Bölüm 1:Akteosit, Mitojenle Aktive Edilen Protein Kinazların Modülasyonu ve NFκB Hücresel Sinyal Yolu Yoluyla İnterlökin-1 -İndüklenen Katabolik Süreçlere Karşı Etkiler

Acteoside, Mitojenle Aktive Edilen Protein Kinazların Modülasyonu ve NFκB Hücresel Sinyal Yolu Yoluyla İnterlökin-1 -İndüklenen Katabolik Süreçlere Karşı Etki Eder

HyangI Lim ,1 Do Kyung Kim ,1 Tae-Hyeon Kim ,1 Kyeong-Rok Kang ,1 Jeong-Yeon Seo ,1,2 Seung Sik Cho ,3 Younghee Yun ,4,5 Ye-yong Choi ,4,5 Jungtae Leem ,4,5 Hyoun-Woo Kim ,6 Geon-Ung Jo ,6

Chan-Jin Oh ,6 Deuk-Sil Oh ,6 Hong-Sung Chun ,2 ve Jae-Sung Kim 1

İletişim:joanna.jia@wecistanche.com

1Diş Bilimi Enstitüsü, Chosun Üniversitesi, Gwangju 61452, Kore Cumhuriyeti

2Biyomedikal Bilim Bölümleri, Chosun Üniversitesi, Gwangju 61452, Kore Cumhuriyeti

3Biyotıp, Sağlık ve Yaşam Yakınsama Bilimleri Bölümü, BK21 Four, Eczacılık Fakültesi, Mokpo Ulusal Üniversitesi,

Jeonnam 58554, Kore Cumhuriyeti

4Chung-Yeon Tıp Enstitüsü, Gwangju 61949, Kore Cumhuriyeti

5Araştırma ve Geliştirme Enstitüsü, CY Pharma Co., Seul 06224, Kore Cumhuriyeti

6Jeollanamdo Orman Kaynakları Enstitüsü, Naju, Jeollanamdo, 58213, Kore Cumhuriyeti

Yazışmalar Jae-Sung Kim'e yönelik olmalıdır; js_kim@chosun.ac.kr

2 Temmuz 2020'de alındı; 15 Şubat 2021'de revize edildi; 6 Mart 2021'de kabul edildi; 25 Mart 2021'de yayınlandı

Akademik Editör: Joël R. Drevet

Telif hakkı © 2021 HyangI Lim et al. Bu, CreativeCommonsAttributionLicense altında dağıtılan açık erişimli bir makaledir,

sınırsız kullanım, dağıtım,ve orijinal esere uygun şekilde atıfta bulunulması koşuluyla herhangi bir ortamda çoğaltılması.

cistanche böbrek hastalığını tedavi edebilir böbrek fonksiyonunu iyileştirebilir

Osteoartrit (OA), sinovyal eklemlerde artiküler kıkırdağın ilerleyici dejenerasyonunun neden olduğu kronik eklem ağrılı en yaygın dejeneratif eklem hastalığıdır.Acteosidebir caffeoylfeniletanoid glikozit, antimikrobiyal, antiinflamatuar, antikanser, antioksidan, sitoprotektif ve nöroprotektif etki gibi çeşitli biyolojik aktivitelere sahiptir. Ayrıca, oral uygulamaasteosityüksek dozda genotoksisiteye neden olmaz. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı antikatabolik etkilerini doğrulamaktır.asteositosteoartrite ve onun antikatabolik sinyal yolağına karşı.Acteosidenormal hücreler ve birincil sıçan kondrositleri olarak kullanılan fare fibroblast L929 hücrelerinin canlılıklarını azaltmadı.Acteosidematris metalloproteinaz- (MMP-) 13, MMP-1 ve MMP{{ gibi kıkırdağı bozan enzimlerin ekspresyonunu ve aktivasyonunu baskılayarak kondrositlerde ve eklem kıkırdağında IL-1 -indüklenen proteoglikan kaybını önledi{{ 6}}. Üstelik,asteositIL-1 ile tedavi edilen birincil sıçan kondrositlerinde indüklenebilir nitrik oksit sentaz, siklooksijenaz-2, nitrik oksit ve prostaglandin E2 gibi inflamatuar aracıların ekspresyonunu bastırdı. Daha sonra, proinflamatuar sitokinlerin ekspresyonu şu şekilde azaldı:asteositIL ile tedavi edilen birincil sıçan kondrositlerinde-1 . Ayrıca, ateozid, IL-1 ile tedavi edilen primer sıçan kondrositlerinde sadece mitojenle aktive olan protein kinazların fosforilasyonunu değil, aynı zamanda fosforilasyonunu baskılayarak NFκB'nin sitozolden çekirdeğe translokasyonunu da bastırdı. 5 ve 10 mg/kg asteozidin oral yoldan verilmesi, osteoartritik fare modelinde medial menisküsün destabilizasyonu tarafından oluşturulan artiküler kıkırdağın ilerleyici dejenerasyonunu hafifletmiştir. Bulgularımız, ateozidin, artiküler kıkırdağın ilerleyici dejenerasyonunu azaltmak veya önlemek için umut verici bir potansiyel antikatabolik ajan veya ek olduğunu göstermektedir.

