kapiller seyrelme de böbrek hipoksisinin önemli bir nedenidir. Hipoksi, böbrek fibrozunu indüklemek için TGF-/Smad, Notch ve NF-kB yolları gibi çoklu sinyal ağlarının entegrasyonuna yol açan HIF-1 sinyal yolunu aktive eder [3]. Böbrek fibrozu ve hipoksi arasındaki bu kısır döngü, KBH'nin ilerlemesine katkıda bulunur. Bu nedenle, bunlar böbrek hasarında ana terapötik hedeflerdir.

Perisitlerin hipoksik değişikliklerini ve parikalsitolün böbrek hasarına benzer bir ortamda koruyucu etkisini net bir şekilde değerlendirmek için perisitler hipoksik koşullara maruz bırakıldı. Hipoksiye maruz kalma, HIF-1 ve HIF-1 -bağımlı gen ifadelerini arttırdı. HIF-1 böbrek fibrozisine neden olur ve oksijen tüketen metabolik yolları ve hücre içi organelleri inhibe ederek oksijen kullanımını azaltır [34-36]. Parikalsitol, HIF-1, ardından HIF-1 -bağımlı genleri ve hipoksiye maruz kalan perisitlerdeki TGF- 1 ifadelerini aşağı regüle ederek bir antifibrotik etki gösterdi. HIF-1 gen susturmasının sonuçları da HIF-1'ın hipoksik perisit hasarında parikalsitolün ana terapötik hedefi olacağını desteklemektedir. Bu arada, PHD3 ifadesi, azalma derecesi zayıflamasına rağmen, HIF-1 susturulduktan sonra bile parikalsitol tedavisinden sonra azaldı. Bu, PHD3'ün sadece bir oksijen sensörü olmakla kalmayıp aynı zamanda HIF-1 -bağımsız mekanizma yoluyla apoptozu indüklediği gerçeğiyle ilgili olabilir [37]. Ancak parikalsitolün perisitlerdeki antiapoptotik etkisi ile ilgili daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. Ayrıca parikalsitolün, hipoksiye maruz kalan perisitlerde HIF-1 -bağımsız bir şekilde oksidatif stres hasarını azalttığı gösterilmiştir. Oksidatif stres, böbrek fibrozu ve inflamasyonuna katkıda bulunan iyi bilinen bir faktördür [38]. Genel olarak, renal hipoksi, CKD geliştirmek için PMT'yi aktive ederken, parikalsitol HIF-1 -bağımlı ve HIF-1 - bağımsız bir şekilde fibrozu inaktive edebilir.

Son zamanlarda, birçok çalışma AKI'den CKD'ye geçişte hipoksinin önemini bildirmiştir [39,40]. Fibrozis, doku hasarına karşı temel bir koruyucu yanıttır, ancak böbrekteki kronik aşırı fibrozis hipoksiye neden olur ve onarım sürecini engeller [41]. Bildiğimiz kadarıyla bu, hipoksi ve TGF- 1-indüklediği PMT'nin yanı sıra parikalsitolün perisitlerdeki antifibrotik ve antioksidan etkilerini araştıran ilk çalışmadır. Bu çalışmanın, parikalsitolün AKI-CKD geçişini inhibe etmek için böbrek yaralanmalarını tedavi etmedeki terapötik etkisini kanıtlayan gelecekteki araştırmalar için bir temel sağlaması beklenmektedir. Ancak, bu çalışmanın birkaç sınırlaması vardır. İlk olarak, kokültür deneyinde parikalsitolün antifibrotik ve antioksidan etkilerini değerlendirmedik. Perisitler kapiller endotelyal hücrelere yakın konumlandığından, hasarlı endotelyal hücreler tarafından üretilen faktörler parikalsitolün etkilerini etkileyebilir [2]. İkincisi, parikalsitolün koruyucu etkisinin ayrıntılı mekanizması ve Smad2'nin fosforilasyonunu nasıl engellediği değerlendirilmemiştir. Kesin etki mekanizmasını doğrulamak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.