Lütfen Bölüm 2 için buraya tıklayın

1. Giriş

Osteoartrit (OA), eklem kıkırdağının sinovyal eklemlerde ilerleyici dejenerasyonunun neden olduğu kronik eklem ağrılı en yaygın dejeneratif eklem hastalığıdır [1].

Yaşam beklentisindeki artışa bağlı olarak, eklem kıkırdağının sinovyal eklemlerde ilerleyici dejenerasyonunun neden olduğu hareket kaybı ve kronik eklem ağrısı ile birlikte OA prevalansının, menopozdan sonra kadınlarda sırasıyla yüzde 18 ve erkeklerde yüzde 9,6 olduğu tahmin edilmektedir [2]. ]. OA'nın dünya çapında prevalansı her yıl artmasına rağmen, OA'nın patofizyolojik etiyolojisi hala bilinmemektedir. Yaşlanma, cinsiyet, genetik kalıtım, travmatik eklem yaralanması ve şiddetli mekanik eklem yükü gibi çok karmaşık ve çok faktörlü risk faktörlerinden kaynaklanabilir. Ayrıca, eklem kıkırdağının ilerleyici dejenerasyonu ile kronik eklem ağrısı gelişimi arasındaki nöropatolojik ilişkiler bilinmemektedir [3]. Bu nedenle, OA'li hastalar için klinik yönetimin amacı, farmakolojik ve farmakolojik olmayan yaklaşımlar ve eklem replasman cerrahisi kullanarak kronik eklem ağrısından kurtulma yoluyla vücut hareketliliğinin ve mekanik eklem fonksiyonunun korunmasıdır. Yaşlı popülasyonda mekanik eklem fonksiyonunun sürdürülmesi yoluyla yaşam kalitesini korumak için OA'yı önlemek veya azaltmak için uzun vadeli biyolojik güvenlik ile etkili müdahale veya takviyenin geliştirilmesine olan talep artmaktadır.

Şekil 1'de gösterildiği gibi,asteosit(CAS No. 61276-17-3; C29H36O15), Verbascum klorürler [4], Buddleja globosa [5] ve Plantago australis [6] gibi çeşitli bitkisel bitkilerden izole edilen bir caeoylfeniletanoid glikozittir. Acteoide, antimikrobiyal [5], antienflamatuar [7], antikanser [8], antioksidan [9], sitoprotektif [9] ve nöroprotektif etki [10] gibi çeşitli biyolojik aktivitelere sahiptir. Ayrıca, oral uygulamaasteosityüksek bir dozda genotoksisiteye neden olmaz[11].

Bu nedenle, antiinflamatuar biyolojik güvenliliğe sahip ateozidin, proinflamatuar sitokinler, inflamatuar mediatörler ve sinovyal eklemlerdeki kıkırdağı bozan enzimler gibi katabolik faktörlerin baskılanması yoluyla, artiküler kıkırdağın ilerleyici dejenerasyonuna karşı eklem kıkırdağının korunması ile ilişkili antikatabolik etkileri olduğunu varsaydık. . Bu nedenle, bu çalışmanın amacı,akteosit-indüklenen antikatabolik etkiler ve bunun hücresel sinyal yolu, hem sıçan diz ekleminin eklem kıkırdağından izole edilen birincil kondrositleri kullanarak in vitro, hem de farelerin diz eklemindeki medial menisküsün cerrahi kararsızlaştırılmasıyla oluşturulan bir OA hayvan modelini kullanarak in vivo olarak.

asteositiçindecistancheYapabilmekgeliştirmekbağışıklık

2. Yöntemler

2.1. Hücre kültürü.

Birincil sıçan kondrositleri, Kurumsal tarafından onaylanan protokole (CIA-CUC2019-A0027) uygun olarak, sıçan (5-günlük; Sprague-Dawley) diz eklemlerinin eklem kıkırdağından izole edildi. Chosun Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi, Gwangju, Kore Cumhuriyeti. İzole birincil sıçan kondrositleri, yüzde 10 fetal sığır serumu (FBS) (Life Technologies) ile takviye edilmiş Dulbecco's Modiified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) (Thermo Scienti- ic, Rockford, IL, ABD) içinde tutuldu. , Grand Island, NY, ABD), antibiyotikler (50U/mL penisilin ve 50ug/mL streptomisin) ve 50ug/mL askorbik asit. Normal fare fibroblast L-929 hücre çizgisi, American Type Culture Collection'dan (ATCC) satın alındı. ATCC'den sağlanan talimatlara göre, L-929 hücreleri, Eagle'ın yüzde 10 FBS içeren minimum temel ortamında kültürlendi ve yüzde 5 CO2 ile 37 derecede nemlendirilmiş bir inkübatörde büyütüldü.

2.2. Hücre Canlılığı Deneyi.

Dimetil tiazolil difenil tetrazolyum tuzu (MTT) tahlili, normal hücre olarak kullanılan fare fibroblast hücre hattı L929 hücrelerinin ve asteosit ile muamele edilmiş birincil sıçan kondrositlerinin canlılıklarını değerlendirmek için yapıldı. Kısaca, L929 hücreleri ve birincil sıçan kondrositleri, 24 saat boyunca kültür plakalarında 8x105 hücre/mL hücre yoğunluğunda kültürlendi ve daha sonra 2.5, 5, 10, 25, 50 ve 100uM ile işleme tabi tutuldu.asteosit24 saat için. MTT çözeltisi ile muameleden sonra, hem L929 hücreleri hem de kondrositler 4 saat daha kültürlendi. İnkübasyondan sonra oluşan MTT kristalleri tamamen dimetil sülfoksit içinde süspanse edildi ve hücre canlılığını değerlendirmek için bir spektrometre (Epoch mikroplaka spektrofotometre, BioTek®, Winooski, VT, ABD) kullanılarak 570 nm'de absorbans için ölçüldü.

2.3. Hücre Canlı/Ölü Testi.

Hücre sağkalımı, canlı hücreleri etiketlemek için yeşil kalsein-AM'den (yeşil floresanlı) ve ölüleri etiketlemek için etidyum homodimer-1'den oluşan Cell Live/Dead tahlil kiti (Molecular Probes, Carlsbad, CA, ABD) kullanılarak gerçekleştirildi. hücreler (kırmızı floresanlı). Kısaca, hem L929 hücreleri hem de birincil sıçan kondrositleri, oda slaytlarında (Nunc® Lab-Tek® Chamber Slide™ sistemi; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) 8x105 hücre/mL hücre yoğunluğunda 24 saat kültürlendi ve ardından 24 saat boyunca 50 ve 100μM acteoside. Yetiştirmeden sonra, üreticinin talimatlarına göre bir hücre hayatta kalma tahlili yapıldı. Daha sonra, boyanmış hücreler bir floresan mikroskobu (Eclipse TE200; Nikon Instruments, Melville, NY) kullanılarak görüntülendi.