Sonuç olarak, hipoksi veya TGF- 1, Smad2 sinyal yolu yoluyla HIF-1 -bağımlı bir şekilde PMT'yi indükledi. Parikalsitol, HIF-1 -bağımlı yolun aşağı regülasyonu ve TGF- 1/Smad2 sinyal yolunun inhibisyonu yoluyla yukarı regüle edilmiş PMT'yi iyileştirdi. Hipoksiye maruz kalan perisitler ayrıca parikalsitol tedavisine bağlı olarak antioksidatif enzimleri HIF-1 -bağımsız bir şekilde artırarak iyileşen oksidatif stres yaralanmalarına neden oldu. Ayrıca, sonuçlarımız parikalsitolün hipoksi ile indüklenen ve TGF{8}} ile indüklenen hasarda perisit biyolojisini hedefleyerek renal fibroz tedavisinde potansiyel bir terapötik seçenek olabileceğini düşündürmektedir.

4. Malzemeler ve Yöntemler

4.1. Fare Böbrek Perisitlerinin İzolasyonu ve Kültürü

C57BL/6 fareböbreklerkapsüller dekapsüle edildi, küp küp doğrandı ve ardından Liberase (0.5 mg/mL, Roche, Mannheim, Almanya) ve DNase (100 U/mL, New England) ile 37 derecede 45 dakika inkübe edildi. Biolabs, Hitchin, UK) DMEM/F12 içinde 37°C'de çalkalayıcı bir su banyosunda. Santrifüjden sonra hücreler, 4 °C'de 5 dakika boyunca RBC lizis tamponu içinde yeniden süspanse edildi, yıkandı, EDTA içeren yüzde 0,5 BSA tamponu içinde yeniden süspanse edildi ve bir 70- ve 40-mm hücre süzgecinden süzüldü. Santrifüjlemeden sonra, pelet yüzde 45 (h/h) Percoll çözeltisi içinde yeniden süspanse edildi ve 5525 x g'de 30 dakika boyunca 4 °C'de (frenleme olmadan) santrifüjlendi. Hücre katmanı daha sonra Percoll çözeltisinin üst katmanından toplandı. Santrifüjden sonra hücre topakları daha sonra CD146 (LSEC) MicroBeads ile manyetik olarak etiketlendi ve

üreticinin talimatlarına uygun olarak. Toplanan hücreler daha sonra kültüre alındı.

yüzde 2 FBS, yüzde 1 PGS ve yüzde 1 P/S (ScienCell, Carlsbad, CA, ABD) ile desteklenmiş bir perisit ortamı, 37°C'de yüzde 5 CO2 ve yüzde 95 hava koşulunda. Bu çalışmada kullanılan birincil kültürlenmiş hücreler Geçiş 2 ve 6 arasındaydı. Büyüme ortamı her 3-4 günde bir değiştirildi.

Kültürlenmiş perisitleri, akış sitometrisi ve PDGFR , CD146 ve nöron-glial antijen 2 (NG2) (Ek Şekil S2) gibi perisite özgü belirteç boyama yoluyla doğruladık. Floresanla aktive olan hücre sınıflandırma analizinde, kültürlenmiş perisitler artan bir PDGFR , CD146 ve NG2 pozitif hücre popülasyonu gösterdi ve CD31 pozitif hücre popülasyonu değişmedi. İmmünofloresan boyama analizinde, kültürlenmiş perisitler ayrıca CD146/PDGFR, CD146/NG2 ve PDGFR/NG2'yi birlikte eksprese etti. Perisit canlılığı, Hücre Sayım Kiti-8 (CCK-8) testi kullanılarak değerlendirildi; 24 saat boyunca parikalsitol (20 ng/mL) ve/veya TGF- 1 (5 ng/mL) ile tedaviden sonra perisit canlılığı değişmedi.

4.2. Hücre Tedavileri

24 saat büyüme faktörü açlığından sonra, perisitler 90 dakika boyunca parikalsitol (20 ng/mL) ile veya onsuz ön işleme tabi tutuldu ve ardından TGF- 1 (5 ng/mL; R&D Systems, Minneapolis, MN, ABD) tarafından uyarıldı. 48 saat boyunca. Hipoksi için, perisitler hipoksi iş istasyonunda (Invivo2 400, Baker Ruskin, Sanford, ME, ABD) yüzde 1 oksijen ve yüzde 5 CO2 içinde kültürlendi.