2.4. Dimetilmetilen Mavisi (DMMB) Testi.

IL-1 varlığında veya yokluğunda 21 gün boyunca asteozid ile tedavi edilen primer sıçan kondrositlerindeki proteoglikan içeriğinin değişimini değerlendirmek için DMMB tahlili yapıldı. 21 gün boyunca birincil sıçan kondrositlerinin özelliklerini korumak için, birincil sıçan kondrositleri (2x106 hücre) 1 mL yüzde 1.2 aljinat içinde süspanse edildi ve daha sonra hücre/aljinat süspansiyonunun 105mM CaCl2 çözeltisine damlatılmasıyla kapsüllendi. Aljinat içinde kapsüllenen birincil sıçan kondrositleri, 24 saat boyunca DMEM/F12'de (yüzde 10 FBS, 50U/mL penisilin, 50ug/mL streptomisin ve 50ug/mL askorbik asit içerir) kültürlendi ve daha sonra yüzde 1 içeren DMEM/F12'de 24 saat uyarlandı. mini-insülin-transferrin-selenyum (mini-ITS) ve 50ug/mL askorbik asit. Daha sonra, kondrositler 50 veya 100μM ile muamele edildi.asteosit21 gün boyunca 1ng/mL IL-1 varlığında veya yokluğunda. 21. günde, daha önce tarif edildiği gibi DMMB testi kullanılarak proteoglikan içeriğinin değerlendirilmesi için birincil sıçan kondrositleri toplandı [12]. Ek olarak, hücre başına proteoglikan içeriğini ölçmek ve birincil sıçan kondrositlerinin proliferasyonunu değerlendirmek için hücre sayıları, üreticinin talimatlarına göre PicoGreen (Molecular Probes, Carlsbad, CA) kullanılarak DNA tahlili ile ölçülmüştür. 7 gün boyunca 10ng/mL IL-1 varlığı veya yokluğu. Kültür süresinin sonunda örnekler toplandı ve histolojik analiz için 72 saat yüzde 4 paraformaldehit içinde sabitlendi.

2.6. Histolojik Analiz.

7 gün boyunca 10ng/mL IL-1 varlığında veya yokluğunda 100μM acteoside ile tedavi edilen eklem kıkırdağında proteoglikan kaybını doğrulamak için safranin-O ve hızlı yeşil boyama kullanılarak histolojik analiz yapıldı. Kısaca, sabitlenmiş eklem kıkırdağı örnekleri etilendiamintetraasetik asit içinde kireçten arındırılmış ve daha sonra paraffin içine gömülmüştür. Daha sonra hazırlanan artiküler kıkırdak içeren paraffin bloklar seri olarak 5μm kalınlığında dilimlendi ve lamlara yerleştirildi. Artiküler kıkırdak zemin maddesindeki proteoglikan kaybını değerlendirmek için daha sonra Safranin-O ve hızlı yeşil boyama yapıldı. Ayrıca eklem kıkırdağının genel morfolojisini gözlemlemek için hematoksilen ve eozin boyaması yapıldı.

2.7. Western Blot.

MMP-13, MMP-1, MMP-3, indüklenebilir nitrik oksit sentaz (iNOS) ve siklooksijenaz-2 (COX) dahil olmak üzere katabolik faktörlerin ifadesini araştırmak için Western blot uygulandı. -2) ve mitojenle aktive olan protein kinazlar ve nükleer faktör-kappa B (NFκB) gibi hücresel sinyal moleküllerinin değiştirilmesi. Kısaca, sıçan birincil kondrositleri, 24 saat boyunca 10ng/mL IL-1 varlığında veya yokluğunda 50 veya 100uM ateozid ile tedavi edildi. Daha sonra, sıçan birincil kondrositleri, santrifüjleme ile toplandı ve üreticinin talimatlarına göre lizis tamponu (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, ABD) kullanılarak parçalandı. Ek olarak, NFκB'nin nükleer translokasyonunu doğrulamak için, sıçan primer kondrositleri, 24 saat boyunca 10ng/mL IL-1 varlığında veya yokluğunda 50 veya 100μM asteozid ile tedavi edildi. Daha sonra, üreticinin talimatlarına göre NE-PER™ Nükleer ve Sitoplazmik ekstraksiyon reaktifleri (Thermo Scientific, Rockford, IL, ABD) kullanılarak sitozolik ve nükleer fraksiyonlar ekstrakte edildi. Primer sıçan kondrositlerinden ekstrakte edilen toplam protein konsantrasyonu, üreticinin talimatlarına göre bir bisinkoninik asit protein tahlil kiti (Thermo Scientific, Rockford, IL, ABD) kullanılarak belirlendi. Ek olarak, kondrositlerden salgılanan kıkırdağı bozan enzimlerin seviyelerini tespit etmek için şartlandırılmış ortam toplandı. Eşit miktarlarda protein ve şartlandırılmış ortam, sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) üzerinde elektroforeze tabi tutuldu ve daha sonra nitroselüloz membranlara aktarıldı. Daha sonra, MMP-13, MMP-1, MMP-3, iNOS, COX-2, fosfo-ERK1/2, total'e karşı hedeflenen birincil antikorlar kullanılarak western blotlama yapıldı. -ERK1/2, fosfo-p38, toplam-p38, fosfo-JNK, toplam JNK, fosfo-NFkB, toplam NFkB, -aktin ve lamin B. İmmünoreaktif bantlar, geliştirilmiş bir kemilüminesans sistemi kullanılarak görselleştirildi (Thermo Scientific, Rockford , IL, ABD) üreticinin talimatına göre ve daha sonra bir Microchemi cihazı (DNR Bioimaging Systems, Kudüs, İsrail) ile görüntülendi.

2.8. Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR) ve Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR (qRT-PCR).

Birincil sıçan kondrositleri, 50 veya 100uM ile tedavi edildiasteosit24 saat boyunca 10ng/mL IL-1 varlığında veya yokluğunda. Daha sonra, üreticinin talimatlarına göre TRIzol reaktifi (Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD) kullanılarak birincil sıçan kondrositlerinden toplam RNA izole edildi. Toplam RNA konsantrasyonu, bir NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Rockford, IL, ABD) kullanılarak ölçüldü. cDNA'yı sentezlemek için, 1ug ​​RNA üreticinin talimatlarına göre bir ThermoScript ters transkripsiyon-PCR sistemi (Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD) kullanılarak ters kopyalandı. cDNA'nın qPCR'si 2x TOPsimple™ DyeMIX-Taq (Enzynomics, Seul, Kore Cumhuriyeti) ve bir TaKaRa PCR Termal Döngü Cihazı (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japonya) üzerinde özel primerler kullanılarak yapıldı. Daha sonra PCR ürünleri, hedef genlerin ekspresyon seviyelerini belirlemek için bir agaroz jel üzerinde elektroforeze tabi tutuldu. Gliseraldehit 3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH), endojen kontrol olarak kullanıldı. Ek olarak, qRT-PCR için cDNA, Eco™ Real-Time PCR sistemi (illumine Inc., San Diego, CA, ABD) kullanılarak amplifiye edildi. -Aktin endojen kontrol olarak kullanıldı. qPCR ve qRT-PCR'de kullanılan primerlerin dizileri sırasıyla Tablo 1 ve 2'de özetlenmiştir.

2.9. Jelatin Zimografisi.

Primer sıçan kondrositlerinde MMP'lerin aktivasyonunu değerlendirmek için jelatin zimografi yapıldı. Kısaca, birincil sıçan kondrositleri, 24 saat boyunca 10ng/mL IL-1 varlığında veya yokluğunda 50 veya 100μM acteoside ile tedavi edildi. Daha sonra eşit hacimde şartlandırılmış ortam, yüzde 0,2 (1 mg/mL) domuz derisi jelatini ile kopolimerize edilmiş yüzde 10'luk bir poliakrilamid jel üzerinde elektroforezlendi. Elektroforezden sonra jel zimogram renatürasyon tamponunda (50mM Tris–HCl (pH7.6), 10mM CaCl2, 50mM NaCl ve yüzde 0.05 Brij-35) 37 derecede 72 saat inkübe edildi. MMP'lerin renatürasyonundan sonra jel, yüzde 0.1 Coomassie Brilliant Blue R250 ile boyandı. Jelatinolitik bantlar, düzgün bir şekilde açık mavi boyanmış bir arka plan üzerinde berrak bantlar olarak ortaya çıkarılmış ve daha sonra bir dijital kamera kullanılarak görüntülenmiştir.