4.3. Perisitlerin İmmünofloresan Boyanması

Perisitler, oda slaytlarında kültürlendi ve 30 dakika boyunca PBS içinde yüzde 3,7 paraformaldehit ile sabitlendi. Ayrıca perisitler, PBS ile yıkandı ve 15 dakika boyunca yüzde 0.3 Triton ile geçirgenleştirildi. Sabitlenmiş hücreler, PDGFR (1:50), CD146 (1:50) ve NG2 (1:50) için birincil antikorlarla gece boyunca 4 .C'de inkübe edildi. Perisitler tekrar yıkandıktan sonra sekonder antikorlarla (Alexa Fluor 488 ve Alexa Fluor 594, Life Technologies, Eugene, OR, ABD) 2 saat oda sıcaklığında inkübe edildi. Çekirdek, 4/,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile zıt boyandı ve slaytlar, solmaya karşı bir montaj reaktifi (Molecular Probes) ile monte edildi. Kesitler, LSM 5 Exciter (Carl Zeiss, Oberkochen, Almanya) kullanılarak bir Zeiss konfokal tarama lazer mikroskobu ile incelendi.

4.4. Hücre Canlılığı Testi

Perisitler 96-kuyulu plakalara ekildi ve serumsuz bir ortam kullanılarak 24 saat inkübe edildi. Açlıktan sonra perisitler parikalsitol (20 ng/mL) ve/veya TGF- 1 (5 ng/mL) ile tedavi edildi. Hücre canlılığı, üreticinin talimatlarına göre CCK-8 tahlili (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japonya) kullanılarak analiz edildi. Absorbans, bir mikroplaka (SPARK 10M, Tecan, Durham, NC, ABD) kullanılarak 450 nm'de ölçüldü. Değer, kontrolün yüzdesi olarak ifade edildi.

4.5. Scratch Cell Migration Assay

Perisitler 96-kuyulu IncuCyte ImageLock Plakalarına (Essen BioScience, AnnArbor, MI, ABD) kaplandı ve gece boyunca inkübe edildi. Ortam, hücre proliferasyonunu inhibe etmek için 2 saat boyunca mitomisin-C (10 ug/mL, M4287; MilliporeSigma, Burlington, MA, ABD) ile tam ortam olarak değiştirildi. Her hücre tek tabakası, üreticinin talimatlarına uygun olarak bir 96-pin WoundMaker (IncuCyte Zoom Live-Cell Imaging System; Essen BioScience) kullanılarak çizildi. Kaşımadan sonra, parikalsitolün hücre göçü üzerindeki etkisini incelemek için perisitler, 90 dakika süreyle parikalsitol (20 ng/mL) ile ön işleme tabi tutuldu ve ardından 48 saat süreyle TGF- 1 (5 ng/mL) ile inkübe edildi. Tedaviden sonra, görüntüler her 4 saatte bir IncuCyte yazılım sistemine alındı, kaydedildi ve kaydedildi. Veriler entegre bir metrik kullanılarak analiz edildi ve değerler bağıl yara yoğunluğu olarak ifade edildi.

4.6. Transwell Hücre Geçiş Testi

Perisitler, 90 dakika boyunca parikalsitol (20 ng/mL) ile ön inkübasyondan sonra 24 saat boyunca TGF- 1 (5 ng/mL) ile muamele edildi. Ayrıca, hücreler tripsin-EDTA ile ayrılmış ve 24-kuyulu Transwell ekleri (1 x 104 hücre/kuyu, 8 mm gözenek boyutu; 6.5 mm) üzerine kaplanmıştır.

Transwell [#3422], Corning, NY, ABD). 24 saat sonra, eklerin alt yüzüne göç eden hücreler, 10 dakika boyunca yüzde 3,7 paraformaldehit ile sabitlendi. Öte yandan, alt yüzdeki migrasyon yapan hücreler 5 dakika boyunca yüzde 0.1 kristal viyole (V5265; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) ile boyandı ve rastgele seçilen 10 alandaki hücreler bir altında sayıldı. ×100 büyütmede ışık mikroskobu.

4.7. HIF-1bir siRNA ile Perisitlerin Transfeksiyonu

Fare HIF{{0}} siRNA ve hedeflenmeyen (negatif kontrol) siRNA, Dharmacon'dan (Chicago, IL, ABD) satın alınmıştır. Transfeksiyon, üreticinin talimatlarına uygun olarak Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen, Paisley, UK) kullanılarak yapıldı. Perisit hücreleri (5.0 x 104), transfeksiyondan 1 gün önce ekildi ve ertesi gün yüzde 40-50 birleşmeye ulaşmak için kültürlendi. HIF-1 için RNAi dupleksleri, kaplanmış hücrelere eklenen bir transfeksiyon kompleksi oluşturmak için Lipofectamine ile karıştırıldı. 6 saatlik inkübasyondan sonra hücreler, 90 dakika süreyle parikalsitol (20 ng/mL) ile ön işleme tabi tutuldu, daha sonra bir hipoksi odasına aktarıldı ve 24 saat boyunca hipoksiye maruz bırakıldı. Transfekte edilmiş hücreler, kantitatif gerçek zamanlı ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) için kullanıldı.

4.8. RNA Ekstraksiyonu ve Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR Analizi

Toplam RNA, üreticinin talimatlarına göre Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD) ile muamele edilmiş perisitlerden ekstre edildi. Bir mikrogram toplam RNA, PrimeScript cDNA Sentez kiti (Takara Shuzo Co., Otsu, Japonya) kullanılarak ters olarak kopyalandı. Gerçek zamanlı PCR (Ek Tablo S1) için tüm primerler, Primer Express V1.5 yazılımı (Applied Biosystems, Foster City, CA, ABD) kullanılarak tasarlanmıştır. Kantitatif gerçek zamanlı PCR, SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, ABD) kullanılarak ABI PRISM 7500 Sekans Tespit Sisteminde (Applied Biosystems, Foster City, CA, ABD) gerçekleştirilmiştir. Numunelerin tümü, GAPDH ifadesi ile ilgili olarak gen ekspresyonunun ve normalizasyonun nispi niceliği için karşılaştırmalı Ct yöntemi kullanılarak hesaplandı.

4.9. Western Blot Analizi

İşlemden sonra toplam proteinler (25 ug) yüzde 10 sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrıldı ve bir nitroselüloz zara aktarıldı. Membran, oda sıcaklığında 1 saat boyunca yüzde 10 yağsız süt ile bloke edildi ve gece boyunca 4 derecede fosfo-Smad2 (1:1000, Millipore), Smad2 (1:200, Invitrogen), fosfo-Smad3 (1: 1000, Hücre Sinyali, Danvers, MA, ABD), Smad3 (1:1000, Hücre Sinyali), TGF- 1 (1:1000, Santa Cruz, Dallas, TX, ABD) ve GAPDH (1:2000, Telefon sinyali). Yıkandıktan sonra zar, yaban turpu peroksidazla konjuge sekonder antikorlarla (P0448, Dako, Glostrup, Danimarka) 1 saat süreyle inkübe edildi. Membran, ECL reaktifleri (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, ABD) kullanılarak saptandı ve bir ImageQuant™ LAS 4000 sisteminde (GE Healthcare Life Sciences, Tokyo, Japonya) görselleştirildi. Protein bant yoğunlukları, Scion Image yazılımı (Scion, Frederick, MD, ABD) kullanılarak ölçüldü.

4.10. İstatistiksel analiz

Veriler standart hatalar olarak sunulur ve en az üç bağımsız deneyden elde edilir. İstatistiksel analizler parametrik olmayan Kruskal-Wallis testi kullanılarak yapıldı, ardından Bonferroni düzeltmeli Mann-Whitney U testi kullanılarak bir posthoc analiz yapıldı. Analiz SPSS (sürüm 20.0, IBM Corp., Armonk, NY, ABD) kullanılarak yapıldı. 0.05'ten küçük bir p değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Ek Materyaller: Aşağıdakiler çevrimiçi olarak https://www.mdpi.com/article/10 .3390/ijms22189751/s1 adresinde mevcuttur.

Yazar Katkıları: Kavramsallaştırma, J.-HL ve S.-HP; metodoloji, J.-HL, J.-MY ve S.-HP; doğrulama, J.-HL, J.-MY ve S.-HP; biçimsel Analiz, J.-HL ve J.-MY; soruşturma, J.-HL, J.-MY, S.-HO ve S.-HP; kaynaklar, J.-MY ve S.-HP; veri iyileştirme, J.-HL, J.-MY ve S.-HP; yazı—orijinal taslak hazırlama, J.-HL, J.-MY ve S.-HP; yazma—inceleme ve düzenleme, J.-HL, S.-JJ, HWN, H.-YJ, J.-YC, J.-HC, C.-DK, Y.-LK ve S.-HP; denetim, S.-HP; proje yönetimi, S.-HP Tüm yazarlar makalenin yayınlanan versiyonunu okumuş ve kabul etmiştir.

Finansman: Bu çalışma Biyomedikal Araştırma Enstitüsü hibesi, Kyungpook Ulusal Üniversite Hastanesi (2019) tarafından desteklenmiştir.

Veri Kullanılabilirlik Beyanı: Bu çalışmada sunulan veriler, ilgili yazardan talep üzerine sağlanabilir.

Çıkar Çatışmaları: Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.