2.10. Nitrik Oksit (NO) Ölçümü.

Birincil sıçan kondrositleri, 24 saat boyunca 10ng/mL IL-1 varlığında veya yokluğunda 50 veya 100uM asteozid ile tedavi edildi. Daha sonra, 50 uL koşullandırılmış ortam, 50 uL sülfanilamid ve N-1-naftil etilendiamin dihidroklorür ile reaksiyona sokuldu. Absorbans daha sonra bir spektrofotometre (Epoch Spectrophotometer, BioTek, Winooski, VT, ABD) kullanılarak 540nm dalga boyunda ölçüldü.

2.11. Prostaglandin E2 (PGE2) Testi.

Birincil sıçan kondrositleri, 50 veya 100uM ile tedavi edildiasteosit24 saat boyunca 10ng/mL IL-1 varlığında veya yokluğunda. Daha sonra PGE2 konsantrasyonu, üreticinin talimatlarına göre bir PGE2 parametre tahlil kiti (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, ABD) kullanılarak ölçüldü.

2.12. Sitokin Dizisi.

Birincil sıçan kondrositleri, 24 saat boyunca 10ng/mL IL-1 varlığında veya yokluğunda 50uM asteozid ile tedavi edildi. Daha sonra, toplam proteinler ekstrakte edildi ve daha önce tarif edildiği gibi nicelendirildi [13]. Daha sonra, üreticinin talimatlarına göre sitokin üretimindeki değişikliği araştırmak için bir sitokin dizisi yapıldı (RayBiotech, Inc., Norcross, GA, ABD).

2.13. Nükleer Translokasyon Deneyi.

Birincil sıçan kondrositleri, 50 ve 100ug/mL ile tedavi edildi.asteosit10ng/mL IL-1 varlığında. 30 dakika sonra, birincil sıçan kondrositleri yüzde 1 paraformaldehit ile sabitlendi, yüzde 0.2 Triton X-100 içinde geçirgenleştirildi ve fosfat tamponlu salin ile kapsamlı bir şekilde yıkandı. Spesifik olmayan sinyaller, normal keçi serumu kullanılarak bloke edildi. Birden fazla yıkamadan sonra, kondrositler tavşan anti-NFκB antikorları ile inkübe edildi, ardından FITC-konjuge keçi anti-tavşan IgG (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) ile 4 derecede gece boyunca inkübe edildi. Daha sonra, boyanmış hücreler, Kore Temel Bilimler Enstitüsü'nün (Gwangju, Kore Cumhuriyeti) Gwangju şubesinde bir lazer konfokal taramalı mikroskop sistemi (Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya) kullanılarak görüntülendi.

2.14. Osteoartritik Hayvanların Nesli.

Osteoartritik hayvanlar oluşturmak için, medial menisküs (DMM), BALB/c farelerinin diz eklemlerinde (ortalama vücut ağırlığı 19:3±0:5g) IACUC yönergelerine (CIACUC{{4}) uygun olarak cerrahi olarak dengesizleştirildi. }A0029). OA ile indüklenen hayvanlar, her seferinde yüzde 5 etanol (deney grubu; n =5) veya araç (yüzde 5 etanol) (DMM grubu; n =5) içinde çözülen 5 ve 10 mg/kg asteosit ile ağızdan tedavi edildi. diğer gün 8 hafta. Kültür periyodunun sonunda, diz eklemleri diseke edildi ve histolojik değerlendirmeler yapmak için yüzde 5 paraformaldehit kullanılarak 7 gün sabitlendi. safranin-O ve hızlı yeşil boyama sonrası görüntülenen eklem kıkırdağı dokuları Mankin derecesine göre incelendi [14, 15].

2.15. İstatistiksel analiz.

Deneysel veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulur ve varyans analizi kullanılarak karşılaştırılır, ardından SPSS yazılım sürüm 25 (IBM Corp.) kullanılarak post hoc çoklu karşılaştırmalar (Tukey testi) yapılır. Hayvan çalışması dışındaki tüm veriler elde edildi. üç bağımsız deneyden.

asteositiçindecistanche

3. Sonuçlar

3.1. Acteoside, L929 Hücresini ve Birincil Sıçan Kondrosit Canlılığını Etkilemez.

Normal hücreler olarak kullanılan fare fibroblast hücre hattı L929, 24 saat boyunca 2.5, 5, 10, 25, 50 ve 100uM ateozid ile muamele edildi. Daha sonra, L929 hücreleri üzerindeki asteositin sitotoksisitesini değerlendirmek için MTT tahlili yapıldı. Şekil 2(a)'da gösterildiği gibi, L929 hücrelerinin bağıl canlılıkları yüzde 94:8±8, yüzde 93:6±7, yüzde 100±5, yüzde 103:9±5, yüzde 126:1±8 olarak belirlendi. ve kontrol ile karşılaştırıldığında sırasıyla 2.5, 5, 10, 25, 50 ve 100μM asteositte yüzde 122:7±4 (yüzde 100:02 ± 3). Ayrıca, asteositin birincil sıçan kondrositleri üzerindeki sitotoksisitesini doğrulamak için MTT tahlili, Şekil 2(b)'de gösterildiği gibi yapıldı. 2.5, 5, 10, 25, 50 ve 100μM asteozid ile muamele edilen primer sıçan kondrositlerinin canlılıkları yüzde 114 ± 4 , yüzde 117:8±6 , yüzde 123:9± 5 , yüzde 132:6±4 olarak belirlendi. Kontrol ile karşılaştırıldığında (yüzde 100:4±5) sırasıyla yüzde 153:1±7 ve yüzde 142:1±6. Ayrıca, hem L929 hücrelerinin hem de birincil sıçan kondrositlerinin canlılığı üzerindeki ateozidin etkisini doğrulamak için Şekil 2(c)'de gösterildiği gibi bir Hücre Canlı/Ölü tahlili yapıldı. Kırmızı floresan olarak boyanmış ölü hücrelerin sayısı, hem L929 hücreleri hem de 24 saat boyunca 50 ve 100 uM ateozid ile tedavi edilen birincil sıçan kondrositleri için artmamıştır. Bu veriler tutarlı bir şekilde, tanımlanmış dozajınasteositL929 hücrelerinin ve birincil sıçan kondrositlerinin canlılığını etkilemedi. Bu nedenle, hem L929 hücrelerinde hem de primer sıçan kondrositlerinde toksik olmayan dozlar olan 50μM asteosit ve 100μM asteozit, primer sıçan kondrositleri kullanılarak yapılan in vitro çalışmalarda antikatabolik etkilerini doğrulamak için kullanıldı.

3.2. Acteoside, Birincil Sıçan Kondrositlerinde IL-1 -İndüklenmiş Proteoglikan Kaybını Önler.

Aljinat boncuklarına gömülü birincil sıçan kondrositleri, 21 gün boyunca 1ng/mL IL- 1 varlığında veya yokluğunda 50 ve 100uM ateozid ile muamele edildi. Daha sonra, Şekil 3(a)'da gösterildiği gibi proteoglikan içeriğindeki değişikliği değerlendirmek için bir DMMB tahlili yapıldı. Göreceli proteoglikan içerikleri, kontrol ile karşılaştırıldığında, sırasıyla 50 ve 100μM acteoside ile tedavi edilen birincil sıçan kondrositlerinde yüzde 88:3±18:1 ve 86:8±16:3 olarak belirlendi (103:8± yüzde 32:3 ). Göreceli proteoglikan içerikleri ateozid tarafından azaltılsa da, bu sonuçlar anlamlı değildi. Bununla birlikte, 1ng/mL IL-1 ile tedavi edilen birincil sıçan kondrositlerinde bağıl proteoglikan içeriği yüzde 37:1±14:7 oranında önemli ölçüde azaldı, ancak 50 ve 100μM asteozit, proteoglikan içeriğini önemli ölçüde 57 ± 12:4 oranında azalttı. 1ng/mL IL-1 varlığında sırasıyla yüzde 64 ± 14:5 . Daha sonra, ateozidin IL-1 - ile indüklenen proteoglikan kaybını baskılayıp baskılamadığını doğrulamak için, sıçan diz eklemlerinden kesilen eklem kıkırdağı, 7 gün boyunca 10ng/mL IL-1 varlığında veya yokluğunda 100μM asteozid ile tedavi edildi. Daha sonra, Şekil 3(b)'de gösterildiği gibi H&E boyama ve safranin-O ve hızlı yeşil boyama kullanılarak histolojik değerlendirmeler yapıldı. H&E boyaması kullanılarak morfolojik değişiklik gözlenmedi; bununla birlikte safranin-O ve hızlı yeşil boyama, kırmızı renk olarak boyanan proteoglikanın, kontroldekine kıyasla 100μM acteoside ile tedavi edilen eklem kıkırdaklarında değişmediğini ortaya koydu. Bununla birlikte, eklem kıkırdağında 10ng/mLIL-1 ile ciddi proteoglikan kaybı indüklendi ve 100μM asteozid, 10ng/mL IL- 1 ile tedavi edilen eklem kıkırdağında proteoglikan kaybını önemli ölçüde bastırdı. Toplu olarak, bu veriler tutarlı bir şekilde, ateositin, IL-1 -indüklü proteoglikan kaybını önleyerek eklem kıkırdağının dejenerasyonunu geciktiren bir antikatabolik etkiye sahip olduğunu göstermektedir.

asteositiçindecistancheüzerinde iyi etkileri varantioksidan

3.3. Acteoside, IL ile Tedavi Edilen Primer Sıçan Kondrositlerinde MMP Ekspresyonunu ve Aktivasyonunu Bastıran Antikatabolik Etkiye Sahiptir-1 .

Acteoside ile indüklenen antikatabolik etkinin MMP ekspresyonu ve aktivasyonunun baskılanması ile ilişkili olup olmadığını araştırmak için, birincil sıçan kondrositleri, 24 saat boyunca 10ng/mL IL-1 varlığında veya yokluğunda 50 ve 100μM asteozid ile tedavi edildi. Daha sonra MMP'lerdeki değişiklikler araştırıldı. Şekil 4(a)'da gösterildiği gibi, MMP-13, MMP-1 ve MMP-3 gibi kıkırdak bozucu enzimlerin ekspresyonu, birincil sıçanın şartlandırılmış ortamında önemli ölçüde artmış olsa da 10ng/mL IL-1 ile tedavi edilen kondrositler, azaltıldıasteositdoza bağlı bir şekilde. Ayrıca, hem qPCR (Şekil 4(b)) hem de qRT-PCR (Şekil 4(c)) sonuçları, IL-1'nin MMP-13, MMP{ gibi MMP'lerin mRNA seviyelerini önemli ölçüde arttırdığını ortaya koydu. {6}} ve MMP-3 birincil sıçan kondrositlerinde. Bununla birlikte, 50 ve 100uM ateozid ile tedavi edilen birincil sıçan kondrositlerinde doza bağlı olarak azaldılar. Ayrıca, 50 ve 100μM asteozid, 10ng/mL IL-1 ile tedavi edilen sıçan primer kondrositlerinde MMP'lerin aktivasyonunu etkili bir şekilde bastırdı (Şekil 4(d)). Birlikte ele alındığında, bu veriler tutarlı bir şekilde, ateozidin, kıkırdağı parçalayan enzimlerin ekspresyonunu ve aktivasyonunu baskılayan bir antikatabolik etkiye sahip olduğunu göstermektedir.